CN112567243B

CN112567243B - 体外转胞吞作用测定

Info

Publication number: CN112567243B
Application number: CN201980054147.XA
Authority: CN
Inventors: S·钟; V·H·恩古耶; A·宋
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2024-12-03
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN112567243A; JP7631187B2; JP2025013814A; WO2020037213A1; JP2021534409A; US20210172932A1; EP3837545A1

Abstract

本公开涉及可用于测量分子的转胞吞作用的方法和组合物。特别地，本公开涉及体外受体依赖性转胞吞作用测定，用于评估治疗性抗体分子和Fc融合蛋白在人和动物体内的清除速率。

Description

体外转胞吞作用测定

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2018年8月17日提交的美国临时专利申请序列号62/719,402的优先权，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及可用于测量分子的转胞吞作用的方法和组合物。特别地，本公开涉及用于评估体内药代动力学特征(例如，与FcRn相互作用的分子(例如，治疗性抗体、Fc融合分子和与白蛋白连接的分子)的清除速率和/或半衰期)的体外受体依赖性转胞吞作用测定。

背景技术

治疗性单克隆抗体(mAb)由于其在各种疾病的治疗中证实有效并且其理想的药理特性，因此已成为世界上主要的医药产品类别。mAb药物的有利药理特性之一是，其循环半衰期通常较长。延长生物治疗产品的半衰期可以减少药物的频繁给药和/或降低剂量，其降低护理成本，改善患者依从性并降低浓度依赖性细胞毒性/不良事件。

在了解mAb药物在动物和人体内的药代动力学(PK)特征方面已取得重大进展。尽管许多mAb药物表现出与内源性IgG类似的相似PK行为，但常常观察到mAb药物在人体内的非特异性清除速率的明显异质性。因此，在药物开发过程中，评估和选择具有理想PK特性的临床候选药物是重要的早期步骤。已经采用了涉及计算机模拟、体外分析和体内分析的广泛的技术来评估和/或预测mAb在人体内的PK行为(Dostalek等人,2017,MAbs 9(5):756-766)。但是，PK数据从动物到人类以及从体外测定到体内读数的转换对于药物开发者仍然难以捉摸(Vugmeyster等人，2012,World J Biol Chem 3(4):73-92)。此外，虽然一些动物模型诸如人FcRn转基因小鼠(Avery,2010)和非人灵长动物(Deng等人,2011,Drug MetabDispos 38(4):600-605)已成功用于反映mAb在人体内的PK，但这些研究通常耗时、昂贵且涉及动物牺牲。

从动物研究和体外测定中预测人mAb的PK有许多复杂性。已知靶标介导的药物处置(TMDD)影响mAb的剂量依赖性PK行为，从而导致非线性分布和消除。在缺乏TMDD的情况下，mAb有望表现出线性消除和非特异性清除速率，这反映了靶标无关性的分子特异性药物分解代谢。mAb的非特异性清除主要由网状内皮系统中的溶酶体降解介导，其中新生儿Fc受体(FcRn)介导的挽救途径起主要作用。结构上，FcRn是异源二聚体，其由与I类主要组织相容性复合物(MHC)样分子同源的跨膜重链(FCGRT)和可溶性轻链β2微球蛋白(B2M)组成。FcRn在酸性pH(小于6.5)与内源性IgG的Fc结构域结合，但在中性或碱性pH(大于7.0)仅最小程度地与之结合。这种独特的特性使FcRn能够通过以下过程保护含Fc的分子免受降解：在该分子被摄取到细胞内之后与该分子在酸性内体中结合，然后将该分子运输回细胞表面并在生理pH将它们释放到循环中。相比之下，未与FcRn结合的内化分子被引导至溶酶体进行降解(参见图6和Roopenian等人,Nat RevImmunol.2007Sep；7(9):715-25)。

尽管FcRn在延长含Fc的蛋白质的半衰期中的作用已被广泛认可(Ward,2015)，但有报道称，在人体内，mAb药物的FcRn结合与PK之间缺乏相关性(Suzuki,2010；Zheng,2011；Hotzel,2012)表明对FcRn的结合亲和力不是决定含Fc的蛋白质的消除速率的唯一决定因素。考虑到FcRn在细胞内转运中的功能，内体分选和转运含Fc的分子/FcRn复合体的动力学可能会影响FcRn介导的挽救机制的整体效率，并因此影响分子的非特异性清除速率。此外，经由胞饮作用或胞吞作用进行的细胞摄取以及溶酶体内的降解过程也可能在确定mAb降解的速率和程度中发挥作用(Gurbaxani,2013)。最后，据报道，生化特征诸如电荷/pI和糖基化模式会影响mAb处置(Datta-Mannan,2015；Igawa,2010；Khawli,2010)。这些分子特征本身可能会影响mAb结构，从而在体内改变与FcRn的“真实”相互作用，或者可能有助于非特异性细胞表面结合，从而改变内化的模式/速率以及FcRn介导的细胞内转运途径(包括再循环和转胞吞作用)的相对比例。

已经开发出多种体外测定来模拟IgG Fc-FcRn相互作用。许多这些测定的固有局限性是缺乏涉及细胞、血浆蛋白和细胞外基质(ECM)成分的非特异性相互作用以及与mAb的再循环、转胞吞作用和溶酶体降解有关的细胞内转运参数。优选地，用于预测mAb清除率的体外测定将能够评定静电相互作用、Ab的细胞摄取、与FcRn的相互作用以及分子的细胞内转运的联合效应。但是，考虑到影响体内mAb处置的多种因素，很难开发出能够准确、一致地预测mAb药物的PK行为的简单体外测定。

动物模型的开发同样面临挑战。虽然动物模型诸如人FcRn转基因小鼠模型(Avery,2010)和非人灵长动物模型(Deng,2011)已成功用于反映mAb在人体内的PK，但这些研究通常耗时、昂贵且涉及动物牺牲。此外，从动物研究到人类的PK行为转化并不简单易行，部分原因是FcRn结合、TMDD和诱导抗药物免疫应答方面的物种差异(Liu,2018)。

因此，仍然需要预测治疗分子的体内PK特性(例如清除率或半衰期)的方法，该方法可以在短时间内以合理成本执行以帮助评估和选择治疗性分子。

发明内容

本公开涉及可用于测量目标分子的转胞吞作用的方法和组合物。特别地，本公开涉及用于评估体内药代动力学特征(例如，与FcRn相互作用的分子(例如，治疗性抗体、Fc融合分子和与白蛋白连接的分子)的清除速率和/或半衰期)的体外受体依赖性转胞吞作用测定。

在某些实施例中，本公开涉及用于确定目标分子的药代动力学(PK)参数的方法。例如，此类方法可以包括确定在生理pH条件下通过一个细胞或多个细胞的一个分子或多个分子的转胞吞作用的量度。在某些实施例中，PK参数是分子的体内清除率的量度。在某些实施例中，PK参数是分子的体内半衰期的量度。

在某些实施例中，与本文公开的方法结合使用的转胞吞作用的量度是转胞吞作用的速率。在某些实施例中，转胞吞作用的量度是转胞吞的一个分子或多个分子的量的量度。

在某些实施例中，转胞吞作用的量度是通过测量一个分子或多个分子从第一腔室中的溶液到第二腔室中的溶液的转胞吞作用而确定的，其中第一腔室和第二腔室通过细胞单层分隔，并且每个腔室中的溶液均处于生理pH。在某些实施例中，一个细胞或多个细胞是马丁-达比犬肾(MDCK)细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量分子的转胞吞作用包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。在某些实施例中，本文公开的方法进一步包括：基于测得的分子的数目确定分子的体内清除率。

在本公开的某些实施例中，目标分子是天然地结合FcRn的分子。在某些实施例中，分子经工程化以结合FcRn。在某些实施例中，分子是含Fc的分子。在某些实施例中，含Fc的分子是受体Fc融合分子。在某些实施例中，分子是抗体。在某些实施例中，抗体是单克隆抗体。在某些实施例中，分子是含白蛋白的分子。

在某些实施例中，本公开涉及一种用于测量多个单一分子或多个不同分子的跨细胞运输的方法，其包括：a)将多个单一分子或多个不同分子引入两个腔室中的第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；以及b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目。在某些实施例中，第一腔室包括单层的细胞。在某些实施例中，细胞是马丁-达比犬肾(MDCK)细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。在某些实施例中，本文公开的方法进一步包括：基于测得的分子的数目确定分子的体内清除率。

在某些实施例中，本公开涉及用于确定分子的体内清除率的方法，包括：a)将分子引入两个腔室中的第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目；以及c)基于测得的分子数目，确定该分子的体内清除率。在某些实施例中，第一腔室包括单层的细胞。在某些实施例中，细胞是MDCK细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。在某些实施例中，分子是天然地结合FcRn的分子。

在某些实施例中，本公开涉及用于测量多个分子的跨细胞运输的测定。例如但并非限制，测定可包括采用第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值，其中第一腔室接收多个分子、构造成将分子跨细胞地运输至第二腔室，并且多个分子的跨细胞运输得到测量。在某些实施例中，第一腔室包括单层的细胞。在某些实施例中，细胞是MDCK细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。在某些实施例中，测定进一步包括：基于测得的分子数目确定分子的体内清除率。

在某些实施例中，本公开涉及一种测定系统，其包括：第一腔室和第二腔室，其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH；单层的细胞，其定位在第一腔室中，使得细胞可介导引入第一腔室中的分子至第二腔室的转胞吞作用；以及检测器，其用于检测分子在第二腔室中的存在。在某些实施例中，细胞是MDCK细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

附图说明

图1描绘了本公开的转胞吞作用测定的某些实施例的示意图。

图2A至图2B描绘了人FcRn重链和β2-微球蛋白在经转染的克隆MDCK细胞系305-6上的表达。WT和305-6细胞的B2M(A)和FCGRT(B)细胞表面表达的流式细胞术直方图。

