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CN112584852A - 新抗原及其用途 - Google Patents

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CN112584852A
CN112584852A CN201980054704.8A CN201980054704A CN112584852A CN 112584852 A CN112584852 A CN 112584852A CN 201980054704 A CN201980054704 A CN 201980054704A CN 112584852 A CN112584852 A CN 112584852A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
sequence
peptide
mutant
fmoc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980054704.8A
Other languages
English (en)
Inventor
维克拉姆·朱内贾
董正鑫
罗宾·杰西卡·艾泽特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aetna Usa Inc
Biontech US Inc
Original Assignee
Aetna Usa Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aetna Usa Inc filed Critical Aetna Usa Inc
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本文的公开内容涉及包含含有新表位的免疫治疗肽的免疫治疗组合物。本文还公开了编码所述免疫治疗肽的多核苷酸。本文还公开了包含新表位的免疫治疗肽的合成方法以及所述免疫治疗组合物的用途，包括治疗方法。

Description

新抗原及其用途
交叉引用
本申请要求2018年6月19日提交的第62/687,191号美国临时申请、2018年7月24日提交的第62/702,567号美国临时申请、2018年9月4日提交的第62/726,804号美国临时申请、2019年1月7日提交的第62/789,162号美国临时申请、2019年2月6日提交的第62/801,981号美国临时申请、2019年2月4日提交的第62/800,700号美国临时申请和2019年2月4日提交的第62/800,792号美国临时申请的权益，其中每个临时申请均通过引用整体并入本文。
背景技术
癌症免疫疗法是利用免疫系统治疗癌症。免疫疗法利用以下事实：癌细胞通常在其表面上具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤抗原，该分子通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向肿瘤抗原来指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤应答，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。肿瘤疫苗一般由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如佐剂、细胞因子或TLR配体)组成，它们共同作用以诱导识别并裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。开发治愈性且肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是鉴定和选择用以避免自身免疫的高度特异性且受限制的肿瘤抗原。
由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原，并且可以是患者特异性的或共有的。肿瘤新抗原是肿瘤细胞特有的，因为突变及其相应的蛋白质仅存在于肿瘤中。它们还避免了中枢耐受，因此更可能是免疫原性的。因此，肿瘤新抗原为免疫识别提供了极好的靶标，包括通过体液免疫和细胞免疫。然而，由于在鉴定肿瘤新抗原、选择优化的抗原和产生用于疫苗或免疫原性组合物的新抗原方面的技术困难，肿瘤新抗原很少在癌症疫苗或免疫原性组合物中使用。因此，仍然需要开发另外的癌症治疗剂。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含(a)包含第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列的至少一种多肽或其药学上可接受的盐，其中(i)第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列各自包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且(ii)第一突变GATA3肽序列的C末端序列与第二突变GATA3肽序列的N末端序列重叠；其中SEQ IDNO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH(SEQID NO:2)的至少一个氨基酸，或者(b)包含编码所述至少一种多肽的序列的至少一种多核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列或所述第二突变GATA3肽序列包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变肽序列包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的所述至少8个连续氨基酸包含以下序列的至少8个连续氨基酸：PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGL(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的所述至少8个连续氨基酸包含以下序列的至少一个氨基酸：EPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(SEQID NO:4)。
在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列中的至少一个包含至少14个突变氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少3个突变GATA3肽序列。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少两种多肽。在一些实施方案中，所述至少一种多肽进一步包含第三突变GATA3肽序列，其中所述第三突变GATA3肽序列包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列SEQ ID NO:2的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述第三GATA3突变肽包含SEQID NO:2的至少8个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由以下等位基因编码的蛋白质：(a)HLA-A02:01等位基因和HLA-A24:02等位基因，(b)HLA-A02:01等位基因和HLA-B08:01等位基因，(c)HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因；或(d)HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因。在一些实施方案中，(a)所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；并且(b)所述第二GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；其中与所述第二突变GATA3肽序列相比，所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由不同HLA等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列中的至少一个以小于500nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变肽序列中的至少一个以大于1小时的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含以下序列中的至少一个：(a)TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI，和/或(b)MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI，和/或(c)VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR，和/或(d)FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF和/或KPKRDGYMFL，和/或(e)IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含以下序列中的至少两个：(a)TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI，和/或(b)MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI，和/或(c)VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR，和/或(d)FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF，和/或(e)IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
在一些实施方案中，所述突变GATA3肽序列包含(a)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(b)的第二突变GATA3肽序列；(b)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(c)的第二突变GATA3肽序列；(c)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；(d)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；(e)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(c)的第二突变GATA3肽序列；(f)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；(g)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；(h)来自(c)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；(i)来自(c)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；或(j)来自(d)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列。
在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列包含表5和/或表6的肽。在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列包含GATA3蛋白的第一新表位，并且所述第二肽突变GATA3肽序列包含突变GATA蛋白的第二新表位，其中所述第一突变GATA3肽序列不同于所述第二突变GATA3肽序列，并且其中所述第一新表位包含至少一个突变氨基酸，且所述第二新表位包含相同的突变氨基酸。
在一些实施方案中，所述包含至少八个连续氨基酸的第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列中的每一个由下式表示：[Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C或[Xaa]N-[Xaa]C-[Xaa]F，其中每个Xaa为氨基酸，其中[Xaa]N和[Xaa]C各自包含由GATA3基因的不同部分编码的氨基酸序列，其中[Xaa]F为任何氨基酸序列，其中[Xaa]N在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，其中[Xaa]C包含至少一个突变氨基酸，并且在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，其中N为0-100的整数，其中C为1-100的整数，其中F为0-100的整数，其中N和M之和至少为8。
在一些实施方案中，[Xaa]F的每个Xaa为赖氨酸残基，并且F为1-100、1-10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的整数。在一些实施方案中，F为3、4或5。
在一些实施方案中，每个所述突变GATA3肽序列以至少50μg/mL-400μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列包含表1或表2的序列。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚ICLC。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：一个或多个突变GATA3肽序列，所述一个或多个突变GATA3肽序列包含选自下组的序列：ESKIMFATLQRSSL、KPKRDGYMFLKAESKI、SMLTGPPARVPAVPFDLH、EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH、LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI、GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD和KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是ESKIMFATLQRSSL。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是KPKRDGYMFLKAESKI。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是SMLTGPPARVPAVPFDLH。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列是KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含以0.1mM–1mM的浓度存在的pH调节剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含以1mM–10mM的浓度存在的pH调节剂。
在一个方面，本文提供了一种合成GATA3肽的方法，其中所述肽包含选自Xaa-Cys、Xaa-Ser和Xaa-Thr的至少两个连续氨基酸的序列，其中Xaa为任何氨基酸，所述方法包括：(a)将至少一种二肽或其衍生物与GATA3肽或其衍生物的氨基酸或其衍生物偶联，以获得含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物，其中所述二肽或其衍生物包含伪脯氨酸部分，(b)将一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物与所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联，以及(c)从树脂上切下所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物。在一些实施方案中，所述方法包括使所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物脱保护。
在一些实施方案中，至少一种二肽或其衍生物所偶联的氨基酸或其衍生物选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、Tyr、His和Val。在一些实施方案中，所述任选地与含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联的一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物包含Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
在一些实施方案中，所述GATA3肽或其衍生物的N末端氨基酸或其衍生物选自Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是(a)Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH，(b)Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH，
(c)Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH，(d)Fmoc-Leu-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH，(e)Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH。在一些实施方案中，(a)Xaa-Ser为Ser-Ser，(b)Xaa-Ser为Glu-Ser，(c)Xaa-Thr为Ala-Thr，(d)Xaa-Thr为Leu-Thr，或者(e)Xaa-Cys为Leu-Cys。
在一个方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用上述任一方面的药物组合物。
在一个方面，本文提供了一种鉴定患有癌症的受试者作为治疗剂的候选者的方法，该方法包括：将受试者鉴定为表达由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂包含(a)至少一种包含一个或多个突变GATA3肽序列的多肽，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含至少一个突变氨基酸，并且是由癌细胞的GATA3基因中的突变引起的突变GATA3蛋白的至少8个连续氨基酸的片段；或者(b)至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个或其部分与由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述治疗剂。
在一个方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用药物组合物，该药物组合物包含：(a)包含第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列的至少一种多肽，其中(i)第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列各自包含SEQID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且(ii)第一突变GATA3肽序列的C末端序列与第二突变GATA3肽序列的N末端序列重叠；其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:2)的至少一个氨基酸，或者(b)包含编码所述至少一种多肽的序列的至少一种多核苷酸，其中由受试者表达的HLA等位基因在施用时是未知的。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含以下序列的至少一个氨基酸：PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，所述受试者患有对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌、为MSI乳腺癌、为转移性乳腺癌、为Her2阴性乳腺癌、为Her2阳性乳腺癌、为ER阴性乳腺癌、为ER阳性乳腺癌、为PR阳性乳腺癌、为PR阴性乳腺癌或其任意组合。
在一些实施方案中，所述乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。在一些实施方案中，上述方面的方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂、抗CD40剂、来曲唑、氟维司群、PI3激酶抑制剂和/或CDK 4/6抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是帕博西尼、瑞博西尼、阿贝西尼、塞利西利、dinaciclib、milciclib、roniciclib、atuveciclib、briciclib、riviciclib、塞利西利、trilaciclib、voruciclib或其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是帕博西尼(PD0332991)；阿贝西尼(LY2835219)；瑞博西尼(LEE 011)；voruciclib(P1446A-05)；fascaplysin；arcyriaflavin；2-溴-12,13-二氢-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮；3-氨基硫代吖啶酮(3-ATA)、反式-4-((6-(乙基氨基)-2-((1-(苯甲基)-1H-吲哚-5-基)氨基)-4-嘧啶基)氨基)-环己酮(CINK4)；1,4-二甲氧基吖啶-9(10H)-硫酮(NSC 625987)；2-甲基-5-(对甲苯基氨基)苯并[d]噻唑-4,7-二酮(ryuvidine)；flavopiridol(阿伏西地)；塞利西利；dinaciclib；milciclib；roniciclib；atuveciclib；briciclib；riviciclib；trilaciclib(G1T28)；或其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，所述癌症是复发性或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，所述受试者是在内分泌疗法联合CDK 4/6抑制剂后疾病进展的受试者；或者其中所述受试者尚未接受先前的全身疗法。在一些实施方案中，所述方法包括确定所述受试者的细胞的雌激素受体基因的突变状态。在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞或针对雌激素受体的表达而富集的细胞。
在一些方面，本文提供了包含至少一种多肽的组合物，所述至少一种多肽包含一个或多个突变GATA3肽序列，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含至少一个突变氨基酸，并且是由癌细胞的GATA3基因中的突变引起的突变GATA3蛋白的至少8个连续氨基酸的片段；至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸；一种或多种包含所述至少一种多肽的APC；或与HLA蛋白复合的对于所述至少一种多肽的新表位具有特异性的T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列包含两个或更多个突变GATA3肽序列。在一些实施方案中，所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含SEQID NO:1或2的至少8个连续氨基酸。
在一些方面，本文提供了包含至少一种多肽的组合物，所述至少一种多肽包含两个或更多个突变GATA3肽序列，其中所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的每一个包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且第一GATA3肽序列的N末端序列与第二GATA3肽序列的N末端序列重叠；至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸；一种或多种包含所述至少一种多肽的APC；或与HLA蛋白复合的对于所述至少一种多肽的新表位具有特异性的T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述突变GATA3肽序列包含由癌细胞的GATA3基因中的移码突变引起的突变GATA3蛋白的片段。在一些实施方案中，所述至少8个连续氨基酸包含由GATA3neoORF序列编码的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，癌细胞的GATA3基因中的突变是移码突变。在一些实施方案中，癌细胞的GATA3基因中的突变是错义突变、剪接位点突变或基因融合突变。在一些实施方案中，每个突变GATA3肽序列包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个突变氨基酸。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个突变GATA3肽序列。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少两种多肽，或者所述至少一种多核苷酸包含至少两种多核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个GATA3肽序列中的至少一个或者所述两个或更多个GATA3肽序列中的至少一个包含GATA3蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，至少两个所述GATA3肽序列包含GATA3蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。
在一些实施方案中，每个所述GATA3肽序列包含GATA3蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的至少一个包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的至少3、4、5、6、7、8、9或10个包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的每一个包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的至少一个包含SEQID NO:3的至少8个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述至少8个连续氨基酸中的至少一个是SEQ ID NO:4的氨基酸。在一些实施方案中，所述至少8个连续氨基酸中的连续氨基酸不是SEQ ID NO:4的氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因和HLA-A24:02等位基因，HLA-A02:01等位基因和HLA-B08:01等位基因，HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因，或HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列包含第一突变GATA3肽序列和第二GATA3肽序列，所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；并且所述第二GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；其中与所述第二突变GATA3肽序列相比，所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由不同HLA等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因选自HLA-A02:01、HLA-A24:02、HLA-A03:01、HLA-B07:02、HLA-B08:01及其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含以下序列中的至少一个：TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI；和/或MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI、VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR；和/或FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF和/或KPKRDGYMFL和/或IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列包含以下序列中的至少两个：TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI；和/或MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI、VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR；和/或FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF和/或KPKRDGYMFL和/或IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
在一些实施方案中，所述突变GATA3肽序列包含以下序列中的至少两个：EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH、SMLTGPPARVPAVPFDLH、GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD、DLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI、KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH、FLKAESKIMFATLQRS和KPKRDGYMFLKAESKI。
在一些实施方案中，所述突变GATA3肽序列包含表5和/或表6中的至少两个序列。在一些实施方案中，所述两个或更多个突变GATA3肽序列的第一突变GATA3肽序列包含GATA3蛋白的第一新表位，并且第二肽突变GATA3肽序列包含突变GATA蛋白的第二新表位，其中所述第一突变GATA3肽序列不同于所述突变GATA3肽序列，并且其中所述第一新表位包含至少一个突变氨基酸，且所述第二新表位包含相同的突变氨基酸。
在一些方面，本文提供了一种包含至少一种多肽的组合物，所述多肽包含一个或多个突变GATA3肽序列，其中所述至少一种多肽由下式表示：
[Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C，其中每个Xaa独立地为任何氨基酸，其中[Xaa]N-[Xaa]C代表所述一个或多个突变GATA3肽序列，其中[Xaa]N和[Xaa]C各自包含由GATA3基因的不同部分编码的连续氨基酸序列，其中[Xaa]N在非野生型阅读框中编码，其中[Xaa]C包含至少一个突变氨基酸，并且在非野生型阅读框中编码，其中N为0-100的整数，其中C为1-100的整数，其中F为0-100的整数，其中N和M之和至少为8。
在一些实施方案中，所述包含至少八个连续氨基酸的突变GATA3肽序列中的每一个由式[Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C或[Xaa]N-[Xaa]C-[Xaa]F表示，其中每个Xaa为氨基酸，其中[Xaa]N和[Xaa]C各自包含由GATA3基因的不同部分编码的氨基酸序列，其中[Xaa]F为任何氨基酸序列，其中[Xaa]N在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，其中[Xaa]C包含至少一个突变氨基酸，并且在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，其中N为0-100的整数，其中C为1-100的整数，其中F为0-100的整数，其中N和M之和至少为8。在一些实施方案中，[Xaa]F的每个Xaa为赖氨酸残基，并且F为1-100、1-10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的整数。在一些实施方案中，F为3、4或5。
在一些实施方案中，所述至少一个突变氨基酸序列包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续突变氨基酸。在一些实施方案中，每个所述突变GATA3肽序列以至少1μg/mL、至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少200μg/mL、至少250μg/mL、至少300μg/mL或至少400μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，每个所述突变GATA3肽序列以至多5000μg/mL、至多2500μg/mL、至多1000μg/mL、至多750μg/mL、至多500μg/mL、至多400μg/mL或至多300μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，每个所述突变GATA3肽序列以10μg/mL至5000μg/mL、10μg/mL至4000μg/mL、10μg/mL至3000μg/mL、10μg/mL至2000μg/mL、10μg/mL至1000μg/mL、25μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至500μg/mL、100μg/mL至500μg/mL、200μg/mL至500μg/mL、200μg/mL至400μg/mL或3000μg/mL至400μg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚ICLC。在一些方面，本文提供了包含本文所述的组合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含以低于1mM或高于1mM的浓度存在的pH调节剂。在一些实施方案中，该药物组合物是疫苗组合物。在一些实施方案中，该药物组合物是水性的。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽中的一种或多种受以下参数限制：pI>5且HYDRO>-6，pI>8且HYDRO>-8，pI<5且HYDRO>-5，pI>9且HYDRO<-8，pI>7且HYDRO值>-5.5，pI<4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO<-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且HYDRO≤-4.，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-9，5≥pI≥12且-4≥HYDRO≥-9。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是碱。在一些实施方案中，所述pH调节剂是弱酸的共轭碱。在一些实施方案中，所述pH调节剂是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是柠檬酸和/或柠檬酸盐。在一些实施方案中，该柠檬酸盐是柠檬酸钠和/或柠檬酸三钠。在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸和/或琥珀酸盐在一些实施方案中，该琥珀酸盐是琥珀酸二钠和/或琥珀酸单钠。在一些实施方案中，该琥珀酸盐是六水合琥珀酸二钠。在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–10mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–5mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–1mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述pH调节剂以1mM–10mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述pH调节剂以1mM–5mM的浓度存在。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括液体。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含水。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含糖。在一些实施方案中，该糖包括右旋糖或甘露醇。在一些实施方案中，该右旋糖或甘露醇以1-10％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，该糖包括海藻糖。在一些实施方案中，该糖包括蔗糖。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含二甲基亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，DMSO以0.1％至10％、0.5％至5％、1％至5％、2％至5％、2％至4％或2％至4％的浓度存在。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体不包含二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，所述药物组合物是可冻干的。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0002944947110000171
载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体(virosomes)和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys和Aquila的QS21刺激子。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为2:1至1:10v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4或1:5v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:3v:v。
在一些方面，本文提供了一种合成GATA3肽的方法，其中所述肽包含选自Xaa-Cys、Xaa-Ser和Xaa-Thr的至少两个连续氨基酸的序列，其中Xaa为任何氨基酸，所述方法包括：将至少一种二肽或其衍生物与GATA3肽或其衍生物的氨基酸或其衍生物偶联，以获得含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物，其中所述二肽或其衍生物包含伪脯氨酸部分；将一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物与所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联；以及从树脂上切下所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物。
在一些实施方案中，所述方法包括使所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物脱保护。在一些实施方案中，所述GATA3肽是本文所述组合物或本文药物组合物中的所述至少一种多肽的肽。在一些实施方案中，所述GATA3肽或其衍生物的N末端氨基酸或其衍生物附接至树脂。在一些实施方案中，该树脂是Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂(2-Cl-Trt树脂)。在一些实施方案中，用于偶联的起始材料是Fmoc-His(Trt)-Wang树脂、H-His(Trt)-2Cl-Trt树脂、Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂、Fmoc-Ile-Wang树脂、Fmoc-Ser(tBu)-Wang树脂或Fmoc-Leu-Wang树脂。在一些实施方案中，至少一种二肽或其衍生物所偶联的氨基酸或其衍生物选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、Tyr、His和Val。
在一些实施方案中，所述任选地与含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联的一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物包含Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
在一些实施方案中，所述GATA3肽或其衍生物的N末端氨基酸或其衍生物选自Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH。在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH。在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH。在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是Fmoc-Leu-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH。在一些实施方案中，所述伪脯氨酸部分是Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH。
在一些实施方案中，Xaa-Ser为Ser-Ser。在一些实施方案中，Xaa-Ser为Glu-Ser。在一些实施方案中，Xaa-Thr为Ala-Thr。在一些实施方案中，Xaa-Thr为Leu-Thr。在一些实施方案中，Xaa-Cys为Leu-Cys。
在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些方面，本文提供了一种鉴定患有癌症的受试者作为治疗剂的候选者的方法，该方法包括：将受试者鉴定为表达由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂包含至少一种包含一个或多个突变GATA3肽序列的多肽，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含至少一个突变氨基酸，并且是由癌细胞的GATA3基因中的突变引起的突变GATA3蛋白的至少8个连续氨基酸的片段；至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸；一种或多种包含所述至少一种多肽的APC；或与HLA蛋白复合的对于所述至少一种多肽的新表位具有特异性的T细胞受体(TCR)；其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个或其部分与由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述治疗剂。
在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用组合物，该组合物包含：至少一种包含一个或多个突变GATA3肽序列的多肽，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含至少一个突变氨基酸，并且是由癌细胞的GATA3基因中的突变引起的突变GATA3蛋白的至少8个连续氨基酸的片段；至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸；一种或多种包含所述至少一种多肽的APC；或与HLA蛋白复合的对于所述至少一种多肽的新表位具有特异性的T细胞受体(TCR)；其中所述突变GATA3肽或其部分与由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质结合；其中所述受试者被鉴定为表达HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因。
在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用包含至少一种多肽的组合物，所述至少一种多肽包含两个或更多个突变GATA3肽序列，其中所述两个或更多个突变GATA3肽序列中的每一个包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且第一GATA3肽序列的N末端序列与第二GATA3肽序列的N末端序列重叠；至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸；一种或多种包含所述至少一种多肽的APC；或与HLA蛋白复合的对于所述至少一种多肽的新表位具有特异性的T细胞受体(TCR)；其中受试者表达的HLA等位基因在施用时是未知的。
在一些实施方案中，在受试者中引发免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答是体液应答。在一些实施方案中，所述突变GATA3肽序列同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，在足以使第二肽激活第二T细胞的时间段之后顺序施用第一肽。在一些实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，所述受试者患有对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌、为MSI乳腺癌、为转移性乳腺癌、为Her2阴性乳腺癌、为Her2阳性乳腺癌、为ER阴性乳腺癌、为ER阳性乳腺癌、为PR阳性乳腺癌、为PR阴性乳腺癌或其任意组合。在一些实施方案中，所述乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂、抗CD40剂、来曲唑、氟维司群和/或CDK 4/6抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂选自帕博西尼(PD0332991)；阿贝西尼(LY2835219)；瑞博西尼(LEE 011)；voruciclib(P1446A-05)；fascaplysin；arcyriaflavin；2-溴-12,13-二氢-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮；3-氨基硫代吖啶酮(3-ATA)、反式-4-((6-(乙基氨基)-2-((1-(苯甲基)-1H-吲哚-5-基)氨基)-4-嘧啶基)氨基)-环己酮(CINK4)；1,4-二甲氧基吖啶-9(10H)-硫酮(NSC 625987)；2-甲基-5-(对甲苯基氨基)苯并[d]噻唑-4,7-二酮(ryuvidine)；和flavopiridol(阿伏西地)；塞利西利；dinaciclib；milciclib；roniciclib；atuveciclib；briciclib；riviciclib；trilaciclib(G1T28)；及其任意组合。
在一些实施方案中，在施用所述突变GATA3肽序列之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。在一些实施方案中，施用包括皮下或静脉内施用。在一些实施方案中，所述癌症是复发性或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，所述受试者是在内分泌疗法联合CDK 4/6抑制剂后疾病进展的受试者。
CLL和某些淋巴瘤共同的突变是BTK(布鲁顿酪氨酸激酶)基因中第481位的半胱氨酸至丝氨酸改变(C481S)。该突变在具有以下氨基酸序列的区域携带：IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR，突变的丝氨酸加下划线表示。这种改变产生了与一系列HLA分子结合的许多结合肽。
在一个方面，本文提供了一种包含多肽的组合物，该多肽包含来自C481S突变BTK蛋白的一个或多个突变BTK肽序列，所述一个或多个突变BTK肽序列包含所述突变BTK蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽的氨基酸序列是：表34中列出的ANGSLLNY；ANGSLLNYL；ANGSLLNYLR；EYMANGSL；EYMANGSLLN；EYMANGSLLNY；GSLLNYLR；GSLLNYLREM；ITEYMANGS；ITEYMANGSL；ITEYMANGSLL；MANGSLLNYL；MANGSLLNYLR；NGSLLNYL；NGSLLNYL；SLLNYLREMR；TEYMANGSLL；TEYMANGSLLNY；YMANGSLL；或YMANGSLLN。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变BTK肽序列包含：(a)ANGSLLNY并且结合或被预测结合由HLA-A36:01等位基因编码的蛋白质，(b)ANGSLLNYL并且结合或被预测结合由选自HLA-C15:02、HLA-C08:01、HLA-C06:02、HLA-A02:04、HLA-C12:02、HLA-B44:02、HLA-C17:01和HLA-B38:01的HLA等位基因编码的蛋白质，(c)ANGSLLNYLR并且结合或被预测结合由HLA-A74:01等位基因或HLA-A31:01等位基因编码的蛋白质，(d)EYMANGSL并且结合或被预测结合由选自HLA-C14:02、HLA-C14:03和HLA-A24:02的HLA等位基因编码的蛋白质，(e)EYMANGSLLN并且结合或被预测结合由HLA-A24:02等位基因或HLA-A23:01等位基因编码的蛋白质，(f)EYMANGSLLNY并且结合或被预测结合由HLA-A29:02等位基因编码的蛋白质，(g)GSLLNYLR并且结合或被预测结合由HLA-A31:01等位基因或HLA-A74:01等位基因编码的蛋白质，(h)GSLLNYLREM并且结合或被预测结合由HLA-B58:02等位基因或HLA-B57:01等位基因编码的蛋白质，(i)ITEYMANGS并且结合或被预测结合由HLA-A01:01等位基因编码的蛋白质，(j)ITEYMANGSL并且结合或被预测结合由HLA-A01:01等位基因编码的蛋白质，(k)ITEYMANGSLL并且结合或被预测结合由HLA-A01:01等位基因编码的蛋白质，(l)MANGSLLNYL并且结合或被预测结合由选自HLA-C17:01、HLA-C02:02、HLA-B35:01、HLA-C03:03、HLA-C08:01、HLA-B35:03、HLA-C12:02、HLA-C01:02、HLA-C03:04和HLA-C08:02的HLA等位基因编码的蛋白质，(m)MANGSLLNYLR并且结合或被预测结合由HLA-A33:03等位基因或HLA-A74:01等位基因编码的蛋白质，(n)NGSLLNYL并且结合或被预测结合由HLA-B14:02等位基因编码的蛋白质，(o)NGSLLNYL并且结合或被预测结合由选自HLA-A68:01、HLA-A33:03、HLA-A31:01和HLA-A74:01的HLA等位基因编码的蛋白质，(p)SLLNYLREMR并且结合或被预测结合由HLA-A74:01等位基因或HLA-A31:01等位基因编码的蛋白质，(q)TEYMANGSLL并且结合或被预测结合由选自HLA-B40:01、HLA-B44:03、HLA-B49:01、HLA-B44:02和HLA-B40:02的HLA等位基因编码的蛋白质，(r)TEYMANGSLLNY并且结合或被预测结合由HLA-B44:03等位基因编码的蛋白质，(s)YMANGSLL并且结合或被预测结合由选自HLA-B15:09、HLA-C03:04、HLA-C03:03、HLA-C17:01、HLA-C03:02、HLA-C14:03、HLA-C14:02、HLA-C04:01、HLA-C02:02、HLA-A01:01的HLA等位基因编码的蛋白质，或者(t)YMANGSLLN并且结合或被预测结合由HLA-A29:02等位基因或HLA-A01:01等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变BTK肽序列对与HLA蛋白复合的同源T细胞受体是特异性的。在一些实施方案中，所述组合物包含两个或更多个突变BTK肽序列。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含：至少一种包含一个或多个突变BTK肽序列的多肽，每个BTK肽序列具有来自C481S突变BTK蛋白的至少8个连续氨基酸，所述一个或多个突变BTK肽序列选自表34，进一步包含与突变BTK肽序列的N末端或C末端连接的、与突变BTK蛋白异源的三个或更多个氨基酸残基，其中所述三个或更多个氨基酸残基增强了所述突变BTK肽序列在细胞内的加工，并且/或者增强了所述突变BTK肽序列的表位的呈递。在一些实施方案中，与突变BTK蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基包含来自CMV-pp65、HIV、MART-1或非病毒非BTK内源肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与突变BTK蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。
在一些实施方案中，与突变BTK蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基包含至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。
在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含：至少一种式(N-末端Xaa)N-(XaaBTK)P-(Xaa-C末端)C的多肽，其中，P为大于7的整数；(XaaBTK)P为包含至少8个连续氨基酸的突变BTK肽序列，所述氨基酸选自包含C481S突变氨基酸的突变BTK蛋白的序列IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR；N为(i)0或(ii)大于2的整数；(N-末端Xaa)N为与突变BTK蛋白异源的任何氨基酸序列；C为(i)0或(ii)大于2的整数；(Xaa-C末端)C为与突变BTK蛋白异源的任何氨基酸序列；并且N和C均为0。
在一些实施方案中，(N-末端Xaa)N和/或(Xaa-C末端)C包含CMV-pp65、HIV、MART-1或非病毒非BTK内源蛋白质或肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，N和/或C为大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的整数。
在一些实施方案中，N和/或C为小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100的整数。在一些实施方案中，权利要求8-10中任一项的化合物，其中N为0。在一些实施方案中，权利要求8-10的化合物，其中C为0。
在一个方面，本文提供了一种包含编码权利要求1的多肽的多核苷酸序列的组合物。在一个方面，该组合物包含编码上文以及表34和表36中所述的任何突变BTK肽的一个或多个肽序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个突变BTK肽序列。在一些实施方案中，所述突变BTK肽序列中的至少一个包含突变BTK蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述突变BTK肽序列中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个包含突变BTK蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述突变BTK肽序列中的每一个或所述两个或更多个BTK肽序列中的每一个包含突变BTK蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变BTK肽序列，所述突变BTK肽序列以150nM或更低的亲和力和/或2小时或更长的半衰期结合或被预测结合由表35中所列的HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述突变BTK肽序列包含：(a)选自表34的第一突变BTK肽序列，并且结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质；以及(b)具有C481S突变的第二BTK肽，其中第一突变BTK肽序列和第二突变BTK肽序列不相同。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变BTK肽序列，所述突变BTK肽序列以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变BTK肽序列，所述突变BTK肽序列以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，(N-末端Xaa)N包含氨基酸序列IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY,WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK或MTEYKLVVV。在一些实施方案中，(C-末端Xaa)C包含氨基酸序列KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
在一些实施方案中，所述突变BTK肽序列中的至少一个包含不由受试者的癌细胞的基因组编码的突变氨基酸。
在一些实施方案中，每个所述突变BTK肽序列以至少1μg/mL、至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL或至少100μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，每个所述突变BTK肽序列以至多5000μg/mL、至多2500μg/mL、至多1000μg/mL、至多750μg/mL、至多500μg/mL、至多400μg/mL或至多300μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，每个所述突变BTK肽序列以10μg/mL至5000μg/mL、10μg/mL至4000μg/mL、10μg/mL至3000μg/mL、10μg/mL至2000μg/mL、10μg/mL至1000μg/mL、25μg/mL至500μg/mL或50μg/mL至300μg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚ICLC。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)以上描述的组合物，和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，该药物组合物进一步包含pH调节剂。在一些实施方案中，该药物组合物是疫苗组合物。在一些实施方案中，该药物组合物是水性的。在一些实施方案中，该药物组合物包含所述至少一种多肽中的一种或多种，所述多肽受以下参数限制：(a)pI>5且HYDRO>-6，(b)pI>8且HYDRO>-8，(c)pI<5且HYDRO>-5，(d)pI>9且HYDRO<-8，(e)pI>7且HYDRO值>-5.5，(f)pI<4.3且-4≥HYDRO≥-8，(g)pI>0且HYDRO<-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-8，(h)pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且HYDRO≤-4，(i)pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-9，(j)5≥pI≥12且-4≥HYDRO≥-9。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是碱。在一些实施方案中，所述pH调节剂是弱酸的共轭碱。在一些实施方案中，所述pH调节剂是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是柠檬酸和/或柠檬酸盐。在一些实施方案中，该柠檬酸盐是柠檬酸钠和/或柠檬酸三钠。在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸和/或琥珀酸盐在一些实施方案中，该琥珀酸盐是琥珀酸二钠和/或琥珀酸单钠。在一些实施方案中，其中该琥珀酸盐是六水合琥珀酸二钠。在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–1mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括液体。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含水。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含糖。在一些实施方案中，该糖包括右旋糖。在一些实施方案中，该右旋糖以1-10％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，该糖包括海藻糖。在一些实施方案中，该糖包括蔗糖。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，DMSO以0.1％至10％、0.5％至5％或1％至3％的浓度存在。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体不包含二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，所述药物组合物是可冻干的。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，其中所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0002944947110000271
