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CN112566624A - 稳定的液体凝血酶组合物 - Google Patents

稳定的液体凝血酶组合物 Download PDF

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CN112566624A
CN112566624A CN201980054176.6A CN201980054176A CN112566624A CN 112566624 A CN112566624 A CN 112566624A CN 201980054176 A CN201980054176 A CN 201980054176A CN 112566624 A CN112566624 A CN 112566624A
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thrombin
glycerol
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liquid
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E·伊兰
O·法因戈德
S·多伦
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Omrix Biopharmaceuticals Ltd
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Omrix Biopharmaceuticals Ltd
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Abstract

本发明提供了用于大规模制备下列物质的方法：由甘油构成的无菌稳定的液体凝血酶组合物；稳定的液体凝血酶组合物；和止血组合物及试剂盒。本发明还提供了由液体凝血酶、甘油和明胶构成的止血组合物。本文还提供了用于大规模生产由甘油构成的无菌液体凝血酶组合物的方法。

Description

稳定的液体凝血酶组合物
技术领域
本发明尤其涉及包含甘油的稳定的液体凝血酶组合物、其制品及包含它们的止血试剂盒。本发明还涉及包含甘油的无菌液体凝血酶组合物。
背景技术
特别是在外科手术中，控制出血对于使失血最小化、减少术后并发症、和缩短手术室中外科手术的持续时间是至关重要和关键的。虽然可获得包含凝血酶的止血制品，但凝血酶要么是冷冻的，要么以粉末形式提供，原因在于其具有自动催化功能，这使得凝血酶不稳定。液体凝血酶的若干制品是当前已知的，例如：
欧洲专利EP0277096公开了使用稳定量的多元醇和特定pH的缓冲液使之在室温下稳定的凝血酶制剂。
美国专利US4696812公开了使用稳定量的抗自溶缓冲液与低水平的盐水和甘油的组合来防止变性而使之储存稳定的凝血酶溶液。
美国专利US4965203公开了使用稳定量的多元醇和特定pH的缓冲液使之在室温下稳定的改良凝血酶制剂。
具有公布号US20060270015的美国专利申请公开了包含具有高纯度和高比活性的凝血酶的稳定液体制剂以及制备和使用此类制剂的方法。
具有公布号US20140120078的美国专利申请公开了交联水凝胶及包括这些交联水凝胶的试剂盒，这些试剂盒可另外包括塑化剂(例如，甘油)和生物活性剂诸如凝血酶。
发明内容
可将液体凝血酶制品制成冻干医学制品，该冻干医学制品是在使用的时候溶解之后使用的。
当前已知的用于稳定液体形式的凝血酶的组合物和方法不尽人意并且包括例如以下：加入各种非特异性组分(例如，大量载体蛋白诸如白蛋白、不同稳定糖、一般蛋白酶抑制剂等)；凝血酶与凝血酶活性抑制剂的制剂，所述制剂虽然可能有效，但也会灭活或抑制凝血酶，从而降低其有效性；以及低凝血酶浓度溶液的制剂，这需要施用更大量的制剂。
本发明提供了液体制品，与冻干制品相比，所述液体制品是有利的，因为它们满足了在没有在使用之前溶解于溶剂中的附加步骤的情况下简便施用稳定的液体凝血酶组合物的未满足需求。另外，本发明提供了包含液体凝血酶的即用型药物液体组合物，与包含凝血酶的药物冻干组合物相比，该即用型药物液体组合物是有利的，因为它们满足了简便而快速地施用储存稳定的液体凝血酶组合物的未满足需求。术语“药物液体”是指包含具有治疗或药用价值的物质的任何液体。
在某个方面，本发明提供了一种止血试剂盒，该止血试剂盒包括：
a.包含具有超过50％体积/体积甘油的液体凝血酶组合物的容器；以及
b.包含明胶的容器。
在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。
在止血试剂盒的一些实施方案中，凝血酶溶液包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在止血试剂盒的一个实施方案中，凝血酶溶液包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的任何值和范围。