图3A至图3E显示了散点图，其描绘人体内的清除率(以mK/Kg/天计的速率)与任一转胞吞作用值(A；以ng/mL计的浓度)、在pH 6.0的FcRn结合亲和力(B；以M计的Kd)或BVELISA分数(C)之间的关系。此外，将mAb在食蟹猴体内的清除速率(以mK/Kg/天计的速率)对转胞吞作用值(D)或人体内的清除速率(E)作图。用线性回归模型拟合数据，并给出方程和R平方值两者。

图4A至图4C显示了人体内的清除率与MDCK细胞(A)或MDCK-hFcRn细胞(B)中的转胞吞作用之间的关系，以及与MDCK-hFcRn细胞结合和MDCK-hFcRn细胞中的转胞吞作用之间的关系(C)。

图5A至图5C显示了人体内的清除率与电荷(A)、pI(B)或mAb的转胞吞作用输出(C)之间的关系。

图6描绘了内化分子的潜在命运的示意图。

具体实施方式

在实践当前公开的主题时，使用了分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的许多常规技术。这些技术在以下文献中更详细地描述，例如，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)第3版，J.F.Sambrook和D.W.Russell编，冷泉港实验室出版社，2001年；《用于免疫治疗的重组抗体》(Recombinant Antibodiesfor Immunotherapy)，Melvyn Little编，剑桥大学出版社，2009年；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.Gait编，1984年；《动物细胞培养》(Animal CellCulture)，R.I.Freshney编，1987年；《酶学方法》(Methods in Enzymology)，美国学院出版公司；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编，1987年，以及定期更新；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The PolymeraseChainReaction)，Mullis等人编，1994年；《分子克隆实践指南》(A Practical GuidetoMolecular Cloning)，Perbal Bernard V.，1988年；《噬菌体展示：实验室手册》(PhageDisplay:A Laboratory Manual)，Barbas等人，2001年。这些参考文献和包含标准方案的其他参考文献的内容，包括制造商的产品说明书，是本领域技术人员广泛已知和依赖的，在此通过引用并入作为本公开的一部分。

1.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有普通理解含义的术语，并且，本文包含此类定义不必视为代表了与现有技术中通常理解的相比存在明显差异。

本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，并不排除附加行为或结构的可能性。除非另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个指代物。本公开还考虑其他实施例“包括”本文所提出的实施例或元件、“由其构成”和“基本上由其构成”，无论是否明确提出。

如本文所用，术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，在某些实施例中，“约”可以意指3个或多于3个标准偏差。替代地，在某些实施例中，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。替代地，特别是关于生物学系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，例如在5倍以内或在2倍以内。

如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”是指用于生长或维持细胞的营养源。如本领域技术人员所理解的，营养源可以含有细胞生长和/或存活所需的组分，或者可以含有有助于细胞生长和/或存活的组分。维生素、必需或非必需氨基酸(例如，半胱氨酸和胱氨酸)和微量元素(例如，铜)是培养基成分的示例。本文提供的任何培养基也可以补充有胰岛素、植物水解产物和动物水解产物中的任何一种或多种。

如本文所用，短语“药代动力学(PK)参数”是指本领域已知的多种PK参数中的任一种，包括但不限于清除率(CL)、半衰期(t_1/2)、曲线下面积(AUC)、分布体积(V_d)和最大/最小血浆浓度(C_max/C_min)。

如本文所用，术语“清除率”是指分子或多肽从血流中去除的速率。

如本文所用，术语“生理pH”是指约6.5至约8.0的pH。在某些实施例中，生理pH值是在约6.5至约8.0之间的任何值，例如，约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、或约7.9、或约6.5至约8.0范围内的任何范围。

“培养”细胞是指在适合于细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。

如本文所用，“分子”通常是指作为测定对象的分子。例如但并非限制，该分子可以是天然地结合FcRn或已经工程化以结合FcRn的任何分子，诸如但不限于含白蛋白的分子，这是一种经工程化以经由以下定义的肽标签或其他氨基酸序列、抗体、抗体片段或多克隆或单克隆抗体结合FcRn的分子。此类多肽、蛋白质、抗体、抗体片段或多克隆或单克隆抗体可包括非天然存在的物质，包括但不限于非天然存在的氨基酸、非氨基酸连接子或间隔子，并且可包括与其他组成例如小分子或大分子治疗剂的缀合物。

如本文所用，“多肽”通常是指具有超过约十个氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以与宿主细胞同源或可以是外源性的，这意味着对于所利用的宿主细胞而言，这些多肽是异源的，即，是外来的，诸如中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白质、或由哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在某些实施例中，使用哺乳动物多肽(最初源自哺乳动物生物的多肽)，并且在某些实施例中，本公开的多肽直接分泌到培养基中。

术语“蛋白质”意为其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。这是为了与“肽”或其他不具有此类结构的小分子量药物区分开。通常，本文的蛋白质将具有至少约15-20kD的分子量，并且在某些实施例中，至少约20kD。本文定义中涵盖的蛋白质的示例包括所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性蛋白质和诊断性蛋白质，诸如治疗性抗体和诊断性抗体，并且一般是含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于表现出所需的抗原结合活性的多特异性(例如，双特异性抗体)和抗体片段。

如本文所用，“抗体片段”、抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)或抗体的“抗原结合片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合抗原和/或表位的部分。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及从多特异性抗体(例如，双特异性抗体)形成的抗体片段。

如本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据当前公开的主题使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

术语“杂交瘤”是指通过将免疫来源的永生细胞系与抗体产生细胞融合而产生的杂交细胞系。该术语涵盖异种杂交骨髓瘤融合体的子代，其是与人细胞和随后与浆细胞融合的鼠类骨髓瘤细胞系融合的结果，俗称三源杂交瘤细胞系。此外，该术语意在包括产生抗体的任何经永生化杂交细胞系，诸如，举例而言，四源杂交瘤。参见，例如，Munson等人,Anal.Biochem.,537:3053(1983)。

如本文所用，术语“细胞”是指动物细胞、哺乳动物细胞、培养的细胞、宿主细胞、重组细胞和重组宿主细胞。此类细胞通常是从哺乳动物组织获得或源自哺乳动物组织的细胞系，当将其置于含有适当营养物质和/或生长因子的培养基中时能够生长和存活。

如本文所用，术语“异源基因”是指编码对于所利用的宿主细胞而言是外来者的蛋白质的基因，诸如编码由中国仓鼠卵巢细胞内产生的人蛋白质的基因、或在哺乳动物细胞中编码产生的酵母多肽的基因。

2.概述

本公开涉及可用于测量目标分子的转胞吞作用的方法和组合物。特别地，本公开涉及用于评估治疗性抗体分子的PK参数诸如清除速率和/或半衰期的体外受体依赖性转胞吞作用测定。如本文中详细公开的，通过本公开的方法测量的目标分子(例如，mAb)的转胞吞作用与细胞的PK特性(诸如该分子的体内清除率)高度相关。因此，所要求保护的用于测量目标分子的转胞吞作用的方法可以用于评估该分子的体内清除率和其他PK参数诸如半衰期。在某些实施例中，该方法包括测量多个相同的目标分子从第一腔室到第二腔室的跨细胞运输，其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值(例如，pH＝约7.4)。

因此，例如，在一方面，本文提供了使用稳定地表达人FcRn和β2-微球蛋白基因的MDCK细胞的基于细胞的测定，以在与FcRn介导的IgG挽救途径相关的条件下测量单克隆抗体(mAb)药物的转胞吞作用效率。这种转胞吞作用测定是在生理pH条件下进行的，并且设计为评定IgG与细胞的非特异性结合、其经由胞饮作用的摄取、其与FcRn的pH依赖性相互作用以及细胞内转运和分选过程的动力学的联合效应的结果。如在“实例”中更详细地描述的，本发明人评估了49种mAb，包括27种市售mAb药物，并证明了在人体内的清除速率与来自诸如本文公开的测定的读数之间存在显著的相关性。FcRn的表达是促进测定中mAb的转胞吞作用所必需的，并且直接对观察到的相关性有所贡献。再者，诸如本文提供的测定能够正确地对含Fc分子的电荷或糖基化变体在临床前物种体内的清除速率进行排序。实例中提供的结果支持本文所公开的测定的实用性，作为经济有效且节省动物的筛选工具用于在前导选择和优化过程中评估基于mAb的候选药物并且为所期望的药代动力学特性进行工艺开发。

3.转胞吞作用测定

转胞吞作用是指大分子从细胞的一侧向另一侧的囊泡运输，是多细胞生物用于在两种环境之间选择性地移动物质而不改变那些环境的独特组成的策略。转胞吞作用是一种跨细胞运输的机制，其中细胞将细胞外物质包裹在细胞膜的内陷中以形成囊泡，然后将囊泡穿过细胞，从而通过相反的过程使物质通过相反的细胞膜弹出。

在典型的FcRn介导的转胞吞作用测定中，表达FcRn的MDCK细胞在trans-well板的滤膜上生长至汇合，并且在测定之前，通过向内腔室填充酸性测定缓冲液(pH<6.0)并且向外腔室填充碱性测定缓冲液(pH>7.4)而创建pH梯度。该测定设计的基本原理是利用FcRn的pH依赖性结合特性的优势，通过在酸性pH与细胞表面上的FcRn结合以及在碱性pH释放测试分子来促使细胞摄取测试分子，该结合和释放两者均改善了测定的鲁棒性和灵敏度。然而，基于本文所述的研究，本发明人开始认识到，此类测定对于mAb的PK行为的预测性评定固有地具有缺陷。由于经转染细胞通常在细胞表面表达高水平的FcRn，并且测试抗体与细胞一起在酸性环境中孵育，因此可以确定，在酸性pH对FcRn具有高结合亲和力的测试抗体容易地结合FcRn并经由FcRn介导的胞吞作用进入细胞。然而，本发明人确定这与体内发生的情况相反，在体内发生的情况是，抗体在生理pH最低限度地与细胞表面FcRn结合，并且mAb的细胞摄取主要由非特异性流体相胞饮作用介导。结果，本发明人确定，pH梯度转胞吞作用测定的输出在酸性pH受到抗体的FcRn结合亲和力的严重影响，因此不可能充分反映影响PK的其他因素诸如静电相互作用和细胞内转运参数的贡献。另外，进一步确定了人工pH条件本质上对细胞有害，这限制了测定的持续时间并且可能潜在地产生额外的测定伪影。