载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体(virosomes)和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys和Aquila的QS21刺激子。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为2:1至1:10v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:1、1:2、1:3、1:4或1:5v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:3v:v。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向该受试者施用如上所述的药物组合物。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：向有需要的受试者施用包含具有选自表34、36或37左列的序列的肽的组合物；其中该受试者表达由对应于该表格内的肽的右列中列出的任何一种HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：向有需要的受试者施用包含一种或多种突变BTK肽或编码所述一种或多种突变BTK肽的一种或多种核酸的组合物，其中每种突变BTK肽包含含有突变C481S的突变BTK蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述一种或多种肽中的至少一种与表34、36或37中列出的HLA等位基因编码的蛋白质结合，该蛋白质由所述受试者表达。在一些实施方案中，所述肽以150nM或更低的亲和力和/或2小时或更长的半衰期与HLA蛋白结合。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用第一和第二肽或编码所述第一和第二肽的核酸，其中所述第一肽具有选自表34、36或37的氨基酸序列；并且所述第二肽具有选自表34、36或37中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在受试者中引发免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答是体液应答。
在一些实施方案中，所述一种或多种突变BTK肽同时、分开或顺序施用。
在一些实施方案中，在足以使第一肽激活第二T细胞的时间段之后顺序施用第二肽。
在一些实施方案中，所述癌症选自某些类型的淋巴瘤和某些类型的白血病。在一些实施方案中，所述癌症是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤或B细胞非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂或抗CD40剂。在一些实施方案中，在施用所述突变BTK肽序列之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定所述受试者表达的第一蛋白质，其中所述第一蛋白质由所述受试者的第一HLA等位基因编码，并且其中所述第一HLA等位基因是表34、37或38中的任一个中提供的HLA等位基因，(b)向所述受试者施用(i)第一突变BTK肽，其中所述第一突变BTK肽是表34、36或37中的任一个提供的第一HLA等位基因所编码的肽；或(ii)编码所述第一突变BTK肽的多核酸。
在一个方面，本文提供了一种鉴定患有癌症的受试者作为治疗剂的候选者的方法，该方法包括将该受试者鉴定为表达由表34、36或37之一的HLA编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂是突变BTK肽或编码该突变BTK肽的核酸，其中该突变BTK肽包含在C481处包含突变的突变BTK蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽(i)包含C481S突变，(ii)包含表34、36或37中任一个的肽的序列，并且(iii)与由表34、36或37中任一个的HLA编码的相应蛋白质结合。
在一些方面，本文提供了一种包含多肽的组合物，该多肽包含来自T790M突变EGFR蛋白的一个或多个突变EGFR肽序列，所述一个或多个突变EGFR肽序列包含选自LIMQLMPF、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM、VQLIMQLM、STVQLIMQL和LTSTVQLIM的至少8个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变EGFR肽序列对与HLA蛋白复合的同源T细胞受体是特异性的。
在一些实施方案中，所述组合物包含两个或三个或更多个突变EGFR肽序列的混合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变EGFR肽序列。在一些实施方案中，突变EGFR蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。
在一些方面，本文提供了一种包含至少一种多肽的组合物，该多肽包含来自T790M突变EGFR蛋白的一个或多个突变EGFR肽序列，所述一个或多个突变EGFR肽序列包含选自LIMQLMPF、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM、VQLIMQLM、STVQLIMQL和LTSTVQLIM的至少8个连续氨基酸，进一步包含与突变EGFR肽序列的N末端或C末端连接的，与突变EGFR蛋白异源的三个或更多个氨基酸残基，其中所述三个或更多个氨基酸残基增强了所述突变EGFR肽序列在细胞内的加工，并且/或者增强了所述突变EGFR肽序列的表位的呈递。
在一些实施方案中，与突变EGFR蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基包含来自CMV-pp65、HIV、MART-1或非病毒非EGFR内源肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与突变EGFR蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。
在一些实施方案中，与突变EGFR蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基与所述两个或更多个突变EGFR肽序列的N末端或C末端连接，包含至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。
在一些实施方案中，(Xaa-C末端)C为与突变EGFR蛋白异源的任何氨基酸序列；并且N和C都不是0。
在一些实施方案中，(N-末端Xaa)N和/或(Xaa-C末端)C包含CMV-pp65、HIV、MART-1或非病毒非EGFR内源蛋白质或肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，N和/或C为大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的整数。
在一些实施方案中，N和/或C为小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100的整数。在一些实施方案中，N为0。在一些实施方案中，C为0。
在一个方面，本文提供了一种包含编码上述多肽的多核苷酸序列的组合物。在一个实施方案中，组合物包含编码本文公开的一个或多个突变EGFR肽序列的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述包含一个或多个突变EGFR肽序列的组合物进一步包含选自表40A-40D的一种或多种突变EGFR肽。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个突变EGFR肽序列。
在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列中的至少一个包含突变EGFR蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个包含突变EGFR蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列中的每一个或所述两个或更多个EGFR肽序列中的每一个包含突变EGFR蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变EGFR肽序列，所述突变EGFR肽序列以150nM或更低的亲和力和/或2小时或更长的半衰期结合或被预测结合由表41中所列的HLA等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列包含选自STVQLIMQL、LIMQLMPF、LTSTVQLIM、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM和VQLIMQLM的第一突变EGFR肽序列以及具有T790M突变的第二突变EGFR肽序列。
在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列包含：(a)选自STVQLIMQL、LIMQLMPF、LTSTVQLIM、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM和VQLIMQLM的第一突变EGFR肽序列，其中第一突变EGFR肽序列结合或被预测结合由HLA-A68:02、HLA-C15:02、HLA-A25:01、HLA-B57:03、HLA-C12:02、HLA-C03:02、HLA-A26:01、HLA-C12:03、HLA-C06:02、HLA-C03:03、HLA-B52:01、HLA-A30:01、HLA-C02:02、HLA-C12:03、HLA-A11:01、HLA-A32:01、HLA-A02:04、HLA-A68:01、HLA-B15:09、HLA-C17:01、HLA-C03:04、HLA-B08:01、HLA-A01:01、HLA-B42:01、HLA-B57:01、HLA-B15:01、HLA-B14:02、HLA-B37:01、HLA-A36:01、HLA-C15:02、HLA-B15:09、HLA-C12:02、HLA-B38:01、HLA-C03:03、HLA-A02:03、HLA-B58:02、HLA-C08:01、HLA-B35:01、HLA-B40:01和/或HLA-B35:03等位基因编码的蛋白质；以及(b)包含T790M突变的第二EGFR肽序列，其中第一和第二肽不相同。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变EGFR肽序列，所述突变EGFR肽序列以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变EGFR肽序列，所述突变EGFR肽序列以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
在一些实施方案中，(N-末端Xaa)N包含氨基酸序列IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY,WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK或MTEYKLVVV。
在一些实施方案中，(C-末端Xaa)C包含氨基酸序列KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE。
在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列中的至少一个包含不由受试者的癌细胞的基因组编码的突变氨基酸。
在一些实施方案中，所述突变EGFR肽序列以至少1μg/mL、至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL或至少100μg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，其中每个所述突变EGFR肽序列以至多5000μg/mL、至多2500μg/mL、至多1000μg/mL、至多750μg/mL、至多500μg/mL、至多400μg/mL或至多300μg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，每个所述突变EGFR肽序列以10μg/mL至5000μg/mL、10μg/mL至4000μg/mL、10μg/mL至3000μg/mL、10μg/mL至2000μg/mL、10μg/mL至1000μg/mL、25μg/mL至500μg/mL或50μg/mL至300μg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚ICLC。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：
(a)包含至少一种多肽的组合物，该多肽包含至少一个如上所述的突变EGFR肽序列，和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含pH调节剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物是水性的。
在一些实施方案中，所述至少一种多肽中的一种或多种受以下参数限制：pI>5且HYDRO>-6，pI>8且HYDRO>-8，pI<5且HYDRO>-5，pI>9且HYDRO<-8，pI>7且HYDRO值>-5.5，pI<4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO<-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且HYDRO≤-4.，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-9，5≥pI≥12且-4≥HYDRO≥-9。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含pH调节剂，后者为碱。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是弱酸的共轭碱。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是二羧酸盐或三羧酸盐。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是柠檬酸和/或柠檬酸盐。
在一些实施方案中，该柠檬酸盐是柠檬酸钠和/或柠檬酸三钠。
在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸和/或琥珀酸盐
在一些实施方案中，该琥珀酸盐是琥珀酸二钠和/或琥珀酸单钠。
在一些实施方案中，该琥珀酸盐是六水合琥珀酸二钠。
在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–1mM的浓度存在。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，后者包括液体。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含水。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含糖。
在一些实施方案中，该糖包括右旋糖。
在一些实施方案中，该右旋糖以1-10％w/v的浓度存在。
在一些实施方案中，该糖包括海藻糖。
在一些实施方案中，该糖包括蔗糖。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含二甲基亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，DMSO以0.1％至10％、0.5％至5％或1％至3％的浓度存在。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体不包含二甲基亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，所述药物组合物是可冻干的。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0002944947110000351
载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体(virosomes)和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys和Aquila的QS21刺激子。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为2:1至1:10v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:1、1:2、1:3、1:4或1:5v:v。在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:3v:v。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向该受试者施用以上描述的药物组合物。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含一种或多种突变EGFR肽或编码所述一种或多种突变EGFR肽的一种或多种核酸的组合物，其中每种突变EGFR肽包含含有突变T790M的突变EGFR蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述一种或多种突变EGFR肽具有表40A-40D所示的氨基酸序列；其中所述一种或多种肽中的至少一种以150nM或更低的亲和力和/或2小时或更长的半衰期结合或被预测结合由HLA-A68:02、HLA-C15:02、HLA-A25:01、HLA-B57:03、HLA-C12:02、HLA-C03:02、HLA-A26:01、HLA-C12:03、HLA-C06:02、HLA-C03:03、HLA-B52:01、HLA-A30:01、HLA-C02:02、HLA-C12:03、HLA-A11:01、HLA-A32:01、HLA-A02:04、HLA-A68:01、HLA-B15:09、HLA-C17:01、HLA-C03:04、HLA-B08:01、HLA-A01:01、HLA-B42:01、HLA-B57:01、HLA-B15:01、HLA-B14:02、HLA-B37:01、HLA-A36:01、HLA-C15:02、HLA-B15:09、HLA-C12:02、HLA-B38:01、HLA-C03:03、HLA-A02:03、HLA-B58:02、HLA-C08:01、HLA-B35:01、HLA-B40:01和/或HLA-B35:03等位基因编码的蛋白质；并且，其中所述等位基因由所述受试者表达。
在一个方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中该方法包括：向有需要的受试者施用包含突变EGFR肽序列的多肽或编码该突变EGFR肽的多核苷酸，其中(a)所述突变EGFR肽具有序列LIMQLMPF，并且所述受试者表达由HLA-C03:02等位基因编码的蛋白质，(b)所述突变EGFR肽具有序列LTSTVQLIM，并且所述受试者表达由选自HLA-C12:03、HLA-C15:02、HLA-B57:01、HLA-B57:01、HLA-A36:01、HLA-C12:02、HLA-C03:03和HLA-B58:02的HLA等位基因编码的蛋白质，(c)所述突变EGFR肽具有序列QLIMQLMPF，并且所述受试者表达由HLA-A26:01等位基因编码的蛋白质，(d)所述突变EGFR肽具有序列STVQLIMQL，并且所述受试者表达由选自HLA-A68:02、HLA-C15:02、HLA-A25:01、HLA-B57:03、HLA-C12:02、HLA-A26:01、HLA-C12:03、HLA-C06:02、HLA-C03:03、HLA-A30:01、HLA-C02:02、HLA-A11:01、HLA-A32:01、HLA-A02:04、HLA-A68:01、HLA-B15:09、HLA-C03:04、HLA-B38:01、HLA-B57:01、HLA-A02:03、HLA-C08:01、HLA-B35:01和HLA-B40:01的HLA等位基因编码的蛋白质，(e)所述突变EGFR肽具有序列STVQLIMQLM，并且所述受试者表达由HLA-B57:01等位基因编码的蛋白质，(f)所述突变EGFR肽具有序列TSTVQLIMQL，并且所述受试者表达由HLA-C15:02等位基因编码的蛋白质，(g)所述突变EGFR肽具有序列TVQLIMQL，并且所述受试者表达由选自HLA-C17:01、HLA-B08:01、HLA-B42:01、HLA-B14:02、HLA-B37:01、HLA-B15:09的HLA等位基因编码的蛋白质，(h)所述突变EGFR肽具有序列TVQLIMQLM，并且所述受试者表达由HLA-B35:03等位基因编码的蛋白质，或者(i)所述突变EGFR肽具有序列VQLIMQLM，并且所述受试者表达由选自HLA-B52:01、HLA-B14:02和HLA-B37:01的HLA等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用包含至少一种突变EGFR肽的第二多肽组合物，其中所述第二突变EGFR肽选自表40A-40D。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)鉴定所述受试者表达的第一蛋白质，其中所述第一蛋白质由所述受试者的第一HLA等位基因编码，并且其中所述第一HLA等位基因是表41至43中的任一个中提供的HLA等位基因，以及(b)向所述受试者施用(i)第一突变EGFR肽，其中所述第一突变EGFR肽是表42Ai和ii、42B或43中的任一个提供的第一HLA等位基因所编码的肽；或(ii)编码所述第一突变EGFR肽的多核酸。在一些实施方案中，治疗受试者的癌症的方法包括以下步骤：鉴定所述受试者中表达的一种或多种特定的HLA亚型；向所述受试者施用包含一种或多种本文所述的突变EGFR肽的组合物，使得所述一种或多种肽以150nM或更低的亲和力和/或2小时或更长的半衰期与所述受试者表达的至少一种HLA亚型结合。
在一个方面，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)鉴定所述受试者表达由受试者基因组的HLA-B57:01等位基因编码的蛋白质；(b)向所述受试者施用包含具有序列STVQLIMQLM的肽的组合物。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)鉴定所述受试者是否表达由受试者基因组的HLA-A26:01等位基因编码的蛋白质；(b)向所述受试者施用包含具有序列QLIMQLMPF的肽的组合物。
在一些实施方案中，在受试者中引发免疫应答。在一个实施方案中，该免疫应答是体液应答。
在一些实施方案中，所述一种或多种突变EGFR肽序列同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，在足以使第一肽激活第二T细胞的时间段之后顺序施用第二肽。
在一些实施方案中，所述癌症选自胶质母细胞瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和食管癌。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。
在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂或抗CD40剂。在一些实施方案中，在施用所述突变EGFR肽序列之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。
在一个方面，本文提供了一种鉴定患有癌症的受试者作为治疗剂的候选者的方法，该方法包括将该受试者鉴定为表达由表41、42Ai、42Aii、42B或43之一的HLA编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂是突变EGFR肽或编码该突变EGFR肽的核酸，其中该突变EGFR肽包含在T790处包含突变的突变EGFR蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽(i)包含T790M突变，(ii)包含表42Ai、42Aii、42B、43和44中任一个的肽的序列，并且(iii)与由表42Ai、42Aii、42B、43和44中任一个的HLA编码的相应蛋白质结合。
在一个方面，本文提供了一种将受试者鉴定为治疗剂的候选者的方法，该方法包括确定该受试者表达由HLA-B57:01等位基因编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列STVQLIMQLM的突变EGFR肽。
在一个方面，本文提供了一种将受试者鉴定为治疗剂的候选者的方法，该方法包括确定该受试者表达由HLA-A26:01等位基因编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列QLIMQLMPF的突变EGFR肽。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本发明的特征。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1示出了用于确定可以诱导CD8+和/或CD4+ T细胞的GATA3表位的示例性工作流程。
图2示出了用于确定表位是否被加工并呈递(上图)以及表位是否被T细胞识别(下图)的实验的示例性工作流程。该工作流程证实了GATA3新抗原被加工并呈递(通过质谱法检测)，并且与HLA多聚体结合的GATA3新抗原可以被Jurkat细胞系中表达的重组T细胞受体(TCR)识别。
图3示出了用于通过质谱法检测GATA3 neoORF表位的工作流程的示例性示意图。对于肽分离，进行批量裂解，并将HLA I类泛抗体(W6/32)用于免疫沉淀。
图4示出了用于CD8+ T细胞的GATA3抗原特异性扩充的工作流程的示例性示意图。
图5示出了实验的总结，其显示可以通过质谱法检测预测的针对HLA-A02(左)、HLA-B07(中)和HLA-B08(右)的GATA3表位。
图6是GATA3 neoORF的图示。阴影区域代表所有患者共有的(共同区)以及某些患者共有的(可变区)GATA3 neoORF序列部分的一部分。
图7A是具有可变区序列(SEQ ID NO:3)和共同区序列(SEQ ID NO:4)的GATA3neoORF序列(SEQ ID NO:2)的图示。
图7B描绘了示意图，其显示具有neoORF序列(SEQ ID NO:2)的GATA3序列(SEQ IDNO:1)，并且通过质谱法观察到3个预测的HLA-02:01表位、2个预测的HLA-B07:02表位和1个预测的HLA-B08:01表位。该数据表明，所述表位是可靶向的。
图7C是跨越整个GATA3 neoORF区域的重叠肽(OLP)的肽设计方案实例的图示。
图7D是GATA3 neo ORF的可变区的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图7E是GATA3 neo ORF的共同区的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图8是描绘治疗性I类GATA3 neoORF表位的数目与包含这些表位的患者的百分比的图示。大多数患者将具有4-5个表位。
图9A描绘了示例结果，其显示了使用来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图9B描绘了示例结果，其显示了使用来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图9C描绘了示例结果，其显示了使用来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图10A描绘了示例结果，其显示了使用来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图10B描绘了示例结果，其显示了使用来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图11描绘了对于用负载有或不具有GATA3 neoORF肽的APC刺激的健康HLA-A02:01供体的CD4+细胞，IFNγ和TNFα水平的抗原特异性诱导的FACS分析。
图12A显示，在具有5mM或0.25mM琥珀酸盐、无DMSO、5％右旋糖水溶液(5DW)和无聚ICLC的药物组合物中，所示肽在所示肽浓度下是可溶的。
图12B显示，在具有5mM或0.25mM琥珀酸盐、无DMSO、5％右旋糖水溶液(5DW)和具有聚ICLC的药物组合物中，所示肽在所示肽浓度下是可溶的。
图12C显示，在具有5mM或0.25mM琥珀酸盐、无DMSO、5％右旋糖水溶液(5DW)和以所示肽:聚ICLC比具有聚ICLC的药物组合物中，所示肽在所示肽浓度下是可溶的。
图13显示了GATA3移码突变的共同区的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图14显示了MSK-IMPACT乳腺癌数据集中的患者的Kaplan-Meier存活曲线。
图15显示了每名患者所呈现的表位的模拟计数。
图16显示了GATA3野生型和突变核苷酸序列的比对。
图17显示了GATA3野生型和突变氨基酸序列的比对。
图18显示了GATA3突变编码的质粒图。
图19显示了GATA3突变基因的多重比对和GATA3突变质粒构建体的DNA测序数据。
图20显示了用AflII对GATA3突变质粒的限制酶消化。
图21显示了经GATA3转导的HEK 293T细胞的MHC I类和MHC II类表达。
图22A-22D显示了经HLA-A02.01、HLA-B07.02和HLA-B08.01转染的GATA3 HEK293T细胞的HLA-A02和MHC-ABC表达概况。
图22A显示了未转染的GATA3 HEK293T细胞。
图22B显示了经HLA-A02.01转染的GATA3 HEK293T细胞。
图22C显示了经HLA-B07.02转染的GATA3 HEK293T细胞。
图22D显示了经HLA-B08.01转染的GATA3 HEK293T细胞。
图23显示了从在HEK293T细胞中稳定表达的GATA3 neoORF的共同区衍生的预测的肽表位的检测。浅灰色和黑色序列分别表示GATA3 neoORF的可变区和共同区。
图24A显示了内源加工的肽表位SMLTGPPARV(下图)及其相应的合成肽(上图)的MS/MS谱。
图24B显示了MS/MS谱匹配的从头到脚(head-to-toe)图。
图25A显示了内源加工的肽表位MLTGPPARV(下图)及其相应的合成肽(上图)的MS/MS谱。
图25B显示了光谱匹配的从头到脚图。
图26A显示了内源加工的肽表位MLKPKRDGYMF(下图)及其相应的合成肽(上图)的MS/MS谱。
图26B显示了光谱匹配的从头到脚图。
图27A显示了内源加工的肽表位KPKRDGYMFL(下图)及其相应的合成肽(上图)的MS/MS谱。
图27B显示了光谱匹配的从头到脚图。
图28A显示了内源加工的肽表位ESKImFATL(下图)及其相应的合成肽(上图)的MS/MS谱。
图28B显示了光谱匹配的从头到脚图。
图29A显示了用GATA3 neoORF特异性肽(FLT-mDC GATA3Stim2多聚体)对CD8+应答的代表性诱导。
图29B显示了阴性对照，其在PBMC和树突细胞中没有CD8+应答的诱导。
图30A显示了不使用肽对抗原特异性CD4 T细胞的诱导。
图30B显示了用GATA3 neoORF特异性肽对抗原特异性CD4 T细胞的诱导。
图31A-31D通过多聚体染色显示了GATA3特异性CD8+ T细胞。
图31A显示了对于健康供体HD47，在长期刺激后，以1.16％阳性的平均值观察到GATA3特异性CD8+ T细胞。
图31B显示了对于健康供体HD50，在长期刺激后，以1.29％阳性的平均值观察到GATA3特异性CD8+ T细胞。
图31C显示了对于健康供体HD51，在长期刺激后，以1.9％阳性的平均值观察到GATA3特异性CD8+ T细胞。
图31D显示了在与图31C不同的肽浓度下，对于健康供体HD51，在长期刺激后，以4.5％阳性的平均值观察到GATA3特异性CD8+ T细胞。
图32显示了活靶细胞的胱天蛋白酶-3阳性分数的比较。将4种不同的GATA3诱导的健康供体PBMC 1至4与GATA3突变转导的HEK293T细胞(GATA3Trd)或未转导的HEK 293T细胞(NoTRd293T)共培养为阴性对照组。
图33显示了GATA3转导的HEK293T细胞与未转导的HEK293T细胞之间的显著差异。
图34显示了与GATA3转导的HEK293T细胞或未转导的HEK293T细胞共培养的CD8+ T细胞的CD107a表达差异。
图35显示了在GATA3转导的HEK293T细胞和未转导的HEK293T细胞与GATA3诱导的T细胞之间，在共培养条件下的IFN-γ浓度差异。
图36显示了GATA3特异性TCR克隆的概述。细节在实施例26中描述。
图37显示了用于产生GATA3特异性TCR转导的Jurkat和PBMC的示例性方法。细节在实施例26中描述。
图38显示了使用TCR转导的Jurkat的功能测定的概述。
图39显示了通过用于分选的多聚体染色，GATA3特异性CD8+T细胞。
图40显示了用于慢病毒的GATA3特异性TCR构建体。
图41A显示了GATA3 TCRα序列和野生型DNA序列的多重比对。
图41B显示了GATA3 TCRβ序列和野生型DNA序列的多重比对。
图42显示了用AflII对GATA3 TCR质粒的限制酶消化。
图43显示了用GATA3多聚体PE和GATA3多聚体BV650染色的GATA3特异性TCR转导的Jurkat。
图44显示了GATA3特异性TCR肽滴定测定。
图45显示了GATA3特异性TCR转导的Jurkat细胞和GATA3突变转导的靶细胞的IL-2释放测定。
图46显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由14个氨基酸组成，序列为ESKIMFATLQRSSL。该肽的分子式为C70H119N19O22S，分子量为1610.89g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图47显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由16个氨基酸组成，序列为KPKRDGYMFLKAESKI。该肽的分子式为C87H143N23O23S，分子量为1911.30g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图48显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由18个氨基酸组成，序列为SMLTGPPARVPAVPFDLH。该肽的分子式为C87H137N23O23S，分子量为1905.25g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图49显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由21个氨基酸组成，序列为EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH。该肽的分子式为C100H156N26O28S2，分子量为2234.62g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图50显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由25个氨基酸组成，序列为LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI。该肽的分子式为C134H217N37O34S3，分子量为2986.62g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图51显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由26个氨基酸组成，序列为GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD。该肽的分子式为C131H209N39O33S2，分子量为2922.47g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图52显示了示例性GATA3 neo ORF肽的立体化学。该肽由33个氨基酸组成，序列为
KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH。该肽的分子式为C173H274N48O46S4，分子量为3890.63g/mol。该肽为三氟乙酸(TFA)盐形式。
图53显示了使用来自人类供体的PBMC样品，BTK抗原肽特异性CD8+ T细胞应答。
图54显示了使用来自人类供体的PBMC样品，EGFR抗原肽特异性CD8+ T细胞应答。
具体实施方式
GATA3是在乳腺癌中高度表达的基因，并且是这些癌症中最频繁突变的基因之一。该基因中最常见的突变类别是在编码氨基酸393和445的核苷酸(自然终止密码子)之间的插入或缺失。当这些将开放阅读框移动到+1框时，它们导致延伸的新阅读框(“neoORF”)，其导致在正常情况下在健康细胞中不表达的至少61个和多达113个氨基酸。所有患者(保守区)之间共有61个氨基酸，而每名患者将有0-52个另外的氨基酸(可变区)。因此，从该neoORF加工并呈递的表位是在某些或所有携带该相同类别突变的患者之间共有的新抗原。GATA3 neoORF似乎是乳腺癌的不良预后因素。GATA3野生型是高度表达的基因，而GATA3neoORF保留了高表达。GATA3 neoORF被翻译，并与乳腺癌风险增加相关。
在一些实施方案中，覆盖整个neoORF的重叠的长肽(OLP)可以用于治疗癌症。在一些方面，本文所述的OLP已被设计成在肽的末端包括表位，这简化了加工和呈递的过程(因为仅需要一个切割事件)。在一些方面，可以将短肽(例如9-11个氨基酸)施用于受试者，以治疗与MHC I类蛋白质结合的癌症。本文所述的方法可用来靶向许多新抗原，而无需根据患者的HLA组成对其进行选择。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包含可增加免疫原性的修饰(例如脂化)。在一些实施方案中，提供了编码由整个GATA3 neoORF编码的多肽(例如，多体(polybodies))的多核苷酸。在一些实施方案中，基于细胞的疗法，如表达靶向特定表位的TCR的工程化T细胞，可以用来治疗患有癌症的受试者。
本文公开了覆盖GATA3蛋白的共同区的合成长肽(SLP)。这些肽在本文所述的制剂中是可溶的，并且对于皮下注射与聚ICLC相容。这些肽中的一种或多种的高纯度和合成产率可通过在固相肽合成(SPPS)过程中采用伪脯氨酸结构单元来实现。还已经开发了这些肽中的每一种的纯化条件。
本文描述了新免疫治疗剂及其用途，这是基于由对个体肿瘤独特的突变事件引起的新抗原的发现。因此，本文描述的公开内容提供了肽、编码该肽的多核苷酸以及肽结合剂，其可以用于例如刺激对肿瘤相关抗原或新表位的免疫应答，以产生用于治疗疾病的免疫原性组合物或癌症疫苗。
以下描述和实施例详细阐明了本公开的实施方案。应当理解，本公开不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。
所有术语均应按照它们将被本领域技术人员所理解的那样来理解。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文所用的章节标题仅用于组织编排的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
尽管本公开的各个特征可以在单个实施方案的语境中描述，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的语境中描述本公开，但是本公开也可以在单个实施方案中实现。
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非旨在限制。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数形式的使用包括复数形式。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用的术语“和/或”和“其任意组合”及其语法等同语可互换使用。这些术语可表达，具体涉及任何组合。仅为了说明目的，下列短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任意组合”可指“单独A；单独B；单独C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以合取性使用或析取性使用，除非上下文具体指出为析取性使用。
术语“约”或“大约”可意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可指给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可指在数值的数量级内，在5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应推定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其他未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。
本说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特性包含在本公开的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。
“主要组织相容性复合物”或“MHC”是在控制导致生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人类中，MHC复合物也被称为人白细胞抗原(HLA)复合物。关于MHC和HLA复合物的详细描述，参见Paul,Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993)。“主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白”或“HLA蛋白”应被理解为意指这样的蛋白质，其能够结合由蛋白质抗原的蛋白质水解裂解所产生的肽并且代表潜在的淋巴细胞表位(例如，T细胞表位和B细胞表位)，从而将其转运到细胞表面并在那里将其呈递给特定细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞。基因组中的主要组织相容性复合物包含遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源性和/或外源性抗原至关重要，并且因此用于调节免疫过程。主要组织相容性复合物被分为编码不同蛋白质的两个基因分组，即MHC I类分子和MHC II类分子。这两种MHC类别的细胞生物学和表达模式适应于这些不同的作用。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见，例如，Stites等人,Immunology,第8版.,Lange Publishing,Los Altos,Calif.(1994))。
如本文所用的“多肽”、“肽”及其语法等同语是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基(一般为L-氨基酸)的聚合物。多肽和肽包括但不限于“突变肽”、“新抗原肽”和“新抗原性肽”。多肽或肽可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其他修饰的蛋白质。本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。
肽或多肽可包含至少一个侧翼序列。如本文所用的术语“侧翼序列”是指不是表位的一部分的肽的片段或区域。
“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“肽表位”是包含等位基因特异性基序的肽，这使得该肽将结合HLA分子并且诱导细胞介导的应答或体液应答，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL(例如CD8+))、辅助性T淋巴细胞(Th(例如CD4+))和/或B淋巴细胞应答。因此，本文所述的免疫原性肽能够与适当的HLA分子结合，之后诱导针对肽的CTL(细胞毒性)应答或HTL(和体液)应答。
“新抗原”是指由蛋白质的肿瘤特异性改变产生的一类肿瘤抗原。新抗原包括但不限于由例如蛋白质序列的置换、移码突变、融合多肽、框内缺失、插入、内源性逆转录病毒多肽的表达以及多肽的肿瘤特异性过表达产生的肿瘤抗原。
术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入肽或蛋白质中的氨基酸残基或氨基酸模拟残基，或编码该氨基酸或氨基酸模拟物的核酸(DNA或RNA)。
“新表位”、“肿瘤特异性新表位”或“肿瘤抗原”是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位或抗原决定簇区域。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。如本文所用的术语“新表位”是指在肽或新抗原性肽内的抗原决定簇区域。新表位可包含至少一个“锚定残基”和至少一个“锚定残基侧翼区”。新表位可以进一步包含“分隔区”。术语“锚定残基”是指与HLA上的特定口袋结合，从而导致与HLA相互作用的特异性的氨基酸残基。在一些情况下，锚定残基可位于规范锚定位置。在其他情况下，锚定残基可位于非规范锚定位置。新表位可以通过突出到肽结合沟中的口袋中的一级和二级锚定残基与HLA分子结合。在肽结合沟中，特定氨基酸组成了容纳所呈递的新表位的锚定残基的相应侧链的口袋。在HLA I和HLA II分子两者的不同等位基因之间存在肽结合偏好。HLA I类分子结合短的新表位，后者的N和C末端锚定在位于新表位结合沟末端的口袋中。虽然大多数HLA I类结合新表位约为9个氨基酸，但更长的新表位可通过其中心部分的凸起来容纳，从而产生约8至12个氨基酸的结合新表位。与HLA II类蛋白质结合的新表位在大小上不受限制，可以在约16至25个氨基酸之间变化。HLA II类分子中的新表位结合沟在两端均打开，从而允许长度相对较长的肽的结合。虽然长度为9个氨基酸残基的核心区段对新表位的识别贡献最大，但锚定残基侧翼区对于肽对HLA II类等位基因的特异性也很重要。在一些情况下，锚定残基侧翼区是N末端残基。在另一种情况下，锚定残基侧翼区是C末端残基。在又一种情况下，锚定残基侧翼区是N末端残基和C末端残基两者。在一些情况下，锚定残基侧翼区的侧翼为至少两个锚定残基。侧翼为锚定残基的锚定残基侧翼区是“分隔区”。
“参考”可以用来将本公开的方法中获得的结果与肿瘤标本相关联并且进行比较。通常，“参考”可以基于一个或多个正常标本获得，特别是不受癌症疾病影响的标本，其获自患者或一个或多个不同的个体，例如健康个体，特别是同一物种的个体。“参考”可以通过检测足够大量的正常标本来凭经验确定。
“表位”是分子的特征集合，诸如一起形成被例如免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体识别的位点的一级、二级和三级肽结构和电荷。或者，表位可以被定义为参与被特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基，或者在T细胞的情况下，对于被T细胞受体蛋白、嵌合抗原受体和/或主要组织相容性复合物(MHC)受体识别所必需的那些残基。“T细胞表位”应被理解为意指肽序列，其可以以呈递肽的MHC分子或MHC复合物的形式被MHC I类或II类分子结合，然后以这种形式被T细胞如T淋巴细胞或T辅助细胞识别并结合。表位可以通过从天然来源分离来制备，或者它们可以根据本领域的标准方案进行合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然存在的氨基酸残基。在整个公开内容中，表位在一些情况下可以被称为肽或肽表位。应当理解，包含本文所述的表位或类似物以及另外的氨基酸的蛋白质或肽仍在本公开的范围内。在某些实施方案中，该肽包含抗原的片段。在某些实施方案中，对本公开的肽的长度具有限制。当包含本文所述表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续的一系列氨基酸残基)时，发生长度受限的实施方案。为了避免表位的定义例如在整个天然分子上读取，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度具有限制。因此，对于包含本文所述表位及与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：少于或等于600个氨基酸残基、少于或等于500个氨基酸残基、少于或等于400个氨基酸残基、少于或等于250个氨基酸残基、少于或等于100个氨基酸残基、少于或等于85个氨基酸残基、少于或等于75个氨基酸残基、少于或等于65个氨基酸残基以及少于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”被包含在具有以低至5个氨基酸残基的任一增量少于51个氨基酸残基的区域的肽中，该区域与天然肽序列具有100％的同一性；具有例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
用于描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践，其中氨基基团呈现于每个氨基酸残基的左侧(氨基端或N末端)且羧基基团呈现于右侧(羧基端或C末端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，在氨基至羧基方向上对氨基酸残基进行编号，其中1位是位于表位或该表位可能是其一部分的肽或蛋白质的氨基末端的残基。在代表本公开所选择的具体实施方案的通式中，除非另有说明，否则氨基端和羧基端基团(尽管没有具体显示)是它们在生理pH值下呈现的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三字母或单字母命名表示。氨基酸残基的L-形式由大写单字母或首字母大写的三字母符号表示，而具有D-形式的那些氨基酸残基的D-形式由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用没有大写字母的三字母符号或全名时，它们也可以指L氨基酸残基。甘氨酸没有不对称碳原子，并简称为“Gly”或“G”。本文所述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号表示。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸)。
术语“突变”是指与参考相比核酸序列的变化或差异(核苷酸置换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在除生殖细胞(精子和卵子)之外的身体的任何细胞中，因此不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。在一些实施方案中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中的氨基酸改变如氨基酸置换的突变，例如，核苷酸置换。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。
“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。鉴定不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。
如本文所用的，术语“亲和力”是指结合对的两个成员(例如，HLA结合肽和I类或II类HLA)之间的结合强度的量度。KD是解离常数并且具有摩尔浓度的单位。亲和常数是解离常数的倒数。亲和常数有时用作描述该化学实体的通用术语。它是结合能量的直接量度。亲和力可以通过实验确定，例如使用市售Biacore SPR单元通过表面等离子体共振(SPR)确定。亲和力也可以被表示为抑制浓度50(IC50)，即50％的肽被替代时的浓度。同样，ln(IC50)是指IC50的自然对数。Koff是指解离速率常数，例如，关于HLA结合肽和I类或II类HLA的解离。在整个公开内容中，“结合数据”结果可以用“IC50”表示。IC50是结合测定中观察到标记的参考肽结合的50％抑制时测试肽的浓度。考虑到运行测定的条件(即，限制HLA蛋白和标记的参考肽浓度)，这些值接近KD值。用于确定结合的测定是本领域公知的，并且详细描述于例如PCT公开WO 94/20127和WO 94/03205以及其他出版物如Sidney等人,Current Protocolsin Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人,J.Immunol.154:247(1995)；和Sette等人,Mol.Immunol.31:813(1994)中。或者，结合可以相对于参考标准肽的结合来表示。例如，可以基于其相对于参考标准肽的IC50的IC50。结合也可以使用其他测定系统来确定，包括使用以下系统的测定系统：活细胞(例如，Ceppellini等人,Nature 339:392(1989)；Christnick等人,Nature 352:67(1991)；Busch等人,Int.Immunol.2:443(1990)；Hill等人,J.Immunol.147:189(1991)；del Guercio等人,J.Immunol.154:685(1995))、使用去污剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等人,J.Immunol.21:2069(1991))、固定化纯化的MHC(例如，Hill等人,J.Immunol.152,2890(1994)；Marshall等人,J.Immunol.152:4946(1994))、ELISA系统(例如，Reay等人,EMBO J.11:2829(1992))、表面等离子体共振(例如，Khilko等人,J.Biol.Chem.268:15425(1993))；高通量可溶相测定(Hammer等人,J.Exp.Med.180:2353(1994))以及I类MHC稳定化或组装的测量(例如，Ljunggren等人,Nature 346:476(1990)；Schumacher等人,Cell 62:563(1990)；Townsend等人,Cell 62:285(1990)；Parker等人,J.Immunol.149:1896(1992))。“交叉反应性结合”指示肽被多于一个HLA分子结合；同义词是简并结合。
当用来讨论表位时，术语“衍生的”及其语法等同语是“制备的”及其语法等同语的同义词。衍生的表位可以从天然来源分离或者可以根据本领域的标准方案合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然氨基酸残基。衍生的或制备的表位可以是天然表位的类似物。
“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。这样的序列本质上可以包含更长的序列。
“受体”应被理解为是指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用来在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可以由蛋白质分子组成。受体具有与配体的结构互补的结构，并且可以作为结合配偶体与配体复合。具体通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递信息。在一些实施方案中，受体应被理解为尤其是指能够与配体(特别是合适长度的肽或肽片段)形成受体/配体复合物的MHC I类和II类的蛋白质。
“配体”应被理解为意指具有与受体的结构互补的结构并且能够与该受体形成复合物的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，以使得肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合物。
在一些实施方案中，“受体/配体复合物”还应被理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，其包括呈递肽或肽片段的MHC I类或II类分子。
“合成肽”是指从非天然来源中获得的肽，例如是人造的。可以使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法产生这类肽。“合成肽”包括“融合蛋白”。
术语“基序”是指所限定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，长度小于约15个氨基酸残基或长度小于约13个氨基酸残基的肽，例如，对于I类HLA基序，具有约8至约13个(例如，8、9、10、11、12或13个)氨基酸残基，而对于II类HLA基序，具有约6至约25个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个)氨基酸残基，其被特定的HLA分子所识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序的一级和二级锚定残基的模式不同。在一些实施方案中，MHC I类基序标识长度为9、10或11个氨基酸残基的肽。
如本文所用的，术语“天然存在的”及其语法等同语是指对象可以在自然界中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界的来源中分离并且在实验室中没有被人工有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
根据本公开，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答(例如细胞或体液免疫应答)的药物制品(药物组合物)或产品，其识别并攻击病原体或病变细胞，如癌细胞。疫苗可以用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个性化癌症疫苗”涉及特定癌症患者，并且意指癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
“抗原加工”或“加工”及其语法等同语是指将多肽或抗原降解成加工产物(该加工产物是所述多肽或抗原的片段(例如，多肽降解成肽))以及将这些片段中的一个或多个(例如，经由结合)与MHC分子缔合以供由细胞(例如，抗原呈递细胞)呈递给特定T细胞。
“抗原呈递细胞”(APC)是在其细胞表面上呈递与MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞。专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用非常有效地内化抗原，随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与其相互作用。随后由抗原呈递细胞产生其他共刺激信号，从而导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的定义性特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞，还有巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。树突细胞(DC)是经由MHC II类和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群体。众所周知，树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可以用作区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，这种命名法不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟的树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fc受体(FcR)和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是这些标志物的较低表达以及负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)以及共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表达。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”及其语法等同语或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置，通常约50至约200、更通常约100至约150个连续位置的区段，其中可在两个序列经过最佳比对后将一个序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方法进行：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(包括但不限于Intelligentics,MountainView Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.)；CLUSTAL程序在以下文献中充分描述：Higgins和Sharp,Gene,73:237-244(1988)以及Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Corpet等人,NucleicAcids Res.,16:10881-10890(1988)；Huang等人,Computer Applications in theBiosciences,8:155-165(1992)；及Pearson等人,Methods in Molecular Biology,24:307-331(1994)。比对通常还通过检查和手动比对来进行。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL。或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳比对时，根据两个分子最佳比对的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。