在止血试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还包含钙。在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物还包含一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含1IU/ml与约5,000IU/ml之间的凝血酶。在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约1IU/ml至约2,000IU/ml或100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。在止血试剂盒的一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。试剂盒还可包含使用说明。
根据另一个方面，本发明提供了一种包含凝血酶、明胶和甘油的止血组合物，并且甘油的比率为高于30重量％的固体。
在止血组合物的一些实施方案中，组合物还包含钙。在止血组合物的一些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。在止血组合物的一些实施方案中，组合物包含1IU/ml与约2,500IU/ml之间的凝血酶或约100IU/ml至约2,000IU/ml的凝血酶。在止血组合物的一些实施方案中，组合物用于辅助止血的局部应用。
根据进一步的方面，本发明提供了一种用于大规模生产包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物的方法(“大规模生产方法”)，该方法包括以下步骤：
a.通过将凝血酶与甘油溶液混合以获得具有超过50％体积/体积甘油的溶液来制备凝血酶溶液；
b.将所获得的凝血酶溶液加热到至少约40℃；以及
c.通过使凝血酶溶液穿过孔径为约0.22μm或更小的至少一个过滤器来对凝血酶溶液进行灭菌，
从而获得包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
在大规模生产方法的一些实施方案中，该方法还包括通过热灭活来执行的病毒灭活的步骤。在大规模生产方法的一些实施方案中，凝血酶溶液包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在该方法的一个实施方案中，凝血酶溶液包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％体积/体积甘油，包括其间的任何值和范围。
在大规模生产方法的一些实施方案中，凝血酶溶液还包含钙。在大规模生产方法的一些实施方案中，凝血酶溶液还包含一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。
在大规模生产方法的一些实施方案中，凝血酶溶液包含1IU/ml与约2,500IU/ml之间的凝血酶或约100IU/ml至约2,000IU/ml的凝血酶。在大规模生产方法的一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。在大规模生产方法的一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。
根据又一个方面，本发明提供了一种通过本发明的方法获得的包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
根据另外的方面，本发明提供了一种包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，组合物包含约60％至约100％体积/体积甘油。在一些实施方案中，无菌液体凝血酶组合物包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在无菌液体凝血酶组合物的一个实施方案中，凝血酶溶液包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％体积/体积甘油，包括其间的任何值和范围。
在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，组合物还包含钙。在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，组合物包含1IU/ml与约2,500IU/ml之间的凝血酶或约100IU/ml至约2,000IU/ml的凝血酶。在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。在无菌液体凝血酶组合物的一些实施方案中，组合物还包含明胶。
根据又一个方面，本发明提供了一种包含凝血酶、明胶和浓度范围高于30重量％的固体的甘油的止血组合物。
根据又一个方面，本发明提供了一种包含凝血酶和超过50％体积/体积甘油的封闭剂制剂。在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在封闭剂制剂的一个实施方案中，制剂包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的任何值和范围。