因此并且如在“实例”中更详细描述的，本发明人开发了一种不同的方法来测量转胞吞作用，作为随后准确地确定PK参数诸如清除率和/或半衰期的量度的基础。因此，例如，在某些实施例中，本公开提供用于测量多个单一分子或多个不同分子的跨细胞运输的方法，包括：a)将多个单一分子或多个不同分子引入第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；以及b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目。在某些实施例中，生理pH值为约6.5至约8.0。在某些实施例中，生理pH值是在约6.5至约8.0之间的任何值，例如，约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、或约7.9、或约6.5至约8.0范围内的任何范围。在某些实施例中，每个腔室的pH可以不同，只要两个腔室都具有生理pH即可。例如但并非限制，第一腔室的pH可以为6.5，而第二腔室的pH可以为8.0，反之亦然。在某些实施例中，生理pH可以为约7.4。

在某些实施例中，本公开提供用于确定分子的药代动力学(PK)参数的方法，包括确定在生理pH条件下通过一个细胞或多个细胞的一个分子或多个分子的转胞吞作用的量度。在某些实施例中，PK参数可以是分子的体内清除率的量度。在某些实施例中，PK参数可以是分子的体内半衰期的量度。在某些实施例中，转胞吞作用的量度可以是转胞吞作用的速率。在某些实施例中，转胞吞作用的量度可以是转胞吞的一个分子或多个分子的量的量度。在某些实施例中，转胞吞作用的量度可以是通过测量一个分子或多个分子从第一腔室中的溶液到第二腔室中的溶液的转胞吞作用而确定的，其中第一腔室和第二腔室通过细胞单层分隔，并且每个腔室中的溶液均处于生理pH。在某些实施例中，一个细胞或多个细胞可以是马丁-达比犬肾(MDCK)细胞。在某些实施例中，细胞包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因可以选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。在某些实施例中，细胞可以表达异源细胞表面蛋白。在某些实施例中，异源细胞表面蛋白可以包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，测量分子的转胞吞作用可以包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。在某些实施例中，本公开的方法可以进一步包括：基于测得的分子数目确定分子的体内清除率。在某些实施例中，分子可以是天然地结合FcRn的分子或经工程化以结合FcRn的分子。在某些实施例中，分子可以是含Fc的分子。在某些实施例中，分子可以是抗体。在某些实施例中，抗体可以是单克隆抗体。在某些实施例中，分子可以是含白蛋白的分子。在某些实施例中，生理pH值为约6.5至约8.0。在某些实施例中，生理pH值是在约6.5至约8.0之间的任何值，例如，约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、或约7.9、或约6.5至约8.0范围内的任何范围。在某些实施例中，每个腔室的pH可以不同，只要两个腔室都具有生理pH即可。例如但并非限制，第一腔室的pH可以为6.5，而第二腔室的pH可以为8.0，反之亦然。在某些实施例中，生理pH可以为约7.4。

在某些实施例中，测定包括将细胞生长培养基中的一个细胞或多个细胞接种到在内腔室和外腔室中具有培养基的96孔Trans-well板上，从内腔室中去除培养基，将测试分子添加到内腔室中，在组织培养箱中孵育一段时间，从外腔室收集培养基并将转胞吞的测试分子定量。在某些实施例中，可以将细胞以约1×10⁵个细胞/孔的密度接种在细胞生长培养基中。在某些实施例中，细胞生长培养基可以是补充有10％FBS、100单位的青霉素/链霉素和5μg/mL的嘌呤霉素的高葡萄糖DMEM。在某些实施例中，内腔室中的培养基可以为100μL，而外腔室中的培养基可以为200μL。在某些实施例中，细胞可在铺板后第二天使用。在某些实施例中，可以将测试分子添加至约100μg/mL(0.67μM)的终浓度，并在37℃的组织培养箱中孵育24小时。在某些实施例中，可以在细胞生长培养基中制备荧光黄(荧光黄CH，二锂盐；Sigma Aldrich；St.Louis MO)，并且可以在24小时测定孵育的最后90分钟添加。在某些实施例中，可以通过将来自外腔室的样品中的荧光信号除以内腔室的荧光信号来计算测定期间荧光黄的被动通过水平。在某些实施例中，来自在外腔室中表现出大于0.1％的荧光黄被动通过的孔的转胞吞作用结果可以丢弃。

在某些实施例中，可以将测试分子添加到trans-well测定的外腔室中，并且可以通过在适当的孵育期之后测量存在于内室中的测试分子的量来检测转胞吞作用。在某些实施例中，测试分子从暴露于细胞顶端膜的腔室转胞吞至暴露于细胞基侧膜的腔室。

在某些实施例中，本公开提供了用于确定或预测一个或多个分子的体内清除率的方法，包括：a)将分子引入两个腔室中的第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；以及b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目。在某些实施例中，生理pH值为约6.5至约8.0。在某些实施例中，生理pH值是在约6.5至约8.0之间的任何值，例如，约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、或约7.9、或约6.5至约8.0范围内的任何范围。在某些实施例中，每个腔室的pH可以不同，只要两个腔室都具有生理pH即可。例如但并非限制，第一腔室的pH可以为6.5，而第二腔室的pH可以为8.0，反之亦然。在某些实施例中，生理pH可以为约7.4。

在某些实施例中，本公开提供了用于测量多个相同分子或多个不同分子的跨细胞运输的测定，其包括第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室中各自具有生理pH值，其中第一腔室接收多个分子并且构造成允许分子转胞吞至第二腔室。在某些实施例中，生理pH值为约6.5至约8.0。在某些实施例中，生理pH值是在约6.5至约8.0之间的任何值，例如，约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、或约7.9、或约6.5至约8.0范围内的任何范围。在某些实施例中，每个腔室的pH可以不同，只要两个腔室都具有生理pH即可。例如但并非限制，第一腔室的pH可以为6.5，而第二腔室的pH可以为8.0，反之亦然。在某些实施例中，生理pH可以为约7.4。

在某些实施例中，本公开提供了用于确定或预测一个或多个分子的体内清除率的测定，包括第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室中各自具有生理pH值，其中第一腔室接收多个分子并且构造成允许分子转胞吞至第二腔室。在某些实施例中，生理pH值为约7.4。

在某些实施例中，第一腔室可以包括单层的细胞。在某些实施例中，用于测定的细胞选自下面第3节中提供的列表。在某些实施例中，测定中采用的细胞是MDCK细胞。

在某些实施例中，在本公开所述方法中使用的细胞可以包含至少一种异源基因。在某些实施例中，至少一种异源基因可以选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

在某些实施例中，在本公开所述方法中使用的细胞可以表达细胞表面蛋白。在某些实施例中，细胞表面蛋白包含Fc受体(FcR)。在某些实施例中，细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

在某些实施例中，分子可以是经标记的或未经标记的。经标记分子的非限制性示例包括³H标记的分子、荧光标记的分子或放射性同位素(例如，I-125和P-32)。

在某些实施例中，本公开的方法包括测量跨细胞运输的分子的数目。在某些非限制性实施例中，测量跨细胞运输的分子的数目可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR、荧光读取器系统、共聚焦显微镜或活细胞成像系统执行。

在某些实施例中，本公开提供了基于FcRn依赖性细胞的测定，用于在类似于FcRn介导的IgG挽救途径的条件下，通过表达人FcRn和B2M的MDCK细胞测量mAb(例如，IgG mAb)的转胞吞作用。在某些实施例中，该测定的输出不仅涉及在生理条件下的Fc-FcRn相互作用，而且涉及与mAb的体内PK行为有关的非特异性结合、细胞摄取、分选和细胞内转运过程。

在某些实施例中，本公开提供了用于将用本公开所述测定测量的转胞吞作用与所报道的具有不同结构、功能和药理特性的分子例如多肽在人体内的清除速率关联的方法。

在某些实施例中，可能需要FcRn的表达以促进测定中mAb的转胞吞作用并且为观察到的转胞吞作用与清除率之间的关联做出贡献。在某些实施例中，本公开所述测定能够对临床前物质中的含Fc分子的电荷或糖基化变体的清除速率进行排序。在某些实施例中，本公开中描述的测定可以用作省时、节省成本和节省动物的工具，用于在前导选择和优化期间评估基于mAb的候选药物，以及针对所希望的药代动力学性质进行工艺开发。

在某些实施例中，本公开提供基于细胞的测定，其在生理相关条件下测量mAb药物的转胞吞作用效率。在某些实施例中，将稳定地表达人FcRn和β2-微球蛋白基因的MDCK细胞与本文所述的测定结合使用。

在某些实施例中，本公开提供了在补充有胎牛血清的正常细胞培养基中在生理pH执行的测定，该胎牛血清提供已知与人FcRn结合的牛白蛋白(Chaudhury C.等人,2003,J.Exp.Med.197,315–322)。

在某些实施例中，本公开提供了测定，其中分子通过非特异性胞饮作用被细胞摄取，在白蛋白的存在下与人FcRn相互作用，并且在与FcRn介导的作用机制有关的条件下穿过细胞。