应用于核酸或氨基酸序列的术语“基本上相同的”及其语法等同语是指使用标准程序，与使用上述程序(例如BLAST)的参考序列相比，核酸或氨基酸序列包含具有至少90％或更高、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性的序列。例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性百分比，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括添加或缺失(即空位)。通过以下方法来计算百分比：确定在两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将所得结果乘以100以得到序列同一性百分比。在实施方案中，在长度至少约50个残基的序列的区域上，在至少约100个残基的区域上存在基本同一性，并且在实施方案中，序列在至少约150个残基上基本相同。在实施方案中，序列在编码区的整个长度上基本相同。
如本文所用的术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，以及包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是未在自然界中发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化至其不再是在自然界中发现的形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。在一些实施方案中，“分离的多核苷酸”涵盖包含在PCR或定量PCR反应中扩增的多核苷酸的PCR或定量PCR反应。
术语“分离的”、“生物学纯的”或其语法等同语是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下被发现时通常伴随该材料的组分。因此，本文所述的分离的肽不含有在其原位环境中通常与该肽关联的一些或全部物质。“分离的”表位是指不包括衍生出该表位的抗原的全序列的表位。通常，“分离的”表位不会在其上附接有导致序列在天然序列的整个长度上具有100％同一性的其他氨基酸残基。天然序列可以是诸如衍生出表位的肿瘤相关抗原的序列。因此，术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其为天然存在的，则为天然环境)中移出。“分离的”核酸是从其天然环境中移取的核酸。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离的RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括以合成方式产生的这类分子。
如本文所用的术语“基本上纯化的”及其语法等同语是指这样的核酸序列、多肽、蛋白质或其他化合物，其基本上不含，即超过约50％不含、超过约70％不含、超过约90％不含与该核酸、多肽、蛋白质或其他化合物天然关联的多核苷酸、蛋白质、多肽和其他分子。
如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”|“多核酸”或“寡核苷酸”及其语法等同语在本文中可互换使用，并且指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA，例如，mRNA。因此，这些术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。可以通过例如转染、转化或转导将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，使用本公开的方法施用的多核苷酸是mRNA。
如本文所用的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著),Methods in Molecular Biology,Vol.7,GeneTransfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。
当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是“同源的”。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。用于确定序列同一性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)在本文中描述并且通常是可获得的。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，在提到人类受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症有效的治疗剂的量。治疗有效量的药物具有治疗效果，因此可以预防疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的进展；在一定程度上缓解与疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗”或“缓解”是指：(1)治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或病症的症状，和/或中止该病理状况或病症的进展的治疗措施；和(2)预防或减缓目标病理状况或病症的发展的预防性或防范性措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者；易于患该病症的受试者；以及要预防该病症的受试者。
“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理学相容的组合物或组合物组分。
“药用赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。“药用赋形剂”为药学上可接受的赋形剂。
新抗原及其用途
开发治愈性且肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是鉴定和选择用以避免自身免疫的高度特异性且受限制的肿瘤抗原。由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原。由于鉴定新抗原、选择优化的抗原和产生用于疫苗或免疫原性组合物的新抗原的技术困难，新抗原很少用于癌症疫苗或免疫原性组合物。这些问题可以通过以下方法解决：鉴定肿瘤中以DNA水平存在但不存于来自高比例癌症受试者的匹配种系样品中的瘤形成/肿瘤中的突变；用一种或多种肽-MHC结合预测算法分析所鉴定的突变，以生成在瘤形成/肿瘤内表达以及与高比例的患者HLA等位基因结合的多种新抗原T细胞表位；以及合成多种选自所有新抗原肽和预测的结合肽的组的新抗原肽，以用于适用于治疗高比例的癌症受试者的癌症疫苗或免疫原性组合物。
例如，将肽测序信息翻译成治疗性疫苗可以包括预测可以结合高比例个体的HLA分子的突变肽。有效地选择使用哪些特定突变作为免疫原需要具有预测哪些突变肽将有效地结合高比例的患者的HLA等位基因的能力。最近，采用经验证的结合和非结合肽的基于神经网络的学习方法提高了主要HLA-A和HLA-B等位基因的预测算法的准确性。然而，即使使用先进的基于神经网络的算法来编码HLA-肽结合规则，若干因素仍然限制了预测HLA等位基因上呈现的肽的能力。
将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的另一个实例可包括将药物配制为长肽的多表位疫苗。靶向实际上尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，通过下调免疫靶向基因产物来防止免疫逃逸的机会，并补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供了有效制备多种免疫原以及快速地将突变表位的鉴定转化为有效的疫苗的有用方法。肽可轻松化学合成且易于使用不含污染细菌或动物物质的试剂进行纯化。小尺寸允许清楚地聚焦蛋白质的突变区域并且还减少了与其他组分(未突变的蛋白质或病毒载体抗原)的不相关的抗原竞争。
将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的又一个实例可包括与强疫苗佐剂的组合。有效的疫苗可能需要强佐剂来引发免疫应答。例如，聚-ICLC——TLR3以及MDA5和RIG3的RNA解旋酶结构域的激动剂，已显示出疫苗佐剂的几种理想的性质。这些性质包括诱导体内免疫细胞的局部和全身活化、产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过DC刺激抗原呈递。此外，聚-ICLC可以在人体中诱导持久的CD4+和CD8+应答。重要的是，在接种聚-ICLC的受试者和接受过高效、具有复制能力的黄热病疫苗的志愿者中观察到转录和信号转导途径上调的惊人相似性。此外，在最近的1期研究中，>90％的(除Montanide外还)使用聚-ICLC联合NYESO-1肽疫苗免疫的卵巢癌患者显示出CD4+和CD8+ T细胞的诱导以及对肽的抗体应答。同时，聚-ICLC迄今已在超过25项临床试验中进行了广泛测试，并表现出相对良好的毒性概况。
在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，编码第一肽和第二肽的多核苷酸，包含第一肽和第二肽的一种或多种APC，或与HLA蛋白复合的对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)和与HLA蛋白复合的对第二新表位具有特异性的第二TCR；其中第一肽不同于第二肽，并且其中第一新表位包含突变而第二新表位包含相同突变。
在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含蛋白质的区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的区域的第二新表位的第二肽，其中第一新表位和第二新表位包含相同的区域的至少一个氨基酸，编码第一肽和第二肽的多核苷酸，包含第一肽和第二肽的一种或多种APC，或与HLA蛋白复合的对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)和与HLA蛋白复合的对第二新表位具有特异性的第二TCR；其中第一肽不同于第二肽，并且其中第一新表位包含突变而第二新表位包含第二突变。
在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，第一肽和第二肽是不同的分子。在一些实施方案中，第一新表位包含相同蛋白质的区域的第一新表位，其中第二新表位包含相同蛋白质的区域的第二新表位。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位包含相同区域的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的区域包含该蛋白质的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000个连续氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的区域包含该蛋白质的至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000个连续氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位是从第一肽加工的第一新表位肽，并且/或者第二新表位是从第二肽加工的第二新表位肽。在一些实施方案中，第一新表位在长度上短于第一肽，并且/或者第二新表位在长度上短于第二肽。在一些实施方案中，第一新表位肽由包含第一肽的抗原呈递细胞(APC)加工，并且/或者第二新表位肽由包含第二肽的APC加工。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与包含第一或第二肽的II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与包含第一或第二肽的I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与包含第一或第二肽的I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与包含第一或第二肽的II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，所述一种或多种APC包括包含第一肽的第一APC和包含第二肽的第二APC。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位包含由表1或表2的基因编码的序列。在一些实施方案中，所述蛋白质由表1或表2的基因编码。在一些实施方案中，所述突变是表1或表2的第2列的突变。在一些实施方案中，所述蛋白质是GATA3。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位包含由表34或表36的基因编码的序列。在一些实施方案中，所述蛋白质由表34或表36的基因编码。在一些实施方案中，所述突变是表34或表36的第2列的突变。在一些实施方案中，所述蛋白质是BTK。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位包含由表40A-40D的基因编码的序列。在一些实施方案中，所述蛋白质由表3或表35的基因编码。在一些实施方案中，所述突变是表3或表35的第2列的突变。在一些实施方案中，所述蛋白质是EGFR。在一些实施方案中，单个多肽包含第一肽和第二肽，或者单个多核苷酸编码第一肽和第二肽。在一些实施方案中，第一肽和第二肽由从相同转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，第一肽由从第一转录起始位点转录的序列编码，而第二肽由从第二转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，单个肽的长度为至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的第一野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一序列；和与相应的第二野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的第一野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少8或9个连续氨基酸的第一序列；和与相应的第二野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少16或17个连续氨基酸的第二序列。在一些实施方案中，第二肽长于第一肽。在一些实施方案中，第一肽长于第二肽。在一些实施方案中，第一肽的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第二肽的长度为至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少9个连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少17个连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二新表位长于第一新表位。在一些实施方案中，第一新表位的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位的长度为8至12个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位的长度为至少16个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位的长度为16至25个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。
在一些实施方案中，第一肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，第二肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，第一肽、第二肽或两者包含至少一个侧翼序列，其中所述至少一个侧翼序列在新表位的上游或下游。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列包含非野生型序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是N末端侧翼序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是C末端侧翼序列。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼序列与第二肽的至少一个侧翼序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼区域不同于第二肽的至少一个侧翼区域。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼残基包含突变。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置处。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在非规范锚定位置处。在一些实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置处。在一些实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在非规范锚定位置处。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基不同于第二新表位的至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是野生型残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是置换。在一些实施方案中，第一新表位和/或第二新表位与没有该置换的相应新表位相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一新表位和/或第二新表位与没有该置换的相应野生型序列相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，至少一个锚定残基不包含该突变。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基侧翼区。在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基包括至少两个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少两个锚定残基被包含至少1个氨基酸的分隔区隔开。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区不在该分隔区内。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区在所述至少两个锚定残基的N末端锚定残基的上游，在所述至少两个锚定残基的C末端锚定残基的下游，(a)和(b)兼具。
在一些实施方案中，组合物包含佐剂。在一些实施方案中，该组合物包含一种或多种另外的肽，其中所述一种或多种另外的肽包含第三新表位。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与相应野生型序列相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA I类蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA II类蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与由受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，在受试者的非癌细胞中不存在所述突变。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位由受试者的癌细胞的基因或表达基因编码。在一些实施方案中，所述组合物包含含有第一TCR的第一T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含含有第二TCR的第二T细胞。在一些实施方案中，第一TCR包含非天然胞内域，并且/或者第二TCR包含非天然胞内域。在一些实施方案中，第一TCR是可溶性TCR，并且/或者第二TCR是可溶性TCR。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，第一T细胞是用第一新表位刺激、扩充或诱导的T细胞，并且/或者第二T细胞是用第二新表位刺激、扩充或诱导的T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是工程化T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二T细胞是细胞系的T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二TCR以小于1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA-肽复合物结合。在一些方面，本文提供了一种包含编码本文所述的第一和第二肽的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，该多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，该载体是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，该载体是病毒载体。在一些实施方案中，该载体衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或其假型。在一些实施方案中，该载体是非病毒载体。在一些实施方案中，该非病毒载体是纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米聚合物、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽或脂球(liposphere)。
在一些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：本文所述的组合物，或本文所述的载体；和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述多个细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述多个APC细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述多个T细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，该免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方案中，该佐剂是聚ICLC。在一些实施方案中，该佐剂是Hiltonol。
在一些方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些方面，本文提供了一种预防对癌症疗法的抗性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些方面，本文提供了一种诱导免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，该免疫应答是体液应答。在一些实施方案中，第一肽和第二肽同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，在第二肽之后顺序施用第一肽。在一些实施方案中，在第一肽之后顺序施用第二肽。在一些实施方案中，在足以使第二肽激活T细胞的时间段之后顺序施用第一肽。在一些实施方案中，在足以使第一肽激活T细胞的时间段之后顺序施用第二肽。在一些实施方案中，在第二肽之后顺序施用第一肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，在第一肽之后顺序施用第二肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，施用第一肽以刺激T细胞，并且在第一肽之后施用第二肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，施用第二肽以刺激T细胞，并且在第二肽之后施用第一肽以重新刺激T细胞。
在一些实施方案中，所述受试者患有癌症，其中该癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，该癌症是对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌、为MSI乳腺癌、为转移性乳腺癌、为Her2阴性乳腺癌、为Her2阳性乳腺癌、为ER阴性乳腺癌、为ER阳性乳腺癌、为PR阳性乳腺癌、为PR阴性乳腺癌或其任意组合。在一些实施方案中，该乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。在一些实施方案中，该受试者患有对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。在一些实施方案中，该受试者患有对于依鲁替尼疗法具有抗性的CLL。在一些实施方案中，该CLL表达具有突变如C481S突变的布鲁顿酪氨酸激酶。在一些实施方案中，该受试者患有对酪氨酸激酶抑制剂具有抗性的肺癌。在一些实施方案中，该肺癌表达具有突变如T790M突变的表皮生长因子受体(EGFR)。在一些实施方案中，包含第一肽的多个APC细胞和包含第二肽的多个APC细胞同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，包含第一TCR的多个T细胞和包含第二TCR的多个T细胞同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂或抗CD40剂。在一些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。
肽
在一些方面，本公开提供了分离的肽，其包含来自表1或表2的肿瘤特异性突变。在一些方面，本公开提供了分离的肽，其包含来自表34的肿瘤特异性突变。在一些方面，本公开提供了分离的肽，其包含来自表40A-40D的肿瘤特异性突变。这些肽和多肽在本文中被称为“新抗原肽”或“新抗原多肽”。如本文所用的“多肽”、“肽”及其语法等同语是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基(一般为L-氨基酸)的聚合物。多肽和肽包括但不限于“突变肽”、“新抗原肽”和“新抗原性肽”。多肽或肽可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。肽或多肽可包含至少一个侧翼序列。如本文所用的术语“侧翼序列”是指不是表位的一部分的肽的片段或区域。
表1列出了GATA3 neoORF肽
Figure BDA0002944947110000711
Figure BDA0002944947110000721
Figure BDA0002944947110000731
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Figure BDA0002944947110000821
Figure BDA0002944947110000831
以下表2列出了示例性的选定肽
Figure BDA0002944947110000832
Figure BDA0002944947110000841
1带下划线的氨基酸代表非天然氨基酸
表3
Figure BDA0002944947110000842
Figure BDA0002944947110000851
Figure BDA0002944947110000861
Figure BDA0002944947110000871
Figure BDA0002944947110000881
Figure BDA0002944947110000891
Figure BDA0002944947110000901
Figure BDA0002944947110000911
Figure BDA0002944947110000921
Figure BDA0002944947110000931
Figure BDA0002944947110000941
Figure BDA0002944947110000951
Figure BDA0002944947110000961
1带下划线的氨基酸代表非天然氨基酸
2加粗的氨基酸代表由两个融合基因中的第二个编码的氨基酸序列的天然氨基酸
3加粗并带下划线的氨基酸代表由移码引起的两个融合基因中的第二个编码的氨基酸序列的非天然氨基酸。
依鲁替尼——一种靶向布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)并用于CLL和某些淋巴瘤的分子——的一个非常常见的突变是第481位的半胱氨酸至丝氨酸的改变(C481S)。这种改变产生了与一系列HLA分子结合的许多结合肽。该突变在具有以下氨基酸序列的区域携带：IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR，突变的丝氨酸加下划线表示。
表34中列出了对应于C481S突变的示例性新抗原肽。该表还提供了HLA等位基因的列表，其编码的蛋白质产物可以与所述肽结合。在一些实施方案中，本公开提供了用于癌症治疗剂的C481S新表位，如ANGSLLNY；ANGSLLNYL；ANGSLLNYLR；EYMANGSL；EYMANGSLLN；EYMANGSLLNY；GSLLNYLR；GSLLNYLREM；ITEYMANGS；ITEYMANGSL；ITEYMANGSLL；MANGSLLNYL；MANGSLLNYLR；NGSLLNYL；NGSLLNYL；SLLNYLREMR；TEYMANGSLL；TEYMANGSLLNY；YMANGSLL；和YMANGSLLN。表35和表3提供了与其他癌症相关基因突变相对应的示例性新抗原候选物。表36提供了用于本申请目的的选择的HLA限制性BTK肽以及由突变BTK肽所结合或预测结合的HLA等位基因所编码的相应蛋白质的列表。表37提供了如适用于本申请上下文的，选择的BTK肽以及由该肽所结合或预测结合的HLA等位基因所编码的相应优选蛋白质的列表。
以下表34列出了对应于C481S突变的示例性新抗原肽
Figure BDA0002944947110000971
Figure BDA0002944947110000981
表35提供了与其他癌症相关基因突变相对应的示例性新抗原候选物
Figure BDA0002944947110000982
Figure BDA0002944947110000991
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1带下划线的氨基酸代表非天然氨基酸
2加粗的氨基酸代表由两个融合基因中的第二个编码的氨基酸序列的天然氨基酸
3加粗并带下划线的氨基酸代表由移码引起的两个融合基因中的第二个编码的氨基酸序列的非天然氨基酸。
以下表36提供了用于本申请目的的选择的HLA限制性BTK肽以及由突变BTK肽所结合或预测结合的HLA等位基因所编码的相应蛋白质的列表。
表36
Figure BDA0002944947110001261
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表37提供了如适用于本申请上下文的，选择的BTK肽以及由该肽所结合或预测结合的HLA等位基因所编码的相应优选蛋白质的列表。
表37
Figure BDA0002944947110001272
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表40A-40D呈现了在各种类型的癌症中普遍存在的EGFR基因中的示例性突变。该表还提供了示例性的EGFR新抗原肽。表40A-40C中列出了涉及在癌症中普遍存在的单氨基酸置换的突变。表40D中呈现了涉及缺失或缺失和插入的示例性突变。
表40A.癌症中的示例性EGFR点突变以及突变肽
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表40B.癌症中的示例性EGFR点突变以及突变肽
Figure BDA0002944947110001322
表40C.癌症中的示例性EGFR点突变以及突变肽
Figure BDA0002944947110001331
表40D.癌症中的示例性EGFR缺失突变、融合突变
Figure BDA0002944947110001332
在上表中，对于一个或多个示例性融合，在第一个“:”之前的序列属于由第一个基因编码的多肽的外显子序列，在第二个“:”之后的序列属于由第二个基因编码的多肽的外显子序列，而出现在“:”符号之间的氨基酸由在由第一个基因编码的多肽的外显子序列和由第二个基因编码的多肽的外显子序列之间分开的密码子编码。
然而，在一些实施方案中，例如，在NAB:STAT6中，NAB外显子与STAT6的5’UTR连接，并且在连接点后出现的第一个氨基酸是STAT6的正常起始密码子(在该位点不存在框(因为它通常不翻译))。
在一些实施方案中，上表中的AR-V7还可以被认为是AR基因的剪接变体，其编码缺乏在全长AR中发现的配体结合域的蛋白质。
在一些实施方案中，使用测序方法来鉴定肿瘤特异性突变。根据本公开可以使用任何合适的测序方法，例如，下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法可能在未来取代NGS技术以加速该方法的测序步骤。为了阐明的目的：在本公开上下文中的术语“下一代测序”或“NGS”意指所有新型高通量测序技术，与被称为Sanger化学法的“常规”测序方法相比，其通过将整个基因组分成小块，沿整个基因组平行随机读取核酸模板。这类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如1-2周内，例如1-7天内或少于24个小时内，提供全基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可商购获得的或文献中提到的多个NGS平台可以在本公开的背景中使用，例如，在WO 2012/159643中详细描述的那些NGS平台。
在某些实施方案中，本文所述的肽可包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约150、约200、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约4,000、约5,000、约7,500、约10,000个氨基酸或更多个氨基酸残基，以及其中可得出的任何范围。在具体的实施方案中，新抗原肽分子等于或少于100个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽的长度可以是约8至约50个氨基酸残基，或约8至约30、约8至约20、约8至约18、约8至约15或约8至约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是约8至约500个氨基酸残基，或约8至约450、约8至约400、约8至约350、约8至约300、约8至约250、约8至约200、约8至约150、约8至约100、约8至约50或约8至约30个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更少的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更少的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述肽的总长度为至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽的总长度为至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450或至多500个氨基酸。
可以以几种方式设计更长的肽。在一些实施方案中，当HLA结合肽被预测或已知时，较长的肽包含：(1)向每个相应基因产物的N末端及C末端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与每个结合肽的延伸序列的串接。在其他实施方案中，当测序揭示肿瘤中存在长(>10个残基)新表位序列时(例如，由于导致新的肽序列的移码、通读或内含子包含)，较长的肽可由作为单个较长的肽或几个重叠的较长肽的整个新肿瘤特异性氨基酸段组成。在一些实施方案中，推测使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答诱导。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种肽，其中肽重叠并铺在长的新抗原肽上。
在一些实施方案中，所述肽可具有约0.5至约12、约2至约10或约4至约8的pI值。在一些实施方案中，所述肽可具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更高的pI值。在一些实施方案中，所述肽可具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更低的pI值。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以是溶液、冻干的或可以是晶体形式。在一些实施方案中，本文所述的肽可以通过重组DNA技术或化学合成经由合成而制备，或者可以从诸如原始肿瘤或病原生物体的天然来源中分离。新表位可以单独合成或直接或间接地连接在肽中。尽管本文所述的肽可能基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，但在一些实施方案中，该肽可以通过合成进行缀合以与天然片段或颗粒连接。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以用很多种方式制备。在一些实施方案中，可以根据常规技术在溶液中或在固体支持体上合成肽。各种自动合成器可商购获得，并可根据已知方案进行使用。参见，例如，Stewart&Young,olid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,1984。此外，可以使用化学连接将各个肽进行连接，以产生仍然在本公开范围内的较大的肽。
或者，可以使用重组DNA技术，其中将插入表达载体中的编码肽的核苷酸序列转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。这些方法通常是本领域已知的，如在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所概述的。因此，包含一种或多种本文所述的新抗原肽的重组肽可以用于呈递合适的T细胞表位。
在一些实施方案中，所述肽由具有点突变(导致天然肽的氨基酸置换)的基因编码。在一些实施方案中，所述肽由具有点突变(导致移码突变)的基因编码。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。在一些实施方案中，所述肽由具有突变的基因编码，该突变导致融合多肽、符合读框的缺失、插入、内源逆转录病毒多肽的表达以及多肽的肿瘤特异性过表达。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的符合读框的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第一基因的剪接变体的外显子的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第一基因的隐蔽外显子的融合体编码肽。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的融合体编码，其中该肽包含由该融合产生的框外序列编码的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含至少两种或超过两种肽的组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有至少两种不同的肽。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。所述至少两种不同的肽可根据长度、氨基酸序列或两者而不同。所述肽可衍生自已知或已被发现含有肿瘤特异性突变的任何蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。
在一些实施方案中，所述肽可衍生自具有置换突变的蛋白质，该突变例如是KRASG12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突变，或NRAS Q61K或Q61R突变，或BTK C481S突变，或EGFRS492R，或EGFR T490M突变。该置换可位于肽长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N末端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C末端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于距N末端2-5个残基处，或距C末端2-5个残基处。所述肽可类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，其中所述肽包含一个或多个或所有插入的残基。
在一些实施方案中，第一肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，第二肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第二新表位中的突变。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其含有包含第一肽和第二肽的单个多肽，或者编码第一肽和第二肽的单个多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种另外的肽，其中所述一种或多种另外的肽包含第三新表位。在一些实施方案中，第一肽和第二肽由从相同转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，第一肽由从第一转录起始位点转录的序列编码，而第二肽由从第二转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，其中多肽的长度为至少26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少8或9个连续氨基酸的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少16或17个连续氨基酸的第二序列。
在一些实施方案中，第二肽长于第一肽。在一些实施方案中，第一肽长于第二肽。在一些实施方案中，第一肽的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第二肽的长度为至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少9个连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少17个连续氨基酸的序列。
在一些实施方案中，第一肽、第二肽或两者包含至少一个侧翼序列，其中所述至少一个侧翼序列在新表位的上游或下游。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列包含非野生型序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是N末端侧翼序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是C末端侧翼序列。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼序列与第二肽的至少一个侧翼序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼区域不同于第二肽的至少一个侧翼区域。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼残基包含突变。
在一些实施方案中，具有侧翼序列的新抗原肽包含多肽，该多肽可以由式(N-末端Xaa)N-(XaaBTK)P-(Xaa-C末端)C表示，其中(XaaBTK)P为包含突变BTK蛋白的至少8个连续氨基酸的突变BTK肽序列，P为大于7的整数；N为(i)0或(ii)大于2的整数；(N-末端Xaa)N为与突变蛋白质异源的任何氨基酸序列；C为(i)0或(ii)大于2的整数；(Xaa-C末端)C为与突变BTK蛋白异源的任何氨基酸序列；并且N和C均不是0。
在一些实施方案中，具有侧翼序列的新抗原肽包含多肽，该多肽可以由式(N-末端Xaa)N-(XaaEGFR)P-(Xaa-C末端)C表示，其中(XaaEGFR)P为包含突变EGFR蛋白的至少8个连续氨基酸的突变EGFR肽序列，P为大于7的整数；N为(i)0或(ii)大于2的整数；(N-末端Xaa)N为与突变EGFR蛋白异源的任何氨基酸序列；C为(i)0或(ii)大于2的整数；(Xaa-C末端)C为与突变EGFR蛋白异源的任何氨基酸序列；并且N和C均不是0。
在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸；和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。
在一些实施方案中，肽包含表1或表2中所示的新抗原肽序列。在一些实施方案中，肽包含表1或表2中所示的新表位序列。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含表34或表36中所示的新抗原肽序列。在一些实施方案中，肽包含表34或表36中所示的新表位BTK序列。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸，如表34或表36中所示。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少一个粗体氨基酸的新表位序列，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表1或表2中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表1或表2中所示。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表34或表36中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表34或表36中所示。
在一些实施方案中，肽包含表40A-40D、32或3A-3D中所示的新抗原肽序列。在一些实施方案中，肽包含表40A-40D中所示的新表位EGFR序列。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸，如表40A-40D中所示。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸(例如，表40A-40D中的任一个中的带下划线的氨基酸)。在一些实施方案中，EGFR肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个以粗体字母显示的突变氨基酸，如表40D中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸，如表40A-40D中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(例如，表40C中的带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，如表40A-40D中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表40A-40D中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表40A-40D中所示。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1或表2中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。
在一些实施方案中，BTK肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表34或表36中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。
表34中列出了对应于C481S突变的示例性新抗原肽。该表还提供了HLA等位基因的列表，其编码的蛋白质产物可以与所述肽结合。在一些实施方案中，包含C481S突变的肽是：MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND。在一些实施方案中，包含BTK突变的肽包含ANGSLLNY的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含ANGSLLNYL的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含ANGSLLNYLR的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含EYMANGSL的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含EYMANGSLLN的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含EYMANGSLLNY的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含GSLLNYLR的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含GSLLNYLREM的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含ITEYMANGS的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含ITEYMANGSL的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含ITEYMANGSLL的新表位序列。MANGSLLNYL。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含MANGSLLNYLR的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含NGSLLNYL的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含NGSLLNYL的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含SLLNYLREMR的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含TEYMANGSLL、TEYMANGSLLNY的新表位序列。在一些实施方案中，包含C481S BTK突变的肽包含YMANGSLL的新表位序列。
在一些实施方案中，EGFR肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表40A-40D中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。
在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含GICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDY的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含VQLIMQLMPF的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含STVQLIMQLM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的突变EGFR肽包含QLIMQLMPF的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含MQLMPFGCLL的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含LIMQLMPF的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含LTSTVQLIM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含STVQLIMQL的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含TSTVQLIMQL的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含TVQLIMQL的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含TVQLIMQLM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含VQLIMQLM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含CLTSTVQLIM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含IMQLMPFGC的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含IMQLMPFGC的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFRT790M突变的肽包含IMQLMPFGCL的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含LIMQLMPFG的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含LIMQLMPFGC的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的肽包含QLIMQLMPFG的新表位序列。
在一些实施方案中，包含EGFR S492R突变的肽包含SLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIIRNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLL的序列。在一些实施方案中，包含EGFR S492R突变的肽包含IIRNRGENSCK的新表位序列。
在一些实施方案中，EGFR新肽选自表40A-40D。
在一些实施方案中，包含EGFR中的缺失突变，如EGFRvIII中的G缺失(内部缺失)，
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK:G:NYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD的肽包含ALEEKKGNYV的新表位序列。
在一些实施方案中，包含以下序列所示的突变的肽：LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD，包含IQLQDKFEHL的新表位序列。在一些实施方案中，包含以下序列所示的突变的肽：LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD，包含QLQDKFEHL的新表位序列。在一些实施方案中，包含以下序列所示的突变的肽：LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD，包含QLQDKFEHLK的新表位序列。在一些实施方案中，包含以下序列所示的突变的肽：LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD，包含新表位序列
肽的修饰
在一些实施方案中，本公开包括修饰的肽。修饰可以包括不改变抗原肽本身的一级氨基酸序列的共价化学修饰。修饰可以产生具有所需性质(例如，延长体内半衰期、增加稳定性、降低清除率、改变免疫原性或变应原性、能够产生特定抗体、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、HLA亲和力、HLA稳定性或抗原呈递)的肽。在一些实施方案中，肽可包含一个或多个序列，所述序列增强APC对表位的加工和呈递，例如用于产生免疫应答。
在一些实施方案中，可以修饰所述肽以提供所需属性。例如，可以通过与含有至少一个能够诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接来增强肽诱导CTL活性的能力。在一些实施方案中，免疫原性肽/T辅助缀合物通过间隔体分子来连接。在一些实施方案中，间隔体包含在生理条件下基本上不带电荷的相对较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物。间隔体可以选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔体。应当理解，任选存在的间隔体不必包含相同的残基，因此可以是异源寡聚体或同源寡聚体。新抗原肽可以直接或经由肽的氨基或羧基末端的间隔体连接至T辅助肽。新抗原肽或T辅助肽的氨基末端可以被酰化。T辅助肽的实例包括破伤风类毒素残基830-843、流感残基307-319以及疟疾环子孢子残基382-398和残基378-389。
本公开的肽序列可任选地通过DNA水平的改变而改变，特别是通过在预选的碱基处突变编码该肽的DNA，从而生成将转化为所需氨基酸的密码子。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包含置换以改变所得肽的物理性质(例如，稳定性或溶解性)。例如，可以通过用α-氨基丁酸(“B”)置换半胱氨酸(C)来修饰该肽。由于其化学性质，半胱氨酸具有形成二硫键的倾向，并且在结构上充分改变肽以降低结合能力。用α-氨基丁酸置换C不仅可以缓解这个问题，而且在某些情况下实际上改善了结合和交叉结合能力。用α-氨基丁酸置换半胱氨酸可以发生在新抗原肽的任何残基上，例如在肽内表位或类似物的锚定或非锚定位置或肽的其他位置上。
还可以通过延长或减少化合物的氨基酸序列(例如通过氨基酸的添加或缺失)来修饰所述肽。还可以通过改变某些残基的顺序或组成来修饰所述肽或类似物。技术人员将会理解，对于生物活性必需的某些氨基酸残基，例如在关键接触位点的残基或保守残基，通常可在不对生物活性产生不利影响的情况下进行改变。非关键氨基酸不必限于蛋白质中天然存在的那些氨基酸，如L-α-氨基酸，而是也可以包括非天然氨基酸，如D-异构体、β-γ-δ-氨基酸，以及L-α-氨基酸的许多衍生物。
在一些实施方案中，可以使用具有单氨基酸置换的一系列肽来优化所述肽，以确定静电荷、疏水性等对HLA结合的影响。例如，可以沿肽的长度进行一系列带正电荷(例如Lys或Arg)或带负电荷(例如Glu)的氨基酸置换，从而揭示对各种HLA分子和T细胞受体的不同敏感模式。另外，可以采用使用小的相对中性的部分如Ala、Gly、Pro或类似残基的多重置换。该置换可以是同源寡聚体或异源寡聚体。置换或添加的残基的数目和类型取决于必需接触点与所寻求的某些功能属性(例如，疏水性与亲水性)之间必需的间隔。与亲本肽的亲和力相比，通过这样的置换也可以实现对HLA分子或T细胞受体的结合亲和力增加。在任何情况下，这样的置换应该采用选择的氨基酸残基或其他分子片段以避免例如可能破坏结合的空间干扰和电荷干扰。氨基酸置换通常是单残基的。可以将置换、缺失、插入或其任意组合进行组合，以得到最终的肽。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包含氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基，例如D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟-甲基)-苯丙氨酸；D-ρ-氟苯丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸残基。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。具有各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基的修饰肽可具有增加的体内稳定性。这样的肽还可具有改善的保质期或制备性质。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以通过末端-NH2酰化(例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)进行修饰。在一些实施方案中，这些修饰可以提供用于与支持体或其他分子连接的位点。在一些实施方案中，本文所述的肽可包含修饰，诸如但不限于糖基化、侧链氧化、生物素化、磷酸化、添加表面活性物质(例如脂质)，或可以进行化学修饰，例如乙酰化等。此外，肽中的键可以是除了肽键之外的键，例如共价键、酯键或醚键、二硫键、氢键、离子键等。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包括诸如本领域公知的那些载体，例如甲状腺球蛋白、诸如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、诸如聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸的聚氨基酸残基、流感病毒蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白等。