在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂包含约60％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂还包含钙。在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂包含1IU/ml与约2，500IU/ml之间的凝血酶或约100IU/ml至约2，000IU/ml的凝血酶。
根据又一个方面，本发明提供了一种包含凝血酶、明胶和浓度范围高于30重量％的固体的甘油的无菌止血组合物。在无菌止血组合物的一个实施方案中，组合物包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％体积/体积甘油，包括其间的任何值和范围。
根据又一个方面，本发明提供了一种包含凝血酶和超过50％体积/体积甘油的无菌封闭剂制剂。
在无菌封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂包含65％至约100％、65％至约100％体积/体积甘油或80％至约100％体积/体积甘油。在无菌封闭剂制剂的一个实施方案中，制剂包含超过60％、超过65％、超过70％或超过75％体积/体积甘油，诸如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％体积/体积甘油，包括其间的任何值和范围。
在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂还包含钙。在封闭剂制剂的一些实施方案中，制剂包含1IU/ml与约2,500IU/ml之间的凝血酶或约100IU/ml至约2,000IU/ml的凝血酶。
在一些实施方案中，封闭剂制剂包含纤维蛋白原组分。
在本文所提供的试剂盒、组合物、制剂和方法的任何方面的一些实施方案中，试剂盒、组合物和/或制剂分别为至少双组分试剂盒、双组分组合物和双组分制剂。在双组分组合物和双组分制剂的任何方面的一些实施方案中，这些组分之一包括纤维蛋白原。
例如，试剂盒可使用施用装置来施用并且可用于施用至少双组分物质(例如，纤维蛋白封闭剂诸如EVICEL)的若干且连续的注射。在一个实施方案中，施用装置在移动该装置时实现了固定剂量的混合组分在组织的2-D表面上的多次注射。在一个实施方案中，施用装置具有注射针，在完成注射之后该注射针任选地自动从患者的皮肤回缩而不必施用人员从注射表面向上提起该装置。在一个实施方案中，试剂盒可用于在其任何方面的任何实施方案中施用具有纤维蛋白原组分和凝血酶组分的纤维蛋白封闭剂。
如本文和本领域中所用，术语“纤维蛋白原”是指血凝块基质的前体蛋白。纤维蛋白原具有约340,000道尔顿的分子量并且由通过二硫键连接在一起的3对不同多肽链Aα、Bβ和γ组成。通常，纤维蛋白原具有三结节结构：由超螺旋的α-螺旋连接的两个相同D末端球状结构域和中心E球状结构域。
在一些实施方案中，纤维蛋白原是或源于纤维蛋白原浓缩物。在一些实施方案中，纤维蛋白原是血源性纤维蛋白原浓缩物。
在本文通篇中，术语“源于”或“来源于”可互换使用并且是指相关组分的起源或来源，该相关组分可包括天然存在、重组、处理、未纯化或纯化的分子(例如，相关蛋白)。在一些实施方案中，纤维蛋白原包括冷沉淀的纤维蛋白原。在一些实施方案中，纤维蛋白原源于冷沉淀的纤维蛋白原。在一些实施方案中，纤维蛋白原溶液组分和凝血酶溶液以1∶2至2∶1例如约1∶1的比率(体积/体积)组合。
在一些实施方案中，冷沉淀的纤维蛋白原被认为是血浆的生物活性组分(BAC)。在一些实施方案中，BAC是病毒灭活的。在一些实施方案中，BAC是包含抗纤溶剂(诸如但不限于氨甲环酸)的生物活性组分。包含氨甲环酸的非限制示例性BAC是名称为“Quixil”(以色列的奥姆里克斯公司(Omrix，Israel))的产品。这被视为第二代BAC，并且在本领域中被称为“BAC2”。在BAC2制备期间，去除纤溶酶原(纤溶酶的酶前体，其分解纤维蛋白原和纤维蛋白)。BAC的非限制性制备路线描述于US 6,121,232和/或WO 1998033533中，这些专利的内容以引用方式并入。在一些实施方案中，BAC组合物包含一种或多种抗纤溶剂(例如，氨甲环酸)和精氨酸盐酸盐。在一些实施方案中，BAC中的抗纤溶剂(诸如氨甲环酸)的浓度在约80mg/ml至约110mg/ml的范围内。在一些实施方案中，根据EP 534178的公开内容来制备BAC2，该专利的内容以引用方式并入本文。例如，BAC2可由浓缩的冷沉淀物制备，然后例如通过溶剂洗涤剂处理和巴氏消毒进行病毒灭活。鉴于从冷沉淀物中去除了纤溶酶/纤溶酶原，因此无需添加抗纤溶剂，诸如氨甲环酸、抑肽酶等。因此，在一些实施方案中，BAC2不包含氨甲环酸。
若干止血材料(诸如
Figure BDA0002943753790000071
)可有效地与所公开的试剂盒和/或凝血酶制剂联合使用。例如，可在使用之前将所公开的凝血酶溶液添加到明胶，例如可流动的明胶基质。一旦明胶与凝血酶制剂混合，就可将适当的施用装置尖端附接到注射器以便产品输送到出血部位或组织上，或在可接近毛细血管和小静脉的渗血和小出血的任何时候作为止血和控制出血的辅助手段。