在某些实施例中，本公开内容提供了用于确定或预测mAb在人体内的清除率的测定，这是由于该测定能够评定与细胞的非特异性结合、经由胞饮作用的摄取、与FcRn的pH依赖性相互作用以及细胞内转运和分选过程的动态变化的联合效应。

在某些实施例中，本公开提供了用于将所得转胞吞作用输出与mAb在人体内的清除速率关联的测定。在某些实施例中，本公开的测定的输出可以是外腔室的培养基中的转胞吞分子的浓度(ng/mL)，并且该测定的可报告值可以是来自同一块板的至少2个重复孔的平均浓度。在某些实施例中，测定的输出可以是转胞吞速率的量度或转胞吞的分子相对于对照分子的相对转胞吞作用的量度。

在某些实施例中，本公开的测定的测试分子的选择可以基于临床级材料的可用性和来自可靠来源的人体内清除率数据，该可靠来源诸如但不限于处方信息、基于群体PK模型的已发表报告或生成线性PK数据的内部临床试验。在某些实施例中，临床级材料的使用可以确保测试材料的质量可以与在生成人PK数据的临床研究中使用的那些一致。

在某些实施例中，本公开所述测定可以作为工具，用于对候选药物的非特异性清除中的潜在负累进行体外评估以支持前导选择和优化，目的是对候选药物进行排序并减少在动物模型中测试的分子的数目。

在某些实施例中，本公开所述测定可用于支持对表现出不良或非典型PK行为的mAb进行探究，或支持开发具有与特殊应用(诸如跨越血脑屏障以增强脑暴露，或增强在肿瘤微环境中的处置能力以改善肿瘤靶向性)有关的转胞吞作用特性的新型mAb药物。

在某些实施例中，本公开所述测定可用于开发改善的基于机制的PK模型，以支持临床研究中最佳剂量和给药方案的设计。

在某些实施例中，本公开所述测定可用于证明测试分子的体外读数与体内PK数据之间的相关性。

在某些实施例中，测试分子可以是抗体。在某些实施例中，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在某些实施例中，抗体可以具有不同的结构组成(嵌合的、人源化的和完全人的)。在某些实施例中，抗体可以由不同的重链和轻链序列(IgG1、IgG2和IgG4重链，κ和λ轻链)组成。在某些实施例中，抗体可以识别不同类型的靶标(膜结合的和可溶的)。在某些实施例中，抗体可以发挥不同的治疗作用机理(激动性的、拮抗性的和细胞毒性的)。在某些实施例中，抗体可以并且确实通过不同途径(例如，iv、im和sc)给予患者。

在某些实施例中，测试分子可以携带工程化的突变，该突变可以改变效应子功能(诸如但不限于，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗)、使双特异性半抗体缔合(诸如但不限于，艾米珠单抗)或稳定IgG4Fab臂(诸如但不限于，纳武单抗、派姆单抗)。

在某些实施例中，测试分子可以是表现出极端FcRn结合亲和力的mAb。在某些实施例中，所观察到的转胞吞作用读数与在人体内的清除率之间的相关性可适用于携带典型Fc区的多种mAb。在某些实施例中，测试分子可以是经工程化以具有改变的FcRn结合活性的抗体。在某些实施例中，测试分子可以是含白蛋白的分子，或经工程化以经由肽标签或重组蛋白结合FcRn的任何分子。在某些实施例中，测试分子可以是天然地结合FcRn的分子。在某些实施例中，测试分子可以是经工程化以结合FcRn的分子。

在某些实施例中，本公开所述测定可用于指示，在转胞吞作用测定中，人FcRn的表达是否是有效的转胞吞作用所必需的。

在某些实施例中，本公开的测定可用于检测和/或指示与FcRn的相互作用对所观察到的转胞吞作用读数与测试分子清除率之间的相关性有所贡献。

在某些实施例中，本公开的测定可用于测试分子与受体的结合分析。在某些实施例中，受体可以是FcRn受体。在某些实施例中，测试分子可以是mAb。

在某些实施例中，本发明的测定可用于评估多种因素的贡献，诸如但不限于，内化、分选和细胞内转运的动力学以及胞吐作用对测试分子回收过程的整体效率的影响。

在某些实施例中，本公开的测定可用于鉴别和/或检测FcRn介导的挽救途径中涉及的多个参数，用于确定或预测mAb的PK。

在某些实施例中，本公开的测定可用于检测分子的体外转胞吞作用与体内清除率的相关性。在某些实施例中，与BV ELISA或Fv电荷/pI相比，本公开的测定可用于检测分子的体外转胞吞作用与体内清除率的相关性。

在某些实施例中，本公开的测定可用于评估和/或探究糖基化对mAb的体内分布和分解代谢的作用。在某些实施例中，分子可以是糖型变体。

在某些实施例中，本公开的测定可用于评估向分子中添加唾液酸对细胞内转运参数的作用。在某些实施例中，本公开的测定可用于分析附加机制在该分子的高甘露糖和高唾液酸化糖型变体的体内清除中的参与。

在某些实施例中，本公开的测定可作为工具，用于研究作为与其PK有关的Ab消除机制的FcRn介导的转胞吞作用。

在某些实施例中，本发明的测定可作为工具，用于研究和阐明控制FcRn复合IgG的分布的分子机制。

在某些实施例中，本公开内容的测定可提供反映具有典型FcRn结合亲和力的mAb在人体内的靶标无关性、非特异性清除机制的输出。

在某些实施例中，本公开的测定可以用于分析各种含Fc分子的不同组并且对已知影响PK的因素有所响应。

在某些实施例中，本实施例的测定可用于剖析转胞吞作用测定中涉及的因素，以便了解这些因素如何与体内清除率相关联并定义该相关性的定量性质。

在某些实施例中，本公开的测定可用于探究胞饮的mAb在各种细胞类型/组织室中的再循环、转胞吞作用和降解途径之间的分布，以及控制在IgG清除所涉及细胞中的此类分布的分子机制。

在某些实施例中，本发明涉及转胞吞作用测定系统。例如但并非限制，此类系统可以包括：第一腔室和第二腔室，其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH；以及单层的细胞，其定位在第一腔室中，使得细胞可介导引入第一腔室中的分子至第二腔室的转胞吞作用；以及检测器，其用于检测第二腔室中分子的存在。在某些实施例中，本文公开的测定系统采用单层的MDCK细胞。在某些实施例中，本文公开的测定系统采用包含至少一种异源基因的细胞。在某些实施例中，本文公开的测定系统采用包含至少一种选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组的异源基因的细胞。在某些实施例中，本文公开的测定系统采用表达异源细胞表面蛋白的细胞。在某些实施例中，本文公开的测定系统采用表达异源细胞表面蛋白的细胞，其中该异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。在某些实施例中，本文公开的测定系统可以经由使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统测量跨细胞运输的分子的数目。

4.细胞

在本公开的测定中使用的合适的细胞包括如本文所述的原核或真核细胞。

在某些实施例中，也可以使用脊椎动物细胞。有用的哺乳动物细胞系的非限制性示例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。有用的哺乳动物细胞系的另外非限制性示例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))。在某些实施例中，本公开的方法可以使用杂交瘤细胞。例如但并非限制，杂交细胞系可以是任何物种(包括人和小鼠)的。在某些实施例中，本公开的方法可以使用原代和构建的内皮和/或上皮细胞。例如但并非限制，内皮和/或上皮细胞可以是caco-2、T-84、HMEC-1、MHEC 2.6、HUVEC和诱导的多能干细胞(iPSC)来源的细胞(Lidington,E.A.,D.L.Moyes,et al.(1999).“A comparison ofprimary endothelial cells and endothelial cell lines forstudies of immuneinteractions.”Transpl Immunol 7(4):239-246；Yamaura,Y.,B.D.Chapron,等人(2016).“Functional Comparison of Human Colonic Carcinoma CellLines and Primary SmallIntestinal Epithelial Cells for Investigations of IntestinalDrug Permeabilityand First-Pass Metabolism.”Drug Metab Dispos 44(3):329-335)。

在某些实施例中，用于所公开方法的细胞可以包含编码分子例如受体的核酸。在某些实施例中，核酸可以存在于一种或多种载体(例如，表达载体)中。载体的一种类型是“质粒”，其是指另外的DNA链段可以连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA链段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)中自主复制。在导入细胞中之后，将其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)整合到细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体(表达载体)能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。用于本公开中的表达载体的另外非限制性示例包括起到等效功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

在某些实施例中，可以将编码分子例如受体的核酸引入细胞中。在某些实施例中，可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞中，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施例中，细胞是真核细胞，例如，MDCK细胞。

5.Trans-well测定

本公开的方法中采用的合适的trans-well测定包括但不限于Boyden腔室测定、细胞迁移测定、细胞侵袭测定、微流体迁移装置、体外刮擦测定、细胞外基质(ECM)蛋白质测定。本公开的方法可以利用多种测定平台(例如12孔、24孔或96孔多孔阵列)执行，包括“通用”trans-well平台。测定平台的非限制性示例包括细胞培养插入物和插入板，以及聚碳酸酯膜细胞培养插入物。

本公开的实施例

本公开的非限制性实施例包括：

1.一种用于确定分子的药代动力学(PK)参数的方法，该方法包括确定在生理pH条件通过一个细胞或多个细胞的一个分子或多个分子的转胞吞作用的量度。

2.根据实施例1所述的方法，其中PK参数是分子的体内清除率的量度。

3.根据实施例1所述的方法，其中PK参数是分子的体内半衰期的量度。

4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中转胞吞作用的量度是转胞吞作用的速率。

5.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中转胞吞作用的量度是经转胞吞的一个分子或多个分子的量的量度。

6.根据实施例1所述的方法，其中转胞吞作用的量度是通过测量一个分子或多个分子从第一腔室中的溶液到第二腔室中的溶液的转胞吞作用而确定的，其中第一腔室和第二腔室通过细胞单层分隔，并且每个腔室中的溶液均处于生理pH。