可以进一步修饰所述肽，以使之含有通常不是蛋白质的一部分的其他化学部分。那些衍生化的部分可以改善溶解性、生物半衰期、蛋白质的吸收或结合亲和力。该部分还可以减少或消除肽等的任何不期望的副作用。这些部分的概述可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第20版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。例如，可以在必要时修饰具有所需活性的新抗原肽，以提供某些期望的属性，例如改善的药理学特性，同时增加或至少保留未修饰肽的基本上所有生物活性以结合期望的HLA分子并激活适当的T细胞。例如，该肽可以经受各种改变，如保守或非保守置换，其中这样的改变可以在其使用中提供某些优点，如改善的HLA结合。这样的保守置换可包括将氨基酸残基替换为生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸残基，例如，用一个疏水残基替代另一个疏水残基，或用一个极性残基替代另一个极性残基。还可以使用D-氨基酸探测单氨基酸置换的影响。这样的修饰可以使用公知的肽合成程序进行，如在例如Merrifield,Science 232:341-347(1986),Barany&Merrifield,The Peptides,Gross&Meienhofer编著(N.Y.,AcademicPress),第1至284页(1979)；以及Stewart&Young,Solid Phase Peptide Synthesis,(Rockford,III.,Pierce)第2版(1984)中所描述的。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以缀合至大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素珠；聚氨基酸，如聚谷氨酸、聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子的类毒素；灭活的细菌；和树突细胞。
可以进行的肽的改变包括但不限于与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、聚唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性物质、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。
糖基化可影响蛋白质的物理性质，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也至关重要。适当的糖基化对于生物活性可能是重要的。事实上，来自真核生物的一些基因，当在缺乏对蛋白质进行糖基化的细胞过程的细菌(例如，大肠杆菌)中表达时，回收到由于缺乏糖基化而没有或几乎没有活性的蛋白质。可以通过改变氨基酸序列来实现糖基化位点的添加。肽或蛋白质的改变可以例如通过添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(用于N-连接的糖基化位点)来进行。在每种类型中发现的N-连接和O-连接的寡糖和糖残基的结构可以是不同的。通常在两者上均发现的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，并且由于其负电荷，可赋予糖蛋白酸性。本公开的实施方案包括N-糖基化变体的生成和使用。可以通过化学或酶促方式或通过置换编码糖基化的氨基酸残基的密码子来完成碳水化合物的去除。化学去糖基化技术是已知的，并且可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
用于缀合的其他合适的组分和分子包括，例如，用于靶向淋巴系统的分子，甲状腺球蛋白；诸如人血清白蛋白(HAS)的白蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；诸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)的聚氨基酸；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素，流感病毒核蛋白；匙孔戚血蓝蛋白(KLH)；以及B型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或者前述的任何组合。
另一种类型的修饰是在多肽序列的N末端和/或C末端缀合(例如，连接)一个或多个另外的组分或分子，诸如另一种蛋白质(例如，具有与主题蛋白质异源的氨基酸序列的蛋白质)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以作为与另一种组分或分子的缀合物提供。在一些实施方案中，白蛋白与本公开的肽或蛋白质的融合可以例如通过遗传操作实现，以使得编码HSA的DNA或其片段与编码一种或多种多肽序列的DNA连接。之后，可以用例如合适的质粒形式的融合核苷酸序列转化或转染合适的宿主，以便表达融合多肽。表达可以在体外从例如原核或真核细胞实现，或在体内从例如转基因生物体实现。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白的表达在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行。此外，可以修饰白蛋白本身以延长其循环半衰期。通过上述遗传操作技术或通过化学缀合可以实现修饰的白蛋白与一种或多种多肽的融合；得到的融合分子具有超过未修饰白蛋白的融合体的半衰期(参见，例如，WO2011/051489)。已经开发了几种白蛋白结合策略作为直接融合的替代，包括通过缀合的脂肪酸链结合白蛋白(酰化)。由于血清白蛋白是脂肪酸的转运蛋白，这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于小蛋白质治疗的半衰期延长。
用于缀合的其他候选组分和分子包括适用于分离或纯化的那些。非限制性实例包括结合分子，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠子、板或珠子、磁珠、测试条和膜。诸如阳离子交换色谱法的纯化方法可以用来通过电荷差异分离缀合物，其有效地将缀合物分离成各种分子量。通过阳离子交换色谱法获得的级分的含量可以使用常规方法通过分子量来鉴定，例如，质谱法、SDS-PAGE或用于通过分子量分离分子实体的其他已知方法。
在一些实施方案中，本公开的肽或蛋白质序列的氨基或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已经表明Fc融合缀合物增加生物药物的系统半衰期，因此生物制药产品可能需要较低频率的施用。Fc与内衬于血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)结合，并且在结合后，保护Fc融合分子免于降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长时间。这种Fc结合被认为是内源IgG保持其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，最近的Fc-融合技术将生物药物的单拷贝与抗体的Fc区连接，以优化生物药物的药代动力学和药效学性质。
本公开设想使用肽的当前已知或未来开发的其他修饰来改善一种或多种性质。这种延长本公开的肽的循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变免疫原性或变应原性的方法包括通过羟乙基淀粉化(hesylation)修饰肽序列，其利用与其他分子连接的羟乙基淀粉衍生物来修饰分子的特性。例如，在申请号为2007/0134197及2006/0258607的美国专利申请中描述了羟乙基淀粉化的各个方面。
可以用多种方式测定肽稳定性。例如，肽酶和各种生物介质如人血浆和血清已经用于测定稳定性。参见，例如，Verhoef等人,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11:291(1986)。使用25％人血清(v/v)测定方便地测定本文所述肽的半衰期。方案如下：将合并的人血清(AB型，非热灭活的)在使用前通过离心进行破坏。然后用RPMI-1640或另一种合适的组织培养基将血清稀释至25％。以预定的时间间隔，将少量反应溶液取出并添加至6％三氯乙酸(TCA)水溶液或乙醇中。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，然后进行旋转以使沉淀的血清蛋白成团。然后使用稳定性特异性色谱条件，通过反相HPLC确定肽的存在。
可以通过各种修饰来克服与短血浆半衰期或对蛋白酶降解的易感性相关的问题，包括将肽或蛋白质序列与多种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中的任何一种进行缀合或连接(参见，例如，通常经由与蛋白质和非蛋白质聚合物例如PEG共价结合的连接部分)。这类PEG缀合的生物分子已经显示出具有临床上有用的性质，包括更好的物理和热稳定性、防止对酶促降解的易感性、增加的溶解性、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。
适合与多肽或蛋白质序列缀合的PEG通常在室温下可溶于水，并且具有通式R-(O-CH2-CH2)n-O-R，其中R为氢或保护基如烷基或烷醇基团，并且其中n为1至1000的整数。当R为保护基时，其通常具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可以是直链的或支链的。本公开设想了支链PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。本公开还设想了缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此各种不同的PEG以一定比例存在。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的缀合物的百分比为18％-25％，n＝2的缀合物的百分比为50％-66％，n＝3的缀合物的百分比为12％-16％，n＝4的缀合物的百分比可达5％。这类组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法产生。例如，可以使用阳离子交换色谱法分离缀合物，然后鉴定含有附接有例如所需数目的PEG的缀合物的级分，纯化为不含未修饰的蛋白质序列且不含附接有其他数目的PEG的缀合物。
PEG可以经由末端反应性基团(“间隔体”)与本公开的肽或蛋白质结合。该间隔体是，例如，介导一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与PEG之间的键的末端反应性基团。具有可与游离氨基结合的间隔体的PEG包括可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化PEG的琥珀酸酯而制备的N-羟基琥珀酰亚胺PEG。可以与游离氨基结合的另一种活化的PEG是可以通过使PEG单甲醚与氰尿酰氯反应而制备的2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪。与游离羧基结合的活化的PEG包括聚氧乙烯二胺。
本公开的一个或多个肽或蛋白质序列与具有间隔体的PEG的缀合可以通过各种常规方法进行。例如，该缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下、利用4:1至30:1的试剂与肽/蛋白质的摩尔比进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以引导反应主要产生所需的置换度。通常，低温、低pH(例如，pH＝5)和短反应时间往往减少附接的PEG的数目，而高温、中性至高pH(例如，pH>7)和更长的反应时间往往增加附接的PEG的数目。可以使用本领域已知的各种手段终止反应。在一些实施方案中，通过酸化反应混合物并在例如-20℃下冷冻来终止反应。
本公开还设想了使用PEG模拟物。已经开发了保留PEG的属性(例如，延长的血清半衰期)同时赋予几种额外的优势性质的重组PEG模拟物。举例来说，能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含，例如，Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)可以重组产生，且已经融合至目的肽或蛋白质药物(例如，Amunix XTEN技术；Mountain View,CA)。这消除了对制备过程中其他缀合步骤的需要。此外，已建立的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，从而优化免疫原性和制备性质。
新表位
新表位包含被免疫系统识别的新抗原肽或新抗原多肽的新抗原决定簇部分。新表位是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。术语“新表位”与“肿瘤特异性新表位”在本说明书中可互换使用，用来表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。新表位可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。本公开提供了分离的新表位，其包含来自表1或表2的肿瘤特异性突变。本公开还提供了示例性的分离的新表位，其包含来自表34的肿瘤特异性突变。本公开还提供了示例性的分离的新表位，其包含来自表40A-40D和表3A-3D的肿瘤特异性突变。
在一些实施方案中，本文针对HLA I类所述的新表位的长度为13个或更少的残基，并且通常由约8至约12个残基，尤其是9或10个残基组成。在一些实施方案中，本文针对HLAII类所述的新表位的长度为25个或更少的残基，并且通常由约16至约25个残基组成。
在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。
在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，包含新抗原C481S BTK肽的组合物包含第一BTK新表位和第二BTK新表位。在一些实施方案中，第一BTK新表位包含选自表34的新表位。在一些实施方案中，第二BTK新表位包含选自表34的新表位。
在一些实施方案中，选自表34的第一突变BTK肽序列结合或被预测结合由表34列出的HLA等位基因编码的蛋白质，其对应于相应的肽(左列对右列)。
在一些实施方案中，包含新抗原EGFR肽的组合物包含第一EGFR新表位和第二EGFR新表位。在一些实施方案中，第一EGFR新表位包含选自表40A-40D的新表位。在一些实施方案中，第二EGFR新表位包含选自表40A-40D的新表位。
在一些实施方案中，第一突变EGFR新表位选自STVQLIMQL、LIMQLMPF、LTSTVQLIM、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM和VQLIMQLM。
在一些实施方案中，选自STVQLIMQL、LIMQLMPF、LTSTVQLIM、TVQLIMQL、TSTVQLIMQL、TVQLIMQLM和VQLIMQLM的第一突变EGFR肽序列结合或被预测结合由HLA-A68:01等位基因、HLA-B15:02等位基因、HLA-A25:01等位基因、HLA-B57:03等位基因、HLA-C12:02等位基因、HLA-C03:02等位基因和HLA-A26:01等位基因、HLA-C12:03等位基因、HLA-C06:02等位基因、HLA-C03:03、HLA-B52:01等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-C02:02等位基因、HLA-C12:03等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A32:01等位基因、HLA-A02:04等位基因、HLA-B15:09等位基因、HLA-C17:01等位基因、HLA-C03:04等位基因、HLA-B08:01等位基因、HLA-A01:01等位基因、HLA-B42:01等位基因、HLA-B57:01等位基因、HLA-B14:02等位基因、HLA-B37:01等位基因、HLA-B36:01等位基因、HLA-B38:01等位基因、HLA-C03:03等位基因、HLA-B14:02等位基因、HLA-B37:01等位基因、HLA-A02:03等位基因、HLA-B58:02等位基因、HLA-C08:01等位基因、HLA-B35:01等位基因、HLA-B40:01等位基因和/或HLA-B35:03等位基因编码的蛋白质。
表41提供了编码可以结合或被预测结合EGFR新抗原肽的HLA蛋白的示例性HLA等位基因的列表。
Figure BDA0002944947110001661
Figure BDA0002944947110001671
表42Ai、42Aii和42B显示了具有预测的HLA亚型特异性的EGFR新表位。
表5Ai、5Aii和5B显示了具有预测的HLA亚型特异性的EGFR新表位。
表42Ai
Figure BDA0002944947110001672
表42Aii
Figure BDA0002944947110001673
Figure BDA0002944947110001681
表42B
Figure BDA0002944947110001682
在一些实施方案中，第一和第二新表位是不同的表位。在一些实施方案中，第二新表位长于第一新表位。在一些实施方案中，第一新表位的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位的长度为8至12个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位的长度为至少16个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位的长度为16至25个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。
在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基。在一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在另一个实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在又一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基不同于第二新表位的至少一个锚定残基。
在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是野生型残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是置换。在一些实施方案中，至少一个锚定残基不包含该突变。
在一些实施方案中，第一或第二新表位或两者包含至少一个锚定残基侧翼区。在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基包括至少两个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少两个锚定残基被包含至少1个氨基酸的分隔区隔开。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区不在该分隔区内。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区在(a)所述至少两个锚定残基的N末端锚定残基的上游；(b)所述至少两个锚定残基的C末端锚定残基的下游；或(a)和(b)兼具。在一些实施方案中，第二新肽选自表34。
在一些实施方案中，第二新表位包含突变T790M。在一些实施方案中，包含EGFRT790M突变的第二新表位包含VQLIMQLMPF的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含STVQLIMQLM的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含QLIMQLMPF的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含MQLMPFGCLL的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含LIMQLMPF的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含LTSTVQLIM的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新肽包含STVQLIMQL的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含TSTVQLIMQL的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含TVQLIMQL的序列。在一些实施方案中，包含EGFRT790M突变的第二新表位包含TVQLIMQLM的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含VQLIMQLM的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含CLTSTVQLIM的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含IMQLMPFGC的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含IMQLMPFGC的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含IMQLMPFGCL的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含LIMQLMPFG的新表位序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含LIMQLMPFGC的序列。在一些实施方案中，包含EGFR T790M突变的第二新表位包含QLIMQLMPFG的序列。
在一些实施方案中，第二新表位包含EGFR S492R突变。在一些实施方案中，包含EGFR S492R突变的肽包含IIRNRGENSCK的新表位序列。
在一些实施方案中，第二EGFR新表位包含EGFR中的缺失突变，如EGFRvIII中的G缺失(内部缺失)，其中该新表位序列是ALEEKKGNYV。
在一些实施方案中，第二新表位包含以下序列中所示的突变：LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEHLKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD，其中该新表位序列是IQLQDKFEHL。在一些实施方案中，第二新表位序列是QLQDKFEHL。在一些实施方案中，第二新表位序列是QLQDKFEHLK。在一些实施方案中，第二新表位序列是YLVIQLQDKF。
在一些实施方案中，第二新肽选自表35或表3A-表3D。
在一些实施方案中，所述新表位结合HLA蛋白(例如，HLA I类或HLA II类)。在一些实施方案中，所述新表位以比相应的野生型肽更高的亲和力结合HLA蛋白。在一些实施方案中，所述新表位的IC50低于5,000nM、低于1,000nM、低于500nM、低于100nM、低于50nM或更低。
在一些实施方案中，所述新表位可以具有约1pM至约1mM、约100pM至约500μM、约500pM至约10μM、约1nM至约1μM或约10nM至约1μM的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，所述新表位可以具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000nM或更高的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，所述新表位可以具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000nM的HLA结合亲和力。
在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与相应野生型新表位相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA I类蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于2,000nM、1,500nM、1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA II类蛋白结合。
在一个方面，第一和/或第二新表位与由受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质结合。在另一方面，在受试者的非癌细胞中不存在所述突变。在又一方面，第一和/或第二新表位由受试者的癌细胞的基因或表达基因编码。
在一些实施方案中，第一新表位包含表1或表2的第2列所示的突变。在一些实施方案中，第二新表位包含表1或表2的第2列所示的突变。在一些实施方案中，某些抗原肽与特定等位基因配对。
置换可位于新表位长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N末端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C末端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于距N末端2-5个残基处，或距C末端2-5个残基处。所述肽可类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，其中所述肽包含一个或多个或所有插入的残基。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以使用不含污染细菌或动物物质的试剂轻松化学合成(Merrifield RB:Solid phase peptide synthesis.I.The synthesis of atetrapeptide.J.Am.Chem.Soc.85:2149-54,1963)。在一些实施方案中，通过以下步骤制备肽：(1)使用均匀合成和切割条件在多通道仪器上平行固相合成；(2)采用柱洗出在RP-HPLC柱上纯化；以及在肽之间重新洗涤，但不替代；随后(3)使用有限的一组最具信息性的试验进行分析。良好生产规范(GMP)足迹可以针对个体患者的一组肽来定义，因此仅在针对不同患者的肽的合成之间需要适当的转换程序。
多核苷酸
或者，编码本公开的肽的核酸(例如，多核苷酸)可以用来在体外产生新抗原肽。该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，或天然或稳定化形式的多核苷酸，例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸，或其组合，并且它可以含有或者可以不含内含子，只要它编码该肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。
本文提供了编码本公开中描述的每种新抗原肽的新抗原多核苷酸。术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”与“突变多核苷酸”、“突变核苷酸”、“突变核酸”、“新抗原多核苷酸”、“新抗原核苷酸”或“新抗原突变核酸”在本公开中可互换使用。由于遗传密码的冗余性，各种核酸序列可以编码相同的肽。这些核酸中的每一种都落入本公开的范围内。编码肽的核酸可以是DNA或RNA，例如mRNA，或DNA和RNA的组合。在一些实施方案中，编码肽的核酸序列是自扩增mRNA(Brito等人,Adv.Genet.2015；89:179-233)。编码本文所述肽的任何合适的多核苷酸都落入本公开的范围内。
术语“RNA”包括并且在一些实施方案中涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板而产生的并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在一些实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。在本公开的上下文中，mRNA可以通过DNA模板的体外转录生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
可以根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，RNA可以被稳定化，并且其翻译通过一种或多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰而增加。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，该文献通过引用并入本文。为了增加根据本公开使用的RNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰该RNA，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，从而增加GC含量以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，从而增强在细胞中的翻译。
在本公开中使用的RNA语境中的术语“修饰”包括对RNA的任何修饰，该修饰在所述RNA中不是天然存在的。在一些实施方案中，该RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。通过用磷酸酶处理RNA可以除去这样的未加帽的5’-三磷酸。在其他实施方案中，该RNA可以具有修饰的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。在一些实施方案中，5-甲基胞苷可以在RNA中部分或完全置换，例如胞苷。任选地，假尿苷部分或完全置换，例如尿苷。
在一些实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’端上发现的帽结构，并且通常由经由不寻常的5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一些实施方案中，这种鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽、7-甲基鸟苷帽(m G)。在本公开的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物，并且被修饰为具有稳定RNA和/或增强体内和/或细胞内的RNA翻译(如果与RNA附接)的能力。
在某些实施方案中，将编码本公开的新抗原肽的mRNA施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，本公开提供了包含修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子，包含修饰的核苷的基因治疗载体，包含修饰的基因治疗方法和核苷的基因转录沉默方法。在一些实施方案中，待施用的mRNA包含至少一个修饰的核苷。
编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过化学技术合成，例如，Matteucci等人,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)的磷酸三酯方法。编码包含类似物或由类似物组成的肽的多核苷酸可以简单地通过用合适的和期望的核酸碱基置换编码天然表位的那些碱基来制备。
本文所述的多核苷酸可以在转录区中包含一个或多个合成或天然存在的内含子。还可以考虑在哺乳动物细胞中包含mRNA稳定序列和用于复制的序列以增加多核苷酸表达。另外，本文所述的多核苷酸可以包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。这些序列可以包含在载体中的多核苷酸编码序列之外，以增强免疫原性。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合至有助于例如从宿主细胞表达和/或分泌该肽或蛋白质的多核苷酸(例如，起到控制多肽从细胞转运的分泌序列的作用的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且可以具有被宿主细胞切割以形成多肽的成熟形式的前导序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同的阅读框中融合至允许例如纯化编码的肽的标志物序列，然后可以将其并入个性化的疾病疫苗或免疫原性组合物中。例如，在细菌宿主的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以提供与标志物融合的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标志物序列可以是来源于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。其他标签包括但不限于钙调蛋白标签、FLAG标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白(BCCP)标签、GST标签、荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白标签)、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、Strep-标签、硫氧还蛋白标签、TC标签、Ty标签等。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含在相同阅读框中融合的一种或多种当前描述的肽或蛋白质的编码序列，以创建能够产生多种新抗原肽的单个多联新抗原肽构建体。
在一些实施方案中，使用重组技术通过分离或合成编码目的野生型蛋白质的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变序列，以提供其功能类似物。参见，例如，Zoeller等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:5662-5066(1984)和美国专利4,588,585。在另一实施方案中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成构建编码目的肽或蛋白质的DNA序列。可以基于所需肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可以应用标准方法合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用来构建反向翻译的基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成编码所需多肽的部分的几种小寡核苷酸，然后将其连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补装配的5'或3'突出端。
一旦装配(例如，通过合成、定点诱变或另一种方法)，将编码特定分离的目的多肽的多核苷酸序列插入表达载体中，并任选地将其可操作地连接至适合于在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图和生物活性多肽在合适宿主中的表达来证实正确的装配。如本领域公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因可以可操作地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
因此，本公开还涉及可用于产生和施用本文所述的新抗原肽和新表位的载体和表达载体，以及包含这类载体的宿主细胞。
载体
在一些实施方案中，还可以制备能够表达如本文所述的肽或蛋白质的表达载体。用于不同细胞类型的表达载体是本领域公知的，并且可以在无需过多试验的情况下进行选择。通常，将DNA以适当的方向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中以供表达。如有必要，DNA可以连接至被期望的宿主(例如细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后使用标准技术将载体引入宿主细菌中以供克隆(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
适合于产生和施用本文所述的新抗原肽的大量载体和宿主系统是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。举例来说，提供以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可以使用其他任何质粒或载体，只要它在宿主中是可复制且可存活的。
为了表达本文所述的新抗原肽，向编码序列提供可操作地连接的起始及终止密码子、启动子和终止子区，并且在一些实施方案中，提供复制系统，以提供用于在所需的细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有适当的限制性酶切位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列，以供插入期望的编码序列。将得到的表达载体转化到合适的细菌宿主中。
哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。这样的启动子还可以来源于病毒来源，例如人巨细胞病毒(CMV-IE启动子)或1型单纯疱疹病毒(HSV TK启动子)。来源于SV40剪接的核酸序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供所需的非转录遗传元件。
重组表达载体可以用来扩增并表达编码本文所述的肽或蛋白质的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码肽或生物等效类似物的合成的或cDNA衍生的DNA片段，该DNA片段可操作地连接至来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节控制元件。如本文所详述的，转录单元通常包含以下元件的装配体：(1)遗传元件或在基因表达中具有调节作用的元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列。这类调节元件可包括控制转录的操纵基因序列。可以另外并入通常由复制起点赋予的、在宿主中复制的能力，以及促进转化体识别的选择基因。当DNA区域在功能上彼此相关时，它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA被表达为参与多肽分泌的前体，则其可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子控制序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以允许翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意味着是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，意味着连续且在阅读框中。打算用于酵母表达系统的结构元件包括能够使宿主细胞在细胞外分泌所翻译的蛋白质的前导序列。或者，当重组蛋白在没有前导或转运序列的情况下表达时，其可以包括N末端甲硫氨酸残基。随后可任选地从表达的重组蛋白上切下该残基以提供最终产物。
通常，重组表达载体将包括复制起点及允许转化宿主细胞的选择性标记，例如大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因以及用来引导下游结构序列的转录的来源于高表达基因的启动子。这样的启动子可以来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始及终止序列，以及在一些实施方案中，与能够指导翻译的蛋白质分泌至周质空间或细胞外培养基中的前导序列一起装配。任选地，异源序列可以编码包括赋予所需特性(例如，表达的重组产物的稳定或简化纯化)的N末端标识肽的融合蛋白。
编码本文所述的新抗原肽的多核苷酸还可以包含泛素化信号序列，和/或靶向序列，如内质网(ER)信号序列，以促进所得肽向内质网中的移动。
在一些实施方案中，本文所述的新抗原肽还可以通过病毒或细菌载体进行施用/表达。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，如牛痘或禽痘。作为该方法的一个实例，痘苗病毒用作载体以表达编码本文所述的新抗原肽的核苷酸序列。可用于免疫方案的痘苗病毒载体和方法在美国专利4,722,848中描述。另一种载体是BCG(卡介苗(Bacille CalmetteGuerin))。Stover等人,Nature 351:456-460(1991)描述了BCG载体。
根据本文的描述，可用于本文所述新抗原多肽的治疗性施用或免疫的多种其他载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、解毒炭疽毒素载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、金丝雀痘载体和禽痘载体等，对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，该载体是修饰的安卡拉牛痘(Vaccinia Ankara(VA))(例如，Bavarian Noridic(MVA-BN))。
在可以在本公开的实践中使用的载体中，利用逆转录病毒基因转移方法可以实现向细胞的宿主基因组中的整合，通常导致所插入的转基因的长期表达。在一些实施方案中，该逆转录病毒是慢病毒。另外，已经在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。逆转录病毒的向性可以通过并入外来包膜蛋白、扩充靶细胞的潜在目标群体来改变。逆转录病毒也可以被工程改造以允许所插入的转基因的条件表达，使得仅有某些细胞类型被慢病毒感染。细胞类型特异性启动子可用来靶向在特定细胞类型中的表达。慢病毒载体是逆转录病毒载体(因此慢病毒和逆转录病毒载体均可以在本公开的实践中使用)。此外，慢病毒载体能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择可取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复序列组成，其包装能力可达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后用其将所需核酸整合到靶细胞中以提供永久表达。可以在本公开的实践中使用的广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的载体(参见，例如，Buchscher等人(1992)J.Virol.66:2731-2739；Johann等人(1992)J.Virol.66:1635-1640；Sommnerfelt等人(1990)Virol.176:58-59；Wilson等人(1998)J.Virol.63:2374-2378；Miller等人(1991)J.Virol.65:2220-2224；PCT/US94/05700)。
另外，在本公开的实践中有用的是最小的非灵长类动物慢病毒载体，如基于马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒载体。所述载体可具有驱动靶基因表达的巨细胞病毒(CMV)启动子。因此，本公开涉及可用于实施本公开内容的一种或多种载体：病毒载体，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。
腺病毒载体也可用于本公开的实践中。一个优点是重组腺病毒在各种哺乳动物细胞和组织中在体内或者体外有效转移和表达重组基因的能力，导致所转移的核酸的高表达。此外，有效感染静息细胞的能力扩展了重组腺病毒载体的实用性。另外，高表达水平确保该核酸的产物将表达至足以生成免疫应答的水平(参见，例如，美国专利7,029,848，其引入作为参考)。
关于可用于实施本公开内容的腺病毒载体，可提及美国专利6,955,808。使用的腺病毒载体可选自Ad5、Ad35、Ad11、C6和C7载体。已公布了腺病毒5(“Ad5”)基因组的序列。(Chroboczek,J.,Bieber,F.和Jacrot,B.(1992)The Sequence of the Genome ofAdenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2,Virology 186,280-285；其内容在此引入作为参考)。Ad35载体在美国专利6,974,695、6,913,922和6,869,794中描述。Ad11载体在美国专利6,913,922中描述。C6腺病毒载体在美国专利6,780,407、6,537,594、6,309,647、6,265,189、6,156,567、6,090,393、5,942,235和5,833,975中描述。C7载体在美国专利6,277,558中描述。也可以使用E1缺陷或缺失、E3缺陷或缺失和/或E4缺陷或缺失的腺病毒载体。某些具有E1区突变的腺病毒具有改善的安全范围，因为E1缺陷腺病毒突变体在非允许细胞中是复制缺陷的，或者至少是高度减毒的。在E3区具有突变的腺病毒可以通过破坏腺病毒下调MHC I类分子的机制来增强免疫原性。由于抑制晚期基因表达，具有E4突变的腺病毒可具有降低的腺病毒载体的免疫原性。当期望使用相同载体重复再接种时，这样的载体可能特别有用。可以根据本公开内容使用在E1、E3、E4、E1和E3以及E1和E4中缺失或突变的腺病毒载体。
此外，根据本公开内容，也可以使用所有病毒基因都缺失的“无内容”腺病毒载体。这类载体需要辅助病毒进行复制，并且需要表达E1a和Cre两者的特殊的人293细胞系，此条件在天然环境中不存在。这样的“无内容”载体是非免疫原性的，因此该载体可以多次接种以用于再接种。“无内容”腺病毒载体可用于插入异源插入物/基因，如本公开的转基因，甚至可用于大量异源插入物/基因的共递送。
在一些实施方案中，该递送是经由腺病毒进行的，该腺病毒可以是单一加强剂量。在一些实施方案中，该腺病毒经由多剂量递送。就体内递送而言，AAV因为其低毒性及由于其不整合到宿主基因组中引起插入诱变的低可能性而优于其他病毒载体。AAV的包装限制为4.5Kb或4.75Kb。大于4.5Kb或4.75Kb的构建体可显著减少病毒产生。有许多启动子可用于驱动核酸分子表达。AAV ITR可用作启动子并且有利于消除对其他启动子元件的需要。
对于全身性的表达，可以使用以下启动子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链等。对于脑表达，可以使用以下启动子：用于所有神经元的突触蛋白I，用于兴奋性神经元的CaMKIIα，用于γ-氨基丁酸能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。用来驱动RNA合成的启动子可包括：Pol III启动子，如U6或H1。Pol II启动子和内含子盒的使用可用来表达指导RNA(gRNA)。关于可用于实施本公开内容的AAV载体，可提及美国专利5658785、7115391、7172893、6953690、6936466、6924128、6893865、6793926、6537540、6475769和6258595以及其中引用的文件。关于AAV，该AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或其任意组合。可以针对待靶向的细胞选择AAV；例如，可以选择AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任意组合用于靶向脑或神经细胞；并且可以选择AAV4用于靶向心脏组织。AAV8可用于递送至肝脏。在一些实施方案中，该递送是经由AAV进行的。可以调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用。
在一些实施方案中，痘病毒在当前描述的组合物中使用。这些包括正痘病毒、禽痘、牛痘、MVA、NYVAC、金丝雀痘、ALVAC、禽痘、TROVAC等(参见，例如，Verardiet等人,Hum.Vaccin.Immunother.2012Jul；8(7):961-70；以及Moss,Vaccine.2013；31(39):4220–4222)。痘病毒表达载体于1982年描述，并迅速广泛用于疫苗开发以及许多领域的研究。该载体的优点包括简单构建、适应大量外来DNA的能力和高表达水平。关于可用于实施本公开内容的痘病毒如脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)痘病毒(脊椎动物的痘病毒)，例如，正痘病毒和禽痘病毒，例如牛痘病毒(例如，Wyeth株、WR株(例如，
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VR-1354)、哥本哈根(Copenhagen)株、NYVAC、NYVAC.1、NYVAC.2、MVA、MVA-BN)、金丝雀痘病毒(例如，Wheatley C93株、ALVAC)，禽痘病毒(例如，FP9株、Webster株、TROVAC)、鸽痘(dovepox)、鸽痘(pigeonpox)、鹌鹑痘(quailpox)和浣熊痘，尤其是其合成或非天然存在的重组体、其用途以及制备和使用这类重组体的方法的信息可以在科学和专利文献中找到。
在一些实施方案中，痘苗病毒在疾病疫苗或免疫原性组合物中使用以表达抗原。(Rolph等人,Recombinant viruses as vaccines and immunologicaltools.Curr.Opin.Immunol.9:517-524,1997)。重组牛痘病毒能够在感染的宿主细胞的细胞质内复制，因此目的多肽可以诱导免疫应答。此外，痘病毒已广泛用作疫苗或免疫原性组合物载体，这不仅是因为其能够通过直接感染免疫细胞(特别是抗原呈递细胞)经由I类主要组织相容性复合物途径靶向编码的抗原，而且也是因为其能够自我辅助。
在一些实施方案中，ALVAC用作疾病疫苗或免疫原性组合物中的载体。ALVAC是一种可以被修饰以表达外来转基因的金丝雀痘病毒，并且已被用作针对原核和真核抗原的疫苗接种方法(Horig H,Lee DS,Conkright W等人.Phase I clinical trial of arecombinant canarypoxvirus(ALVAC)vaccine expressing human carcinoembryonicantigen and the B7.1co-stimulatory molecule.Cancer Immunol Immunother 2000；49:504–14；von Mehren M,Arlen P,Tsang KY等人.Pilot study of a dual generecombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen(CEA)andB7.1transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas.ClinCancer Res 2000；6:2219–28；Musey L,Ding Y,Elizaga M等人.HIV-1vaccinationadministered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cellimmunity in HIV-1-uninfected individuals.J Immunol2003；171:1094–101；PaolettiE.Applications of pox virus vectors to vaccination:an update.Proc Natl AcadSci U S A 1996；93:11349–53；美国专利7,255,862)。在I期临床试验中，表达肿瘤抗原CEA的ALVAC病毒显示出极好的安全性并且导致所选患者的CEA特异性T细胞应答增加；然而，没有观察到客观的临床反应(Marshall JL,Hawkins MJ,Tsang KY等人.Phase I study incancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine thatexpresses human carcinoembryonic antigen.J Clin Oncol 1999；17:332–7)。
在一些实施方案中，修饰的安卡拉牛痘(MVA)病毒可用作抗原疫苗或免疫原性组合物的病毒载体。MVA是正痘病毒科的成员，并且已经通过牛痘病毒(CVA)的安卡拉株在鸡胚成纤维细胞中的约570次连续传代产生(参见，例如，Mayr,A.等人,Infection 3,6-14,1975)。由于这些传代，所得的MVA病毒含有的基因组信息比CVA少31千碱基，并且是高度限制的宿主细胞(Meyer,H.等人,J.Gen.Virol.72,1031-1038,1991)。MVA的特征在于其极度衰减，即减弱的毒力或感染能力，但仍具有优异的免疫原性。当在多种动物模型中进行测试时，MVA被证明是无毒的，甚至在免疫抑制的个体中也是无毒的。此外，MVA-
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-HER2是一种用于治疗HER-2阳性乳腺癌的候选免疫治疗，并且目前正在进行临床试验(Mandl等人,Cancer Immunol Immunother.Jan 2012；61(1):19–29)。已经描述了制备和使用重组MVA的方法(例如，参见美国专利8,309,098和5,185,146，其整体并入本文)。
用于表达多肽的合适的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括哺乳动物来源的已建立的细胞系。也可以使用无细胞翻译系统。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体是本领域已知的(参见Pouwels等人,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。
也有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以进行重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达，因为这类蛋白质通常被正确折叠、适当修饰并且是完全功能性的。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman(Cell 23:175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系，以及能够表达适当载体的其他细胞系，包括，例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，如复制起点，与待表达的基因连接的合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受体位点以及转录终止序列。Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。
用载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。该载体可以是，例如，质粒、病毒小体、噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在适当改变的常规营养培养基中培养以用于激活启动子、选择转化子或扩增多核苷酸。诸如温度、pH等培养条件是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。
作为适当宿主的代表性实例，可以提及：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个种；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和Sf9；动物细胞，如在Gluzman,Cell 23:175(1981)中描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容性载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系或鲍斯黑素瘤(Bowes melanoma)；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。
也可以使用采用合适的载体和控制序列的酵母、昆虫或哺乳动物细胞宿主。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa及BHK细胞系。
本文所述的多核苷酸可以在人类细胞(例如，免疫细胞，包括树突细胞)中施用和表达。可以使用人密码子使用表来指导每种氨基酸的密码子选择。这样的多核苷酸包含表位和/或类似物之间的间隔氨基酸残基，诸如上述那些，或者可以包含与表位和/或类似物(和/或CTL(例如CD8+)、Th(例如CD4+)和B细胞表位)相邻的天然存在的侧翼序列。
载体中可以包含本领域技术人员熟知的标准调节序列以确保在人靶细胞中表达。需要几种载体元件：具有多核苷酸的下游克隆位点的启动子，例如小基因插入；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可以用于此目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。关于其他合适的启动子序列，参见，例如，美国专利5,580,859和5,589,466。在一些实施方案中，该启动子是CMV-IE启动子。
用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人的有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更宽的宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
可以通过许多不同的方法将载体引入动物组织中。两种最常用的方法是使用标准皮下注射针在盐水中注射DNA以及基因枪递送。在Scientific American(Weiner等人(1999)Scientific American 281(1):34–41)中说明了DNA疫苗质粒构建及其随后通过这两种方法递送到宿主中的示意性概述。盐水中的注射通常在骨骼肌中肌肉内(IM)或皮内(ID)进行，或将DNA递送至细胞外空间。这可以由电穿孔通过肌肉毒素如布比卡因暂时损伤肌肉纤维来辅助；或者通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液来辅助(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。对这种递送方法的免疫应答可能受许多因素的影响，包括针类型、针排列、注射速度、注射量、肌肉类型以及所注射动物的年龄、性别和生理状况(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。
另一种常用的递送方法——基因枪递送，使用压缩氦气作为促进剂，以弹道学方式加速已经吸附到金或钨微粒上的质粒DNA(pDNA)进入靶细胞(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410；Lewis等人(1999).Advances inVirus Research(Academic Press)54:129–88)。
替代的递送方法可包括在粘膜表面如鼻粘膜和肺粘膜上气雾剂滴注裸DNA(Lewis等人(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54:129–88)以及将pDNA局部施用到眼睛粘膜和阴道粘膜(Lewis等人(1999)Advances in Virus Research(AcademicPress)54:129–88)。使用阳离子脂质体-DNA制剂、可生物降解的微球、用于口服施用至肠粘膜的减毒志贺氏杆菌或李斯特杆菌载体以及重组腺病毒载体也已实现了粘膜表面递送。在轻微机械破坏细胞膜，暂时使细胞透化后，DNA或RNA也可以被递送至细胞。膜的这种温和的机械破坏可以通过轻微地迫使细胞通过小孔来完成(Sharei等人,Ex Vivo CytosolicDelivery of Functional Macromolecules to Immune Cells,PLOS ONE(2015))。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“坍缩”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。
在一些实施方案中，载体包含多核苷酸，该多核苷酸编码包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。所述至少两种不同的肽可根据长度、氨基酸序列或两者而不同。所述肽来源于已知或已被发现含有肿瘤特异性突变的任何蛋白质。在一些实施方案中，载体含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，载体含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。