7.根据实施例1所述的方法，其中一个细胞或多个细胞是马丁-达比犬肾(MDCK)细胞。

8.根据实施例1或7所述的方法，其中细胞包含至少一种异源基因。

9.根据实施例8所述的方法，其中至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

10.根据实施例2至9中任一项所述的方法，其中细胞表达异源细胞表面蛋白。

11.根据实施例10所述的方法，其中异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

12.根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中测量分子的转胞吞作用包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其进一步包括：基于测得的分子的数目确定该分子的体内清除率。

14.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中分子是天然地结合FcRn的分子。

15.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中分子经工程化以结合FcRn。

16.根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中分子是含Fc的分子。

17.根据实施例16所述的方法，其中含Fc的分子是受体Fc融合分子。

18.根据实施例16中任一项所述的方法，其中分子是抗体。

19.根据实施例18所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。

20.根据实施例1至19中任一项所述的方法，其中分子是含白蛋白的分子。

21.根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中生理pH值为约7.4。

22.一种用于测量多个单一分子或多个不同分子的跨细胞运输的方法，其包括：

a)将多个单一分子或多个不同分子引入两个腔室中的第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；以及

b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目。

23.根据实施例22所述的方法，其中第一腔室包含单层的细胞。

24.根据实施例22或23所述的方法，其中细胞是马丁-达比犬肾(MDCK)细胞。

25.根据实施例22至24中任一项所述的方法，其中细胞包含至少一种异源基因。

26.根据实施例25所述的方法，其中至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

27.根据实施例22至26中任一项所述的方法，其中细胞表达异源细胞表面蛋白。

28.根据实施例27所述的方法，其中异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

29.根据实施例22至28中任一项所述的方法，其中测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

30.根据实施例22至29中任一项所述的方法，其进一步包括：基于测得的分子的数目确定该分子的体内清除率。

31.根据实施例22至30中任一项所述的方法，其中分子是天然地结合FcRn的分子。

32.根据实施例22至31中任一项所述的方法，其中分子经工程化以结合FcRn。

33.根据实施例22至32中任一项所述的方法，其中分子是含Fc的分子。

34.根据实施例33所述的方法，其中含Fc的分子是受体Fc融合分子。

35.根据实施例22至34中任一项所述的方法，其中分子是抗体。

36.根据实施例35所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。

37.根据实施例22至36中任一项所述的方法，其中分子是含白蛋白的分子。

38.根据实施例22至37中任一项所述的方法，其中生理pH值为约7.4。

39.一种确定分子的体内清除率的方法，其包括：

a)将分子引入两个腔室中的第一腔室中，其中第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值；

b)测量从第一腔室转胞吞至第二腔室的分子的数目；以及

c)基于测得的分子的数目，确定该分子的体内清除率。

40.根据实施例39所述的方法，其中第一腔室包含单层的细胞。

41.根据实施例39或40所述的方法，其中细胞是MDCK细胞。

42.根据实施例39至41中任一项所述的方法，其中细胞包含至少一种异源基因。

43.根据实施例42所述的方法，其中至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

44.根据实施例39至43中任一项所述的方法，其中细胞表达异源细胞表面蛋白。

45.根据实施例44所述的方法，其中异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

46.根据实施例39至45中任一项所述的方法，其中测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

47.根据实施例39至46中任一项所述的方法，其中分子是天然地结合FcRn的分子。

48.根据实施例39至46中任一项所述的方法，其中分子经工程化以结合FcRn。

49.根据实施例39至48中任一项所述的方法，其中分子是含Fc的分子。

50.根据实施例49所述的方法，其中含Fc的分子是受体Fc融合分子。

51.根据实施例39至50中任一项所述的方法，其中分子是抗体。

52.根据实施例51所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。

53.根据实施例39至52中任一项所述的方法，其中分子是含白蛋白的分子。

54.根据实施例39至53中任一项所述的方法，其中生理pH值为约7.4。

55.一种用于测量多个分子的跨细胞运输的测定，其包括第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室各自具有生理pH值，其中第一腔室接收多个分子、构造成将分子跨细胞地运输至第二腔室，并且多个分子的跨细胞运输得到测量。

56.根据实施例55所述的测定，其中第一腔室包含单层的细胞。

57.根据实施例55或56所述的测定，其中细胞是MDCK细胞。

58.根据实施例55至57中任一项所述的测定，其中细胞包含至少一种异源基因。

59.根据实施例58所述的测定，其中该至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

60.根据实施例55至59中任一项所述的测定，其中细胞表达异源细胞表面蛋白。

61.根据实施例60所述的测定，其中异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

62.根据实施例55至61中任一项所述的测定，其中测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

63.根据实施例55至62中任一项所述的测定，其进一步包括：基于测得的分子的数目确定该分子的体内清除率。

64.根据实施例55至63中任一项所述的方法，其中分子是天然地结合FcRn的分子。

65.根据实施例55至62中任一项所述的方法，其中分子经工程化以结合FcRn。

66.根据实施例55至65中任一项所述的方法，其中分子是含Fc的分子。

67.根据实施例66所述的方法，其中含Fc的分子是受体Fc融合分子。

68.根据实施例55至67中任一项所述的方法，其中分子是抗体。

69.根据实施例68所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。

70.根据实施例55至69中任一项所述的方法，其中分子是含白蛋白的分子。

71.根据实施例55至70中任一项所述的方法，其中生理pH值为约7.4。

72.一种测定系统，其包括：

a)第一腔室和第二腔室，其中第一腔室和第二腔室各自具有生理pH；

b)单层的细胞，其定位在第一腔室中，使得细胞可介导引入第一腔室中的分子至第二腔室的转胞吞作用；以及

c)检测器，用于检测分子在第二腔室中的存在。

73.根据实施例72所述的测定系统，其中细胞是MDCK细胞。

74.根据实施例72或73所述的测定系统，其中细胞包含至少一种异源基因。

75.根据实施例74所述的测定系统，其中该至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

76.根据实施例72至75中任一项所述的测定系统，其中细胞表达异源细胞表面蛋白。

77.根据实施例76所述的测定系统，其中异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

78.根据实施例72至77中任一项所述的测定系统，其中测量跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)、定量PCR或荧光读取器系统。

实例

以下实例仅是对当前公开的主题的说明，不应以任何方式视为限制。

方法

测试分子

测试分子包括具有人体内清除率数据的53种mAb、5种Fc融合蛋白和另外9种mAb(4种电荷变体、3种糖基化变体和5种FcRn结合变体)。30种mAb是市售治疗性抗体，其中19种(奥法木单抗、维多珠单抗(Vedolizumab)、阿达木单抗、那他珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、西妥昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、奥拉单抗(Olaratumab)、帕尼单抗、瑞利珠单抗、巴利昔单抗、伊卡珠单抗(Ixekizumab)、德瓦鲁单抗、依伐洛单抗(evolocumab)、阿利库单抗(alirocumab)、戈利木单抗)自制造商购得。其余的全部由Genentech(South San Francisco,CA)在经工程化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产。

表达人FcRn和β2-微球蛋白的MDCK细胞的生成和表征

用与先前描述的那些方法相似的方法开发了稳定的细胞系(Claypool,2002)。在37℃、5％CO₂的湿润培养箱中，使马丁-达比犬肾II(MDCK II)细胞(欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)，英国索尔兹伯里)在含有10％胎牛血清、100单位/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和0.292mg/mL的L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良最小基本培养基(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)中生长。使用含有人FcRn(FCGRT(UniProtKB-P55899，FCGRTN_HUMAN)和β₂m(UniProtKB-P61769，B2MG_HUMAN))的cDNA的经修饰pRK质粒(Eaton DL等人,1986,Biochemistry,25(26),pp.8343–8347)，通过电穿孔(Lonza核转染试剂盒L)转染细胞，该cDNA通过P2A序列分隔(Kim,JH等人,2011,PLoS One 6(4):e18556)并且处于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。3天后，用5μg/mL的嘌呤霉素选择细胞并扩展两周。

然后使用抗FCGRT抗体(ADM31，Aldevron,Fargo,ND)和抗小鼠PE缀合的二级抗体(A10543，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，通过荧光激活细胞分选(FACS)对细胞进行克隆性和FCGRT表达的分选。所有克隆物均用恒定选择剂(5μg/mL嘌呤霉素)维持。基于使用FITC抗人β2m FITC缀合的抗体(2M2，BioLegend,San Diego,CA)通过流式细胞术评定的FCGRT和β₂m两者的细胞表面表达，使用下述方法选择最终克隆物。

使MDCK-II细胞生长至汇合并使用非酶细胞解离试剂(Sigma)分离。首先，在冰上用抗FCGRT抗体(1:100稀释)在PBS-0.05M EDTA 2％BSA中将10⁶个细胞/ml染色。洗涤后，在黑暗中将细胞与抗小鼠PE缀合的二级抗体(1:200稀释)和抗β2M FITC缀合的抗体(1:50稀释)一起于冰上孵育一小时。洗涤样品，并将其重悬于PBS-0.05M EDTA 2％BSA中，用于在BDFACSCanto II(BD Biosciences,San Jose,CA)上进行流式细胞术分析。

转胞吞作用测定

将处于补充有10％FBS、100单位青霉素/链霉素和5μg/mL嘌呤霉素的高葡萄糖DMEM细胞生长培养基中的细胞以1x 10⁵个细胞/孔的密度接种在96孔Trans-well板(Corning Costar,Acton,MA,USA)上，该板的内腔室和外腔室中分别具有100μL和200μL培养基。在铺板后第二天将细胞用于实验。去除内腔室中的培养基，并且添加测试分子至终浓度为100μg/mL(0.67μM)，并在37℃的组织培养箱中孵育24小时。在24小时测定孵育的最后90分钟，添加在细胞生长培养基中制备的荧光黄(荧光黄CH，二锂盐；Sigma Aldrich；St.Louis MO)。从外腔室收集培养基，并定量转胞吞分子的量(图1)。通过将来自外腔室的样品中的荧光信号除以内腔室的荧光信号来计算测定期间荧光黄的被动通过水平。丢弃来自在外腔室中表现出大于0.1％的荧光黄被动通过的孔的转胞吞作用结果。

测定的输出是外腔室的培养基中的转胞吞分子的浓度(ng/mL)，并且该测定的可报告值是来自同一块板的2个重复孔的平均浓度。在某些实施例中，测定的输出可以是转胞吞速率的量度或转胞吞的分子的相对转胞吞作用的量度。

转胞吞作用的定量

在2-8℃，用处于碳酸钠(pH 9.6)中1μg/mL的100μL的山羊抗人IgG-F(ab)'(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)将96孔微量滴定板包被过夜。用PBS/0.05％聚山梨酯-20洗涤后，将板与200μL封闭缓冲液(PBS/0.5％；BSA/0.1％；酪蛋白/0.05％；P20/0.05％；Proclin300)一起在轻柔搅动下，在室温孵育2小时。洗涤后，将100μL的在测定稀释液(PBS/0.5％；BSA/0.05％；P20/0.05％；Proclin300)中连续稀释的测定标准品、对照品或样品加入板中(图1)。在轻柔搅动下在室温再孵育一小时后，再次洗涤板，然后用100μL的以1:10000稀释在测定稀释液中缀合至HRP的山羊抗人IgG-Fc(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)孵育。在轻柔搅动下将板孵育1小时，洗涤后，加入100μL新鲜混合的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)。不搅动的情况下显色15分钟，并通过添加100μL的1MH₃PO₄终止反应。在Spectra Max I3读板器(Molecular Devices Corporation,CA)上在450nm和650nm的参比的波长处读取吸光度，并使用制造商提供的SoftmaxPro软件处理数据。从同一板上标准曲线的四参数拟合中进行插值，获得样品中测试抗体的浓度。

对于Fc融合蛋白，遵循上述程序，通过与蛋白特异性结合的抗体捕获测试分子，并通过缀合至HRP的抗人IgG-F(ab)'进行检测。

BV ELISA

在包被缓冲液(0.05碳酸钠，pH 9.6)中制备了1％杆状病毒颗粒悬液，向384孔板(Nunc-Immuno板MaxiSorp表面，目录号464718)中每孔添加25μL，并在4℃孵育过夜。在轻柔摇动下，在室温用50μL测定缓冲液(含5％BSA和10PPM Proclin的PBS)将孔封闭1小时。用100μL洗涤缓冲液(PBS)洗涤孔三遍后，将25μL的在测定缓冲液中制备的样品一式两份上样，并在轻柔摇动下在室温孵育1小时。将板用100μL洗涤缓冲液洗涤六次，并且将25μL的与辣根过氧化物酶特异性缀合的山羊抗人FcRn片段(JacksonImmunoResearch)以测定缓冲液中10ng/mL的浓度添加到每个孔中，并在轻柔摇动下在室温孵育1小时。将孔用100μL洗涤缓冲液洗涤六次，在轻柔摇动下在室温向每孔中添加25μL TMB(Moss，Inc.，目录号TMBE-1000)底物15分钟，向每孔中添加25μL 1M磷酸以终止反应，并使用读板器测量450nm处的吸光度。

基于BLI的mAb-FcRn相互作用评定

使用Octet RED(PALL/ForteBio)用于所有FcRn体外测定，该测定于30℃在96孔黑色实心板(Greiner Bio-One,655900)中进行。最初，以最佳浓度将FcRn固定至镍-氮三乙酸涂覆的生物传感器(ForteBio，18-0029)上180秒。在基线步骤之后，当将具有经固定化FcRn的生物传感器暴露于用HCl调节至pH 6.0的PBS中的mAb样品30秒后，确定mAb-FcRn的结合速率。分析之前，将所有抗体透析至pH 6.0的PBS中，在pH 6.0的PBS中稀释至100mg/mL，并以200mL的体积使用。每种测定均在特定mAb上平行执行五次。使用软件版本7.0(PALL，ForteBio)执行数据分析。

通过成像毛细管等电聚焦进行pI测定

如之前所述(Li等人,2014)，在iCE280分析仪(ProteinSimple,Toronto,ON)上执行成像毛细管等电聚焦(icIEF)。阳极电解液和阴极电解液分别是80mM磷酸和100mM NaOH，各自用0.1％甲基纤维素制备。在含有羧肽酶的水中制备mAb样品，并在37℃孵育20分钟以去除C端赖氨酸残基。将由3.1％(v/v)Pharmalytes(GE Life Sciences)、2.5M尿素、0.1％(v/v)甲基纤维素和pI 5.5和9.77标记物(Protein Simple)组成的两性电解质混合物与经处理的抗体联合至终浓度为0.25mg/mL。用光吸收检测器在280nm处对电泳图成像。

通过流式细胞术进行细胞结合测定

用在FACS缓冲液(PBS/1％BSA/2mM EDTA/0.1％叠氮化钠)中以100μg/mL浓度的测试分子对细胞染色，并且在冰上孵育一小时。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞用PE缀合的小鼠抗人IgG Fc二级抗体(Southern Biotech,Birmingham,AL)在冰上染色1小时。洗涤细胞并用固定缓冲液(BDBiosciences,San Jose,CA)固定。使用FACSCanto II流式细胞分析仪(BDBiosciences；San Jose,CA)测量经染色细胞的荧光强度，并使用FlowJo软件(TreeStar；Ashland,OR)分析数据。

X-Fc唾液酸化变体的小鼠PK研究

以1mg/kg的剂量向CD1小鼠施用单次I.V推注剂量的X-Fc变体(1、5、8、12或15)。在给药后直至21天的各个时间点，收集血清样品(每个时间点，n＝4)并分析药物浓度。使用经过验证的ELISA测定来测量血清中的药物浓度。使用Phoenix WinNonlin版本6.4.0.768(WinNonlin 6.4；PharsightCorporation,Mountain View,CA)中的非房室模型稀疏分析，使用来自单个动物的血清浓度-时间数据估算药代动力学参数。

通过使用Gyros技术平台(Gyros US Inc.,Warren,NJ)和一种通用PK测定的ELISA，测量小鼠血清中的总抗体浓度。该测定使用生物素化的绵羊抗人IgG抗体作为捕获，并使用与Alexa Fluor_647缀合的绵羊抗人IgG作为检测。用于该测定的最小稀释度为1:10。对于小鼠血清，该测定的标准曲线范围为0.03至30μg/mL。

实例1：中性pH FcRn介导的转胞吞作用测定的开发与表征

用人B2M(B2M)和FcRn重链(FCGRT)基因两者转染MDCK细胞系。通过FACS分选分离出表达两种基因的稳定细胞，并选择在细胞表面表达高水平FCGRT和B2M的克隆细胞系(MDCK-hFcRn；305-6)(图2)来进一步开发FcRn依赖性转胞吞作用测定。为了最小化潜在的测定偏差/伪影并更好地模拟生理条件，在测定中测试的分子没有标记，并且在生理pH的生长培养基中执行测定。

在本测定中，细胞在trans-well的滤膜上生长至汇合，将测试分子添加到内腔室的生长培养基中，孵育后，通过ELISA将运输通过细胞并释放到外腔室的培养基中的分子定量。在接种密度、trans-well板型式、上样浓度、测定培养基和测定持续时间方面对该测定进行了广泛优化。由于测定培养基包含胎牛血清白蛋白(BSA)，而已经证明胎牛血清白蛋白在IgG的存在下与人FcRn结合并形成三分子复合物(Chaudhury C.等人,2003,J.Exp.Med.197,315–322)，因此预期人FcRn在该测定中同时吸引测试抗体和BSA两者。与含有BSA的培养基相比，含有不同量的人血清白蛋白而不是BSA的替代测定培养基在转胞吞作用读数上几乎没有差异。由于操作上的考虑，测定是在含有FBS/BSA的正常生长培养基中执行的。

通过测量跨上皮电阻(TEER；Srinivasan B.等人,2015,J Lab Autom 20(2):107-126)来监测过滤器上生长的MDCK-hFcRn细胞的功能完整性。测定前，单层的TEER通常在250至300Ω*cm²范围内，这是经极化的MDCK II细胞的特征范围(Tesar DB等人,2006,Traffic7(9):1127-1142)。此外，如“方法”中所述，通过在内腔室中并入荧光黄和测试分子来监测测定过程中单层的屏障完整性(渗漏性)。

实例2：人体外转胞吞作用效率与mAb的体内清除率的相关性

为了评估该测定在确定或预测mAb的体内PK行为中的潜在效用，在该测定中测试了53种mAb，其包括30种市售治疗性抗体和23种临床候选抗体。分析了mAb的转胞吞作用输出与报道的它们在人体内的清除速率之间的潜在相关性。这些分子是基于临床级材料的可用性以及人体内清除率数据而选择的。除转胞吞作用测定外，还对一些分子进行了另外两种体外测定：BV ELISA以及基于生物层干涉法(BLI)的人FcRn结合测定。BV ELISA测量作为mAb的一般非特异性结合特性指标的与杆状病毒颗粒的非特异性结合，并且据报道能够鉴别出在食蟹猴体内快速清除风险增加的抗体等人,2012,(2012),MAbs 4(6):753-760)。基于BLI的FcRn结合测定已用于生成组合的在pH 6.0的FcRn缔合速率和在pH 7.4的解离速率，这显示了与五种mAb在人和人FcRn转基因小鼠体内的半衰期的强相关性(Souders CA等人,2015,MAbs 7(5):912-921)。