在一些实施方案中，载体包含可操作地连接至启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，该载体是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，该载体衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或其假型。在一些实施方案中，该载体是非病毒载体。在一些实施方案中，该非病毒载体是纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米聚合物、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽或脂球(liposphere)。
T细胞受体
在一个方面，本公开提供了表达激活免疫应答性细胞的新抗原识别受体(例如，T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。这类细胞包括表达与本文所述的新抗原肽之一结合的抗原识别受体(例如，TCR或CAR)的遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL(例如CD8+)细胞)、辅助T淋巴细胞(Th(例如CD4+)细胞)，以及因此用于治疗瘤形成和其他需要增加抗原特异性免疫应答的病理的使用方法。T细胞活化由靶向至抗原的TCR或CAR介导。
本公开提供了表达激活免疫应答性细胞的抗原识别受体(例如，TCR、CAR)与嵌合共刺激受体(CCR)的组合的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。在一些实施方案中，使用肿瘤抗原特异性T细胞、NK细胞、CTL细胞或其他免疫应答性细胞作为穿梭物，用于选择性富集一种或多种共刺激配体，以供治疗或预防瘤形成。将这类细胞施用于需要它的人类受试者，以供治疗或预防特定癌症。
在一些实施方案中，可以在本公开的方法中使用的肿瘤抗原特异性人淋巴细胞包括但不限于经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain,M.等人,2003 Nat Rev Cancer 3:35-45)、经遗传修饰以表达包含a和p异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞(Morgan,R.A.等人,2006 Science 314:126-129)、来源于肿瘤活检物中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物(Panelli,M.C.等人,2000 J Immunol 164:495-504；Panelli,M.C.等人,2000 J Immunol 164:4382-4392)以及使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突细胞选择性地体外扩充的抗原特异性外周血白细胞(Dupont,J.等人,2005 Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人,2003 Blood 102:2498-2505)。T细胞可以是自体的、同种异体的或在体外来源于工程化祖细胞或干细胞。
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是工程化受体。在一些实施方案中，该工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)、过继性T细胞治疗(ACT)或其衍生物。在其他方面，该工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，该CAR是第一代CAR。在其他方面，该CAR是第二代CAR。在另外其他方面，该CAR是第三代CAR。在一些方面，所述CAR包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。在一些方面，该细胞内部分包含至少一个T细胞共刺激域。在一些方面，该T细胞共刺激域选自CD27、CD28、TNFRS9(4-1BB)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF8(CD30)、CD40LG(CD40L)、ICOS、ITGB2(LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2(NKG2C)、TNFRS18(GITR)、TNFRSF14(HVEM)或其任意组合。
在一些方面，所述工程化受体结合靶标。在一些方面，该结合对于患有疾病或病况的一个或多个受试者所特异的肽是特异性的。
在一些方面，所述免疫治疗剂是如本文所详述的细胞。在一些方面，该免疫治疗剂是包含特异性结合本文所述的肽或新表位的受体的细胞。在一些方面，该免疫治疗剂是与本公开的肽/核酸联合使用的细胞。在一些实施方案中，该细胞是患者细胞。在一些实施方案中，该细胞是T细胞。在一些实施方案中，该细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些方面，基于受试者的T细胞受体组库(repertoire)治疗患有病况或疾病的受试者。在一些实施方案中，基于受试者的T细胞受体组库选择肽或新表位。在一些实施方案中，用表达对本文所述的肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞治疗受试者。在一些实施方案中，用对TCR，例如受试者特异性TCR具有特异性的肽或新表位治疗受试者。在一些实施方案中，用对表达TCR，例如受试者特异性TCR的T细胞具有特异性的肽或新表位治疗受试者。在一些实施方案中，用对受试者特异性TCR具有特异性的肽或新表位治疗受试者。
在一些实施方案中，基于在一个或多个受试者中鉴定的TCR来选择本文所述的组合物。在一些实施方案中，使用T细胞组库的鉴定和在功能分析中的测试来确定待施用于患有病况或疾病的一个或多个受试者的组合物。在一些实施方案中，该组合物是包含一种或多种本文所述的肽或蛋白质的抗原疫苗。在一些实施方案中，该疫苗包含受试者特异性新抗原肽。在一些实施方案中，基于与新抗原结合的受试者特异性TCR的定量来选择待包含在疫苗中的肽。在一些实施方案中，基于肽与TCR的结合亲和力选择所述肽。在一些实施方案中，该选择基于量和结合亲和力的组合。例如，在功能分析中与新表位强力结合但在TCR组库中没有高度代表性的TCR可能是抗原疫苗的良好候选物，因为表达TCR的T细胞将有利地扩增。
在一些实施方案中，基于与TCR的结合来选择肽或蛋白质，以供施用于一个或多个受试者。在一些实施方案中，可以扩充T细胞，如来自患有疾病或病况的受试者的T细胞。经扩充的表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞可以施用回受试者。在一些实施方案中，用多核苷酸转导或转染合适的细胞，例如，PBMC，以用于表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR，并将其施用于受试者。表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞可以扩充并施用回受试者。在一些实施方案中，可以扩充表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR且在与自体病变组织一起孵育时产生细胞溶解活性的T细胞，并将其施用于受试者。在一些实施方案中，可以扩充在功能分析中使用的导致与新抗原肽或新表位结合的T细胞，并将其施用于受试者。在一些实施方案中，可以在T细胞中表达已经确定与受试者特异性新抗原肽或新表位结合的TCR，并将其施用于受试者。
在实施方案中，本公开提供了一种组合物，其含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含第一T细胞和第二T细胞，第一T细胞包含对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)，且第二T细胞包含对第二新表位具有特异性的第二TCR。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。
在另一实施方案中，本公开提供了一种组合物，其含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含第一T细胞和第二T细胞，第一T细胞包含对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)，且第二T细胞包含对第二新表位具有特异性的第二TCR。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。
在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD8+ T细胞。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。
在一些实施方案中，第一TCR是对第一新表位具有特异性的第一嵌合抗原受体，而第二TCR是对第二新表位具有特异性的第二嵌合抗原受体。在一些实施方案中，第一T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，第一T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，第二T细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二TCR以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，第一和/或第二TCR以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA I类-肽复合物结合。在一些实施方案中，第一和/或第二TCR以小于2,000、1,500、1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA II类-肽复合物结合。
抗原呈递细胞
可以提供新抗原肽或蛋白质作为含有本文所述的肽、蛋白质或多核苷酸的抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在其他实施方案中，这类抗原呈递细胞用来刺激用于患者的T细胞。因此，本公开的一个实施方案是一种组合物，其含有用一种或多种本文所述新抗原肽或多核苷酸脉冲或负载的至少一种抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在一些实施方案中，这样的APC是自体的(例如，自体树突细胞)。或者，从患者中分离的外周血单核细胞(PBMC)可以离体负载新抗原肽或多核苷酸。在相关实施方案中，将这样的APC或PBMC注射回患者体内。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在相关实施方案中，该树突细胞是用新抗原肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该新抗原肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的肽。使用以来自肿瘤相关抗原的肽脉冲的自体树突细胞的T细胞治疗在Murphy等人(1996)TheProstate 29,371-380和Tjua等人(1997)The Prostate 32,272-278中公开。在一些实施方案中，该T细胞是CTL(例如CD8+)。在一些实施方案中，该T细胞是辅助L淋巴细胞(Th(例如CD4+))。
在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含也可以施用于受试者的基于细胞的免疫原性药物组合物。例如，基于抗原呈递细胞(APC)的免疫原性药物组合物可以使用如本领域所理解的任何已知的技术、载体和赋形剂配制。APC包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于APC的免疫原性药物组合物可以是基于树突细胞的免疫原性药物组合物。
基于树突细胞的免疫原性药物组合物可通过本领域已知的任何方法制备。在一些情况下，可以通过离体或体内方法制备基于树突细胞的免疫原性药物组合物。该离体方法可包括使用以本文所述的多肽离体脉冲的自体DC，以在施用于患者之前激活或负载DC。该体内方法可包括使用与本文所述的多肽相偶联的抗体靶向特异性DC受体。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含DC激活剂，如TLR3、TLR-7-8和CD40激动剂。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含佐剂和药学上可接受的载体。
抗原呈递细胞(APC)可以从多种来源制备，包括人和非人灵长类动物、其他哺乳动物和脊椎动物。在某些实施方案中，APC可以从人或非人类脊椎动物的血液制备。也可以从富集的白细胞群体中分离APC。白细胞群体可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法通常包括收集肝素化血液、单采血液分离术或白细胞去除术、血沉棕黄层的制备、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如，使用Ficoll、硅胶和蔗糖)、差异裂解非白细胞的细胞和过滤。也可以通过从受试者收集血液、除纤以去除血小板并溶解红细胞来制备白细胞群体。白细胞群体可任选地富集单核树突细胞前体。
根据白细胞富集群体的所需用途，可以从多种受试者中获得血细胞群体。该受试者可以是健康受试者。或者，可以从需要免疫刺激的受试者(例如，癌症患者或其他免疫刺激对其有益的患者)获得血细胞。同样，可从需要免疫抑制的受试者，例如患有自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、糖尿病、狼疮、多发性硬化等)的患者获得血细胞。也可以从HLA匹配的健康个体获得白细胞群体。
当使用血液作为APC的来源时，可以使用维持其活力的常规方法获得血液白细胞。根据本公开的一个方面，可以将血液稀释到可以含有或可以不含肝素或其他合适的抗凝剂的介质中。血液与介质的体积可以约为1比1。可以通过在4℃下以大约1,000rpm(150g)在介质中离心血液来浓缩细胞。可以通过将细胞重悬于本领域已知的任何会溶解红细胞的溶液例如氯化铵中，而消除血小板和红细胞。例如，混合物可以是体积比约为1:1的介质和氯化铵。可以通过离心浓缩细胞，并在所需溶液中洗涤，直到获得基本不含血小板和红细胞的白细胞群体。组织培养中常用的任何等渗溶液都可以用作从血小板和红细胞中分离白细胞的介质。这样的等渗溶液的实例可以是磷酸盐缓冲盐水、Hanks平衡盐溶液和完全生长培养基。APC和/或APC前体细胞也可以通过淘洗来纯化。
在一个实施方案中，APC可以是炎性或其他激活条件下的非标称APC。例如，非标称APC可包括用干扰素-γ刺激的上皮细胞、T细胞、B细胞和/或被诱导APC活性的因子或条件激活的单核细胞。可以根据本领域已知的方法来制备这类非标称APC。
根据APC的类型，可以根据需要对APC进行培养、扩充、分化和/或成熟。可以在任何合适的培养容器，例如培养板、烧瓶、培养袋和生物反应器中培养APC。
在某些实施方案中，可以在合适的培养基或生长培养基中培养APC，以维持和/或扩大制品中APC的数目。可以根据分离的APC的类型选择培养基。例如，成熟的APC，如成熟的树突细胞，可以在适合其维持和扩充的生长培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。例如，为了维持和/或扩充成熟的树突细胞，可以添加细胞因子，如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白介素4(IL-4)。在其他实施方案中，可以培养和/或扩充未成熟的APC。未成熟的树突细胞可以保留摄取靶mRNA和加工新抗原的能力。在一些实施方案中，未成熟的树突细胞可以在适于其维持和培养的培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。
其他未成熟的APC可以类似地进行培养或扩充。未成熟的APC的制品可以被成熟以形成成熟的APC。APC的成熟可以在暴露于新抗原肽期间或之后发生。在某些实施方案中，未成熟树突细胞的制品可以成熟。合适的成熟因子包括，例如，细胞因子TNF-α、细菌产物(例如，BCG)等。在另一个方面，分离的APC前体可用来制备未成熟APC的制品。APC前体可以进行培养、分化和/或成熟。在某些实施方案中，单核树突细胞前体可在补充有氨基酸、维生素、细胞因子和/或二价阳离子的合适培养基的存在下培养，以促进单核树突细胞前体向未成熟树突细胞的分化。在一些实施方案中，APC前体是从PBMC分离的。PBMC可以获自供体，例如人类供体，并且可以新鲜使用或冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，APC由一种或多种APC制品制备。在一些实施方案中，APC包括负载有包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽或编码包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽的多核苷酸的APC。在一些实施方案中，APC是自体APC、同种异体APC或人工APC。
在实施方案中，本公开提供了一种包含APC的组合物，该APC含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。在另一实施方案中，本公开提供了包含APC的组合物，该APC含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。
佐剂
佐剂可用来增强在接受本文提供的组合物的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞应答)。有时，佐剂可引发Th1型应答。其他时候，佐剂可引发Th2型应答。Th1型应答的特征可在于产生诸如IFN-γ等细胞因子，相反，Th2型应答的特征可在于产生诸如IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子。
在一些方面，基于脂质的佐剂，如MPLA和MDP，可以与本文公开的免疫原性药物组合物一起使用。例如，单磷酰脂质A(MPLA)是引起脂质体抗原向特异性T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(MDP)也可以作为合适的佐剂与本文所述的免疫原性药物制剂一起使用。
合适的佐剂是本领域已知的(参见WO2015/095811)，并且包括但不限于聚(I:C)、聚-ICLC、Hiltonol、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、MontanideISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0002944947110001951
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、衍生自皂苷的Aquila的QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其他专有佐剂，如Ribi的Detox.Quil或Superfos。佐剂还包括不完全弗氏佐剂或GM-CSF。先前已经描述了几种对树突细胞特异性的免疫佐剂(Dupuis M等人,Cell Immunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92:3-11)(Mosca等人,Frontiers inBioscience,2007；12:4050-4060)(Gamvrellis等人,Immunol&Cell Biol.2004；82:506-516)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子与影响树突细胞向淋巴组织迁移(例如TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6和CD40L)(美国专利5,849,589，其通过引用整体并入本文)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人,J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6):414-418)直接相关。
佐剂还可包含刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：CCL20、a-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ(淋巴毒素α(LTα))、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、表皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮细胞趋化因子(MEC)IL-12、IL-15,、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI和TAP2。
其他佐剂包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
在一些方面，佐剂可以是toll样受体的调节剂。toll样受体调节剂的实例包括TLR-9激动剂，并且不限于toll样受体的小分子调节剂，如咪喹莫特。与本文所述的免疫原性药物组合物组合使用的佐剂的其他实例可包括但不限于皂苷、CpG ODN等。有时，佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚乙二醇嵌段聚合物、铝盐、脂质体、CpG聚合物、水包油乳液或其组合。有时，佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)且生物相容的。乳液中的油滴直径可小于5μm，甚至可具有亚微米级直径，这些小尺寸通过微流化器实现以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的小液滴可以进行过滤除菌。
治疗方法和药物组合物
本文所述的新抗原治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、APC或含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)可用于多种应用，包括但不限于治疗性处置方法，如癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗性处置方法包括免疫疗法。在某些实施方案中，新抗原肽可用于激活、促进、增加和/或增强免疫应答、将现有免疫应答重定向至新靶标、增加肿瘤的免疫原性、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、增加肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。所述使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一些方面，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽或蛋白质激活受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽促进受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽增加受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用新抗原肽增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性或体液免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL或Th活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低T调节(Treg)细胞的抑制活性。在一些实施方案中，该免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，该抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该抗原刺激是癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽激活、促进、增加和/或增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的新抗原肽，该新抗原肽将新抗原肽或多核苷酸递送至肿瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原肽。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原肽，并且该新抗原肽被所述细胞加工。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原多肽，并且新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化、被所述细胞加工的新抗原多肽，并且抗原肽呈递于该肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原肽或多核苷酸，该新抗原肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该新抗原肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括使肿瘤细胞与本文所述的新抗原多肽或多核苷酸接触，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至该肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的免疫应答。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的免疫应答得到增加。在一些实施方案中，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原肽的新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的T细胞杀伤。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增强。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增加。
在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂，其中该治疗剂是特异性结合本文所述的新抗原的抗体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体。
本公开提供了将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法。在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在一些实施方案中，现有免疫应答针对病毒。在一些实施方案中，该病毒选自：麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)。在一些实施方案中，该病毒是水痘-带状疱疹病毒。在一些实施方案中，该病毒是巨细胞病毒。在一些实施方案中，该病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，现有免疫应答在自然病毒感染之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答在针对病毒的疫苗接种之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答是细胞介导的应答。在一些实施方案中，现有免疫应答包括细胞毒性T细胞(CTL)或Th细胞。
在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至受试者的肿瘤的方法包括施用融合蛋白，该融合蛋白包含(i)特异性结合新抗原的抗体和(ii)至少一种本文所述的新抗原肽，其中(a)该融合蛋白在与肿瘤相关抗原或新表位结合后被肿瘤细胞内化；(b)将所述新抗原肽加工并与MHC I类分子相缔合地呈递于该肿瘤细胞的表面上；并且(c)所述新抗原肽/MHCI类复合物被细胞毒性T细胞识别。在一些实施方案中，该细胞毒性T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，该记忆T细胞是用新抗原肽进行接种的结果。
本公开提供了增加肿瘤免疫原性的方法。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本文所述的新抗原治疗剂接触。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。
本公开还提供了使用本文所述的新抗原治疗剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括在体外使细胞混合物与新抗原治疗剂接触。例如，与免疫细胞(例如，T细胞)混合的无限增殖化细胞系或癌细胞系在添加新抗原肽的培养基中培养。在一些实施方案中，从诸如组织活检物、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离肿瘤细胞，与免疫细胞(例如，T细胞)混合，并在添加新抗原治疗剂的培养基中培养。在一些实施方案中，新抗原治疗剂增加、促进和/或增强免疫细胞的活性。在一些实施方案中，新抗原治疗剂抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，新抗原治疗剂激活肿瘤细胞的杀伤。
在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有肿瘤或者该受试者具有至少部分去除的肿瘤。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，其包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至肿瘤细胞的抗原肽。在一些实施方案中，治疗方法包括在施用肽之前鉴定受试者中表达的一种或多种HLA亚型的步骤，使得该肽与受试者特异性表达的至少一种或多种HLA亚型结合。在一些实施方案中，如果在受试者中施用选自表34的一种或多种突变BTK肽，则在该受试者中预先确定与来自表34的肽相对应的HLA亚型的表达，使得所施用的肽与受试者特异性表达的至少一种或多种HLA亚型结合。在一些实施方案中，该方法包括确定该受试者表达由HLA-C14:02等位基因、HLA-C14:03等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-C04:01等位基因、HLA-B15:09等位基因或HLA-B38:02等位基因编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列EYMANGSLL的突变BTK肽。在一些实施方案中，该方法包括确定受试者表达由HLA-C02:02等位基因、HLA-C03:02等位基因、HLA-B53:01等位基因、HLA-C12:02等位基因、HLA-C12:03等位基因、HLA-A36:01等位基因、HLA-A26:01等位基因、HLA-A25:01等位基因、HLA-B57:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B46:01等位基因、HLA-B15:03等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-B35:03等位基因或HLA-A11:01等位基因中的任一个编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列MANGSLLNY的突变BTK肽。在一些实施方案中，该方法包括确定受试者表达由HLA-A02:04等位基因、HLA-A02:03等位基因、HLA-C03:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A32:01等位基因、HLA-A02:07等位基因、HLA-C14:03等位基因、HLA-C14:02等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A30:02等位基因、HLA-A74:01等位基因、HLA-C06:02等位基因、HLA-B15:03等位基因、HLA-B46:01等位基因、HLA-B13:02等位基因、HLA-A25:01等位基因、HLA-A29:02等位基因或HLA-C01:02等位基因中的任一个编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列SLLNYLREM的突变BTK肽。
在一些实施方案中，该方法包括确定该受试者表达由HLA-B14:02等位基因、HLA-B49:01等位基因、HLA-B44:03等位基因、HLA-B44:02等位基因、HLA-B37:01等位基因、HLA-B15:09等位基因、HLA-B41:01或HLA-B50:01等位基因中的任一个编码的蛋白质，其中所述治疗剂包含具有氨基酸序列TEYMANGSL的突变BTK肽。
在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，通过施用新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。在一些实施方案中，提供了降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂。
另外，在一些方面，本公开提供了降低受试者的肿瘤致肿瘤性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在一些实施方案中，通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率来降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，所述方法包括使用本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，通过施用本文所述的新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。
在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是选自下组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。
本公开进一步提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，该方法包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至癌细胞的抗原肽。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向受试者(例如，需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有癌性肿瘤。在某些实施方案中，该受试者具有至少部分去除的肿瘤。
受试者可以是，例如，哺乳动物、人、孕妇、老年人、成年人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿、新生儿或新生婴儿。受试者可以是患者。在一些情况下，受试者可以是人。在一些情况下，受试者可以是儿童(即青春期以下的年轻人)。在一些情况下，受试者可以是婴儿。在一些情况下，受试者可以是配方奶粉喂养的婴儿。在一些情况下，受试者可以是加入临床研究的个体。在一些情况下，受试者可以是实验室动物，例如哺乳动物或啮齿动物。在一些情况下，受试者可以是小鼠。在一些情况下，该受试者可以是肥胖的或超重的受试者。
在一些实施方案中，受试者先前已经用一种或多种不同的癌症治疗方式进行了治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种进行了治疗。在一些实施方案中，受试者已经用一、二、三、四或五线先前疗法进行了治疗。在一些实施方案中，先前的疗法是细胞毒性疗法。
在某些实施方案中，所述癌症是选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤和头颈癌的癌症。在某些实施方案中，该癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，该癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，该癌症是肺癌。在某些实施方案中，该癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，该癌症是实体癌。在一些实施方案中，该癌症包括实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是血液系统癌症。在一些实施方案中，该癌症选自：急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂作为联合治疗施用。具有两种或更多种治疗剂的联合治疗使用通过不同作用机制起作用的药剂，尽管这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂的联合治疗可引起累加或协同效应。联合治疗可以允许每种药剂的剂量低于单一疗法中所使用的剂量，从而降低毒性副作用和/或增加药剂的治疗指数。联合治疗可以降低耐药性癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，联合治疗包含影响免疫应答(例如，增强或激活该应答)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在一些情况下，免疫原性药物组合物可与附加药剂一起施用。在一些实施方案中，新抗原治疗剂可与免疫疗法一起施用。该免疫疗法可以是，例如，针对免疫检查点的抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。附加药剂的选择可以至少部分地取决于所治疗的病况。附加药剂可包括，例如，检查点抑制剂，如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3剂(例如，抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗体)；或对病原体感染(例如病毒感染)具有治疗效果的任何药剂，包括，例如，用来治疗炎性状况的药物，如NSAID，例如，布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、酮洛芬或阿司匹林。例如，检查点抑制剂可以是PD-1/PD-L1激动剂，其选自：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1 106，OPDIVO)、派姆单抗(MK-3475，KEYTRUDA)、pidilizumab(CT-011)和MPDL328OA(ROCHE)。作为另一个实例，制剂可以另外含有一种或多种补充剂，如维生素C、E或其他抗氧化剂。
本公开的方法可以用来治疗本领域已知的任何类型的癌症。通过本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例可包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。
另外，本文提供的疾病或病况包括使用本发明的治疗方法可抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。在一些实施方案中，通过本公开的治疗方法治疗的癌症选自癌、鳞状癌、腺癌、肉瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、结肠癌、结直肠癌、生殖器区域的鳞状细胞癌、黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食管癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、肉瘤、血液系统癌症、白血病、淋巴瘤、神经瘤及其组合。在一些实施方案中，通过本公开的方法治疗的癌症包括，例如，癌、鳞状癌(例如子宫颈管、眼睑、结膜、阴道、肺、口腔、皮肤、膀胱、舌头、喉和食道的癌症)和腺癌(例如，前列腺、小肠、子宫内膜、子宫颈管、大肠、肺、胰腺、食道、直肠、子宫、胃、乳腺和卵巢的癌症)。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症进一步包括肉瘤(例如，肌原性肉瘤)、白血病、神经瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是结直肠癌。
在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有实体瘤。在一些实施方案中，该实体瘤是黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或Merkel细胞癌。在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有血液系统癌症。在一些实施方案中，患者患有血液系统癌症，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、霍奇金淋巴瘤(“HL”)、非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、急性髓样白血病(“AML”)或多发性骨髓瘤(“MM”)。在一些实施方案中，待治疗的患者或患者群体的癌症选自卵巢癌、肺癌和黑素瘤。
根据本公开可以预防和/或治疗的癌症的具体实例包括但不限于以下：肾癌、肾脏癌、多形性胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌；乳腺癌；乳腺肉瘤；神经纤维瘤；神经纤维瘤病；小儿肿瘤；神经母细胞瘤；恶性黑素瘤；表皮癌；白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，如成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病，以及骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱发的骨肉瘤、佩吉特骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、小管性乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病(包括青少年佩吉特病)和炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、VIP瘤、分泌促生长素抑制素的肿瘤以及类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库欣病、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌，如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、胚细胞瘤和基质肿瘤；食管癌，例如但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈状(息肉样)、溃疡性、浅表扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；结直肠癌；KRAS突变结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性；肺癌，如KRAS突变的非小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；肺癌；睾丸癌，例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌，例如但不限于雄激素非依赖性前列腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；松果体癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、痣样恶性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾癌；维尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。
癌症包括但不限于B细胞癌症，例如，多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病(例如α链疾病、γ链疾病及μ链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如，转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔或咽部的癌症、肝癌、肾癌、睪丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症等。适用于本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人类肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病及急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病及慢性淋巴细胞白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病及非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，通过本公开的方法确定其表型的癌症是上皮癌，例如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，该癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在另外其他的实施方案中，该上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以用各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳型(brenner)或未分化的。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型(包括但不限于套细胞淋巴瘤)的治疗、诊断和/或预后。淋巴组织增生性病症也被认为是增殖性疾病。
在一些实施方案中，本文所述药剂与至少一种附加治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的毒性和/或副作用降低。
在某些实施方案中，除了施用本文所述的新抗原治疗剂外，所述方法或治疗进一步包括施用至少一种附加治疗剂。附加治疗剂可在药剂施用之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂包含1、2、3种或更多种附加治疗剂。
可与本文所述的新抗原治疗剂联合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗涉及将本文所述的药剂与化疗剂联合或与化疗剂的混合物联合施用。使用药剂的治疗可以在施用化学疗法之前、同时或之后进行。联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。这类化疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由技术人员凭经验确定。这类化学疗法的制备和给药方案也描述于TheChemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry编,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。
有用的化疗剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂、奥利斯他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托辛(lexitropsin)、亚硝基脲、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱(vinca alkaloid)等。在某些实施方案中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可用于本公开中的化疗剂包括但不限于烷化剂，例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；次乙亚胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、甲基二氯乙基胺、盐酸氧氮芥(mechiorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、卡波霉素(carnomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多醣；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(XELODA)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，附加治疗剂是卡铂。
在某些实施方案中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康(irinotecan)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，附加治疗剂是伊立替康。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗代谢物。抗代谢物是这样的化学物质：其结构类似于正常生化反应所需的代谢物，但其差异足以干扰细胞的一种或多种正常功能，如细胞分裂。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6巯嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨(cladribine)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是吉西他滨。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，该药剂是紫杉烷。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇或多西他赛，或者是紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，所述抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，如Aurora A或Plk1。在某些实施方案中，附加治疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，附加治疗剂是白蛋白结合型紫杉醇。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含诸如小分子的药剂。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子联合施用。在一些实施方案中，本公开的药剂与选自下组的蛋白激酶抑制剂联合施用：吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(RECENTIN)、索拉菲尼(NEXAVAR)和帕唑帕尼(GW786034B)。在一些实施方案中，附加治疗剂包含mTOR抑制剂。在另一个实施方案中，附加治疗剂是减少Treg细胞数的化学疗法或其他抑制剂。在某些实施方案中，所述治疗剂是环磷酰胺或抗CTLA4抗体。在另一个实施方案中，附加治疗剂减少骨髓来源的抑制细胞的存在。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是卡铂紫杉醇(carbotaxol)。在另一个实施方案中，附加治疗剂将细胞转移至1型T辅助细胞应答。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是依鲁替尼。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含生物分子，如抗体。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与针对肿瘤相关抗原的抗体(包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体)联合施用。在某些实施方案中，附加治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在某些实施方案中，附加治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，附加治疗剂是贝伐珠单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(OMNITARG)、帕尼单抗(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案如手术、放射、化学疗法和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)联合使用。例如，一组肿瘤抗原可用于例如大部分癌症患者中。
在一些实施方案中，除包含免疫原性疫苗的组合物外，还可以施用至少一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化疗剂可属于不同类别的化疗剂。
化疗剂的实例包括但不限于烷化剂，如氮芥类(例如甲基二氯乙基胺(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺
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异环磷酰胺和美法仑)；亚硝基脲类(例如N-亚硝基-N-甲基脲、链脲菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀和司莫司汀)；烷基磺酸酯类(例如白消安)；四嗪类(例如达卡巴嗪(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺
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)；氮丙啶类(例如噻替派、丝裂霉素和地吖醌)；和铂类药物(例如顺铂、卡铂和奥沙利铂)；非经典烷化剂，如丙卡巴肼和六甲蜜胺(六甲蜜胺)；抗代谢剂，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯嘌呤(6-MP)、卡培他滨
Figure BDA0002944947110002143
克拉屈滨、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷
Figure BDA0002944947110002144
地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、奈拉滨(nelarabine)、吉西他滨
Figure BDA0002944947110002145
羟基脲、氨甲蝶呤、培美曲塞
Figure BDA0002944947110002146
喷司他丁、硫鸟嘌呤、Vidaza；抗微管剂，如长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁(vinflunine))；紫杉烷类(例如紫杉醇
Figure BDA0002944947110002147
多西他赛
Figure BDA0002944947110002148
鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；埃博霉素类(epothilones)(例如伊沙匹隆
Figure BDA0002944947110002149
)；雌莫司汀
Figure BDA00029449471100021410
抗肿瘤抗生素，如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星
Figure BDA00029449471100021411
表柔比星、伊达比星)；放线菌素-D；和博莱霉素；拓扑异构酶I抑制剂，如托泊替康和伊立替康(CPT-11)；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌、新生霉素(novobiocin)、美巴龙(merbarone)和阿柔比星(aclarubicin)；皮质类固醇，如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙
Figure BDA0002944947110002151
和地塞米松
Figure BDA0002944947110002152
L-天冬酰胺酶；硼替佐米
Figure BDA0002944947110002153
免疫治疗剂，如利妥昔单抗
Figure BDA0002944947110002154
阿仑珠单抗
Figure BDA0002944947110002155
沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)
Figure BDA0002944947110002156
BCG、白介素-2、干扰素-α和癌症疫苗如
Figure BDA0002944947110002157
激素治疗剂，如氟维司群
Figure BDA0002944947110002158
他莫昔芬、托瑞米芬
Figure BDA0002944947110002159
阿那曲唑
Figure BDA00029449471100021510
依西美坦
Figure BDA00029449471100021511
来曲唑
Figure BDA00029449471100021512
醋酸甲地孕酮
Figure BDA00029449471100021513
雌激素、比卡鲁胺
Figure BDA00029449471100021514
氟他胺
Figure BDA00029449471100021515
尼鲁米特
Figure BDA00029449471100021516
亮丙瑞林
Figure BDA00029449471100021517
和戈舍瑞林
Figure BDA00029449471100021518
分化剂，如类视黄醇类、维甲酸(ATRA或
Figure BDA00029449471100021519
)、贝沙罗汀
Figure BDA00029449471100021520
和三氧化二砷
Figure BDA00029449471100021521
以及靶向治疗剂，如伊马替尼
Figure BDA00029449471100021522
吉非替尼
Figure BDA00029449471100021523
和舒尼替尼
Figure BDA00029449471100021524
在一些实施方案中，该化学疗法是鸡尾酒疗法。鸡尾酒疗法的实例包括但不限于CHOP/R-CHOP(美罗华(rituxan)、环磷酰胺、羟基多柔比星、长春新碱和泼尼松)、EPOCH(依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、羟基多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、长春新碱、羟基多柔比星、地塞米松)、FOLFOX(氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、DHAP(高剂量阿糖胞苷[ara-C]、地塞米松、顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、阿糖胞苷[ara-C]、顺铂)和CMF(环磷酰胺、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶)。
在一些实施方案中，免疫原性疫苗可以与磷酸肌醇3-激酶(PI3激酶，PI3K)的抑制剂联合使用。例如，免疫原性疫苗可与渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibisconeC、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477、AEZS-136或其任意组合联合使用。
在一些实施方案中，对于PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136，其用于人类治疗的剂量可以在每天约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，每天约0.1mg/kg至约100mg/kg，每天约0.1mg/kg至约50mg/kg，每天约10mg/kg或每天约30mg/kg)的范围内。所需的剂量可以方便地以单剂量或作为多剂量施用，该多剂量以适当的间隔施用，例如每天2、3、4个或更多个亚剂量。
在一些实施方案中，PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136的剂量可以是约1ng/kg至约100mg/kg。PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136的剂量可以是任何剂量，包括但不限于约1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μμg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg、1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
免疫原性疫苗和PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136的施用方式可以是同时或顺序施用，其中免疫原性疫苗和至少一种附加药学活性剂顺序(或分开)施用。例如，免疫原性疫苗和PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136，可以以单个单位剂型提供以便一起使用，或作为分开的实体(例如在分开的容器中)提供，以便同时或以一定的时间差施用。该时间差可以是1小时至1个月，例如1天至1周，例如48小时至3天。另外，免疫原性疫苗的施用方式可以不同于PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。例如，可能有利的是，静脉内施用免疫原性疫苗或PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136，而另一种则全身或口服施用。例如，静脉内或皮下施用免疫原性疫苗，而口服施用PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibisconeC、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，在时间上在PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136之前，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用PI3激酶抑制剂之前1-24小时、2-24小时、3-24小时、4-24小时、5-24小时、6-24小时、7-24小时、8-24小时、9-24小时、10-24小时、11-24小时、12-24小时、1-30天、2-30天、3-30天、4-30天、5-30天、6-30天、7-30天、8-30天、9,-30天、10-30天、11-30天、12-30天、13-30天、14-30天、15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、21-30天、22-30天、23-30天、24-30天、25-30天、26-30天、27-30天、28-30天、29-30天、1-4周、2-4周、3-4周、1-12个月、2-12个月、3-12个月、4-12个月、5-12个月、6-12个月、7-12个月、8-12个月、9-12个月、10-12个月、11-12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用PI3激酶抑制剂之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，在施用PI3激酶抑制剂之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，在施用PI3激酶抑制剂之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，免疫原性疫苗与所述至少一种附加药学活性剂在时间上同时施用。
在一些实施方案中，在时间上在PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136之后，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前1-24小时、2-24小时、3-24小时、4-24小时、5-24小时、6-24小时、7-24小时、8-24小时、9-24小时、10-24小时、11-24小时、12-24小时、1-30天、2-30天、3-30天、4-30天、5-30天、6-30天、7-30天、8-30天、9,-30天、10-30天、11-30天、12-30天、13-30天、14-30天、15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、21-30天、22-30天、23-30天、24-30天、25-30天、26-30天、27-30天、28-30天、29-30天、1-4周、2-4周、3-4周、1-12个月、2-12个月、3-12个月、4-12个月、5-12个月、6-12个月、7-12个月、8-12个月、9-12个月、10-12个月、11-12个月或其任意组合，施用PI3激酶抑制剂。在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用PI3激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用PI3激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用PI3激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的PI3激酶抑制剂。例如，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
在一些实施方案中，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的周期，每天一次、两次或三次施用免疫原性疫苗，连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，随后休息1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天(例如，不施用免疫原性疫苗/停止治疗)；并且在一天或多天(例如，在第1周期的第1天)，在施用免疫原性疫苗之前、同时或之后，施用PI3激酶抑制剂(例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136)。在一些实施方案中，该联合治疗施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13个周期。在一些实施方案中，该联合治疗施用28天的1至12或13个周期(例如，约12个月)。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的PI3激酶抑制剂，例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136，和第二活性剂，如检查点抑制剂。在一些实施方案中，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的周期，每天一次、两次或三次施用免疫原性疫苗，连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，随后休息1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天(例如，不施用免疫原性疫苗/停止治疗)；在一天或多天(例如，在第1周期的第1天)，在施用免疫原性疫苗之前、同时或之后，施用PI3激酶抑制剂(例如渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136)，并且每天、每周、每月施用第二药剂。在一些实施方案中，该联合治疗施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13个周期。在一些实施方案中，该联合治疗施用28天的1至12或13个周期(例如，约12个月)。
在一些实施方案中，免疫原性疫苗可以与细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，例如与CDK4和/或CDK6的抑制剂联合使用。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是帕博西尼(IBRANCE)(参见，例如，Clin.Cancer Res.；2015,21(13)；2905–10)。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是瑞博西尼。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是阿贝西尼。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是塞利西利。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是dinaciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是milciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是roniciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是atuveciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是briciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是riviciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是塞利西利。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是trilaciclib。可以与本发明的免疫原性疫苗联合使用的这类抑制剂的一个实例是voruciclib。在一些实例中，本公开的免疫原性疫苗可以与CDK4和/或CDK6的抑制剂，以及与增强CDK4/6抑制剂的细胞抑制活性的药剂，以及/或者与将可逆白细胞淤积转化为不可逆生长停滞或细胞死亡的药剂联合使用。示例性癌症亚型包括NSCLC、黑素瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、脂肪肉瘤和套细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，用于人类治疗的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼的剂量可以在每天约0.01mg/kg至约100mg/kg的范围内(例如，每天约0.1mg/kg至约100mg/kg，每天约0.1mg/kg至约50mg/kg，每天约10mg/kg或每天约30mg/kg)。所需的剂量可以方便地以单剂量或作为多剂量施用，该多剂量以适当的间隔施用，例如每天2、3、4个或更多个亚剂量。
在一些实施方案中，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼的剂量可以是约1ng/kg至约100mg/kg。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼的剂量可以是任何剂量，包括但不限于约1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μμg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg、1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
免疫原性疫苗和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼的施用方式可以是同时或顺序施用，其中免疫原性疫苗和至少一种附加药学活性剂顺序(或分开)施用。例如，免疫原性疫苗和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼，可以以单个单位剂型提供以便一起使用，或作为分开的实体(例如在分开的容器中)提供，以便同时或以一定的时间差施用。该时间差可以是1小时至1个月，例如1天至1周，例如48小时至3天。另外，免疫原性疫苗的施用方式可以不同于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。例如，可能有利的是，静脉内施用免疫原性疫苗或细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼，而另一种则全身或口服施用。例如，静脉内或皮下施用免疫原性疫苗，而口服施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。
在一些实施方案中，在时间上在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼之前，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂之前1-24小时、2-24小时、3-24小时、4-24小时、5-24小时、6-24小时、7-24小时、8-24小时、9-24小时、10-24小时、11-24小时、12-24小时、1-30天、2-30天、3-30天、4-30天、5-30天、6-30天、7-30天、8-30天、9,-30天、10-30天、11-30天、12-30天、13-30天、14-30天、15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、21-30天、22-30天、23-30天、24-30天、25-30天、26-30天、27-30天、28-30天、29-30天、1-4周、2-4周、3-4周、1-12个月、2-12个月、3-12个月、4-12个月、5-12个月、6-12个月、7-12个月、8-12个月、9-12个月、10-12个月、11-12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，在施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，在施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。例如，可在施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用免疫原性疫苗。
在一些实施方案中，免疫原性疫苗与所述至少一种附加药学活性剂在时间上同时施用。
在一些实施方案中，在时间上在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼之后，施用免疫原性疫苗。在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前1-24小时、2-24小时、3-24小时、4-24小时、5-24小时、6-24小时、7-24小时、8-24小时、9-24小时、10-24小时、11-24小时、12-24小时、1-30天、2-30天、3-30天、4-30天、5-30天、6-30天、7-30天、8-30天、9,-30天、10-30天、11-30天、12-30天、13-30天、14-30天、15-30天、16-30天、17-30天、18-30天、19-30天、20-30天、21-30天、22-30天、23-30天、24-30天、25-30天、26-30天、27-30天、28-30天、29-30天、1-4周、2-4周、3-4周、1-12个月、2-12个月、3-12个月、4-12个月、5-12个月、6-12个月、7-12个月、8-12个月、9-12个月、10-12个月、11-12个月或其任意组合，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。
在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。
在一些实施方案中，在施用免疫原性疫苗之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，可在施用免疫原性疫苗之前约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9,天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其任意组合，施用塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼。
在一些实施方案中，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的周期，每天一次、两次或三次施用免疫原性疫苗，连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，随后休息1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天(例如，不施用免疫原性疫苗/停止治疗)；并且在一天或多天(例如，在第1周期的第1天)，在施用免疫原性疫苗之前、同时或之后，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼)。在一些实施方案中，该联合治疗施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13个周期。在一些实施方案中，该联合治疗施用28天的1至12或13个周期(例如，约12个月)。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗病况或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的免疫原性疫苗联合治疗有效量的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼，以及第二活性剂，如检查点抑制剂。在一些实施方案中，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的周期，每天一次、两次或三次施用免疫原性疫苗，连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，随后休息1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天(例如，不施用免疫原性疫苗/停止治疗)；在一天或多天(例如，在第1周期的第1天)，在施用免疫原性疫苗之前、同时或之后，施用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如塞利西利、瑞博西尼、阿贝西尼或帕博西尼)，并且每天、每周、每月施用第二药剂。在一些实施方案中，该联合治疗施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13个周期。在一些实施方案中，该联合治疗施用28天的1至12或13个周期(例如，约12个月)。
在某些实施方案中，附加治疗剂包含第二免疫治疗剂。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂包括但不限于集落刺激因子、白介素、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体)、增强免疫细胞功能的抗体(例如，抗GITR抗体、抗OX-40抗体、抗CD40抗体或抗4-1BB抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配体(例如，GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配体或4-1BB配体-Fc)或B7家族成员(例如，CD80、CD86)。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。
在一些实施方案中，附加治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗GITR抗体、抗4-1BB抗体或抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地珠单抗(pidilzumab)、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317和PDR001的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS935559(MDX-1105)、阿特利珠单抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)和阿维鲁单抗(MSB0010718C)的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自伊匹木单抗(YERVOY)和曲美木单抗的抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS-986016和LAG525的抗LAG-3抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自MEDI6469、MEDI0562和MOXR0916的抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自PF-05082566的抗4-1BB抗体。
在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂可与选自下组的生物分子联合施用：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在一些实施方案中，采用本文所述的新抗原治疗剂的治疗可以伴随着手术切除肿瘤、去除癌细胞或治疗医师认为必需的其他任何手术疗法。
在某些实施方案中，治疗涉及与放射疗法联合施用本文所述的新抗原治疗剂。用药剂治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后进行。这类放射疗法的给药方案可由熟练的执业医师确定。
联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
应当理解，本文所述的新抗原治疗剂与至少一种附加治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将所述药剂施用于先前已经接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其他实施方案中，新抗原治疗剂和第二治疗剂基本上同时或并行施用。例如，可以在进行采用第二治疗剂(例如，化学疗法)的疗程的同时给予受试者药剂。在某些实施方案中，在用第二治疗剂治疗的1年内施用新抗原治疗剂。应进一步理解，可在几小时或几分钟内(即，基本上同时)将两种(或更多种)药剂或治疗施用于受试者。
对于疾病的治疗，本文所述的新抗原治疗剂的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、施用药剂是用于治疗还是预防目的、既往治疗、患者的临床病史等，所有均由治疗医师决定。新抗原治疗剂可以一次性施用或在持续数天至数月的一系列治疗期间施用，或施用直至实现治愈或达到疾病状态减轻(例如，肿瘤大小减小)。最佳给药方案可以根据患者体内药物累积的测量来计算，并且将根据单独药剂的相对效力而不同。用药医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复频率。
在一些实施方案中，新抗原治疗剂可以以初始较高的“负荷”剂量施用，随后以一个或多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，然后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用额外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每隔一周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用三个初始剂量3周，然后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以至于阻止以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，必须停止治疗，而可以尝试其他药剂。然而，同一治疗类别中的许多药剂显示出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者必须停止治疗，或者如果可能的话，遭受与治疗剂相关的令人不愉快的副作用。
在一些实施方案中，给药方案可以限于特定次数的施用或“周期”。在一些实施方案中，所述药剂施用3、4、5、6、7、8个或更多个周期。例如，所述药剂每2周施用，持续6个周期，所述药剂每3周施用，持续6个循环，所述药剂每2周施用，持续4个周期，所述药剂每3周施用，持续4个周期，等等。给药方案可以由本领域技术人员决定并随后进行修改。
本公开提供了向受试者施用本文所述的新抗原治疗剂的方法，其包括使用间歇给药策略施用一种或多种药剂，这可以减少与药剂、化疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的化疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的第二免疫治疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每2周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每3周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每4周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，使用间歇给药策略施用所述药剂，并且每周施用附加治疗剂。
本公开提供了包含本文所述的新抗原治疗剂的组合物。本公开还提供了包含本文所述的新抗原治疗剂和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，该药物组合物可用于抑制受试者(例如，人类患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该药物组合物可用于治疗受试者(例如，人类患者)中的癌症。
通过将本公开的新抗原治疗剂与药学上可接受的媒介物(例如，载体或赋形剂)组合，制备制剂以供储存和使用。本领域技术人员通常认为药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。示例性制剂在WO 2015/095811中列出。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒性缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物，例如Zn-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London)。在一些实施方案中，所述媒介物是5％右旋糖水溶液。
本文所述的药物组合物可以以任何数量的用于局部或全身治疗的方式施用。施用可以是通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)的肺部施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如，注射或输注)或颅内(例如，鞘内或脑室内)。
治疗制剂可以是单位剂型。这类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、水或非水性介质中的溶液或悬浮物或栓剂。
本文所述的新抗原肽还可以包埋在微胶囊中。这类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。
在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本文所述的新抗原治疗剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发产生。通过具有确定孔径的过滤器可挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方案中，可以产生包含本文所述的新抗原肽的持续释放制品。持续释放制品的合适的实例包括含有药剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是成型物品(例如，膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸、L-谷氨酸与L-谷氨酸7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本公开提供了包括免疫原性疫苗的治疗方法。提供了治疗疾病(如癌症或病毒感染)的方法。方法可包括向受试者施用有效量的包含免疫原性抗原的组合物。在一些实施方案中，该抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，该抗原包括肿瘤抗原。
可以制备的疫苗的非限制性实例包括基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗、基于T细胞的疫苗和基于抗原呈递细胞的疫苗。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制疫苗组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性剂加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于选定的给药途径。任何公知的技术、载体和赋形剂均可作为如本领域所理解的合适的技术、载体和赋形剂。
在一些情况下，疫苗组合物被配制为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于细胞的疫苗。例如，疫苗组合物可包括阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.等人,J.Clin.Invest.95:341,1995)、包封在例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中的裸cDNA或肽(参见，例如，Eldridge等人,Molec.Immunol.28:287-294,1991；Alonso等人,Vaccine 12:299-306,1994；Jones等人,Vaccine 13:675-681,1995)；免疫刺激复合物(ISCOMS)中含有的肽组合物(例如，Takahashi等人,Nature 344:873-875,1990；Hu等人,Clin Exp Immunol.113:235-243,1998)；或多抗原肽系统(MAP)(参见例如，Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988；Tarn,J.P.,J.Immunol.Methods 196:17-32,1996)。有时，疫苗被配制为基于肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中该核酸编码多肽。有时，疫苗被配制为基于抗体的疫苗。有时，疫苗被配制为基于细胞的疫苗。
可以使用经鉴定的疾病特异性免疫原性新抗原肽的氨基酸序列来开发药学上可接受的组合物。抗原的来源可以是但不限于天然或合成蛋白质，包括糖蛋白、肽和超抗原；抗体/抗原复合物；脂蛋白；RNA或其翻译产物；以及DNA或由DNA编码的多肽。抗原的来源也可以包含未转化、转化、转染或转导的细胞或细胞系。可以使用本领域普通技术人员已知的可用于表达重组抗原的任何多种表达或逆转录病毒载体来转化、转染或转导细胞。还可以在用含有编码重组抗原的DNA分子的表达或逆转录病毒载体转化、转染或转导的任何合适的宿主细胞中实现表达。可以使用本领域技术人员已知的任何数量的转染、转化和转导方案。重组痘苗载体和用痘苗载体感染的细胞可用作抗原的来源。
组合物可包含合成的疾病特异性免疫原性新抗原肽。组合物可包含两种或更多种疾病特异性免疫原性新抗原肽。组合物可包含疾病特异性免疫原性肽的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。疾病特异性免疫原性肽的前体可以生成经鉴定的疾病特异性免疫原性新抗原肽或根据所述新抗原肽生成。在一些实施方案中，治疗组合物包含免疫原性肽的前体。疾病特异性免疫原性肽的前体可以是前药。在一些实施方案中，包含疾病特异性免疫原性新抗原肽的组合物可进一步包含佐剂。例如，新抗原肽可用作疫苗。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含药学上可接受的免疫原性新抗原肽。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽的药学上可接受的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的抗体。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的可溶性TCR或TCR类似物。
本文描述的方法在个性化医学环境中特别有用，其中使用免疫原性新抗原肽为同一个体开发治疗剂(如疫苗或治疗性抗体)。因此，治疗受试者疾病的方法可包括根据本文所述的方法鉴定受试者中的免疫原性新抗原肽；合成该肽(或其前体)；以及向受试者施用该肽或特异性识别该肽的抗体。在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生患者特异性疫苗的必要基础。在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生针对患有特定疾病的一组患者的疫苗的必要基础。因此，可在患者组中选择性地治疗特定疾病，例如，特定类型的肿瘤。
在一些实施方案中，本文所述的肽是结构上正常的抗原，其可以在大的患者组中被自体抗疾病T细胞识别。在一些实施方案中，测定其疾病表达结构上正常的新抗原的一组患病受试者的抗原表达模式。
在一些实施方案中，本文所述的肽含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的肽含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。
有多种方法可以产生免疫原性新抗原。蛋白质或肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽、从天然来源分离蛋白质或肽、体外翻译或化学合成蛋白质或肽。通常，这类疾病特异性新抗原可以在体外或体内产生。免疫原性新抗原可以在体外作为肽或多肽产生，然后可以将其配制成个性化疫苗或免疫原性组合物并施用于受试者。免疫原性新抗原的体外产生可包括肽合成或在任何多种细菌、真核或病毒重组表达系统中从DNA或RNA分子表达肽/多肽，随后纯化所表达的肽/多肽。或者，可以通过将编码免疫原性新抗原的分子(例如DNA、RNA和病毒表达系统)引入受试者中，由此表达所编码的免疫原性新抗原，从而在体内产生免疫原性新抗原。在一些实施方案中，编码免疫原性新抗原肽的多核苷酸可用于在体外产生新抗原肽。
在一些实施方案中，多核苷酸包含与编码免疫原性新抗原的多核苷酸具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，多核苷酸的天然或稳定化形式，或其组合。编码免疫原性新抗原肽的核酸序列可以含有或可以不含内含子，只要该核酸序列编码所述肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。
还设想了包含编码新抗原的序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。适用于本公开的表达载体可包含至少一个与核酸序列可操作地连接的表达控制元件。将表达控制元件插入载体中以控制并调节核酸序列的表达。表达控制元件的实例是本领域公知的，并且包括例如lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母启动子以及来源于多瘤、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号以及核酸序列在宿主系统中适当转录和后续翻译所必需或优选的其他任何序列。本领域技术人员应当理解，表达控制元件的正确组合将取决于所选择的宿主系统。应进一步理解，所述表达载体应含有在宿主系统中转移和后续复制含有核酸序列的表达载体所必需的其他元件。这类元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标记。
新抗原肽可以以编码所需新抗原肽的RNA或cDNA分子的形式提供。本公开的一种或多种新抗原肽可以由单一表达载体编码。通常，将DNA以适当的取向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中用于表达，如有必要，DNA可以与由所需宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后将载体引入宿主细菌中以使用标准技术进行克隆。用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人的有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更宽的宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
在实施方案中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成可构建编码目的多肽的DNA序列。可以基于所需多肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可以应用标准方法合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。
用于表达多肽的合适的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以使用无细胞翻译系统。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体是本领域公知的。可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。示例性哺乳动物宿主细胞系包括但不限于COS-7、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，如复制起点，与待表达的基因连接的合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受体位点以及转录终止序列。
可以根据任何合适的方法纯化由转化的宿主产生的蛋白质。这类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和大小分级柱色谱法等)，离心、差异溶解性或通过用于蛋白质纯化的其他任何标准技术。诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳序列、谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以附接至该蛋白质上，以允许通过合适的亲和柱轻松纯化。分离的蛋白质还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术进行物理表征。
疫苗可包含结合本文所述的多肽序列的实体。该实体可以是抗体。基于抗体的疫苗可以使用如本领域所理解的任何公知的技术、载体和赋形剂配制。在一些实施方案中，本文所述的肽可用于制备新抗原特异性治疗剂，如抗体治疗剂。例如，新抗原可用来产生和/或鉴定特异性识别新抗原的抗体。这些抗体可用作治疗剂。该抗体可以是自然抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或者可以是抗体片段。该抗体可以识别一种或多种本文所述的多肽。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至多40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至少40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至少30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至多30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本公开还设想使用核酸分子作为媒介物，以供在体内以例如DNA/RNA疫苗的形式将新抗原肽/多肽递送至有需要的受试者。
在一些实施方案中，所述疫苗是核酸疫苗。在一些实施方案中，可以通过使用质粒将新抗原施用于受试者。可以通过多种不同的方法将质粒引入动物组织中，例如，将裸DNA注射或气雾剂滴注在粘膜表面如鼻和肺粘膜上。在一些实施方案中，可以使用物理递送，例如使用“基因枪”。表达载体的确切选择可取决于待表达的肽/多肽，并且完全在普通技术人员的技能范围内。
在一些实施方案中，所述核酸编码免疫原性肽或肽前体。在一些实施方案中，所述核酸疫苗包含在编码免疫原性肽或肽前体的序列侧翼的序列。在一些实施方案中，该核酸疫苗包含超过一个免疫原性表位。在一些实施方案中，该核酸疫苗是基于DNA的疫苗。在一些实施方案中，该核酸疫苗是基于RNA的疫苗。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含mRNA。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含裸mRNA。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含修饰的mRNA(例如，使用鱼精蛋白保护免于降解的mRNA、含有修饰的5’帽结构的mRNA或含有修饰的核苷酸的mRNA)。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含单链mRNA。
多核苷酸可以是基本上纯的，或包含在合适的载体或递送系统中。合适的载体和递送系统包括病毒，如基于腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含有超过一种病毒的元件的杂合体的系统。非病毒递送系统包括阳离子脂质和阳离子聚合物(例如，阳离子脂质体)。
可以使用基于病毒的系统在体内编码并表达一种或多种新抗原肽。在本公开中可使用病毒载体作为重组载体，其中删除病毒基因组的一部分以引入新基因而不破坏病毒的感染性。本公开的病毒载体是非致病性病毒。在一些实施方案中，该病毒载体对哺乳动物中的特定细胞类型具有趋向性。在另一个实施方案中，本公开的病毒载体能够感染专职抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞。在本公开的又一个实施方案中，该病毒载体能够感染哺乳动物中的任何细胞。该病毒载体还可以感染肿瘤细胞。在本公开中使用的病毒载体包括但不限于痘病毒如痘苗病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒和高度减毒的痘苗病毒(Ankara或MVA)、逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等。
疫苗可以通过多种途径递送。递送途径可包括经口(包括经颊和舌下)、直肠、经鼻、局部、透皮贴剂、经肺、阴道、栓剂或胃肠外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用，或者以适于通过雾化、吸入或吹入施用的形式施用。关于药物递送系统的一般信息可见Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。本文所述的疫苗可以施用于肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射或以透皮方式(例如通过离子电渗)施用。可以使用疫苗的表皮施用。
在一些情况下，疫苗还可以被配制用于通过鼻道施用。其中载体是固体的适合经鼻施用的制剂可包括粒径例如在约10至约500微米范围内的粗粉末，其以鼻吸的方式施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。该制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器进行气雾剂施用。该制剂可包括疫苗的水性或油性溶液。
疫苗可以是液体制品，如悬浮液、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制品，如无菌悬浮液或乳液。
疫苗可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在多剂量设置中优选包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或除此之外)，所述组合物可被包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。
疫苗可以以约0.5mL的剂量体积施用，但半剂量(即约0.25mL)可施用于儿童。有时，疫苗可以以更高的剂量施用，例如约1ml。
疫苗可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1、2、3或4个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以2个剂量疗程方案来施用。
第一剂量和第二剂量的施用可以间隔约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更多年。
本文所述的疫苗可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每2、3、4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗施用一次。
所述剂量实例并非限制性的，并且仅用来举例说明用于施用本文所述疫苗的特定给药方案。可以从动物模型确定用于人类的有效量。例如，可以配制用于人类的剂量以达到已发现对动物有效的循环、肝脏、局部和/或胃肠道浓度。基于动物数据和其他类型的相似数据，本领域技术人员可以确定适合人类的疫苗组合物的有效量。
在提及药剂或药剂组合时，有效量通常意指已由医学或制药领域的任何各种管理或咨询组织(例如，FDA、AMA)或者由制造商或供应商推荐或批准的剂量范围、给药方式、制剂等。
在一些方面，本文所述的疫苗和试剂盒可以在2℃至8℃之间储存。在一些情况下，疫苗不冷冻储存。在一些情况下，将疫苗储存在如-20℃或-80℃的温度下。在一些情况下，将疫苗避光储存。
试剂盒
本文所述的新抗原治疗剂可以与给药说明书一起以试剂盒形式提供。通常，该试剂盒包括在容器中的单位剂型形式的所需新抗原治疗剂和给药说明书。该试剂盒中还可包括附加治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。其他可能需要的试剂盒组分包括，例如，无菌注射器、加强剂量和其他所需的赋形剂。
本文还提供了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。该试剂盒可含有一种或多种包含一个或多个新表位的新抗原多肽。该试剂盒还可含有编码一种或多种本文所述的肽或蛋白质的核酸，识别一种或多种本文所述肽的抗体，或用一种或多种本文所述肽激活的基于APC的细胞。该试剂盒可以进一步含有组成和递送该疫苗所必需的佐剂、试剂和缓冲液。
该试剂盒还可包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含将在本文描述的方法中使用的一种单独元素，如肽和佐剂。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。该容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般也包括一套说明书。
将通过具体实施例更详细地描述本公开内容。提供以下实施例是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本公开内容。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生本公开的替代实施方案的多种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均通过引用整体并入本文。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1-CD4+和CD8+ T细胞应答的诱导
利用体外T细胞诱导来扩充新抗原特异性T细胞。通过以下方式为这些试验准备成熟的专职APC。使用基于珠子的试剂盒(Miltenyi)从健康人类供体PBMC中富集单核细胞。将富集的细胞接种在GM-CSF和IL-4中以诱导未成熟的DC。5天后，将未成熟的DC与肽池在37℃下一起孵育1小时，之后加入细胞因子成熟混合物(GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6、TNFα、PGE1β)。肽池可包含多个突变，短聚体(shortmers)和长聚体(longmers)分别扩充CD8+和CD4+ T细胞。将细胞在37℃下孵育至成熟DC。
在DC成熟后，将PBMC(大量的或针对T细胞富集的)与增殖细胞因子一起加入到成熟树突细胞中。使用功能分析和/或四聚体染色的组合监测培养物的肽特异性T细胞。使用修饰的肽和亲本肽的平行免疫原性测定允许比较所述肽扩充肽特异性T细胞的相对效率
实施例2-四聚体染色测定
MHC四聚体是购买的或原地制备的，并且用来在免疫原性测定中测量肽特异性T细胞扩充。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体加入到含有1％FCS和0.1％叠氮钠(FACS缓冲液)的PBS中的1x105个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。然后添加对T细胞标志物如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的终浓度，并将细胞在4℃下在黑暗中孵育20分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞，并将其重悬浮于含有1％甲醛的缓冲液中。在FACS Calibur(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用Cellquest软件(BectonDickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，从前向和侧向散射图上选取淋巴细胞门(gate)。数据被报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比。
实施例3-细胞内细胞因子染色测定
在不存在完善的用于鉴定抗原特异性T细胞群体的四聚体染色的情况下，可以使用完善的流式细胞术测定，使用对细胞因子产生的评估来估计抗原特异性。简言之，用目的肽刺激T细胞并与对照进行比较。刺激后，通过细胞内染色评估CD4+ T细胞的细胞因子(例如，IFNγ和TNFα)产生。这些细胞因子，尤其是IFNγ，可用来鉴定经刺激的细胞。图11描绘了对于用负载有或不具有GATA3 neoORF肽的APC刺激的健康HLA-A02:01供体的CD4+细胞，IFNγ和TNFα水平的抗原特异性诱导的FACS分析。
实施例4-ELISPOT测定
使用ELISPOT测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定在单细胞基础上测定IFNγ从T细胞的释放。将靶细胞(T2或HLA-A0201转染的C1R)用10μM肽在37℃下脉冲1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的靶标在ELISPOT板孔中与取自免疫原性培养物的不同浓度的T细胞(5x102至2x103)共培养。根据制造商的方案对板进行显色，并在ELISPOT读取仪(Cellular Technology Ltd.)上使用附带的软件进行分析。将对应于产生IFNγ的T细胞数的斑点报告为绝对斑点数/接种的T细胞数。对于在修饰的肽上扩充的T细胞，不仅检测它们识别用修饰的肽脉冲的靶标的能力，而且还检测它们识别用亲本肽脉冲的靶标的能力。图35是显示IFNγ的抗原特异性诱导的图示。显示了模拟转导的或用编码GATA3 neoORF肽的慢病毒表达载体转导的两个样品的IFNγ水平。
实施例5-CD107染色测定
在用同源肽激活后，CD107a和b在CD8+ T细胞的细胞表面上表达。T细胞的裂解颗粒具有含有溶酶体相关膜糖蛋白(“LAMP”)的脂双层，该溶酶体相关膜糖蛋白包括分子CD107a和b。当通过T细胞受体激活细胞毒性T细胞时，这些裂解颗粒的膜动员并与T细胞的质膜融合。颗粒内容物被释放，并且这导致靶细胞死亡。当颗粒膜与质膜融合时，C107a和b暴露在细胞表面上，因此是脱颗粒的标志物。因为如通过CD107a和b染色测定的脱颗粒是在单细胞基础上报告的，所以该测定用来对肽特异性T细胞进行功能性计数。为了进行该测定，将肽加入到HLA-A02:01转染的细胞C1R中至终浓度为20μM，将细胞在37℃下孵育1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的C1R细胞等分到试管中，并添加CD107a和b特异性抗体至制造商(Becton Dickinson)建议的终浓度。在添加T细胞之前加入抗体，以“捕获”CD107分子，因为它们在测定过程中瞬时出现在表面上。然后加入来自免疫原性培养物的1x105个T细胞，并将样品在37℃下孵育4小时。针对其他细胞表面分子如CD8对T细胞进一步染色，并且在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得所述T细胞。使用附带的Cellquest软件分析数据，并将结果报告为CD8+/CD107a和b+细胞的百分比。图34是显示细胞毒性标志物CD107a的抗原特异性诱导的图示。显示了模拟转导的或用编码GATA3 neoORF肽的慢病毒表达载体转导的两个样品中CD107a+细胞相对于总CD8+细胞的百分比。
实施例6-细胞毒性测定
使用方法1或方法2测定细胞毒活性。方法1需要铬释放测定。将靶T2细胞在37℃下用Na51Cr标记1小时，然后将洗涤过的5x103个靶T2细胞加入到来自免疫原性培养物的不同数目的T细胞。在37℃下孵育4小时后收获的上清液中测定铬释放。特异性裂解的百分比计算如下：
方程式10.实验释放-自发释放/总释放-自发释放x100。
在方法2中，通过用流式细胞术检测靶细胞中裂解的胱天蛋白酶3来测量细胞毒性活性。将靶癌细胞工程改造为表达突变肽以及适当的MHC-I等位基因。模拟转导的靶细胞(即不表达突变肽)用作阴性对照。用CFSE标记细胞，以将它们与用作效应细胞的经刺激的PBMC区分开。在收获前，将靶细胞和效应细胞共培养6小时。进行细胞内染色，以检测CFSE阳性靶癌细胞中胱天蛋白酶3的切割形式。特异性裂解的百分比计算如下：
方程式11.胱天蛋白酶3的实验切割/胱天蛋白酶3的自发切割(在没有突变肽表达的情况下测量的)x100。
方法2的细胞毒性测定在本文实施例25的材料与方法部分中提供。
实施例7-依次使用长聚体和短聚体在体内增强的CD8+ T细胞应答
长聚体肽的疫苗接种可诱导CD4+和CD8+ T细胞应答，具体取决于肽的加工和呈递。用最小的短聚体表位进行的疫苗接种着重于产生CD8+ T细胞应答，但在抗原呈递之前不需要肽加工。这样，任何细胞都可以轻松呈递表位，而不仅仅是专职抗原呈递细胞(APC)。这可导致与呈递抗原的健康细胞接触的T细胞的耐受性，作为外周耐受性的一部分。为了避免这种情况，用长聚体进行的初始免疫允许仅由可加工并呈递所述肽的APC引发CD8+ T细胞。后续免疫加强了初始CD8+ T细胞应答。
体内免疫原性测定
十九只8-12周龄的雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到达时随机地预先分入治疗组。在研究开始前使动物适应环境三(3)天。用LabDietTM 5053无菌啮齿动物食物和随意提供的无菌水饲养动物。第1组的动物充当仅有接种佐剂的对照，并在第0、7和14天通过皮下注射(s.c.)以0.1mL的体积施用100μg的单独聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。第2组的动物在第0、7和14天以0.1mL的体积皮下施用各50μg六种长聚体肽(如下所述)之一以及100μg聚I:C。第3组的动物在第0天以0.1mL的体积皮下施用各50μg六种长聚体肽(如下所述)之一以及100μg聚I:C，并在第7天和第14天以0.1mL的体积皮下施用摩尔匹配当量的相应短聚体肽(如下所述)以及100μg聚I:C。每天对动物称重并监测其总体健康状况。如果动物体重与第0天的体重相比减轻30％以上，或者如果发现动物濒死，则在第21天研究结束时用过量的CO2对动物实施安乐死。处死时，使用标准方案收获脾脏并将其加工成单细胞悬浮液。简言之，通过70μM过滤器机械降解脾脏，将其沉淀，并用ACK裂解缓冲液(Sigma)裂解，之后重悬于细胞培养基中。
肽
六种先前鉴定的鼠新抗原根据其显示出的诱导CD8+ T细胞应答的能力进行使用。对于每种新抗原，已经定义了对应于最小表位的短聚体(8-11个氨基酸)。使用对应于围绕突变的20-27个氨基酸的长聚体。
ELISPOT
按照试剂盒方案进行ELISPOT分析(小鼠IFNγELISPOT Reasy-SET-Go；EBioscience)。简言之，在分析日的前一天，将96孔滤板(孔径为0.45μm的疏水性PVDF膜；EMD Millipore)活化(35％EtOH)，洗涤(PBS)，并用捕获抗体(1:250；4℃过夜)包被。在分析当天，将孔洗涤并封闭(介质；在37℃下2小时)。将100μL中的大约2x105个细胞与100μL10mM测试肽池(短聚体)或PMA/离子霉素阳性对照抗原或媒介物一起添加到孔中。将细胞与抗原在37℃下孵育过夜(16-18小时)。第二天，弃去细胞悬浮液，并用PBS洗涤孔一次，并用去离子水洗涤两次。对于该测定的其余部分中的所有洗涤步骤，在每个洗涤步骤中将孔浸泡3分钟。然后将孔用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温20)洗涤3次，并将检测抗体(1:250)添加到所有孔中。将板在室温下孵育两小时。弃去检测抗体溶液，并用洗涤缓冲液将孔洗涤3次。将抗生物素蛋白-HRP(1:250)添加到所有孔中，并将板在室温下孵育1小时。弃去缀合物溶液，并用洗涤缓冲液将孔洗涤3次，然后用PBS洗涤一次。将底物(3-氨基-9-乙基-咔唑，0.1M乙酸盐缓冲液，H2O2)添加到所有孔中，并监测斑点的显色(约10分钟)。通过用水洗涤孔来终止底物反应，并将板风干过夜。在ELISPOT读取仪(Cellular Technology Ltd.)上用附带的软件分析板。将对应于产生IFNγ的T细胞数的斑点报告为绝对斑点数/接种的T细胞数。
实施例8-通过质谱法检测GATA3 neoORF肽
用编码由GATA3 neoORF编码的肽的各个区域的慢病毒载体转导293T细胞。培养0.5-7亿个表达由GATA3 neoORF序列编码的肽的转导细胞，并使用酸洗液从HLA-肽复合物中洗脱出肽。然后通过MS/MS分析洗脱的肽。对于表达HLA-A02:01蛋白的293T细胞，通过质谱法检测肽VLPEPHLAL、SMLTGPPARV和MLTGPPARV(图5)。对于表达HLA-B07:02蛋白的293T细胞，通过质谱法检测肽KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL(图5)。对于表达HLA-B08:01蛋白的293T细胞，通过质谱法检测肽ESKIMFATL(图5)。
实施例9-GATA3 neoORF在多个等位基因上产生强表位。
含有以下表4中的新表位的多种肽被表达或负载到抗原呈递细胞(APC)上。然后进行质谱分析，并确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。
表4列出了示例性GATA3 neoORF在多个等位基因上产生的表位
Figure BDA0002944947110002541
实施例10-多种新表位引发CD8+ T细胞应答
使用来自人供体的PBMC样品进行抗原特异性T细胞诱导。制备T细胞后，分析CD8+T细胞的诱导。可以在不同时间点取细胞样品进行分析。使用pMHC多聚体监测诱导培养物中抗原特异性CD8+ T细胞的分数。图9A-9C和图10A-10B描绘了示例性结果，其显示了分别用SMLTGPPARV和MLTGPPARV诱导的抗原特异性CD8+记忆T细胞的分数。图9A描绘了使用来自6名不同健康供体的PBMC的T细胞应答测定的示例性结果，其显示了在刺激或诱导后通过流式细胞术分析的对MLTGPPARV肽应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数。观察到抗原特异性T细胞的分数增加。图9B描绘了使用来自健康供体的PBMC的T细胞应答测定的示例性结果，其显示了在刺激或诱导后通过流式细胞术分析的对SMLTGPPARV肽应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数。观察到抗原特异性T细胞的分数增加。在测试的五名健康供体中，有四名显示出对MLTGPPARV肽应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数增加。使用来自3名不同健康供体的PBMC的T细胞应答测定显示，在三名供体之一中，在刺激或诱导后通过流式细胞术分析的对VLPEPHLAL肽应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数增加。图9C描绘了使用来自HLA-A02:01、HLA-A03:01、HLA-A11:01、HLA-B07:02和HLA-B08:01健康供体的PBMC的T细胞应答测定的示例性结果，其显示了在刺激或诱导后通过流式细胞术分析的对SMLTGPPARV、MLTGPPARV、KIMFATLQR、KPKRDGYMFL、KPKRDGYMF或ESKIMFATL肽应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数。图10A描绘了使用来自HLA-B07:02健康供体的PBMC的T细胞应答测定的示例性结果，其显示了对刺激肽KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(分析的最小表位KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL)应答的抗原特异性CD8+T细胞的分数。图10B描绘了使用来自HLA-A02:01健康供体的PBMC的T细胞应答测定的示例性结果，其显示了对刺激肽SMLTGPPARVPAVPFDLH(分析的最小表位SMLTGPPARV和MLTGPPARV)应答的抗原特异性CD8+ T细胞的分数。
实施例11-诱导的T细胞的细胞毒性测定
使用细胞毒性测定来评估诱导的T细胞培养物是否可以杀死表达抗原的肿瘤细胞系。在该实施例中，测量了活性胱天蛋白酶3在存活和死亡的肿瘤细胞上的表达，以量化早期细胞死亡和死亡的肿瘤细胞。在图33中，诱导的CD8+应答能够杀死表达抗原的肿瘤靶标。显示了模拟转导的或用编码GATA3 neoORF肽的慢病毒表达载体转导的两个样品中，活的胱天蛋白酶-A阳性靶细胞的百分比。
实施例12-肽合成
合成并纯化以下表5中的肽。显示了预测和确定的分子量。还显示了所示肽的粗纯度和最终纯度。
表5
Figure BDA0002944947110002561
Figure BDA0002944947110002571
实施例13-合成的GATA3 neoORF肽的溶解度测试