表1列出了这项研究的结果，其中还包括测试分子在人和食蟹猴(cyno)两者体内的清除速率。测试组的平均转胞吞输出为5.4ng/mL，中位数为4.5，范围为2.6至14.9，这反映了内腔室中的上样材料平均为约0.005％(100μg/mL)。在pH 6.0的FcRn结合亲和力(以μM计的Kd)和BV ELISA分数的相应平均值和中位数/范围如下：分别为0.63、0.54/0.25至1.8；以及0.25、0.06/0.0.038至3.916。市售mAb药物的人体内清除速率是从该药物的处方信息或已发表的报告中获得的；临床阶段mAb的清除速率来自Genentech执行的临床研究或已发表的报告。食蟹猴清除速率来自Genentech进行的食蟹猴研究。人体内清除速率的平均值、中位数/范围是5.0、4.1/1.4至14.1mL/Kg/天，而食蟹猴体内是6.8、4.9/3.0至15.8mL/Kg/天。似乎所有参数的值均分布在至少5倍的范围内，其表明本研究中测试的mAb组具有相当大的多样性。

如图3A中所示，在拟合的线性回归R平方值为0.8的情况下，在转胞吞作用输出与清除率值之间观察到明显的关联趋势。据报道，在人体内清除速率较高的抗体通常在该测定中显示出较高的转胞吞作用输出。值得注意的是，所观察到的相关性不受基于重链和轻链亚类、靶标性质(可溶或膜结合)、作用机制(激动的、拮抗的或细胞毒性的)或施用途径的分亚组测试分子的影响。另一方面，经由BLI或BV ELISA，清除速率与在pH 6.0的FcRn结合没有明显的相关性(图3B、图3C)。

通常，食蟹猴PK为确定或预测mAb的人PK提供了最可翻译的模型。转胞吞作用输出与食蟹猴清除率之间的相关性可能为该测定作为PK的确定性或预测性工具的用途提供了额外的证实。在组中获得了25种mAb的食蟹猴清除率数据，并分析了它们与人清除速率或转胞吞作用效率值的相关性。如图D所示，在转胞吞作用效率和食蟹猴清除率之间观察到了关联趋势，并且通过R平方值判断的相关性程度似乎与食蟹猴和人清除率之间的相关性程度相似(图3D)。但是，由于一些“离群值”，R平方值大约为0.6。食蟹猴清除率与转胞吞作用图中最明显的两个异常值(图3D)是aNRP1和帕妥珠单抗；前者因其与人清除率的不一致性而闻名(图3E)，后者可能由于与犬表皮生长因子受体2的交叉反应性而与MDCK细胞结合(Fazekas,2016)。去除这两个分子将线性回归拟合的R平方值增加到图3D中的0.75和图3E中的0.76。

表1

ND＝未完成；NA＝不可用；ROA＝施用途径；M＝膜结合的；S＝可溶的；SC＝皮下注射；IV＝静脉注射；IM＝肌肉注射。

为了证明在观察到的转胞吞作用输出与清除率之间的相关性中对FcRn相互作用的依赖性，基于在实验中观察到的不同的转胞吞作用输出，随机选择12种mAb(10种来自人清除率数据的组)，并在类似的转胞吞作用测定中使用母体MDCK细胞进行测试。分析所得转胞吞作用值与其清除速率的相关性趋势(图4A)，并与使用MDCK-hFcRn细胞测得的结果进行比较(图4B)。如表3和图4A所示，MDCK细胞中的转胞吞作用值一般小于使用经FcRn转染细胞的测定结果的10％，并且与人体内清除速率没有明显的相关性。另一方面，在使用相同mAb组进行测试的MDCK-hFcRn细胞中，转胞吞作用与清除率具有强相关性(图4B)。这项研究的结果支持FcRn与测试抗体之间的相互作用在本测定中不仅涉及到促进转胞吞作用，而且直接对它们与人体内清除率的相关性有所贡献。

实例3：细胞结合对mAb转胞吞作用的影响

已知，非特异性脱靶结合会影响mAb药物的PK(Boswell等人,2010,Bioconjug.Chem.21,2153–2163)。在本测定中，测试分子的转胞吞作用涉及MDCK-hFcRn细胞的结合和内化。测试分子可以在生理pH经由非特异性相互作用或与细胞表面FcRn的特异性结合而与细胞结合，这两者都可能影响转胞吞作用的输出。为了评估细胞结合对转胞吞作用的影响，将选择性mAb与经转染的MDCK-hFcRn和未经转染的MDCK细胞两者一起孵育，并用荧光缀合的小鼠抗人IgG-Fc通过流式细胞术检测结合的抗体。与细胞的结合程度由几何平均荧光强度表示，并且结果列于表2中。似乎除了少数例外，细胞内mAb与任一细胞系结合的差异大多极小，这表明在生理pH由于最低限度地结合FcRn，在多数情况下，FcRn表达并不剧烈改变Ab与MDCK细胞的结合行为。在细胞结合与转胞吞作用输出之间没有观察到明显的相关性(图4C)。

有趣的是，两种抗HER2抗体(曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)均显示出与MDCK细胞的结合增强，无论细胞是否具有经转染的人FcRn(表2)。据报道，人HER2与其犬类对应物具有高度同源性，并且曲妥珠单抗和帕妥珠单抗两者均可用于治疗犬的乳腺癌(Fazekas,2016)。因此，观察到的这两种分子与细胞的结合可以通过与MDCK细胞上表达的犬表皮生长因子受体2的交叉反应来解释。另外，抗gD显示出与MDCK-hFcRn的结合增加，但与未经转染的MDCK细胞没有结合，表明其在生理pH与MDCK-FcRn细胞上的人FcRn特异性结合。再者，与MDCK-FcRn细胞的结合增加并未转化为MDCK-FcRn细胞中的转胞吞作用增加。观察到的结合可能不会直接导致复合物的内化；替代地，内化的抗gD优先再循环回内腔室或直接引导至溶酶体进行降解，因此不经由转胞吞途径运输。最后，在所测试的12种mAb中，两种mAb(巴昔利昔单抗和mAb 12)表现出更高的转胞吞作用和更快的清除率，也显示出与两种细胞系的结合升高。这表明两种分子都可能与MDCK细胞膜发生非特异性相互作用，从而导致测定中的转胞吞作用增加，并可能在其报道的人体内快速清除中发挥作用。

表2

归结起来，这项研究的结果表明，虽然经由特异性或非特异性相互作用与细胞结合可能会影响转胞吞作用，但这种测定的输出并非仅由结合决定；其他影响因素，诸如细胞摄取/内化、与内体中FcRn的相互作用以及细胞中的分选/转运，都与综合结果有关。MFI＝几何平均荧光强度。

实例4：电荷对mAb转胞吞作用的影响

电荷是决定mAb如何与细胞表面带负电的成分相互作用的主要因素之一。已经证明，电荷的变化会改变mAb的PK行为：pI较高或Fv正电荷较高的mAb的清除速度快于其pI/正电荷较少的对应物(Igawa,T.等人,2010,Protein Eng Des Sel 23(5):385-392；Boswell等人,Chem.21,2153–2163(2010).10；Bumbaca Y.等人,2015,J Biol Chem 290(50):29732-29741)。假设较高的正电荷将通过增加非特异性结合而导致更快的非特异性清除率，这可能是由于与带负电荷的细胞外基质发生更大的静电相互作用，而较低的正电荷将导致非特异性结合减少和较慢的非特异性清除率。

为了理解电荷对mAb转胞吞作用的影响，在我们的测定中，测试了之前已经在几种临床前物种中评估其PK行为的具有设计Fv电荷变体的两组mAb(Bumbaca Y.等人,2015,JBiol Chem 290(50):29732-29741)。这些电荷变体基于抗淋巴毒素α(抗Ltα)和humAb4D5-8(抗HER2)，其中一种母体抗体具有带较高正电荷的Fv(抗LTα+3和抗HER2+3)，而另一种具有带较低正电荷的Fv(抗Ltα-4和抗HER2-4)。在已报道的研究中，与母体分子相比，Fv正电荷较高的两种变体均显示出更快的非特异性清除率，而具有较低正电荷的那些变体显示出相似或较慢的清除率(Bumbaca Y.等人,2015,J BiolChem 290(50):29732-29741)。在所有测试的临床前物种(包括食蟹猴、小鼠和大鼠)中均观察到了Fc电荷与清除率之间的相关性；物种依赖性的缺乏支持了带正电荷的mAb与带负电荷的细胞组分之间非特异性静电相互作用的假说。如表3中所示，两组电荷变体的转胞吞作用值的顺序遵循与Fv电荷程度以及在食蟹猴体内观察到的清除速率相同的趋势。与母体分子相比，两种带较高正电荷的变体(抗LTα+3和抗HER2+3)均显示较高的转胞吞作用输出，而两个带较低电荷的分子则显示较低的转胞吞作用输出。似乎转胞吞作用的输出正确地反映了所观察到的两组电荷变体清除速率的排序。这项研究的结果表明，mAb电荷的变化会像其影响mAb的PK一样影响我们的测定中的转胞吞作用读数，并且我们的测定能够反映电荷对清除率的影响。

表3

为了更好地理解静电相互作用对mAb在人体内清除率的一般影响，计算了19种mAb(来自所测试的50种mAb)的Fv(vL+vH)组合电荷，并分析了它们与清除率的相关性。另外，用icIEF测量这些分子的pI，并执行类似的分析。如图5A和图5B所示，虽然观察到人体内清除速率与pI或Fv组合电荷值之间存在关联趋势，但相关性强度似乎较弱，这得到相对较低的R平方值(小于0.25)的证实。另一方面，清除率与转胞吞作用之间的相关性在此mAb亚组中仍然很强(R平方值大于0.8；图5C)。似乎，虽然电荷的实质性改变有望调控mAb的转胞吞作用行为，但该测定的输出仍然是由电荷以外多种因素的联合效应决定的。

实例5：糖基化对含Fc分子的转胞吞作用的影响

mAb或Fc融合蛋白的糖基化模式会显著影响其PK和PD行为(HigelF.等人,2016,Eur J Pharm Biopharm 100:94-100)。已经证明，与具有典型糖基化模式的对照品相比，携带超过99％的高甘露糖N-聚糖(Man5或Man8/9)的mAb在临床前物种中显示出更快的清除率(Yu M等人,2012,MAbs 4(4):475-487)，并且与融合配偶体中唾液酸化程度较低的Fc融合蛋白相比，具有广泛唾液酸化的Fc融合蛋白的清除率降低(Stefanich EG等人,2008JPharmacol Exp Ther 327(2):308-315)。假设携带高甘露糖聚糖的mAb被免疫细胞上最明显表达的甘露糖受体结合并清除(Lee SJ等人,2002,Science 2951898–1901)，而带有暴露的末端半乳糖的Fc融合蛋白(未唾液酸化)被在肝脏中表达的去唾液酸糖蛋白受体结合并清除(Stockert RJ,1995,Physiol.Rev.75:591–609)。

为了探究糖基化对mAb和Fc融合蛋白的转胞吞作用的影响，测试了两组糖基化模式不同的分子。奥瑞珠单抗(2H7)糖型的变体包括一种通过体外去糖基化而不含Fc N联聚糖(2H7-DG)的变体和另一种携带超过99％的甘露糖5聚糖(2H7-Man5)的变体。另一组变体基于X-Fc，这是一种由人糖蛋白X和人IgG1Fc组成的融合蛋白；X-Fc的5种变体携带不同水平的唾液酸化，其分别代表每摩尔X-Fc具有1、5、8、12和15摩尔唾液酸(分别为X-Fc1、X-Fc5、X-Fc8、X-Fc12和X-Fc15)。2H7和2H7-Man5的清除速率是从先前发表的研究中获得的(Yu M等人,2012,MAbs 4(4):475-487)；X-Fc唾液酸化变体的清除速率是通过内部小鼠研究生成的。尽管没有关于2H7-DG的清除率数据，但据报道，Fc N-聚糖的去除不会诱导其半衰期的可辨识变化(Tao MH和Morrison SL,1989,J Immunol 143(8):2595-2601)。此外，由于N297G突变而不携带Fc N-聚糖的阿特珠单抗显示人体内的正常PK特征(处方信息和表1)。如表4所示，与2H7相比，2H7-DG表现出相似的转胞吞作用，而2H7-Man5表现出增加2倍的转胞吞作用，前者预测清除率相似，而后者预测清除率更快，两者均与其体内清除速率的预期/观察排序一致。类似地，5种X-Fc变体显示转胞吞作用的水平降低，其顺序与由于唾液酸化作用增加而导致的暴露的末端半乳糖量的减少一致；这些唾液酸化变体的清除速率的预测排序与从小鼠研究中观察到的清除率数据一致。

为了探究糖基化对FcRn结合和/或与细胞的非特异性相互作用的潜在影响，测试了两组糖基化变体的FcRn结合亲和力和与MDCK-hFcRn细胞的相对结合。与2H7相比，去糖基化分子(2H7-DG)在与FcRn和细胞的结合方面未显示可辨识的差异。另一方面，甘露糖-5糖型(2H7-Man5)显示，在pH6.0，其与MDCK细胞的结合略有增加而与FcRn的结合则有中度增加；然而，它没有显示出在MDCK细胞中的转胞吞作用的增加，并且与MDCK-FcRn细胞的结合也没有额外的增加。与2H7man-5糖型相似，X-Fc唾液酸化变体显示在MDCK-hFcRn细胞中的转胞吞作用与细胞结合或MDCK细胞中的转胞吞作用之间没有明显的相关性。然而，与显示出FcRn结合增加和转胞吞作用增加的2H7-Man5相反，X-Fc唾液酸化变体显示出FcRn结合增加的趋势，与MDCK-FcRn细胞中的转胞吞作用输出呈负相关。这表明糖基化可能根据聚糖种类而不同地影响FcRn结合和转胞吞作用。值得注意的是，2H7-Man5和X-Fc-SA1与MDCK细胞的结合缺乏明显增加，这表明转胞吞作用的增加并不是由于与特定受体(诸如已知涉及这些IgG糖型的分解代谢中的甘露糖受体或脱唾液酸糖蛋白受体)结合所致；但是，我们没有直接的证据来证实MDCK细胞中是否存在此类受体。

表4

实例6：极端FcRn结合对mAb的转胞吞作用的影响

已经证明，经由基因工程改良FcRn的结合亲和力会影响治疗性抗体和Fc融合蛋白的半衰期(Ward ES等人,2015,Mol Immunol 67(2Pt A):131-141)。因此，探究携带实质性改变FcRn结合亲和力的工程化突变的mAb的转胞吞行为是有意义的。测试了两组分子在母体MDCK和MDCK-hFcRn细胞两者中的转胞吞作用。第一组包括抗VEGF(人源化IgG1mAb)和抗VEGF-QA(其携带T307Q/N434A突变，使FcRn结合增加近10倍)(Yeung YA等人,2010,CancerRes 70(8):3269-3277)。第二组包括人源化单纯疱疹病毒糖蛋白D特异性IgG1抗体，即，抗gD(WT)，及其两个FcRn结合变体，即，抗gD-HAHQ，其携带H310A/H435Q突变，从而降低了FcRn的结合活性(Kenanova V.等人,2005,Cancer Res 65(2):622-631)，和抗gD-YTE，其携带M252Y/S254T/T256E突变，可将其FcRn结合增加超过10倍(Dall'Acqua,2006)。如表5所示，在MDCK-hFcRn细胞中清楚地观察到所有五种分子的明显的转胞吞作用，其中抗gD-HAHQ显示出最低的转胞吞作用值，这可能是由于其不能结合FcRn。但是，与其中胞吞作用的增加与清除速率的增加(快速清除)相关的mAb组结果相反，与野生型对应物相比，表现出较慢体内清除率的抗VEGF-QA和抗gD-YTE两者均显示出转胞吞作用增加。具有极端FcRn结合亲和力的分子可能会在该测定中表现不同，这是由于它们对控制再循环和转胞吞途径的分选机制的应答不同。

有趣的是，虽然大多数分子显示出在MDCK细胞中的低水平转胞吞作用，低于或略高于ELISA的检测限0.3ng/mL，但抗gD-YTE却显示出引人注目的转胞吞作用水平，超过了1ng/mL，这大概与FcRn无关。观察到的转胞吞作用输出在两种细胞系之间的显著差异支持在MDCK-hFcRn细胞中观察到的转胞吞作用主要是由FcRn驱动的，并且该测定对含有能够与FcRn相互作用的IgG的完整Fc结构域的分子具有特异性。值得注意的是，尽管与野生型对应物相比，抗VEGF-QA和抗-gD-YTE两者均显示出FcRn结合活性增加8至10倍，但转胞吞作用的增加相当温和，抗VEGF-QA的转胞吞作用增加低于两倍，抗gD-YTE的转胞吞作用增加略高于两倍。

表5

本文引用的所有出版物、专利和其他参考文献通过引用整体并入本公开。

Claims

1.一种确定与FcRn相互作用的分子的体内清除率的方法，其包括：

a)将所述分子引入第一腔室中，其中所述第一腔室通过一个细胞或多个细胞与第二腔室分隔，并且其中所述第一腔室和所述第二腔室各自具有约7.4的生理pH值；

b)测量从所述第一腔室转胞吞至所述第二腔室的分子的数目；以及

c)基于测得的所述分子的数目，确定所述分子的体内清除率，

其中所述第一腔室包含单层的细胞；其中所述细胞表达异源细胞表面蛋白；

并且所述异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)；

其中所述方法不是诊断方法或治疗方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是MDCK细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞包含至少一种异源基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)或荧光读取器系统。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分子是天然地结合FcRn的分子。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分子经工程化以结合FcRn。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分子是含Fc的分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述含Fc的分子是受体Fc融合分子。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述分子是抗体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分子是含白蛋白的分子。

13.一种通过测量多个分子的跨细胞运输来确定与FcRn相互作用的分子的体内清除率的测定系统，所述测定系统包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室和所述第二腔室都具有约7.4的生理pH值，其中所述第一腔室接收多个分子，被构造成将所述分子跨细胞地运输至所述第二腔室，并且所述多个分子的所述跨细胞运输得到测量，其中所述第一腔室包含单层的细胞，其中所述细胞表达异源细胞表面蛋白；且所述异源细胞表面蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)。

14.根据权利要求13所述的测定系统，其中所述细胞是MDCK细胞。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的测定系统，其中所述细胞包含至少一种异源基因。

16.根据权利要求15所述的测定系统，其中所述至少一种异源基因选自由FCGRT基因和B2M基因组成的组。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的测定系统，其中测量所述跨细胞运输的分子的数目包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、液体闪烁计数(LSC)或荧光读取器系统。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的测定系统，其进一步包括：基于测得的所述分子的数目确定所述分子的体内清除率。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的测定系统，其中所述分子是天然地结合FcRn的分子。

20.根据权利要求13至18中任一项所述的测定系统，其中所述分子经工程化以结合FcRn。

21.根据权利要求13至20中任一项所述的测定系统，其中所述分子是含Fc的分子。

22.根据权利要求21所述的测定系统，其中所述含Fc的分子是受体Fc融合分子。

23.根据权利要求13至22中任一项所述的测定系统，其中所述分子是抗体。

24.根据权利要求23所述的测定系统，其中所述抗体是单克隆抗体。

25.根据权利要求13至24中任一项所述的测定系统，其中所述分子是含白蛋白的分子。