在各种所示溶液中测试以下表6中每种肽的溶解度。SS＝琥珀酸钠。测试的制剂A包括4％DMSO，在D5W中的5mM琥珀酸钠(SS)。测试的制剂B包括无DMSO，在D5W中的5mM SS。测试的制剂C包括无DMSO，在D5W中的0.25mM SS。包含两个半胱氨酸的33聚体L15的合成是通过经序列中ES、AT和SS侧链的缀合产生伪脯氨酸结构单元来进行的。这允许将L15纯化至95％的纯度，并防止了固相肽合成过程中的聚集。
以下表6列出了肽的溶解度
Figure BDA0002944947110002581
Figure BDA0002944947110002591
实施例14-用于施用至受试者的合成GATA3 neoORF肽池的设计
根据以下表7设计了所示GATA3肽的各种池。例如，“设计1”包含三种肽池，其中池1包含三种肽(即L7、L8和L14)，池2包含两种肽(即L9和L10c)，池3包含两种肽(即L15和L11f)。例如，“设计6”包含两个肽池，其中池1包含四种肽(即L7、L8、L9和L14)，池2包含两种肽(即L15和L11f)。例如，“设计10”包含四个肽池，其中池1包含五种肽(即L7、L8、L9、L10c和L14)，池2包含一种肽(即L15)，池3包含一种肽(即，L11f)，池4包含一种肽(即L11i)。可由制备肽制剂领域的技术人员改变池中每种肽的浓度。以下表7列出了GATA3池设计的说明。
表7
Figure BDA0002944947110002601
实施例15-GATA3 neoORF肽合成
以700mg粗物质为目标进行常规合成。以下具有适当侧链保护的Fmoc-氨基酸用于构建L7肽(EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH)：Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH。通过使用H-His(Trt)-2Cl-Trt树脂或Fmoc-His(Trt)-Wang树脂预加载到树脂上，将C末端组氨酸并入序列中。可以使用Fmoc-Asp(OMpe)-OH代替Fmoc-Asp(OtBu)-OH，以帮助改善合成，例如采用“DG”的序列组合以最小化天冬酰胺的形成。
肽序列用二甲基甲酰胺(DMF)溶胀并沥干两次。合成开始于N-α-FMOC保护基的脱保护，方法是使用DMF中的20％哌啶并进行氮气分配以混合。排干后，将树脂用DMF洗涤。接下来，添加0.4M氨基酸溶液以及0.4M HCTU和0.8M DIEA。在氮气分配以混合下进行偶联反应，然后排干反应容器(RV)。使用与第一偶联步骤相同的混合和排干参数，将氨基酸、HCTU和DIEA的添加重复两个偶联循环。然后再次用DMF洗涤树脂。对每个氨基酸残基重复该循环。最终的脱保护方法通过DMF中的20％哌啶除去N末端Fmoc，并用DMF洗涤树脂，然后用MeOH洗涤。在氮气下将树脂放在仪器上直到去除。
对于微波合成，使用相同的Fmoc-氨基酸起始材料，仅利用Fmoc-His(Trt)-Wang树脂(而非H-His(Trt)-2Cl Trt树脂)并入C末端组氨酸。
在微波合成仪上，将树脂在DMF中溶胀，直到它通过HT管线转移到微波反应容器(RV)中为止。在RV中时，在85℃/90W下，随后在100℃/20W下，用DMF中的25％吡咯烷处理Fmoc-His(Trt)-OH加载的树脂，以除去N-α-FMOC。接下来，将RV排干并用DMF洗涤，然后再次排干。将编程的Fmoc-氨基酸(在DMF中0.5M)与4M DIC和0.25M Oxymapure一起添加至RV中。该偶联反应采用105℃/288W加热，随后是105℃/73W加热。最初用DMF稀释该第一次脱保护，但是任何后续脱保护均不需要该步骤，因为RV已经含有来自偶联反应的DMF。对每个残基重复脱保护、洗涤和偶联循环，直到已经合成了肽。对于精氨酸残基，进行双偶联步骤，其中在进行单偶联之后，将溶液排干，并在进行脱保护之前重复偶联步骤。如上所述进行N末端Fmoc基团的最终脱保护，不同之处在于在通过DMF转移回到原始HT树脂位置之前，排干并用DMF洗涤两次。
合成后，使用DMF将树脂转移到烧结注射器中，用MeOH冲洗，并使用真空歧管干燥。然后在振动摇床上，使用立式固定器，使用试剂K(82.5％三氟乙酸(TFA)，5％水，5％茴香硫醚，5％苯酚，和2.5％乙二硫醇)在室温下裂解树脂3小时。
然后将裂解混合物通过过滤的烧结注射器分配到冷的乙醚或冷的甲基叔丁醚(MTBE)中。然后通过搅拌用95:5的三氟乙酸:水溶液冲洗每个注射器。然后将冲洗液添加到其余的混合物/醚混合物中。然后将混合物离心。倾出乙醚后，添加另一份冷乙醚洗液。将该容器涡旋并再次离心。重复该步骤以彻底漂洗沉淀物。倾出最终的洗涤液，并通过真空干燥器干燥沉淀物。将沉淀物样品溶解在溶剂(例如，DMSO、DMF、水或乙腈)中，并通过UPLC-MS分析其身份、粗纯度和保留时间。其他肽，例如L14(SMLTGPPARVPAVPFDLH)、L8(GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD)、L10c(KPKRDGYMFLKAESKI)、L11h(FLKAESKIMFATLQR)和L11i(ESKIMFATLQRSSL)，使用这些序列特定的氨基酸和预加载树脂，以类似的方式制备。
实施例16–GATA3 neoORF肽合成
以下Fmoc-氨基酸用于合成肽L15(KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH)：Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH。通过使用H-His(Trt)-2Cl-Trt树脂或Fmoc-His(Trt)-Wang树脂预加载到树脂上，将C末端组氨酸并入该序列中。可以使用Fmoc-Asp(OMpe)-OH代替Fmoc-Asp(OtBu)-OH，以帮助改善合成，例如采用“DG”的序列组合以最小化天冬酰胺的形成。在存在丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)残基时，并入氨基酸二肽(伪脯氨酸)以提高合成产率，例如Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“SS”，Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH代替“AT”，以及Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“ES”。对于L15的某些合成，使用所有三个伪脯氨酸的组合(即Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“SS”，Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH代替“AT”，并用Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH)代替“ES”)。对于L15的其他合成，分别使用以下伪脯氨酸和伪脯氨酸组合：Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH代替“AT”且Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“ES”；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“SS”且Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“ES”；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“SS”且Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH代替“AT”；Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH代替“AT”；Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH)代替“ES”；且Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH代替“SS”。
肽序列用DMF溶胀并沥干两次。合成开始于N-α-Fmoc基团的脱保护，方法是使用DMF中的20％哌啶并进行氮气分配以混合。排干后，将树脂用DMF洗涤。接下来，添加0.4M氨基酸溶液以及0.4M HCTU和0.8M DIEA。在氮气分配以混合下进行偶联反应，然后排干反应容器(RV)。使用与第一偶联步骤相同的混合和排干参数，将氨基酸、HCTU和DIEA的添加重复两个偶联循环。然后再次用DMF洗涤树脂。对每个氨基酸残基重复该循环。最终的脱保护方法通过DMF中的20％哌啶除去N末端Fmoc，并用DMF洗涤树脂，然后用MeOH洗涤。在氮气覆盖下将树脂放在仪器上直到去除。
对于微波合成，使用相同的氨基酸起始材料，仅利用Fmoc-His(Trt)-Wang树脂(而非H-His(Trt)-2Cl Trt树脂)并入C末端组氨酸。
在微波合成仪上，将树脂在DMF中溶胀，直到它通过HT管线转移到微波反应容器(RV)中为止。在RV中时，在85℃/90W下，随后在100℃/20W下，用DMF中的25％吡咯烷处理Fmoc-His(Trt)加载的树脂，以除去N-α-Fmoc。最初用DMF稀释该第一次脱保护，但是任何后续脱保护均不需要该步骤，因为RV已经含有来自偶联反应的DMF。接下来，将RV排干并用DMF洗涤，然后再次排干。将编程的Fmoc-氨基酸(在DMF中0.5M)与4M DIC和0.25M Oxymapure一起添加至RV中。该偶联反应采用105℃/288W加热，随后是105℃/73W加热。对每个残基重复脱保护、洗涤和偶联循环，直到已经合成了肽。对于精氨酸残基，进行双偶联步骤，其中在进行单偶联之后，将溶液排干，并在进行脱保护之前重复偶联步骤。N末端Fmoc基团的最终脱保护与所有其他脱步骤相同地进行，不同之处在于在通过DMF转移回到原始HT树脂位置之前，排干并用DMF洗涤两次。
合成后，使用DMF将树脂转移到烧结注射器中，用MeOH冲洗，并使用真空歧管干燥。然后在振动摇床上，使用立式固定器，使用试剂K(82.5％三氟乙酸(TFA)，5％水，5％茴香硫醚，5％苯酚，和2.5％乙二硫醇)在室温下裂解树脂。
然后将裂解混合物通过过滤的烧结注射器分配到冷的乙醚(或冷MTBE)中。然后通过搅拌用95:5的三氟乙酸:水溶液冲洗每个注射器。然后将冲洗液添加到其余的混合物/醚混合物中。然后将混合物离心。倾出乙醚后，添加另一份冷乙醚洗液。将该容器涡旋并再次离心。重复该步骤以彻底漂洗沉淀物。倾出最终的洗涤液，并通过真空干燥器干燥沉淀物。将沉淀物样品溶解在溶剂(例如，DMSO、DMF、水或乙腈)中，并通过UPLC-MS分析其身份、粗纯度和保留时间。
其他肽，例如L9(LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI)，使用这些序列特定的氨基酸和预加载树脂，以及其中存在丝氨酸(Ser，S)或苏氨酸(Thr，T)残基的伪脯氨酸衍生物和如上所述的Fmoc-Asp(OMpe)-OH，以类似的方式制备。
实施例17-溶解度研究
首先使用在含有4％DMSO的D5W中的5mM琥珀酸钠(SS)测试许多具有新表位的GATA3肽的溶解度。根据初始结果，通过调整琥珀酸钠(SS)浓度和DMSO的量来改进配制策略，从而导致选择了7种肽。确定这些肽的合并策略的溶解度和与聚ICLC的相容性。根据这些结果，选择了三个池。两个池各自在D5W中的0.25mM SS中仅有一种肽，而第三个池在D5W中的5mM SS中具有5种肽。与聚ICLC合并后的池的pH均为pH 5.0-6.0，并且在过滤过程中损失最小。
为了以下研究而筛选的肽均在表8中列出。
表8
Figure BDA0002944947110002651
所有缓冲液均每天制备。通过称量右旋糖并将milliQ水添加到右旋糖中以达到适当的体积来制备D5W。例如，将水添加到12.5g右旋糖中，以达到250mL的总体积。为了通过称重制备50mL在D5W中的5mM SS，将67.54mg SS称重并添加到D5W中以达到50mL总体积。为了制备在D5W中的0.25mM SS，将2.5mL在D5W中的5mM SS用47.5mL D5W稀释。
每种肽的肽含量百分比如下确定：总理论TFA等于正电荷数(N末端、Arg、Lys和His)的总和。将该数值输入以下方程式中，其中MW是肽的分子量：
方程式1.％TFA＝100*((％TFA*114.02)/((％TFA*114.02)+MW))
然后使用6.45％作为理论含水量，使用该值来计算肽含量百分比：
方程式2.％肽＝100-％TFA-6.45％
使用以下方程式计算用于这些实验的目标毛重。
方程式3.目标毛重＝(13.2*10000)/(％肽含量*％纯度)
使用Mettler Toledo XP105 Delta Mass分析天平将肽称量到15mL或50mL锥形管中，记录实际的毛量，并用来确定使用多少DMSO才能获得50mg/mL。计算如下所示：
方程式4.DMSO(μL)＝(实际毛重(mg)*264μl)/(目标毛重(mg))
然后在适当的配制缓冲液中将储备液稀释至2mg/mL(1份DMSO储备液，24份缓冲液)。
如上所述计算肽的重量和含量百分比，并将适当的缓冲液直接添加至肽。使用方程式3计算目标毛重，并使用方程式5计算获得2mg/mL肽所用的缓冲液体积。
方程式5.缓冲液(ml)＝(实际毛重(mg)*6.6mL)/(目标毛重(mg))
用缓冲液将肽进一步1:4稀释以获得0.4mg/mL，或者仅在指示时才将缓冲液直接添加到干燥的肽中以获得0.4mg/mL。在后一种情况下，用方程式6确定要添加的适当体积。
方程式6.缓冲液(ml)＝(实际毛重(mg)*33mL)/(目标毛重(mg))
通过倒转锥形管而不是通过超声或涡旋将肽溶解。
为了合并5种肽，将来自每种2mg/mL储备液的等体积合并，以获得每种肽0.4mg/mL。对于少于5种肽的池，合并等体积的肽，然后用适当的缓冲液稀释该溶液，以获得0.4mg/mL的每种肽。将池倒置3-5次以混合。将配制的肽转移到玻璃小瓶中以观察溶解度。每两小时拍摄一次照片，以记录外观上的任何变化。
聚ICLC可商购获得。在2mL玻璃小瓶中，使用150μL聚ICLC和450μL肽池，以3:1的肽与聚ICLC之比将池合并。将该溶液倒置3-5次以混合，并每两小时拍摄一次照片，持续6小时，以记录外观上的任何变化。所有pH测量均使用Mettler Toledo inLab Micro pH计进行，该pH计每天在使用前进行校准。取出100μL的待分析样品，将其添加到微量离心管中以测量pH值。然后将样品丢弃。通过UPLC-MS(带有Acquity QDa质谱仪的Waters Acquity H-Class)分析样品。使用从10:90溶剂A:B到50:50溶剂A:B(A：0.l％TLA/水，B：0.1％TLA:乙腈)的8分钟梯度，一式两份分析每个样品的2μL进样。对于0.4mg/mL和2mg/mL的每种肽，确定肽在标准制剂中的初始溶解度。尽管拍摄了照片，但由于凝胶通常是澄清的，或者肽在溶解时有小的玻璃状颗粒，因此它们并不总是清楚地显示出溶解性。表9显示了肽在5mM SS/含有4％DMSO的D5W中的溶解度。
以下表9列出了肽在5mM SS/含4％DMSO的D5W中的溶解度和观察结果
Figure BDA0002944947110002671
使用含4％DMSO的D5W中的0.25mM SS，测试了不溶于5mM SS的肽。结果总结在表10中。许多这些不溶于5mM SS的肽可溶于0.25mM SS/含4％DMSO的D5W中，在6小时后浓度为0.4mg/mL，并使用该较低SS浓度在进一步的研究中进行了测试。
表10列出了肽在0.25mM SS/含4％DMSO的D5W中的溶解度和观察结果
Figure BDA0002944947110002681
基于这些结果，选择肽L7、L8、L9、L14、L10c、L11d、L11f和L15用于制剂研究。测试了不含DMSO的制剂，以提高所配制的肽的稳定性并减缓含半胱氨酸的肽的二聚化。所有肽(L7、L8、L9、L14、L10c、L11d、L11f和L15)均在0.25mM SS中以0.4mg/mL的浓度测试，并且在6小时后在不含DMSO的情况下可溶。肽L7、L8、L9、L10c、L12d和L14在5mM SS中测试，并且在6小时后在没有DMSO的情况下也可溶。表11中列出了肽制剂在0.25mM SS/D5W和5mM SS/D5W中的pH值。
以下表11显示了在0.25mM SS/D5W和5mM SS/D5W中的0.4mg/mL肽制剂的pH
肽名称 在5mM SS/D5W中的pH 在0.25mM SS/D5W中的pH
L7 6.4 4.5
L8 6.4 5.0
L9 6.4 4.6
L10c 6.4 4.3
L11f N/A 5.0
L14 6.4 4.2
L15 N/A 4.8
由于表11中报告的肽均可溶于0.25mM SS，因此使用较低的SS浓度研究了初始池设计。还考虑单独溶解度对池进行了设计。因为L15和L11f可溶于低SS，所以将这两种肽合并在一起。表12中显示了前三个池的设计。
以下表12显示了在0.25mM SS/D5W中的初始肽池
设计1 设计2 设计3
肽名称 3个池 3个池 3个池
L7 1 1 1
L14 1 1 1
L8 1 2 2
L9 2 2 2
L15 3 3 3
L11f 3 3 3
L10c 2 2 1
合并后，所有肽均保持可溶。表13中给出了添加或不添加聚ICLC的肽池的pH值。
以下表13列出了添加或不添加聚ICLC的来自表12的肽池的pH
Figure BDA0002944947110002691
然后将每个设计的池与聚ICLC混合以测试其与佐剂的相容性。当与聚ICLC组合时，池3和每个含有肽L10c的池沉淀。另外，具有3种肽的池当与聚ICLC组合时的pH低于5.0，这表明当池包含两种以上的肽时，缓冲能力应更高。
由于L7、L8、L9、L10c和L14均可溶于5mM SS，因此在具有高SS浓度的池中对它们进行了测试。用这五种肽测试了三个池。一个池没有L10c，一个池仅有L10c，而第三个池具有所有五种肽。因为L11f和L15在这种较高浓度下不溶，所以将它们配制在0.25mM SS中。然而，由于观察到的沉淀，它们分别被配制为0.4mg/mL，而不是在一个单独的池中。每种肽都可溶于它们各自的制剂中。基于可视化，这些池也与聚ICLC相容，并且将池与聚ICLC组合后的pH值均在5.0至6.3之间(表14)，这适合于皮下注射。
表14列出了不具有聚ICLC的肽池的pH与具有聚ICLC的肽池的pH
池 不含聚ICLC的池的pH 具有聚ICLC的池的pH
池1 5.6 5.6
池2 5.4 5.5
L10c 6.4 6.3
L11f 5.0 5.9
L15 4.8 6.0
在不含DMSO、具有各种琥珀酸盐浓度的D5W中测试肽L11i。在0.4mg/mL时，该肽似乎可溶于所有浓度的SS。在较高的SS浓度下，在2mg/mL时观察到一些沉淀。与聚ICLC组合时，所有样品看起来都相同。2mg/mL或0.4mg/mL肽L11i在不含聚ICLC的0.25mM SS、0.5mMSS或5mM SS中以及0.4mg/mL肽L11i在含有聚ICLC的0.25mM SS、0.5mM SS或5mM SS中的制剂的pH值在表15中显示。
表15列出了2mg/mL或0.4mg/mL L11i肽在不含聚ICLC的0.25mM SS、0.5mM SS和5mM SS中以及0.4mg/mL在含有聚ICLC的0.25mM SS、0.5mM SS和5mM SS中的pH
Figure BDA0002944947110002701
基于结果的最终池包括池1(在5mM SS/D5W中的L7、L8、L9、L10c和L14)、池2(在0.25mM SS/D5W中的L11i或L11f)和池3(在0.25mM SS/D5W中的L15)。在来自Pall的0.2μm过滤器(HP1002)上测试了这些池中的每一个的保留。通过UPLC-MS分析预过滤的样品以及两次过滤中每一次后的样品。在第一过滤步骤之后损失了少于3％的L11f和L11i，而在第二过滤步骤之后没有损失额外的肽。第一次过滤后仅损失了4.9％的L15，第二次过滤后损失了1.3％。在两个过滤步骤后，池1中每种肽的总损失少于3％。
结论
测试了一系列潜在GATA3肽在含有5mM SS/含4％DMSO的D5W的配制缓冲液中的溶解度。还以较低的SS浓度测试了不溶于5mM SS的肽。基于这些结果，选择了七种肽，其中五种可溶于5mM SS(L7、L8、L9、L10c和L14)，而另一些在较低的浓度下可溶(L11f、L11i和L15)。还测试了DMSO的去除，该去除可以改善溶解度并减缓使UPLC分析更加困难的二硫化物的形成。所选的每种肽在没有DMSO的情况下都是可溶的。
根据溶解度结果，使用0.25mM SS/D5W生成了3个池设计。尽管这些池是可溶的，但有些与聚ICLC不相容。在一些情况下，当将包含L10c的池与聚ICLC混合时，观察到沉淀。当同时含有L11f和L15的池与聚ICLC组合时，也获得相同的观察结果。基于这些结果，设计了第四组池。第一池含有5mM SS/D5W中的L7、L8、L9、L10c和L14，并且与聚ICLC相容。将肽L15和L11f或L11i保持为单独的肽，以通过将其以0.4mg/mL直接溶解于0.25mM SS/D5W而制备。当与聚ICLC混合时，这些池都在pH 5.0以上，这对于皮下注射是可接受的。
实施例18-GATA3 neoORF突变的发生率
该实施例表征了GATA3 neoORF突变的发生率和翻译证据。疫苗由一系列长肽组成，这些长肽跨越GATA3中的新型开放阅读框(GATA结合蛋白3)，该阅读框仅存在于在该基因中具有某些移码突变的细胞中。根据移码突变的起始位置，产生的开放阅读框的长度可以变化，但是它们都共有共同的翻译区“GATA3 neoORF”。图13提供了共同翻译区的示例性氨基酸序列。导致GATA3 neoORF翻译序列的任何遗传移码突变是“GATA3 neoORF突变”。调查了可公开可用的基因组和蛋白质组数据集，以了解GATA3 neoORF突变的发生率以及GATA3 neoORF的翻译证据。
材料与方法
数据集
MSK-IMPACT乳腺癌数据集：MSK-IMPACT乳腺癌数据集(Razavi等人,2018)是可从cBioPortal for Cancer Genomics(http://www.cbioportal.org/study？id＝breast_msk_2018)获得的公共数据集。该数据集包含使用MSK-IMPACT的测序数据，MSK-IMPACT是一种基于杂交捕获的下一代测序分析，其分析来自总共1918个乳腺肿瘤样本的341个和468个癌症相关基因与来自1756名患者的患者匹配正常样本之间的所有蛋白质编码外显子。为了本研究下载了可公开获得的突变数据和包括ER状态、HER2状态和总生存期的临床数据。
TCGA乳腺癌蛋白质组数据集：TCGA乳腺癌蛋白质组数据集(NCI CPTAC等,2016)是可从CPTAC数据门户网站(https://cptac-data-portal.georgetown.edu/cptac/s/S015)获得的公共数据集。该数据集包含使用iTRAQ蛋白质定量方法从105名TCGA乳腺癌患者的全蛋白质组中获得的串联质谱数据。为了本研究下载了可公开获得的原始数据。
突变发生率分析
GATA3 neoORF鉴定：将来自MSK-IMPACT乳腺癌数据集的GATA3基因的每个突变事件映射到来自人类基因组(hg19，GRCh37Genome Reference Consortium Human Reference37)的GATA3转录物ENST00000346208.3，然后在计算机上翻译为全长蛋白质。如果全长蛋白质包含GATA3 neoORF序列，则将包含该突变事件的样品标记为GATA3 neoORF阳性。
GATA3 neoORF发生率：对于群组中的所有受试者，如果受试者具有至少一个被鉴定为GATA3 neoORF阳性的经测序的肿瘤样品，则该受试者被视为GATA3 neoORF阳性。GATA3neoORF发生率被定义为群组中GATA3 neoORF阳性受试者的百分比。
从蛋白质组学数据鉴定肽
蛋白质序列数据库：蛋白质序列数据库包含来自UCSC蛋白质序列数据库(2009年2月人类参考序列，GRCh37/hg19)的63,691个蛋白质序列，以及一个包含GATA3 neoORF序列的全长蛋白质。
肽鉴定：用Comet搜索引擎(http://comet-ms.sourceforge.net)分析了TCGA乳腺癌蛋白质组数据集的原始数据，Comet搜索引擎是用于解读串联质谱的开源软件包。使用Comet(版本2017.01rev.2)针对UCSC蛋白质序列数据库从TCGA乳腺癌蛋白质组数据集中搜索所有MS/MS谱。搜索中允许使用前体离子最多为+6的MS/MS谱。前体离子的质量误差容限为±百万分之10(ppm)，并且对于碎片离子使用0.02的m/z箱元宽度。所有搜索都受胰蛋白酶的限制，使得与实验光谱匹配的每种肽必须符合该酶的切割特异性，即，赖氨酸或精氨酸的C末端侧。最多允许2个错过的切割。如对iTRAQ标记所期望的，将+144.1021Da的固定修饰应用于肽的N末端和每个赖氨酸残基。可变修饰包括每种肽最多两个氧化的甲硫氨酸残基。对于脲基甲基化的半胱氨酸，将+57.021464Da的固定修饰应用于所有半胱氨酸。在搜索过程中，诱饵肽作为Comet搜索引擎的一部分自动生成，以用于估算目标-诱饵的错误发现率。搜索结果由Percolator(3.02.0版)处理，以计算肽水平q值，这是使用串联质谱数据估算肽鉴定的错误发现率的常规指标。使用标准阈值(q值<0.01)来接受从数据集中鉴定的肽，使得不到1％的所接受的肽可能是错误发现。
GATA3 neoORF翻译证据：特定衍生自包含GATA3 neoORF的蛋白质序列而不是衍生自UCSC蛋白质序列数据库中任何其他蛋白质的肽被称为GATA3 neoORF特异性肽。GATA3neoORF特异性肽的鉴定被认为是GATA3 neoORF的翻译的证据。
结果
乳腺癌中GATA3 neoORF突变的发生率
从1,756名患者的MSK-IMPACT乳腺癌数据集中进行了突变发生率分析(以上第1节的材料与方法部分)，并鉴定了91名GATA3neoORF阳性的患者。在这91名患者中，有77名患者被报告为HR+Her2(-)，而62名患者在诊断时被报告为转移。以下表16中报告了每个亚组中GATA3 neoORF阳性患者的发生率。在HR+Her2(-)患者中，与所有HR+Her2(-)患者相比，GATA3 neoORF阳性患者的总生存期无统计学差异(无论其GATA3 neoORF状态如何)(p值＝0.246)(图14)。
以下表16列出了GATA3 neoORF的发生率
Figure BDA0002944947110002741
以下表17列出了GATA3 neoORF特异性肽和映射到从TCGA乳腺癌蛋白质组数据集中鉴定的规范GATA3的其他肽
Figure BDA0002944947110002742
对乳腺癌基因组数据集的调查显示，根据HR+Her2(-)乳腺癌患者的转移状态，GATA3 neoORF在6-7％的乳腺癌患者中存在。鉴定了多种GATA3 neoORF特异性肽以及映射到规范GATA3的其他肽，表明GATA3 neoORF的翻译。综合起来，这些结果表明，GATA3neoORF突变在HR+Her2(-)乳腺癌中普遍发生，并且当存在时，GATA3 neoORF可以被翻译产生蛋白质产物。
实施例19-跨HLA类型的GATA3 neoORF表位计数
该实施例提供了在具有不同HLA类型的患者群体中，从GATA3 neoORF可以预期的典型表位数的估计。
材料与方法
使用共同考虑基因表达、HLA结合潜力和蛋白酶体加工潜力的计算机模拟预测算法，评估GATA3 neoORF的共同区(如实施例18中定义)内的所有肽(长度8-11)。该算法通过对单等位基因质谱HLA-I概况分析数据进行逻辑回归拟合，将这三个变量组合为整体呈现预测。以下假设和工具用于定义这三个输入变量：
表达
根据Cancer Genome Atlas(TCGA)RNA-Seq数据，乳腺癌样本的GATA3表达中值为约700个转录物/百万(TPM)。假设突变等位基因和野生型等位基因对总体GATA3表达的贡献相同，我们估计neoORF转录物将以350TPM表达。
HLA结合潜力
基于种族特定的频率，并假设美国人口中欧洲人为62.3％、非洲裔美国人为13.3％、亚太岛民为6.8％、西班牙裔为17.6％，估算美国等位基因频率(表18)。对于21个最常见的HLA-A等位基因和49个最常见的HLA-B等位基因，使用工具NetMHCpan-3.0进行了肽结合预测(对于HLA-A和HLA-B，21个和49个等位基因分别提供了95％的人群覆盖率)。
加工潜力
使用可公开获得的基于质谱的HLA-I概况分析数据，例如，如Abelin.J.等人Immunity,2017，Bassani-Sternberg,M.等人Molecular&Cellular Proteomics 2015所述，对加工潜力预测器进行了训练，这是一种神经网络配置，其基于每种肽的上游和下游序列背景确定加工潜力。
为了模拟每名患者的表位计数，通过根据其总体美国频率(表18)随机抽取两个HLA-A和两个HLA-B等位基因(进行置换以允许纯合性)来创建模拟HLA基因型。大多数模拟患者有4个不同的等位基因，但由于允许纯合性，因此一些模拟患者只有2或3个不同的等位基因。对于模拟患者中的每个肽-等位基因对，进行由推算的出现概率(根据上述模型得出)参数化的Bernoulli掷硬币；取得阳性结果表明给定的肽将呈现在给定的等位基因上。对于每名模拟患者，对独特阳性肽的总数进行求和，以确定反应性表位的总数(这意味着在模拟中多个等位基因上呈现的肽仅被计数一次)。通过将嵌套表位(例如完全包含在阳性10聚体中的阳性9聚体)计数为单个表位来进一步剔除结果。使用统计编程语言R以这种方式模拟了一万名患者。
以下表18列出了模拟中使用的等位基因频率
Figure BDA0002944947110002761
Figure BDA0002944947110002771
Figure BDA0002944947110002781
结果
方法部分中描述的分析表明，95％的患者可呈现来自GATA3neoORF的≥2个HLA-I表位(图15)。基于上述细节，无论患者的HLA基因型如何，GATA3 neoORF可携带多个可呈现的HLA-I表位。这显示了诱导针对这些预测的新抗原的T细胞应答的疗法的有效性。选择了预测的表位的子集，在以下实施例20、21、22、23中详述的后续研究中进行验证。
实施例20-表位的生化测量
下面的实施例提供了对来自GATA3neoORF的表位的亲和力的生化验证。大量表位可以结合许多HLA等位基因(如实施例19中所述)。在该实施例中，评价表位结合几种常见HLA等位基因即HLA-A02:01、HLA-B07:02和HLA-B08:01的能力。评价表位与其预测的HLA之间结合的亲和力和稳定性。
亲和力是表位与HLA结合强度的量度。强结合(通常定义为
<500nM)是可被T细胞靶向的新抗原的重要特性。这是因为新抗原必须呈现于肿瘤细胞的表面，因此必须在与肿瘤细胞产生的其他抗原竞争一种HLA分子的结合口袋中胜出，因为一次只能有一种肽与单个HLA分子结合。此外，已经显示免疫原性表位倾向于对其特异性HLA具有强亲和力。
稳定性是给定表位与同源HLA保持结合的时间的量度。稳定的结合(通常定义为>1小时)也是可被T细胞靶向的新抗原的重要特性。表位必须保持在细胞表面上与肿瘤细胞结合，才能被T细胞识别。此外，像亲和力一样，先前已经表明免疫原性表位倾向于与它们的特异性HLA稳定地结合。
为了评价表位对其同源HLA分子的稳定性和亲和力，以>70％的纯度(通过％面积的UV分析)合成肽，并将其稀释至20mM或更低，并测量其亲和力和稳定性。
在该实施例中，报告了14个表位与同源HLA分子之间结合的亲和力和稳定性。在HLA-A02:01上研究了4个表位，在HLA-B07:02上研究了5个表位，在HLA-B08:01上研究了8个表位(在HLA-B07:02和HLA-B08:01上都研究了3个表位)。所有肽均显示出强结合，亲和力范围为9.5nM至242.8nM。稳定性从0小时到21.7小时不等，每个等位基因上至少一个表位超过1小时。这些结果表明，每个等位基因至少有一个衍生自GATA3 neoORF的强表位。
材料与方法
选择表位进行生化测量
选择衍生自GATA3 neoORF的多个表位，以证实它们结合特定的常见HLA等位基因即HLA-A02:01、HLA-B07:02或HLA-B08:01的能力。预测这些表位的范围从弱结合物到强结合物。
固相肽合成
在Intavis Peptide Synthesizer上使用固相肽合成，以5μmol规模制备肽。使用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护，并用纯DMF冲洗。使用60μL 0.5M氨基酸(6当量)、55μL0.5M HCTU(5.5当量)、5μL NMP(0.5当量)和14μL 4M NMM(11.2当量)，在室温下在15分钟的时间内将所有氨基酸进行双偶联。在每个双偶联循环后，通过添加100μL DIEA溶液(首先制备成在NMP中的2M溶液，然后使用DMF稀释至12.5％)和在DMF中的6.25％乙酸酐进行乙酰化加帽15分钟，然后抽真空并用DMF冲洗。对序列中的每个氨基酸重复脱保护、洗涤、双偶联、乙酰基加帽、洗涤循环。用在DMF中的20％哌啶进行最终脱保护，并用DMF、EtOH和DCM进行最终洗涤。在仪器上完成最后的排干干燥5分钟，然后用DCM冲洗板底。
肽的裂解
使用92.5％TFA、2.5％TIPS、2.5％H2O、2.5％EDT的溶液裂解肽。1小时后，将板的液体真空排到1.2mL Micronic架中。总共3小时后，将肽用冷乙醚通过离心沉淀。
肽的UPLC-UV-MS分析
将粗肽干燥并重悬于含有0.1％TFA的1:1ACN:H2O中，并保持在-80℃下直至完全冷冻。然后将肽冷冻干燥以分离粉末形式的肽。首先将肽粉溶解在纯DMSO中，然后在DMSO:H2O中以3:1稀释，以进行UPLC-UV-MS分析。使用200-1250Da的质量检测器范围，在214nm波长下进行UV监测。用于长度少于9个氨基酸的肽的UPLC-UV-MS方法包括在2.1x 50mm 1.7μMBEH Acquity UPLC柱上在5分钟内的0-100％流动相B(乙腈中的0.085％TFA，相应的流动相A为0.1％TFA水溶液)的梯度，而用于超过9个氨基酸的肽的方法包括在2.1x100mm 1.7μMBEH Acquity UPLC柱上在8分钟内的10-80％流动相B的梯度。
通过A214方法测定肽浓度
将粗制肽以2-5mg/mL的浓度溶解于纯DMSO中，以通过A214方法进行评估。UPLC-UV色谱图的肽峰面积与为分析而注入的肽量和该肽在检测波长下的消光系数成比例。因此，可以通过将肽样品的UV峰面积与已知浓度的参考肽的UV峰面积进行比较，并考虑各自的消光系数，来确定其浓度。以下方程式用于计算肽浓度：
方程式7.C＝Cref*(Asam*Eref*Vref)/(Aref*Esan*Vsam)
其中，C是以mM为单位的肽样品浓度，Cref是以mM为单位的参考肽浓度，Asam是肽样品的UV峰面积，Aref是参考肽的UV峰面积，Eref是以M-1cm-1为单位的参考肽的消光系数，Esam是以M-1cm-1为单位消光肽样品的消光系数，Vsam是样品的进样量，Vref是参考肽的进样量。
通过结合各个氨基酸和肽键的消光系数预测肽在214nm处的消光系数。将0.2mg/mL的具有RAKFKQLL序列的参考肽(肽ID LS-18)与粗肽样品UPLC-UV-MS上按顺序运行。然后用UV峰面积和计算的消光系数计算以mM为单位的肽浓度。
亲和力测量
肽与HLA分子的结合亲和力通过评估其在与确定的经放射性标记肽竞争HLA分子上的结合口袋中胜出的能力来测量。这如下进行：纯化HLA分子，并将其与多种浓度的目的肽和经放射标记的高亲和力结合肽一起孵育。孵育2天后，通过大小排阻凝胶过滤色谱法分离未结合的放射性标记的肽，并测定具有放射性标记的肽的HLA分子的分数。在测定结束时具有低百分比结合的经放射标记肽的肽对HLA具有强亲和力。定量地，可以通过对多种浓度下的抑制作用进行回归分析来确定将放射性标记的肽的结合抑制50％所需的目的肽的浓度。该IC50测量值用作真实结合亲和力的近似值。
在分析的第一波肽中，基于A214测量，肽的实际浓度是已知的，并根据浓度进行了任何必要的校正。在分析的第二波肽中，假定所有肽的浓度均为20mM，并根据该假设计算出初始IC50，并根据后来的实际浓度进行调整。对于实际浓度低于20mM的肽，通过乘以通过A214方法确定的实际浓度并除以20mM，来校正测得的IC50。
稳定性测量
为了测量肽与I类MHC的结合稳定性，编码生物素化的MHC-I重链和轻链的合成基因在大肠杆菌中表达，并使用标准方法从包涵体中纯化。轻链(β2m)用碘(1251)进行放射性标记，并在18℃下与纯化的MHC-I重链和目的肽混合，以启动pMHC-I复合物的形成。这些反应在链霉亲和素包被的微板上进行，以将生物素化的MHC-I重链结合到表面上，并进行放射性标记的轻链的测量以监测复合物的形成。通过添加更高浓度的未标记的轻链并在37℃下孵育来启动解离。稳定性被定义为通过闪烁计数测量的一半复合物解离所需的时间长度(以小时为单位)。重复进行测量。两次测量的平均值作为稳定性。
结果
亲和力测量
以下表19列出了表位亲和力测量数据。
Figure BDA0002944947110002811
Figure BDA0002944947110002821
*请注意，此处报告的实际肽浓度和测得的IC50是从原始数据四舍五入的，但校正后的IC50值是使用未四舍五入的原始数据计算的。
稳定性测量
以下表20列出了稳定性测量数据
Figure BDA0002944947110002822
在实施例20中，评价了来自多个常见HLA分子(HLA-A02:01、HLA-B07:02、HLA-B08:01)上的GATA3 neoORF的预测表位。确定所有表位具有强亲和力(<500nM)。这些表位的子集也是稳定的结合物(>1小时)，在所评价的每个HLA等位基因上至少有一种强结合物。这些数据表明，在多个HLA等位基因中存在GATA3 neoORF表位。
实施例21：具有GATA3突变和HLA等位基因的细胞系的产生
该实施例描述了具有GATA结合蛋白3(GATA3)新开放阅读框(neoORF)突变和高发生率HLA等位基因HLA-A02:01和HLA-B07:02的细胞系的制备。该细胞系可用作包含GATA3neoORF突变的肿瘤细胞的体外替代物。天然带有特定焦点GATA3 neoORF的细胞系尚无法获得，其中一种是通过常用细胞系HEK293T的稳定慢病毒转导而制备的。选择该细胞系是因为其天然表达两个常见的HLA等位基因，即HLA-A02:01和HLA-B07:02。该修饰的细胞系用于采用T细胞的功能测定(实施例25和实施例26)。另外，该细胞系用于在多个HLA等位基因上验证来自GATA3 neoORF的新抗原加工/呈递(实施例22)。对于这些研究，将HLA等位基因瞬时转染到修饰的细胞系中。
材料与方法
GATA3突变细胞系的产生的概述
GATA3突变转导的HEK 293T细胞的产生需要(a)GATA3突变编码的质粒设计，慢病毒的生产，GATA3突变向HEK 293T细胞系的转导，以及经转导的细胞的选择。下面描述了用于生成GATA3突变细胞系的这些步骤。
细胞系和培养物
HEK 293T细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Rockford,MD,USA)，并保存在DMEM 10％FBS和Pen/Strep培养基中。
GATA3突变编码的质粒设计
GATA3突变基因
为了有效表达GATA3突变基因质粒构建体，从NCBI Reference Sequence:NM_001002295.01获得了从1473至2074的600bp GATA结合蛋白3(GATA3)野生型序列(其包含从558至1892的编码DNA序列(CDS)序列)。通过从参考序列中缺失1734和1735处的2个核苷酸来进一步产生GATA3突变序列(图16)。然后，GATA3突变序列从野生型序列翻译在氨基酸序列的位置87处的移码(图17)。该DNA构建体可以覆盖野生型GATA3氨基酸序列的87个残基和由缺失引起的移码的GATA3 neoORF氨基酸序列的114个残基。
GATA3突变质粒设计
对GATA3突变序列进行密码子优化，合成，并将其克隆到pCDH-CMV-Puro载体(Genescript)(图18)中。
慢病毒生产
在完全培养基(含有10％FBS的DMEM，Pen/Strep)中培养Lenti-X 293T细胞(ClonTech)，并用GATA3突变编码的慢病毒质粒转染，以产生GATA3突变基因的慢病毒。转染前一天，将8x 105个细胞接种在6孔板的每孔中。转染当天更换培养基。将4μg慢病毒构建体质粒和4.6μL慢病毒包装质粒混合物(Sigma-Aldrich)在Opti-MEM(Thermo Fisher)中混合。将混合物与10μL FuGENE HD(Promega)混合，然后直接添加到细胞中。24小时后，将培养基替换为新鲜的完全培养基。转染后72小时收获含有慢病毒的上清液。
GATA3突变的转导
将5x105个HEK 293T细胞(ATCC)接种于12孔板上的2mL DMEM培养基中，该培养基含有6μg/mL的聚凝胺和10％FBS。将130μL含有GATA3慢病毒的上清液直接添加到细胞中。将细胞在5％CO2培养箱中培养。在24小时，将培养基替换为含10％FBS和Pen/Strep的DMEM培养基。
嘌呤霉素选择
在GATA3突变慢病毒转导后的第2天开始用1μg/mL浓度的嘌呤霉素处理。培养细胞，并用含10％FBS、Pen/Strep和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基扩充，直至收获。
用HLA编码构建体转染
将1.5x107个GATA3突变转导的HEK 293T细胞接种在T175培养瓶中。将15μg HLA-A02:01、HLA-B07:02或HLA-B08.01编码的质粒(Genewiz)与70μL Fugene HD(Promega)混合，并在室温下孵育15分钟。将每种HLA型质粒和Fugene HD的混合物添加到T175培养瓶中GATA3突变转导的HEK 293T细胞中进行转染。收获前将3种不同的HLA转染的和GATA3突变转导的HEK 293T细胞培养48小时。
收获GATA3突变转导的和HLA转染的细胞
用1×PBS洗涤细胞，并加入0.25％胰蛋白酶-EDTA(Thermo-Fisher science)。在37℃下孵育3分钟后，将细胞重悬，并用含有10％FBS和Pen/Strep的DMEM培养基收获。洗涤步骤进行3次，其包括以1,500rpm离心5分钟，然后用PBS缓冲液悬浮。将细胞沉淀物在干冰上于70％乙醇中速冻。将冷冻的细胞沉淀物储存在-80℃的冰箱中以供蛋白质组学分析。
结果
GATA3突变转导的HEK 293T用作靶细胞来评价GATA3特异性TCR功能测定，并用作通过质谱法评价HLA-A02.01上的GATA突变呈现的材料(实施例22)。下面概述的结果表明生成了GATA3突变表达的HEK 293T细胞。
GATA3突变质粒构建体
产生了GATA3突变编码的质粒构建体，并通过GENEWIZ的DNA测序进行了评价。最终GATA3突变编码质粒的DNA测序数据与设计的GATA3突变基因序列100％匹配(图19)。限制性酶AflII消化后，在凝胶电泳测定的泳道2中观察到5000bp至3000bp之间的两个DNA条带。这些条带分别与预期的4243bp和3424bp的大小相关(图20)。
GATA3突变转导和收获
HEK 293T细胞用于GATA3突变转导。培养转导的细胞直至达到总细胞数的200X106个细胞。在收获日期，使用1x106个细胞通过流式细胞仪分析HLA-I类和HLA-II类表达(图21)。99.5％的细胞是HLA-I类阳性的。将193X106个细胞冷冻以用于蛋白质组学分析。
HLA感染
用BAP标记的HLA-A02.01、BAP标记的HLA-B07.02和BAP标记的HLA-B08.01编码的表达质粒瞬时转染GATA3突变转导的HEK293T细胞。将转染的细胞培养48小时并收获。在收获日期，使用1x106个细胞通过流式细胞术分析HLA-A02.01和HLA-I类表达(图22)。未转染的(图22A)、HLA-A02.01转染的(图22B)、HLA-B07.02转染的(图22C)和HLA-B08.01转染的(图22C)GATA3 HEK293T细胞。所有转染的细胞都高度表达HLA-A02.01和HLA-I类。
通过将含有突变的GATA3基因的慢病毒稳定转导到HEK293T细胞中，产生了表达GATA3 neoORF的修饰细胞系。GATA3突变转导的HEK 293T细胞表达HLA-I类。随后将该细胞系用作采用针对GATA3新抗原具有特异性的T细胞的功能测定的靶标(实施例25和实施例26)。此外，在用几种常见的HLA等位基因转染后，这些细胞系显示出更宽的HLA-I类和HLA-A:02表达水平分布，并用于评价这些等位基因上多种新抗原的加工和呈递(实施例22)。
实施例22-通过质谱法验证GATA3 neoORF肽表位
该实施例提供了通过质谱法对用于结合HLA-A*02:01、HLA-B*07:02和HLA-B*08:01异二聚体的GATA结合蛋白3(GATA3)新开放阅读框(neoORF)的共同区域衍生的预测肽表位的内源加工和呈递的验证。工程改造HEK293T细胞以稳定表达GATA3 neoORF，并瞬时转染以表达感兴趣的生物素受体肽(BAP)标记的HLA等位基因。实施例19和实施例21分别描述了等位基因特异性肽表位的预测和HEK293T细胞的产生。通过在每个HLA I类异二聚体的α链上表达的生物素化BAP标签的亲和力下拉，从细胞裂解物中分离出HLA-肽复合物。通过用酸处理从HLA-肽复合物中释放肽配体，并通过反相液相色谱法脱盐。通过与高分辨率串联质谱仪耦接的纳米液相色谱法(nLC-MS/MS)进一步分离HLA-肽配体。对衍生自GATA3 neoORF的预测肽表位进行靶向nLC-MS/MS，由此使用每种肽表位前体质量的先验知识来选择每个肽表位的理论单同位素质量，以通过高能碰撞解离(HCD)进行片段化，随后进行肽测序。通过针对包含GATA3 neoORF的数据库的数据库匹配算法，并通过对应于其合成肽对应物的前体质量(MS)和MS/MS谱的谱比较，将GATA3 neoORF肽表位与所得串联质谱(MS/MS)进行匹配。
总共，通过nLC-MS/MS在工程化的HEK293T细胞中检测到了与三种不同的HLA异二聚体结合的来自GATA3 neoORF共同区的五个肽表位。对于HLA-A*02:01，检测到四个靶向肽表位中的以下两个：SMLTGPPARV和MLTGPPARV。对于HLA-B*07:02，检测到五个靶向肽表位中的以下两个：KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL。对于HLA-B*08:01，检测到八个靶向肽表位中的以下一个：ESKIMFATL。通过nLC-MS/MS从表达GATA3 neoORF的细胞中对这些肽表位的检测和鉴定表明，它们是内源加工的，随后被HLA异二聚体结合。
材料与方法
肽：合成对应于GATA3 neoORF肽表位的12C14N合成肽。
以下表21提供了对应于GATA3 neoORF预测肽表位的合成肽的列表。
等位基因 序列 长度 理论分子量
HLA-A*02:01 SMLTGPPARV 10 1027.5484
HLA-A*02:01 MLTGPPARV 9 940.5164
HLA-B*07:02 KPKRDGYMF 9 1140.5750
HLA-B*07:02 KPKRDGYMFL 10 1253.6590
HLA-B*08:01 ESKIMFATL 9 1054.5368
细胞培养
在实施例21中描述了稳定表达GATA3 neoORF的工程化HEK293T细胞的产生以及每个亲和标记的(BAP标记的)等位基因的瞬时转染。表22列出了用于靶向nLC-MS/MS的样品和细胞编号。
以下表22提供了用于靶向nLC-MS/MS的样品的总结
Figure BDA0002944947110002871
Figure BDA0002944947110002881
亲和标记的(BAP标记的)HLA-肽复合物的下拉
将含有BAP标记的HLA分子的冷冻细胞沉淀物在冰上融化20分钟，然后通过在冷裂解缓冲液[20mM Tris-Cl pH 8，100mM NaCl，6mM MgCl2，1.5％(v/v)Triton X-100，60mM辛基BD-吡喃葡萄糖苷，0.2mM 2-碘乙酰胺，1mM EDTA pH 8、1mM PMSF，1X cOmplete不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物]中以每50x106个细胞1.2mL裂解缓冲液的比例手工移液轻轻裂解。将裂解物在4℃下与Benzonase核酸酶一起以每50x106个细胞≥250单位Benzonase的比例翻滚孵育15分钟以降解DNA/RNA，然后在4℃以15,000xg离心20分钟以去除细胞碎片和不溶物。将澄清的上清液转移至新试管中，并通过在室温下在装有0.56μM生物素、1mM ATP/lmM乙酸镁和3μM BirA的1.5mL管中翻滚孵育10分钟，将BAP标记的HLA分子进行生物素化。将上清液与每50x106个细胞对应于200μL体积的Pierce高容量NeutrAvidin珠状琼脂糖树脂浆液于4℃翻滚孵育30分钟，以亲和富集生物素化HLA-肽复合物。最后，将HLA结合的树脂用1mL冷洗涤缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8，100mM NaCl，60mM辛基BD-吡喃葡萄糖苷，0.2mM 2-碘乙酰胺，1mM EDTA pH 8)洗涤四次，然后用1mL冷的10mM Tris-Cl pH 8洗涤四次。在洗涤之间，手工轻轻地混合HLA结合的树脂，然后通过于4℃下以1500x g离心1分钟来沉淀。使用前，将NeutrAvidin珠状琼脂糖树脂用1mL冷PBS洗涤3次。在洗脱HLA-肽之前，将洗涤后的HLA结合的树脂在-80℃下保存不到一周。
HLA-肽脱盐、还原和烷基化
从亲和标记的(BAP标记的)HLA复合物中洗脱HLA-肽，并同时使用Sep-Pak固相提取系统脱盐。简而言之，将Sep-Pak柱体附接到24位固相提取歧管，先后用200μL甲醇和100μL 50％(v/v)乙腈/0.1％(v/v)甲酸活化两次，然后用500μL 1％(v/v)甲酸洗涤四次。为了使HLA-肽从亲和标记的(BAP标记的)HLA分子上解离并促进肽与tC18固相的结合，将400μL的3％(v/v)乙腈/5％(v/v)甲酸添加到含有HLA结合的珠状琼脂糖树脂的试管中。通过移液将浆液混合，然后转移到Sep-Pak柱体中。将试管和移液器吸头用1％(v/v)甲酸(2x200μL)冲洗，并将冲洗液转移到柱体中。将100飞摩尔的Pierce肽保留时间校准混合物添加到柱体中作为上样对照。将珠状琼脂糖树脂与200μL的10％(v/v)乙酸孵育两次，历时5分钟，以进一步从亲和标记的(BAP标记的)HLA分子中解离HLA-肽，然后用500μL 1％(v/v)甲酸洗涤四次。通过采用250μL的15％(v/v)乙腈/1％(v/v)甲酸和随后250μL的30％(v/v)乙腈/1％(v/v)甲酸的分级分离，将HLA-肽从tC18洗脱到新的1.5mL微管中。用于活化、样品加载、洗涤和洗脱的溶液通过重力流动，但是使用真空(≥-2.5PSI)从柱体上除去剩余的洗脱液。冷冻含有HLA-肽的洗脱液，通过真空离心干燥，并在-80℃下储存，之后进行还原、烷基化和第二次脱盐工作流程。
含半胱氨酸的HLA-肽的还原和烷基化如下在1.5mL微管中进行。将干燥的肽溶解在200μL的10mM Tris-Cl pH 8中，然后通过与5mM二硫苏糖醇在60℃下孵育30分钟，同时在ThermoMixer中以1,000rpm摇动，进行还原。通过在黑暗中与15mM 2-碘乙酰胺在室温下孵育30分钟，对还原的硫醇进行烷基化。通过与5mM二硫苏糖醇在室温下于黑暗中孵育15分钟来猝灭任何未反应的2-碘乙酰胺。还原和烷基化后立即将样品脱盐。
使用内部构建的StageTips对HLA-肽样品进行二次脱盐，StageTips使用EmporeCl 8固相提取盘的两个16号冲头进行填充。用100μL甲醇，然后用50μL 99.9％(v/v)乙腈/0.1％(v/v)甲酸，将StageTip活化两次，然后用100μL的1％(v/v)甲酸洗涤3次。通过添加200μL的3％(v/v)乙腈/5％(v/v)酸化肽溶液，然后加载到StageTips上。将试管和移液器吸头先用200μL的3％(v/v)乙腈/5％(v/v)冲洗，再用1％(v/v)甲酸(2x100μL)冲洗，然后将冲洗液转移到StageTips。用100μL的1％(v/v)甲酸将StageTips洗涤五次。使用20μL 15％(v/v)乙腈/1％(v/v)甲酸和随后两段20μL的30％(v/v)乙腈/1％(v/v)甲酸的分步梯度将肽洗脱到1.5mL微管中。在台式离心机上在室温下以最大速度1,800-3,500x g进行样品加载、洗涤和洗脱。将洗脱液冷冻，通过真空离心干燥，并保存在-80℃。
通过nLC-MS/MS进行的HLA-肽测序
所有nLC-MS/MS分析均采用以下所述的相同液相色谱分离条件。使用配备PicoFrit 75μm内径和10μm发射器纳米喷雾柱的EASY-nLC 1200系统对肽进行色谱分离，该柱在采用氦气的约1,000psi压强下用ReproSil-Pur
Figure BDA0002944947110002901
C18-AQ 1.9μm填充材料填充至约35cm，并在分离过程中加热至60℃。用10X床体积的溶剂A[3％(v/v)乙腈/0.1％(v/v)甲酸]平衡柱，将样品在4μL 3％(v/v)乙腈/5％(v/v)甲酸中上样，然后用以下线性梯度洗脱肽：经84分钟的6-40％溶剂B[80％(v/v)乙腈/0.1％(v/v)甲酸]，经9分钟的84-60％溶剂B，然后在90％溶剂B中保持5分钟，并在50％溶剂B中保持9分钟，以洗涤该柱。线性梯度以200nL/min的速度运行。
将肽洗脱到2.5kV下的配备有Nanospray Flex Ion源的Orbitrap Fusion LumosTribrid质谱仪中。使用4x105的自动增益控制(AGC)目标和50毫秒最大注入时间，从300-1,800m/z以15,000的分辨率获取了全扫描MS。根据包含质量列表(表23)，以MS/MS扫描进行每个MS扫描，该列表包含靶向GATA3 neoORF肽表位的计算离子质量(m/z)及其预测的电荷状态(z)。对于满足以下标准的肽，还包括其他计算出的离子质量：i)由于序列中存在一个或多个碱性残基而预期的多个电荷状态，和/或ii)包含预期在样品处理过程中被修饰的氨基酸的肽，如半胱氨酸、甲硫氨酸和N-末端谷氨酰胺。最大进样时间在100毫秒和120毫秒之间不等，以在整个色谱峰上保持2-2.8秒的循环时间。使用1m/z的分离宽度，34的归一化HCD碰撞能量和1x105的AGC靶标，以15,000的分辨率从110到1,300-1,500m/z进行MS/MS扫描。
表23列出了每个HLA等位基因的GATA3 neoORF肽表位的包含质量列表
Figure BDA0002944947110002911
Figure BDA0002944947110002921
数据库搜索
使用Spectrum Mill软件包解释质谱。如果MS/MS谱不具有在600-2,000Da范围内的前体MH+、前体电荷>5或检测到的峰<4个，则从搜索中排除MS/MS谱。禁止将在相同色谱峰中获得的具有相同前体m/z的相似谱合并。在数据库中搜索MS/MS谱，该数据库包含所有带有基因组hg19注释的UCSC Genome Browser基因，及其蛋白质编码转录物(63,691个条目)，与全长GATA3 neoORF序列和150种常见污染物相组合。在数据库搜索之前，所有MS/MS必须通过序列标签长度>2(即，由氨基酸的链内质量分隔的至少3个质量)的谱质量过滤器。最低骨架裂解评分被设置为5，并使用“ESI QExactive HLA v2”评分方案。使用无酶特异性、半胱氨酸脲基甲基化(Camc)的固定修饰以及以下可变修饰：氧化甲硫氨酸(m)、焦谷氨酸和半胱氨酸化(Ccys)，搜索所有谱。前体和产物的质量公差分别设置为0.1Da和10ppm，最小匹配峰强度被设置为30％。使用Spectrum Mill自动验证模块自动将各个谱的肽谱匹配(PSM)指定为可信分配，以在PSM排名上应用基于靶标-诱饵的FDR估计来设置评分阈值标准。针对HLA等位基因在所有nLC-MS/MS运行中优化了使用最小序列长度为7的自动阈值策略、自动可变范围前体质量过滤以及得分和delta Rank1-Rank2得分阈值，从而对于每个前体电荷状态，得出PSM FDR估计值小于1％。
方程式
根据以下方程式计算每个肽表位的实验单同位素分子量(MW)，其中m/z是质谱仪检测到的肽表位的质荷比，z是肽表位的电荷，1.007276是质子的单同位素分子量。
方程式8.实验MW＝((m/z)×(z))–((z)×(1.007276))
结果
使用靶向nLC-MS/MS来验证衍生自GATA3 neoORF的肽表位的内源加工，该表位被预测与HLA-A*02:01、HLA-B*07:02和HLA-B*08:01结合。在三个等位基因中，在HEK293T细胞中检测到衍生自GATA3 neoORF共同区的五个肽表位(图23)。
对于HLA-A*02:01异二聚体，通过nLC-MS/MS靶向来自GATA3 neoORF共同区的四种肽。通过数据库搜索和与其合成肽对应物的谱匹配，成功鉴定了来自共同区的两种肽：SMLTGPPARV和MLTGPPARV。表24显示了每个肽表位的理论和实验单同位素分子量以及相关的质量误差。表25列出了由Spectrum Mill数据库搜索工作流程报告的骨架裂解评分和评分的峰值强度。骨架裂解评分表示HCD生成的片段特异性离子的数目，而评分的峰值强度显示了MS/MS谱中离子流的百分比，这由搜索解释来解读。
以下表24列出了理论和实验分子量以及质量误差
Figure BDA0002944947110002931
*小写字母m表示甲硫氨酸的氧化。
表25显示了来自数据库搜索的解读指标
Figure BDA0002944947110002941
*小写字母m表示甲硫氨酸的氧化。
在内源加工的肽表位上获得的每个MS/MS谱都与使用相应的合成肽生成的MS/MS谱进行匹配。图24显示了内源加工的肽表位SMLTGPPARV的MS/MS谱(图24A下图)与其相应的合成肽的MS/MS光谱(图24A上图)的谱比较。图24B显示了相同谱匹配的替代表示。这些从头到脚图是分别使用9聚体和10聚体肽表位的前45个或50个最丰富的离子生成的(http://orgmassspec.github.io/)。
图25显示了HLA-A*02:01内源加工的肽MLTGPPARV的MS/MS谱比较。
对于HLA-B*07:02，nLC-MS/MS靶向衍生自GATA3 neoORF共同区的五个肽表位。通过数据库搜索和与它们相应的合成肽的谱匹配，成功鉴定了来自共同区的两个肽表位：KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL。表24显示了每个肽表位的理论和实验分子量以及相关的质量误差。表25列出了搜索引擎报告的骨架裂解评分和评分的峰强度。
图26和图27分别显示了HLA-B*07:02肽表位KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL的谱比较。
对于HLA-B*08:01，nLC-MS/MS靶向衍生自GATA3 neoORF的共同区的八个肽表位。通过数据库搜索和与相应的合成肽的谱匹配，成功鉴定了来自共同区的一个肽表位：ESKIMFATL。该肽以甲硫氨酸的亚砜形式检测到，其导致15.999Da的质量位移，表明侧链上增加了氧。甲硫氨酸氧化(表示为小写字母m)为其亚砜形式是样品加工的常见结果。表24显示了ESKImFATL的理论和实验分子量以及相关的质量误差。表25列出了搜索引擎报告的骨架裂解评分和评分的峰强度。
图28显示了HLA-B*08:01肽表位ESKImFATL的谱比较。
使用靶向nLC-MS/MS来验证衍生自GATA3 neoORF共同区的五个肽表位的加工和呈递，这些表位被预测与HLA-A*02:01、HLA-B*07:02和HLA-B*08:01异二聚体结合。使用在每个I类HLA异二聚体的α链上遗传表达的亲和标签，从稳定表达GATA3 neoORF的HEK293T细胞中纯化I类HLA异二聚体。如RP19-005中所述，将每个亲和标记的异二聚体(BAP标记的HLA等位基因)瞬时转染到表达GATA3 neoORF的HEK293T细胞中。通过nLC-MS/MS肽测序确认了每个靶向肽表位的正确线性序列。使用Spectrum Mill数据库搜索工作流程解读了所有MS/MS谱，该工作流程将实验MS/MS谱与来自包含超过63,000个条目(包括全长GATA3 neoORF)的数据库的肽进行匹配。每个观察到的肽表位的分子量经计算在其理论分子量的+/-0.01Da之内。对实验MS/MS谱的解读表明，MS/MS谱中≥72％的离子电流可以用序列特异性碎片离子来解释。通过与显示相同碎片离子质量和骨架裂解模式的相应合成肽的MS/MS谱进行谱匹配，对内源加工的肽表位序列进行了进一步确认。综合起来，靶向nLC-MS/MS证实，HLA-A*02:01肽表位SMLTGPPARV和MLTGPPARV，HLA-B*07:02肽表位KPKRDGYMF和KPKRDGYMFL，以及HLA-B*08:01肽表位ESKIMFATL，在HEK293T细胞中被内源加工，随后被HLA异二聚体结合。
实施例23-对MHC I的免疫原性
该实施例评价了各种高发生率HLA等位基因上的GATA3neoORF的免疫原性。GATA3neoORF是发生在自然终止密码子之前的移码突变，导致蛋白质延伸至少61个新氨基酸。通过针对HLA-A02:01、A03:01,A24:02、B07:02或B08:01特异性预测最小表位在体外诱导健康供体(HD)PBMC来评价免疫原性。
材料与方法
表26列出了基于等位基因限制制备的肽池
Figure BDA0002944947110002961
表27列出了健康供体信息
Figure BDA0002944947110002962
N/A＝供体对于特定等位基因是纯合的。表位靶向的等位基因以粗体显示。
使用FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)诱导以刺激DC
通过以下方法进行FLT3L刺激。将PBMC解冻并以5x10^7个细胞/mL重新浮在AIM-V培养基中。以25-29U/μL加入Benzonase(Sigma-Aldrich 70746)，并在37℃下孵育30分钟-1小时。根据制造商的方案(Miltenyi Biotec,Inc 130-050-201，130-092-983)进行了CD14/CD25耗竭，以去除单核细胞(CD14)和T调节细胞(CD25)。以2x10^6个细胞/mL将细胞重悬浮于含50ng/mL FLT3L(CellGenix 1415-050)的AIM-V培养基中，并在24孔板中每孔接种2mL过夜。以2uM的终浓度加入在AIM-V中稀释的肽，并将孔轻轻混合。将细胞与该肽在37℃下孵育1小时。
加入具有肿瘤坏死因子a(TNF-a)(1000U/mL)(CellGenix1406-050)、IL-1b(10ng/mL)(CellGenix141-1050)、前列腺素-E 1(PGE-1)(0.50.5μg/mL)和IL-7(0.5ng/mL)的成熟混合物，并在37℃下孵育过夜。在成熟混合物孵育过夜之后，将FBS以10体积％的终浓度添加到每个孔中并混合。从第5天开始，每2-3天对共培养物进行滋养，方法是用新鲜的含有对于孔中5ng/mL终浓度足够的IL-7和IL-15的Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI)+10％FBS小心地替换75％的培养基。对于第一个之后的滋养，将培养基替换为新鲜的含有对于孔中5ng/mL终浓度足够的IL-7和IL-15的20/80+10％FBS。在第4天开始mDC生成。
成熟树突细胞(mDC)生成
将PBMC解冻，并以x10^7个细胞/mL重悬于树突细胞(DC)培养基(Cellgenix20801-0500)中。以25-29U/uL加入Benzonase(sigma-aldrich 70746)，并在37℃下孵育30分钟-1小时。
根据制造商的方案(Miltenyi biotec,Inc 130-096-537)进行泛单核细胞分离。将细胞以3x10^6个细胞/孔接种于6孔板中的2mL DC培养基中，其中含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(800U/mL)(CellGenix 1412-050)和IL-4(400U/mL)(CellGenix1403-050)，并在37℃下孵育5天。
通过以下方式进行肽的负载和成熟。通过移液收集孔中的immDC，并通过在1200RPM下离心5分钟沉淀。将细胞以1mL重悬于DC培养基中。将细胞分成池，对于每个池，每个孔具有0.2x10^6(或0.5x10^6)个细胞，并在37℃下与1.6uM的肽(终浓度0.4uM)一起孵育1小时。将每孔800uL(或2mL)DC培养基添加到负载有肽的immDC中，并接种在具有以下细胞因子的6孔板中，并在37℃下孵育2天：IL-4(400U/mL)(CellGenix 1403-050)，GM-CSF(800U/mL)(CellGenix 1412-050)，TNF-a(10ng/mL)(CellGenix 1406-050)，IL-1b(10ng/mL)(CellGenixl411-050)，PGE-1(0.5μg/mL)(捷克共和国的Cayman)，IL-6(10ng/mL)(CellGenix 1004-50)。
成熟树突细胞介导的长期刺激(mDC LTS)
在第12天，加入受FLT3L刺激的T细胞。将DC重悬于1mL 20/80。收获共培养孔并计数，并将细胞以5x10^6/mL重悬浮于20/80。将1mL幼稚T细胞与细胞因子IL-7(5ng/mL)、IL-15(5ng/mL)以10:1(T细胞:mDC)的比例添加至mDC。加入培养基至每孔最终体积为5mL。将共培养物在37℃下孵育。从第15天开始，每2-3天滋养共培养物。根据需要将细胞扩充到更大容量的培养瓶中。
方程式9.待添加的培养基(mL)＝(当前体积(mL)×(180-葡萄糖))/60
在第23天，在新的mDC上对培养物进行重新刺激。将DC重悬于1mL 20/80。收获共培养孔，并将细胞以2e6/mL(或5e6/mL)重悬浮于20/80。将1mL幼稚T细胞与细胞因子IL-7(5ng/mL)、IL-15(5ng/mL)以10:1(T细胞:mDC)的比例添加至mDC。添加培养基至每孔5mL的最终体积。将共培养物在37℃下孵育。每2-3天滋养共培养物。根据需要将细胞扩充到更大容量的培养瓶中。
方程式9.待添加的培养基(mL)＝(当前体积(mL)×(180-葡萄糖))/60
在第31天，将细胞在1mL冷冻介质(90％FBS，10％DMSO)中冷冻。将细胞在CoolCellFreeze Container(VWR 75779-816)中于-80℃保存过夜，然后将其转移到液氮中进行长期保存。
多聚体生成和分析
肽交换单体
内部产生带有紫外线可裂解肽的HLA MHC I类单体。将单体以100ug/mL重悬于过滤的PBS中，并将测定肽以10mg/mL重悬于DMSO中，并将UV可裂解的肽与单独的测定肽以1uL肽:50uL单体的比例在UV光下于4℃交换1小时。交换的单体以3600RPM离心分离，收集上清液。
荧光染料缀合
根据以下每种荧光染料的缀合率(CR)，将50uL pMHC与链霉亲和素标记的荧光染料在冰上于黑暗中混合30分钟：PE(BioLegend 405203)(CR:2)；APC(BioLegend 405207)(CR:3)；BV421(BioLegend 405226)(CR:2)；QD605(Life Technologies Q10101 MP)(CR:2)；QD705(Life Technologies Q10161 MP)(CR:2)；BUV395(BD 564176)(CR:2)；BV650(BD563855)(CR:2)。拆分每种pMHC，并与两种单独的荧光染料缀合。以1:20的比例添加生物素(Avidity BIO200)+0.5％叠氮化物，并将多聚体在黑暗中于4℃保存1至3天。在第11天、22天和冷冻后获得流式细胞术读数。在聚丙烯V型底部96孔板中，在含有25-29U/uL的Benzonase(sigma-aldrich 70746)的培养基中收集约2x10^6个细胞，并在37℃下孵育30分钟-1小时。
在37℃下在黑暗中，用以下所有负载有诱导肽的荧光染料缀合的多聚体在50uL过滤的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中对细胞进行染色15分钟。PE(BioLegend 405203)1uL；APC(BioLegend 405207)3uL；BV421(BioLegend 405226)1uL；QD605(Life TechnologiesQ10101 MP)4.5uL；QD705(Life Technologies Q10161 MP)4.5uL；BUV395(BD 564176)3.5uL；BV650(BD 563855)2.5uL。在黑暗中在冰上将样品用以下表面抗体染色30分钟。在LSR-Fortessa上分析分化簇(CD)8(+)/CD4(-)/CD14(-)/CD16(-)/CD19(-)/Dead(-)/多聚体_1(+)/多聚体_2(+)/无关多聚体(-):CD8-FITC(Biolegend 344704)2uL，CD4-AF700(BD557922)1uL，CD14-AF700(BD 557923)1uL，CD19-AFF700(BD 557921)1uL，CD16-AF700(BD557920)1uL，活死染色剂(Molecular probes L-23101)0.1uL。
结果
对于供体针对其诱导的每种肽，每个样品以独特的荧光染料组合用两种多聚体染色。通过对于至少1个特定荧光染料组合呈阳性且对于无关荧光染料组合呈阴性的至少10个事件确定阳性诱导。每次刺激后收集数据，在两次刺激中的阳性结果被认为是阳性诱导。图29A和图29B显示了GATA3 Neoantigen CD8+应答的代表性诱导。
表28显示了阳性GATA3 Neoantigen CD8+应答的百分比
Figure BDA0002944947110003001
表28报告了经两次独立刺激确认幼稚CD8+ T细胞诱导的重复物的百分比。
这些结果表明，在GATA3 neoORF中存在至少一个最小表位，其可以在体外对5个测定的HLA中的4个产生CD8+特异性诱导。结果表明了跨所有HLA的GATA3 neoORF的广泛免疫原性，并鉴定了高发生率HLA特有的免疫原性最小新抗原表位。
实施例24-对MHC II的免疫原性
该实施例评估了对GATA3neoORF具有特异性的长聚体肽(>15个氨基酸)的CD4免疫原性。为了预测体内CD4的免疫原性，对5名具有最小HLA-II类重叠的不同健康供体进行了体外诱导测定。
材料与方法
以下表29列出了诱导肽
Figure BDA0002944947110003002
Figure BDA0002944947110003011
以下表30提供了健康供体信息
Figure BDA0002944947110003012
成熟树突细胞(mDC)生成
单核细胞分离
将PBMC解冻并以5x10^7个细胞/mL重新浮在树突细胞(DC)培养基(Cellgenix20801-0500)中。以25-29U/μL加入Benzonase(Sigma-Aldrich 70746)，并在37℃下孵育30分钟-1小时。根据制造商的方案(Miltenyi biotec,Inc 130-096-537)进行泛单核细胞分离。将细胞以3x10^6个细胞/孔接种在6孔板中的含有GM-CSF(800U/mL)和IL-4(400U/mL)的2mL DC培养基中，并在37℃下孵育5天。
肽负载和成熟
通过移液收集孔中的immDC，并通过在1200RPM下离心5分钟沉淀。将细胞以1mL重悬于DC培养基中。将细胞分成池，对于每个池，每个孔具有0.2x10^6(或0.5x10^6)个细胞，并在37℃下与1.6uM的肽(终浓度0.4uM)一起孵育1小时。将每孔800uL(或2mL)DC培养基添加到负载有肽的immDC中，并接种在具有以下细胞因子的24(或6)孔板中，并在37℃下孵育2天：IL-4(400U/mL)(CellGenix 1403-050)，GM-CSF(800U/mL)(CellGenix 1412-050)，TNF-a(10ng/mL)(CellGenix 1406-050)，IL-1b(10ng/mL)(CellGenixl411-050)，PGE-1(0.5μg/mL)(捷克共和国的Cayman)，IL-6(10ng/mL)(CellGenix 1004-50)。
长期刺激(LTS)
加入幼稚T细胞。将PBMC解冻，并以5x10^7个细胞/mL重悬于DC培养基(Cellgenix20801-0500)中。以25-29U/uL加入Benzonase(sigma-aldrich 70746)，并在37℃下孵育30分钟-1小时。
根据制造商的方案(Miltenyi Biotec,Inc 130-050-201，130-092-983)进行了CD14/CD25耗竭，以去除单核细胞(CD14)和T调节细胞(CD25)。将1mL幼稚T细胞与细胞因子IL-7(5ng/mL；CellGenix)和IL-15(5ng/mL；CellGenix)以10:1(T细胞:mDC)的比例添加至mDC。将共培养物在37℃下孵育。将mDC悬浮在20/80中或保存在含有细胞因子的DC培养基中。
按照下面的方法1或方法2(2.3.2.1.1或2.3.2.1.2)，从第5天开始每2-3天对共培养物进行滋养。根据需要将细胞扩充到更大容量的培养瓶中。对于方法1，
待添加的培养基的计算公式为(mL)＝(当前体积(mL)x(180葡萄糖))/60。对于方法2，使用血糖仪检查培养基是否为黄色。如果葡萄糖仍然很高(>90mg/dL)，则向孔中加入100uL 20x IL-7和IL-15。如果葡萄糖低(<90mg/dL)，则将细胞扩充到6孔板(4mL/孔)，并补充1x IL-15和IL-7。如果葡萄糖非常低(<60mg/dL)，则在6孔板中扩充至6mL/孔。在第6、13或14天生成了新的mDC。
在第13和21或22天，重新刺激在新mDC上的培养物。收获共培养孔，并以2x10^6/mL(或5x10^6/mL)将细胞计数并重悬于20/80。将1mL幼稚T细胞与细胞因子IL-7(5ng/mL)、IL-15(5ng/mL)以10:1(T细胞:mDC)的比例添加至mDC。将共培养物在37℃下孵育。将mDC悬浮在20/80中或保存在含有细胞因子的DC培养基中。在第28或29天，将细胞在1mL冷冻培养基(90％FBS，10％DMSO)中冷冻。将细胞在CoolCell Freeze Container(VWR 75779-816)中于-80℃保持过夜，然后将其转移到液氮中进行长期保存。CD4召回(recall)试验
或者生成新的mDC，或者从相同的诱导供体融化新鲜的PBMC。将细胞以PBMC的0.26/孔DMSO和0.02x10^6/孔mDC接种在96孔u型底板中，其中肽或DMSO的终浓度为0.8uM。以1:1的诱导:PBMC或10:1的诱导:mDC比将诱导样品添加至孔中，并在32℃下孵育20-24小时。
流式细胞术读数
根据制造商的方案，将Golgi stop(BD 554724)和golgi plug(BD 555029)添加到培养物中，并孵育4小时。将细胞用CD4-BV786(BD 563877)、CD8-AF700(BD 561453)、CD14-FITC(BD 340682)、CD16-FITC(BD 340704)、CD19-FITC(BD 340864)、活死染色剂(Molecular probes L-23101)染色20分钟。使用固定/透化试剂盒(BD 554714)，根据制造商的方案固定样品。用IFN-y-PE(Biolegend 502508)将细胞染色20分钟。在LSR-Fortessa上对CD4(+)/CD8(-)/CD14(-)/CD16(-)/CD19(-)，死(-)/IFNy(+)上进行了分析。
结果
使用流式细胞术，鉴定了抗原特异性的CD4 T细胞(图30A和图30B)。在每个测试的健康供体中，至少鉴定出一种对GATA3 neoORF特异性肽的诱导。
通过针对单种肽召回诱导的细胞，并与不含肽的召回进行比较，从而鉴定出特定的反应性肽。每个诱导样品首先针对诱导池运行，随后针对单种肽召回阳性样品。所有样品均在重复的板上进行，如果与不含肽的相同样品相比，含有肽的诱导样品的平均CD4+/IFNy+百分比大于2％、则认为该样品是命中的。
表31显示了GATA3 Neoantigen CD4应答的百分比
Figure BDA0002944947110003031
粗体序列在所有患者共有的GATA3 NeoOrf区域中
在所有测试的健康供体中，至少观察到一种对GATA3 neoORF共同区的CD4特异性应答。这些供体具有广泛的MHC II类HLA等位基因，表明产生CD4 GATA3应答的能力不是等位基因依赖性的。
实施例25-诱导的CD8+ T细胞的功能测定
该实施例显示了对衍生自GATA结合蛋白3(GATA3)新开放阅读框(neoORF)的新抗原具有特异性的CD8+ T细胞杀死具有适当GATA3neoORF突变的细胞的能力。先前在实施例23中描述了新抗原特异性CD8+ T细胞的诱导，并且在实施例21中描述了具有GATA3 neoORF突变的细胞系的产生。
在该实施例中，选择对来自HLA-A02:01上呈现的GATA3 neoORF的单个表位(被肽序列MLTGPPARV覆盖)具有特异性的CD8+ T细胞用于该详细分析。简而言之，将诱导的CD8+T细胞与靶细胞共培养，所述靶细胞或者用GATA3 neoORF转导，或者未经操作而作为阴性对照。共培养后，评估靶细胞的胱天蛋白酶3表达，胱天蛋白酶3是细胞死亡的标志物，作为诱导的CD8+ T细胞细胞毒性的量度。相对于未操作的细胞，表达GATA3 neoORF的靶细胞上胱天蛋白酶3的增加表示特异性杀伤，这是因为同源表位呈现于靶细胞的表面上。另外，评估CD8+ T细胞的CD107a(一种T细胞活化标志物)的表达，以测量抗原特异性T细胞活化。为了进一步评估对GATA3诱导的PBMC的抗原特异性识别，还在上清液中测量了IFN-γ，它是抗原识别后CD8+细胞毒性T细胞产生的细胞因子。
总共测试了对HLA-A02:01上的GATA3 neoORF表位具有特异性的四个不同的CD8+T细胞群体杀死具有该突变的靶细胞的能力。在所有四种情况下，相对于没有突变的靶细胞，在携带GATA3 neoORF的靶细胞上观察到胱天蛋白酶3增加。胱天蛋白酶3的增加表明了对来自GATA3neoORF的表位具有特异性的CD8+ T细胞杀死具有GATA3 neoORF突变的细胞的能力。
材料与方法
细胞毒性测定
HEK 293T细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Rockford,MD,USA)，并保存在DMEM、10％FBS和Pen/Strep培养基中。生成了GATA3基因编码的慢病毒，并将其转导至HEK293T细胞。将GATA3转导的HEK 293T细胞在完全培养基中在1μg/mL的嘌呤霉素下维持2周以上。实施例21描述了更多细节。
将1mL中的1X107个靶细胞添加到1μL Tag-it Violet(Biolegend)中，然后在5％CO2培养箱中孵育20分钟，用10％FBS洗涤5mL培养基两次，并将细胞以1X106个细胞重悬于培养基中。
通过将诱导的PBMC小瓶置于37℃水浴中解冻。然后将1mL FBS添加到每个小瓶中。将细胞转移至含有15ml AIM-V、10％FBS和Pen/Strep培养基的50mL锥形管中。将细胞以1500rpm离心5分钟，然后重悬于5mL培养基中。将细胞在37℃，5％CO2培养箱中静置1小时30分钟，然后加入5μL Benzonase(Millipore Sigma)并进一步在37℃，5％CO2培养箱中培养30分钟。将培养的细胞再次离心，除去上清液后重悬于5mL AIM-V培养基中。使用Vi-CELL计数器(Beckman coulter)对细胞数进行计数。
将细胞离心并每1X107个靶细胞重悬于40μL MACS缓冲液中。根据人CD8+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)阴性富集CD8+阳性细胞。将CD8+细胞以2.5X106个细胞重悬于1mL AIM-V培养基中。将每孔.5X104个靶细胞接种在96孔平底板上的50μL培养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。将GATA3诱导的和CD8+富集的细胞以每孔2.5X105个细胞接种在100μL AIM-V培养基中的靶细胞上。将共培养细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时。
收集共培养的培养上清液，并根据制造商的方案(Meso Scale Discovery)，使用V-PLEX人IFN-γ测定评估IFN-γ浓度。
将悬浮细胞转移到新的染色板上，并在每孔添加50μL胰蛋白酶、在37℃下孵育并重悬于AIM V培养基后转移贴壁细胞。合并细胞，离心并用FACS缓冲液洗涤。将50μL抗体混合物(抗CD3-BUV8052，抗CD4-BV71，抗CD107a-BV786，抗CD8+-PE-cy5和IR染料Live/Dead；BD)添加到每个样品中，然后在冰上孵育30分钟。用100μL FACS缓冲液洗涤细胞。根据Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD)的制造商手册，使用2μL胱天蛋白酶-3抗体进行胱天蛋白酶-3细胞内染色。通过Fortessa II(BD)分析染色的细胞。
结果
GATA3诱导的PBMC的细胞毒性测定
通过长期刺激方法，用GATA3 HLA-A:02新抗原肽MLTGPPARV诱导了三种不同的健康供体PBMC(HD47、HD50和HD51)。考虑到等位基因频率和细胞计数，与其他与GATA3 neoORF相关的表位:等位基因相比，已确定该表位:等位基因组合最适合用于在细胞毒性测定中测试。图31A-31D通过多聚体染色显示了GATA3特异性CD8+ T细胞。选择这些T细胞作为效应细胞用于细胞毒性测定。
GATA3转导的HEK293T细胞用作靶细胞(实施例21)。另外，未转导的HEK 293T细胞用于阴性对照。效应细胞和靶细胞共培养6小时后，在未转导的靶细胞中，这4个实验观察到胱天蛋白酶-3阳性细胞平均值分别为3.3％、3.7％、2.5％和2.8％，在经GATA3转导的细胞中，分别观察到胱天蛋白酶-3阳性细胞的平均值为4.4％、5.2％、6.3％和6.9％(图32)。与来自HD51的GATA3诱导的PBMC共培养时，观察到明显更高的胱天蛋白酶-3阳性靶细胞(图33)。在GATA3转导的HEK293T细胞与2种GATA诱导的健康供体PBMC(样品1和样品2)的共培养条件下，观察到较高频率的表达CD107a的CD8+ T细胞(图34)。在与2种GATA诱导的健康供体PBMC(样品1和样品2)共培养的相同条件下，检测到较高水平的IFN-γ(图35)。
利用体外细胞毒性测定评估对GATA3 neoORF特异性的CD8+ T细胞识别并杀死具有GATA3移码突变的细胞的能力。测试了PBMC，其包括对来源于用GATA3移码肽MLTGPPARV刺激的健康供体的HLA-A02:01上GATA3移码新抗原具有特异性的T细胞，代表可能由GATA3移码疫苗诱导的T细胞类型。通过分析靶细胞死亡标记物胱天蛋白酶-3的存在，证实这些T细胞导致肿瘤细胞死亡。CD8+ T细胞活化标志物CD107a和细胞因子IFN-γ测定的结果进一步表明，这些肽诱导的T细胞可以识别并杀死天然加工并呈递GATA3移码新抗原的细胞。
实施例26-TCR克隆和功能测定
该实施例显示克隆对HLA-A02:01上GATA3 neoORF的新抗原具有特异性的CD8+ T细胞的T细胞受体(TCR)和功能测定。实施例23中描述了新抗原特异性CD8+ T细胞的诱导。使用荧光激活细胞分选(FACS)分离特定的CD8+ T细胞，并使用10x Genomics和MiSeq平台鉴定TCR序列。然后将所选的TCR在T细胞系中重组表达，以用于TCR的功能表征以及评价新抗原在具有GATA3 neoORF突变的细胞表面上的加工和呈递，其产生在实施例21中进行了描述。
经表征，TCR的亲合力低于40nM。这表明可以产生具有针对GATA3新抗原的TCR的CD8+ T细胞。此外，TCR能够识别具有GATA3neoORF突变的HEK293T细胞表面上已加工并呈递的新抗原，这支持了实施例22中的结果，证明了具有该突变的细胞表面上GATA3新抗原的加工和呈递。
材料与方法
图36-38显示了TCR克隆和功能测定的概览。根据多聚体的GATA3 CD8+ T细胞分选
诱导并扩充GATA3 neoORF特异性T细胞(实施例23)。用GATA3 9聚体肽多聚体和表面抗体(CD8、CD4、CD14、CD16、CD19和近红外荧光反应性染料)对诱导的细胞进行染色。通过FACS ARIA融合(BD)分选GATA3多聚体和CD8阳性的GATA3特异性T细胞，并收集到含有在PBS中的2％FBS的1.5mL试管中。
通过10x Genomics和MiSeq进行的单T细胞TCR测序
分选后，立即使用Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits(10x Genomics)对收集到的细胞进行单细胞条形码处理并生成cDNA。根据制造商的方案进行了TCR序列富集和文库构建。使用MiSeq 300循环试剂试剂盒和MiSeq(Illumina)以10pM的规模进行测序。使用Cell Ranger软件和Loupe VDJ浏览器(10x Genomics)进行TCR序列和克隆性的分析。
TCR基因合成与克隆
将所选的TCR序列对哺乳动物系统进行密码子优化。合成TCR DNA序列，并由GENEWIZ(NJ,USA)将其克隆至慢病毒载体(pCDH-EF1ɑ-Puro，System Biosciences)中。该慢病毒载体包含EF1ɑ启动子，其后是TCRβ、弗林蛋白酶切割位点、F2A、TCRα、T2A和嘌呤霉素抗性位点(图40)。
慢病毒生产
为了产生慢病毒编码的GATA3 neoORF TCR基因，通过转染方法使用慢病毒载体、包装质粒和新鲜的HEK293T细胞(ATCC)。转染和收获的细节在实施例21中描述。
向Jurkat细胞或PBMC中的转导
缺少TCR beta的经修饰的Jurkat(J.RT3-T3.5，ATCC)细胞通过编码CD8+α基因的慢病毒进行修饰以表达CD8+α链。修饰的Jurkat细胞用于转导GATA3 TCR慢病毒。将1.8X106个Jurkat细胞接种在24孔板中的1.2mL含10％FBS和6μg/mL聚凝胺的RPMI-1640培养基中。将0.6mL GATA3特异性TCR慢病毒添加至细胞后，将板在32℃下以2,400rpm离心45分钟。将细胞在5％CO2培养箱中培养24小时。将转导的Jurkat细胞在含10％FBS和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640培养基中保存10天。
采用肽滴定的IL-2释放测定
为了评估克隆到Jurkat细胞中的TCR的敏感性，进行了肽滴定分析。Jurkat细胞响应于TCR信号传导而特异性分泌IL-2。因为在此测定中使用的Jurkat细胞缺少内源TCRβ，所以这些细胞表面上的TCR特别是克隆的TCR。向具有相关HLA(HLA-A02:01)但不具有GATA3突变的HEK293T靶细胞中添加宽浓度范围的肽，以评估最大IL-2分泌，并评估释放该最大分泌量的50％所需的肽浓度(EC50)。该EC50被视为TCR的亲合力。将20,000个内源性表达HLA:A02.01的未修饰的HEK 293T细胞接种在96孔板上，其中在含10％FBS的DMEM中添加有100μLGATA3肽或无关肽，浓度为20μM至2pM。在37℃下孵育过夜后，将200,000个GATA3neoORF特异性TCR转导的Jurkat细胞以10:1的TCR转导的Jurkat细胞与负载有肽的HEK 293T细胞的比例添加到每个孔中。将共培养物在5％CO2培养箱中在37℃下孵育24小时。从每个孔中收集50μl上清液，并通过Meso规模发现试剂盒按照制造商的方案测定人IL-2的浓度。
采用GATA3突变转导的靶细胞的IL-2释放测定
为了评估TCR识别真正加工并呈递的新抗原的能力，将TCR转导的Jurkat细胞和HEK 293T靶细胞共同培养。但是，在该系统中，没有外源添加任何肽。相反，将用GATA3neoORF或无关基因转导的细胞系用作靶标。以这种方式，为了使TCR转导的Jurkat细胞识别其靶标，必须加工GATA3新抗原并将其呈递在靶标细胞的表面上。
将20,000个GATA3突变或无关基因转导的HEK 293T细胞接种在96孔板上。过夜孵育后，将200,000个GATA3特异性TCR转导的Jurkat细胞添加到每个孔中。将共培养物在37℃下在5％CO2培养箱中培养24小时。从每个孔中收获50μl上清液，并通过Meso规模发现试剂按照制造商的方案(Meso Scale Discovery)盒测定人IL-2的浓度。
结果
GATA3特异性TCR Jurkat细胞
GATA3特异性CD8+ T细胞分选
在用GATA3 neoORF肽MLTGPPARV长期刺激后，通过GATA3 HLA-A02多聚体在健康供体42的5号孔中检测到2.1％的GATA3特异性CD8+ T细胞。通过FACSARIA分选5402个多聚体双阳性细胞(图39)。用10X Genomics V(D)J试剂盒对分选的细胞进行条形码编码。使用Loupe V(D)J浏览器分析了TCRα和β配对的序列。显性克隆型(克隆型1)分别具有CDR3 TCRα和β氨基酸序列的序列CALDIYGNNRLAF和CASSLDFVLAGSYSYEQFF。克隆型2具有与克隆型1相同的TCRβ序列，但没有TCRα序列。克隆型4具有与克隆型1相同的TCRα序列，但没有TCRβ序列。克隆型1、2和4的总比例占所有TCR克隆型的82.5％，其他克隆型少于1％(表32)。
以下表32显示了示例性GATA3特异性TCR克隆型分析
克隆型_id 频率 比例 CDR3氨基酸序列
克隆型1 1178 48％ TRA:CALDIYGNNRLAF；TRB:CASSLDFVLAGSYSYNEQFF
克隆型2 848 34％ TRB:CASSLDFVLAGSYSYNEQFF
克隆型4 12 0.5％ TRA:CALDIYGNNRLAF
克隆型3 12 0.5％ TRA:CAEKVPNTGNQFYF；TRB:CASSSLGTVRTEAFF
克隆型5 10 0.4％ TRA:CAVEAYNFNKFYF；TRB:CASRSENTIYF
克隆型6 10 0.4％ TRA:CILSDSGNTPLVF；TRB:CASSDWAVSGNTIYF
克隆型7 9 0％ TRA:CAGAANAGGTSYGKLTF；TRB:CASSQAQGANYGYTF
克隆型9 7 0％ TRA:CAEIPTFSGGYNKLIF；TRB:CASSLAGQETQYF
克隆型8 7 0％ TRA:CLRGGSTLGRLYF；TRB:CASSLYPTGGSGMDEQYF
克隆型10 6 0％ TRA:CAVRDGNTGGFKTIF；TRB:CASSELKTGGAFF
GATA3特异性TCR DNA合成和克隆
根据人密码子使用频率对克隆型1TCRα和β序列进行密码子优化，以在人细胞系和PBMC中获得最大表达(表32)。通过DNA测序和限制酶消化评价了TCR基因编码的慢病毒质粒(图40)。最终GATA3 neoORF特异性TCR编码的质粒的DNA序列数据与TCRα和β密码子优化的序列100％匹配(图41中的粗体)。限制酶AflII消化后，观察到两个DNA条带；一个条带在6000bp与5000bp之间，另一个条带在4000bp与3000bp之间。这些条带分别与预期的5590bp和3424bp的大小相关(图42)。
以下表33显示了GATA3特异性TCRα和βDNA序列及密码子优化的序列。
Figure BDA0002944947110003111
GATA3特异性TCR表达
对于表达GATA3特异性TCR的Jurkat细胞，在用GATA3特异性TCR构建体转染HEK293T细胞系后，使用慢病毒系统，并将慢病毒转导到Jurkat细胞中。用GATA3多聚体-PE和GATA3多聚体-BV650对转导的和嘌呤霉素选择的Jurkat细胞进行染色，并与未转导的Jurkat细胞进行比较，以验证GATA3特异性TCR表达。73.1％的细胞对于GATA3多聚体-PE和GATA3多聚体-BV650均为阳性，表明GATA3 neoORF特异性TCR表达(图43)。
肽滴定试验
为了验证重组TCR是功能性的，用GATA3特异性TCR转导的Jurkat细胞测试了20μM至0.2pM的肽浓度。Jurkat细胞的IL-2分泌水平显示出与GATA3肽浓度呈非线性相关，观察到的EC50＝37.85nM(图44)。GATA3特异性TCR转导的Jurkat的IL-2释放测定
为了验证GATA3突变特异性TCR Jurkat对内源GATA3突变抗原的识别，将突变转导的HEK 293T细胞用作靶细胞，并与GATA3 TCR转导的Jurkat细胞共培养。在图45中，在负载有GATA3突变肽的HEK 293T细胞组(圆圈)中IL-2水平高于负载有无关肽的细胞组(三角形)。在图45中，GATA3突变转导的靶细胞组(正方形)中的IL-2水平也高于无关基因转导的靶细胞组(倒三角形)。
在该研究中，从对HLA-A02:01上呈现的GATA3新抗原具有特异性的CD8+ T细胞克隆了TCR。通过肽滴定(EC50)，将TCR的亲合力定义为小于40nM，并且TCR能够识别表达GATA3neoORF的细胞系。这些数据证实了具有有效TCR的CD8+ T细胞的生成，这些TCR可以识别具有GATA3 neoORF突变的细胞。
以下描述的实施例27-实施例41涉及突变BTK和突变EGFR肽
实施例27-细胞内细胞因子染色测定
如实施例1和实施例2中所述进行BTK新抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的诱导和四聚体染色测定。如实施例1和实施例2中所述进行EGFR新抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的诱导和四聚体染色测定。在不存在完善的用于鉴定抗原特异性T细胞群体的四聚体染色的情况下，可以使用完善的流式细胞术测定，使用对细胞因子产生的评估来估计抗原特异性。简言之，用目的肽刺激T细胞并与对照进行比较。刺激后，通过细胞内染色评估CD4+T细胞的细胞因子(例如，IFNγ和TNFα)产生。这些细胞因子，尤其是IFNγ，可用来鉴定经刺激的细胞。对于用负载有或不具有突变BTK的APC刺激的健康供体的CD4+细胞，进行了IFNγ和TNFα水平的抗原特异性诱导的FACS分析。对于用负载有或不具有突变EGFR肽的APC刺激的健康供体的CD4+细胞，进行了IFNγ和TNFα水平的抗原特异性诱导的FACS分析。
实施例28-ELISPOT测定
使用ELISPOT测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定在单细胞基础上测定IFNγ从T细胞的释放。将靶细胞(T2或HLA-A0201转染的C1R)用10μM肽在37℃下脉冲1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的靶标在ELISPOT板孔中与取自免疫原性培养物的不同浓度的T细胞(5x102至2x103)共培养。根据制造商的方案对板进行显色，并在ELISPOT读取仪(Cellular Technology Ltd.)上使用附带的软件进行分析。将对应于产生IFNγ的T细胞数的斑点报告为绝对斑点数/接种的T细胞数。对于在修饰的肽上扩充的T细胞，不仅检测它们识别用修饰的肽脉冲的靶标的能力，而且还检测它们识别用亲本肽脉冲的靶标的能力。确定了模拟转导的或用编码突变BTK肽或突变EGFR肽的慢病毒表达载体转导的样品的IFNγ水平。
实施例29-CD107染色测定
在用同源肽激活后，CD107a和b在CD8+ T细胞的细胞表面上表达。T细胞的裂解颗粒具有含有溶酶体相关膜糖蛋白(“LAMP”)的脂双层，该溶酶体相关膜糖蛋白包括分子CD107a和b。当通过T细胞受体激活细胞毒性T细胞时，这些裂解颗粒的膜动员并与T细胞的质膜融合。颗粒内容物被释放，并且这导致靶细胞死亡。当颗粒膜与质膜融合时，C107a和b暴露在细胞表面上，因此是脱颗粒的标志物。因为如通过CD107a和b染色测定的脱颗粒是在单细胞基础上报告的，所以该测定用来对肽特异性T细胞进行功能性计数。为了进行该测定，将肽加入到HLA-A02:01转染的细胞C1R中至终浓度为20μM，将细胞在37℃下孵育1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的C1R细胞等分到试管中，并添加CD107a和b特异性抗体至制造商(Becton Dickinson)建议的终浓度。在添加T细胞之前加入抗体，以“捕获”CD107分子，因为它们在测定过程中瞬时出现在表面上。然后加入来自免疫原性培养物的1x105个T细胞，并将样品在37℃下孵育4小时。针对其他细胞表面分子如CD8对T细胞进一步染色，并且在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得所述T细胞。使用附带的Cellquest软件分析数据，并将结果报告为CD8+/CD107a和b+细胞的百分比。
实施例30-细胞毒性测定
使用方法1或方法2测定细胞毒活性。方法1需要铬释放测定。将靶T2细胞在37℃下用Na51Cr标记1小时，然后将洗涤过的5x103个靶T2细胞加入到来自免疫原性培养物的不同数目的T细胞。在37℃下孵育4小时后收获的上清液中测定铬释放。特异性裂解的百分比计算如下：
方程式10.实验释放-自发释放/总释放-自发释放x100。
在方法2中，通过用流式细胞术检测靶细胞中裂解的胱天蛋白酶3来测量细胞毒性活性。将靶癌细胞工程改造为表达突变肽以及适当的MHC-I等位基因。模拟转导的靶细胞(即不表达突变肽)用作阴性对照。用CFSE标记细胞，以将它们与用作效应细胞的经刺激的PBMC区分开。在收获前，将靶细胞和效应细胞共培养6小时。进行细胞内染色，以检测CFSE阳性靶癌细胞中胱天蛋白酶3的切割形式。特异性裂解的百分比计算如下：
方程式11.胱天蛋白酶3的实验切割/胱天蛋白酶3的自发切割(在没有突变肽表达的情况下测量的)x100。
方法2的细胞毒性测定在本文实施例25的材料与方法部分中提供。实施例31-依次使用长聚体和短聚体在体内增强的CD8+ T细胞应答
长聚体肽的疫苗接种可诱导CD4+和CD8+ T细胞应答，具体取决于肽的加工和呈递。用最小的短聚体表位进行的疫苗接种着重于产生CD8+ T细胞应答，但在抗原呈递之前不需要肽加工。这样，任何细胞都可以轻松呈递表位，而不仅仅是专职抗原呈递细胞(APC)。这可导致与呈递抗原的健康细胞接触的T细胞的耐受性，作为外周耐受性的一部分。为了避免这种情况，用长聚体进行的初始免疫允许仅由可加工并呈递所述肽的APC引发CD8+ T细胞。后续免疫加强了初始CD8+ T细胞应答。
体内免疫原性测定
十九只8-12周龄的雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到达时随机地预先分入治疗组。在研究开始前使动物适应环境三(3)天。用LabDietTM 5053无菌啮齿动物食物和随意提供的无菌水饲养动物。第1组的动物充当仅有接种佐剂的对照，并在第0、7和14天通过皮下注射(s.c.)以0.1mL的体积施用100μg的单独聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。第2组的动物在第0、7和14天以0.1mL的体积皮下施用各50μg六种长聚体肽(如下所述)之一以及100μg聚I:C。第3组的动物在第0天以0.1mL的体积皮下施用各50μg六种长聚体肽(如下所述)之一以及100μg聚I:C，并在第7天和第14天以0.1mL的体积皮下施用摩尔匹配当量的相应短聚体肽(如下所述)以及100μg聚I:C。每天对动物称重并监测其总体健康状况。如果动物体重与第0天的体重相比减轻30％以上，或者如果发现动物濒死，则在第21天研究结束时用过量的CO2对动物实施安乐死。处死时，使用标准方案收获脾脏并将其加工成单细胞悬浮液。简言之，通过70μM过滤器机械降解脾脏，将其沉淀，并用ACK裂解缓冲液(Sigma)裂解，之后重悬于细胞培养基中。
肽
六种先前鉴定的鼠新抗原根据其显示出的诱导CD8+ T细胞应答的能力进行使用。对于每种新抗原，已经定义了对应于最小表位的短聚体(8-11个氨基酸)。使用对应于围绕突变的20-27个氨基酸的长聚体。
ELISPOT
按照试剂盒方案进行ELISPOT分析(小鼠IFNγELISPOT Reasy-SET-Go；EBioscience)。简言之，在分析日的前一天，将96孔滤板(孔径为0.45μm的疏水性PVDF膜；EMD Millipore)活化(35％EtOH)，洗涤(PBS)，并用捕获抗体(1:250；4℃过夜)包被。在分析当天，将孔洗涤并封闭(介质；在37℃下2小时)。将100μL中的大约2x105个细胞与100μL10mM测试肽池(短聚体)或PMA/离子霉素阳性对照抗原或媒介物一起添加到孔中。将细胞与抗原在37℃下孵育过夜(16-18小时)。第二天，弃去细胞悬浮液，并用PBS洗涤孔一次，并用去离子水洗涤两次。对于该测定的其余部分中的所有洗涤步骤，在每个洗涤步骤中将孔浸泡3分钟。然后将孔用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温20)洗涤3次，并将检测抗体(1:250)添加到所有孔中。将板在室温下孵育两小时。弃去检测抗体溶液，并用洗涤缓冲液将孔洗涤3次。将抗生物素蛋白-HRP(1:250)添加到所有孔中，并将板在室温下孵育1小时。弃去缀合物溶液，并用洗涤缓冲液将孔洗涤3次，然后用PBS洗涤一次。将底物(3-氨基-9-乙基-咔唑，0.1M乙酸盐缓冲液，H2O2)添加到所有孔中，并监测斑点的显色(约10分钟)。通过用水洗涤孔来终止底物反应，并将板风干过夜。在ELISPOT读取仪(Cellular Technology Ltd.)上用附带的软件分析板。将对应于产生IFNγ的T细胞数的斑点报告为绝对斑点数/接种的T细胞数。
实施例32-通过质谱法检测突变BTK肽
用编码突变BTK肽的各个区域的慢病毒载体转导293T细胞。培养0.5-1亿个表达由突变BTK肽编码的肽的转导细胞，并使用酸洗液从HLA-肽复合物中洗脱出肽。然后通过MS/MS分析洗脱的肽。
实施例33-突变BTK肽在多个等位基因上产生强表位。
含有新表位的多种肽被表达或负载到抗原呈递细胞(APC)上。然后进行质谱分析，并确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。
实施例34-多种BTK新表位引发CD8+ T细胞应答
可使用来自人供体的PBMC样品进行抗原特异性T细胞诱导。制备T细胞后，分析CD8+ T细胞的诱导。可以在不同时间点取细胞样品进行分析。使用pMHC多聚体监测诱导培养物中抗原特异性CD8+ T细胞的分数。
实施例35-突变BTK新肽的预测的HLA特异性
在专有的RECON算法上运行特定的BTK新肽，以预测HLA特异性。基于预测的结合亲和力对新肽进行排名。表38描绘了进一步基于高至低亲和力排名的等位基因特异性。较低的排名值表示较强的亲和力。表38进一步证明，在此鉴定并表征的突变BTK新肽具有对应于多个等位基因的强表位。
表38描绘了进一步基于高至低亲和力排名的等位基因特异性。
Figure BDA0002944947110003161
Figure BDA0002944947110003171
Figure BDA0002944947110003181
Figure BDA0002944947110003191
实施例36-突变BTK新肽的亲和力和稳定性
下表中包含新表位的多种肽被表达或负载到抗原呈递细胞上。然后进行质谱分析，确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力，并确定新表位与HLA等位基因的稳定性。
表39显示了突变BTK肽的相应亲和力和稳定性。
Figure BDA0002944947110003192
Figure BDA0002944947110003201
实施例37-通过质谱法检测突变EGFR肽
用编码突变EGFR肽的各个区域的慢病毒载体转导293T细胞。培养0.5-1亿个表达由突变EGFR肽编码的肽的转导细胞，并使用酸洗液从HLA-肽复合物中洗脱出肽。然后通过MS/MS分析洗脱的肽。
实施例38-突变EGFR肽在多个等位基因上产生强表位。
含有新表位的多种肽被表达或负载到抗原呈递细胞(APC)上。然后进行质谱分析，并确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。
实施例39-多种EGFR新表位引发CD8+ T细胞应答
可使用来自人供体的PBMC样品进行抗原特异性T细胞诱导。制备T细胞后，分析CD8+ T细胞的诱导。可以在不同时间点取细胞样品进行分析。使用pMHC多聚体监测诱导培养物中抗原特异性CD8+ T细胞的分数。
实施例40-EGFR新肽的预测的HLA特异性
在专有的RECON算法上运行特定的新肽，以预测HLA特异性。基于预测的结合亲和力对新肽进行排名。表43描绘了进一步基于高至低亲和力排名的等位基因特异性。较低的排名值表示较强的亲和力。表43还证明，在此鉴定并表征的突变EGFR新肽具有对应于多个等位基因的强表位。
表43
Figure BDA0002944947110003202
Figure BDA0002944947110003211
实施例41-突变EGFR新肽的亲和力和稳定性
下表中包含新表位的多种肽被表达或负载到抗原呈递细胞上。然后进行质谱分析，确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力，并确定新表位与HLA等位基因的稳定性。表44显示了突变EGFR肽的相应亲和力和稳定性。
表44
Figure BDA0002944947110003221

Claims (55)

1.一种药物组合物，其包含：
(a)包含第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列的至少一种多肽或其药学上可接受的盐，其中
(i)第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列各自包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且
(ii)第一突变GATA3肽序列的C末端序列与第二突变GATA3肽序列的N末端序列重叠；其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:2)的至少一个氨基酸；或者
(b)包含编码所述至少一种多肽的序列的至少一种多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列或所述第二突变GATA3肽序列包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变肽序列包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的药物组合物，其中SEQ ID NO:2的所述至少8个连续氨基酸包含序列PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGL(SEQ IDNO:3)的至少8个连续氨基酸。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的药物组合物，其中SEQ ID NO:2的所述至少8个连续氨基酸包含序列EPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:4)的至少一个氨基酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列中的至少一个包含至少14个突变氨基酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含至少3个突变GATA3肽序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含至少两种多肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽进一步包含第三突变GATA3肽序列，其中所述第三突变GATA3肽序列包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列SEQ ID NO:2的至少一个氨基酸。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述第三GATA3突变肽包含SEQ ID NO:2的至少8个连续氨基酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含至少一个突变GATA3肽序列，所述突变GATA3肽序列结合或被预测结合由以下等位基因编码的蛋白质：
(a)HLA-A02:01等位基因和HLA-A24:02等位基因；
(b)HLA-A02:01等位基因和HLA-B08:01等位基因；
(c)HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因；或
(d)HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因和HLA-B08:01等位基因。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中，
(a)所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；并且
(b)所述第二GATA3肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质；其中与所述第二突变GATA3肽序列相比，所述第一突变GATA3肽序列结合或被预测结合由不同HLA等位基因编码的蛋白质。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列中的至少一个以小于500nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变肽序列中的至少一个以大于1小时的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含以下序列中的至少一个：
(a)TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI；和/或
(b)MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI
(c)VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR；和/或
(d)FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF和/或KPKRDGYMFL，和/或
(e)IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种多肽包含以下序列中的至少两个：
(a)TLQRSSLWCL、VLPEPHLAL、HVLPEPHLAL、ALQPLQPHA、AIQPVLWTT、APAIQPVLWTT、SMLTGPPARV、MLTGPPARV和/或YMFLKAESKI；和/或
(b)MFLKAESKI和/或YMFLKAESKI；和/或
(c)VLWTTPPLQH、YMFLKAESK和/或KIMFATLQR；和/或
(d)FATLQRSSL、EPHLALQPL、QPVLWTTPPL、GPPARVPAV、MFATLQRSSL、KPKRDGYMF和/或KPKRDGYMFL，和/或
(e)IMKPKRDGYM、MFATLQRSSL、FLKAESKIMF、LHFCRSSIM、EPHLALQPL、FATLQRSSL、ESKIMFATL、FLKAESKIM和/或YMFLKAESKI。
18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其中所述突变GATA3肽序列包含：
(a)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(b)的第二突变GATA3肽序列；
(b)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(c)的第二突变GATA3肽序列；
(c)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；
(d)来自(a)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；
(e)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(c)的第二突变GATA3肽序列；
(f)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；
(g)来自(b)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；
(h)来自(c)的第一突变GATA3肽序列和来自(d)的第二突变GATA3肽序列；
(i)来自(c)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列；或
(j)来自(d)的第一突变GATA3肽序列和来自(e)的第二突变GATA3肽序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列包含表5和/或表6的肽。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列包含GATA3蛋白的第一新表位，并且所述第二肽突变GATA3肽序列包含突变GATA蛋白的第二新表位，其中所述第一突变GATA3肽序列不同于所述第二突变GATA3肽序列，并且其中所述第一新表位包含至少一个突变氨基酸，且所述第二新表位包含相同的突变氨基酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述包含至少八个连续氨基酸的第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列中的每一个由下式表示
[Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C或[Xaa]N-[Xaa]C-[Xaa]F，
其中每个Xaa为氨基酸，
其中[Xaa]N和[Xaa]C各自包含由GATA3基因的不同部分编码的氨基酸序列，
其中[Xaa]F为任何氨基酸序列，
其中[Xaa]N在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，
其中[Xaa]C包含至少一个突变氨基酸，并且在GATA3基因的非野生型阅读框中编码，
其中N为0-100的整数，
其中C为1-100的整数，
其中F为0-100的整数，
其中N和M之和至少为8。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中[Xaa]F的每个Xaa为赖氨酸残基，并且F为1-100、1-10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的整数。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中F为3、4或5。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，其中每个所述突变GATA3肽序列以至少50μg/mL-400μg/mL的浓度存在。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的药物组合物，其中所述第一突变GATA3肽序列和所述第二突变GATA3肽序列包含表1或表2的序列。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述佐剂是聚ICLC。
28.一种药物组合物，其包含：
一个或多个突变GATA3肽序列，所述一个或多个突变GATA3肽序列包含选自ESKIMFATLQRSSL、KPKRDGYMFLKAESKI、SMLTGPPARVPAVPFDLH、EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH、LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI、GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD和KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH的序列。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含以0.1mM–1mM的浓度存在的pH调节剂。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含以1mM–10mM的浓度存在的pH调节剂。
31.一种合成GATA3肽的方法，其中所述肽包含选自Xaa-Cys、Xaa-Ser和Xaa-Thr的至少两个连续氨基酸的序列，其中Xaa为任何氨基酸，所述方法包括：
(a)将至少一种二肽或其衍生物与GATA3肽或其衍生物的氨基酸或其衍生物偶联，以获得含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物，其中所述二肽或其衍生物包含伪脯氨酸部分；
(b)将一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物与所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联；以及
(c)从树脂上切下所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法包括使所述含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物脱保护。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中至少一种二肽或其衍生物所偶联的氨基酸或其衍生物选自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、Tyr、His和Val。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述任选地与含有伪脯氨酸的GATA3肽或其衍生物偶联的一种或多种选定的氨基酸、小肽或其衍生物包含Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述GATA3肽或其衍生物的N末端氨基酸或其衍生物选自Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，其中所述伪脯氨酸部分是
(a)Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH，
(b)Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH，
(c)Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH，
(d)Fmoc-Leu-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH，
(e)Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中
(a)Xaa-Ser为Ser-Ser，
(b)Xaa-Ser为Glu-Ser，
(c)Xaa-Thr为Ala-Thr，
(d)Xaa-Thr为Leu-Thr，或者
(e)Xaa-Cys为Leu-Cys。
38.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用权利要求1-30中任一项的药物组合物。
39.一种鉴定患有癌症的受试者作为治疗剂的候选者的方法，该方法包括：将受试者鉴定为表达由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂包含
(a)至少一种包含一个或多个突变GATA3肽序列的多肽，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个包含至少一个突变氨基酸，并且是由癌细胞的GATA3基因中的突变引起的突变GATA3蛋白的至少8个连续氨基酸的片段；或者
(b)至少一种包含编码所述至少一种多肽的序列的多核苷酸，其中所述一个或多个突变GATA3肽序列中的每一个或其部分与由HLA-A02:01等位基因、HLA-A24:02等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-B07:02等位基因和/或HLA-B08:01等位基因编码的蛋白质结合。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用所述治疗剂。
41.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用药物组合物，该药物组合物包含：
(a)包含第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列的至少一种多肽，其中
(i)第一突变GATA3肽序列和第二突变GATA3肽序列各自包含SEQ ID NO:1的至少8个连续氨基酸，并且
(ii)第一突变GATA3肽序列的C末端序列与第二突变GATA3肽序列的N末端序列重叠；其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含序列PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:2)的至少一个氨基酸；或者
(b)包含编码所述至少一种多肽的序列的至少一种多核苷酸，
其中由受试者表达的HLA等位基因在施用时是未知的。
42.根据权利要求41所述的方法，其中SEQ ID NO:1的所述至少8个连续氨基酸包含以下序列的至少一个氨基酸：
PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH(SEQ ID NO:2)。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述受试者患有对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌、为MSI乳腺癌、为转移性乳腺癌、为Her2阴性乳腺癌、为Her2阳性乳腺癌、为ER阴性乳腺癌、为ER阳性乳腺癌、PR阳性乳腺癌、PR阴性乳腺癌或其任意组合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂、抗CD40剂、来曲唑、氟维司群、PI3激酶抑制剂和/或CDK 4/6抑制剂。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂是帕博西尼、瑞博西尼、阿贝西尼、塞利西利、dinaciclib、milciclib、roniciclib、atuveciclib、briciclib、riviciclib、塞利西利、trilaciclib、voruciclib或其任意组合。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂是帕博西尼(PD0332991)；阿贝西尼(LY2835219)；瑞博西尼(LEE 011)；voruciclib(P1446A-05)；fascaplysin；arcyriaflavin；2-溴-12,13-二氢-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮；3-氨基硫代吖啶酮(3-ATA)、反式-4-((6-(乙基氨基)-2-((1-(苯甲基)-1H-吲哚-5-基)氨基)-4-嘧啶基)氨基)-环己酮(CINK4)；1,4-二甲氧基吖啶-9(10H)-硫酮(NSC625987)；2-甲基-5-(对甲苯基氨基)苯并[d]噻唑-4,7-二酮(ryuvidine)；flavopiridol(阿伏西地)；塞利西利；dinaciclib；milciclib；roniciclib；atuveciclib；briciclib；riviciclib；trilaciclib(G1T28)；或其任意组合。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂是渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、LY294002、hibiscone C、Idelalisib、Copanlisib、Duvelisib、Taselisib、哌立福辛、Buparlisib、Duvelisib、Alpelisib(BYL719)、Umbralisib、(TGR 1202)、Copanlisib(BAY 80-6946)、PX-866、Dactolisib、CUDC-907、Voxtalisib(SAR245409、XL765)、CUDC-907、ME-401、IPI-549、SF1126、RP6530、INK1117、pictilisib(GDC-0941)、XL147(SAR245408)、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100–115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477或AEZS-136。
52.根据权利要求41-51中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发性或转移性乳腺癌。
53.根据权利要求41-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是在内分泌疗法联合CDK 4/6抑制剂后疾病进展的受试者；或者其中所述受试者尚未接受先前的全身疗法。
54.根据权利要求41-53中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的细胞的雌激素受体基因的突变状态。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞或针对雌激素受体的表达而富集的细胞。
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