术语“组织”是指联合执行特定功能的一群细胞和/或细胞组分。组织中的细胞可全为一种类型或超过一种类型。组织可为人工组织，细胞在其中生长成以与生物活体中的组织类似的方式发挥功能。组织可为人体组织或动物组织。
可通过组合(例如，在混合时)这两种组分，由此获得组合物来提供双组分组合物，并且同时或之后，将所获得的组合物直接施用到需要减少或防止出血的部位。在一些实施方案中，通过将组合物喷洒或滴到待治疗的区域上来协助组合物的施用。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实施方案的操作或试验，但下文描述的是示例性方法和材料。如发生矛盾，应以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法和示例仅为示例性的，而非旨在进行必需的限制。
附图说明
图1示出了曲线图，其呈现了在50℃下持续24小时(h)时各种甘油浓度对凝血酶活性的影响。将凝血酶悬浮于双蒸水(DDW)中的若干不同浓度的甘油中并且在50℃下放置24小时。在1、4.5、8和24小时测量活性。带圆点的灰色实线：0％甘油；黑色实线：50％体积/体积甘油；灰色虚线：60％体积/体积甘油；点划线：80％体积/体积甘油；n＝4。
图2A至图2B示出了条形图，其呈现了在25℃和4℃下各种甘油浓度对凝血酶活性的影响。将凝血酶悬浮于DDW中的若干不同浓度的甘油中并且在25℃下放置6个月并在4℃下放置12个月。图2A呈现了在25℃下在3和6个月时测得的活性。图2B呈现了在4℃下在12个月时测得的活性。本文中和下面呈现的条形图中的顶部条形表示标准偏差。
图3示出了曲线图，其呈现了在100℃下各种甘油浓度对凝血酶活性的影响(在2分钟后测量)。将凝血酶悬浮于DDW中的若干不同浓度的甘油中并且放置在100℃下。在2分钟后测量活性。带圆点的黑色实线：50％体积/体积甘油；灰色实线：60％体积/体积甘油；点划线：80％体积/体积甘油；n＝2。
图4示出了条形图，其呈现了猪穿孔活检模型中各种甘油浓度对体内凝血酶活性的影响。将凝血酶悬浮于DDW中的所指示的浓度的甘油中；并且用于代替明胶试剂盒中的重构凝血酶来制备包含各种甘油浓度下的凝血酶的明胶糊剂。根据止血所需的棉塞数来测量凝血酶活性；从左边起：具有0％体积/体积甘油中的凝血酶的明胶糊剂；具有50％体积/体积甘油中的凝血酶的明胶糊剂；具有60％体积/体积甘油中的凝血酶的明胶糊剂；以及具有100％体积/体积甘油中的凝血酶的明胶糊剂；n＝5。
具体实施方式
凝血酶广泛用作控制出血的止血材料；然而，其是自动催化酶，因此在其液体形式下不稳定。随着凝血酶浓度增加和/或随着温度上升，液体凝血酶稳定性的持续时间减少。因此，凝血酶的商业制品作为粉末或冷冻液体存在。这具有一些缺点，包括相对较长的制备时间，因为必须使粉末凝血酶重构并且必须使冷冻凝血酶解冻；因需要在低温下运输而带来的运输限制；以及在制备需要粉末凝血酶的重构时潜在受损的无菌性。
如本文所用，术语“粉末”是指以通常在0.1微米至1000微米范围内的小粒度为特征的固体的多个颗粒。
术语“固体”表征化合物或组合物在室温(例如25℃)和大气压(760mmHg)下的状态，即，在储存期间保持其形态的高稠度的化合物或组合物。在本申请中该术语还涉及非流体颗粒或溶解的物质。与“液体”化合物和组合物相反，固体不在其自身重量下流动。
如本文所用，“凝血酶”表示因凝血酶原(因子II)的蛋白水解裂解产生的活化酶。凝血酶可通过本领域已知的多种生产方法来产生，并且包括但不限于重组凝血酶和血浆源性凝血酶。人凝血酶是由通过二硫键连接的两个多肽链构成的295个氨基酸的蛋白质。人和非人(例如，牛)凝血酶均可在本公开的范围内使用。
本发明中使用的凝血酶的起源可来自一个或若干个来源，包括但不限于：重组细菌和/或细胞(Vu等人，2016年，J.Viet.Env.，8(1)：21-25)、全血(从或不从若干献血汇集)和/或血级分(可从若干献血汇集，例如血浆)。凝血酶可由诸如强生公司(Johnson andJohnson)、百特公司(Baxter)和杰特贝林公司(CSL Behring)之类的制造商以独立产品的形式(例如
Figure BDA0002943753790000091
)或以产品的组分的形式(例如，
Figure BDA0002943753790000092
Figure BDA0002943753790000093
等)提供。
本发明人已令人惊讶地发现，凝血酶溶液中的高浓度的甘油(高于50％体积/体积)使得凝血酶例如在升高的温度下的稳定性增加以及体内凝血酶活性增强。
如图1所示，虽然在没有甘油的情况下制备的凝血酶在50℃下24小时后失去约90％活性，但在有50％甘油或更多的情况下凝血酶的活性完全保持。另外，图3示出了在100℃下2分钟后(通常这会完全降低酶活性)，在有50％甘油的情况下保持75％活性，并且在有60％或80％甘油的情况下保持至少90％活性。升高的温度下的该增加的稳定性允许以之前不可能的方式使用液体凝血酶，诸如在液体状态下运输、处理和储存而不需要冷藏。此外，以下实施例3证实甘油(通常被认为太粘而不能过滤灭菌)可在40℃和50℃的温度下有效地过滤。合并以上结果允许如本文所述的那样通过升高过滤温度来对包含高甘油浓度(例如，高于60重量％)的溶液中的液体凝血酶进行过滤灭菌。
术语“过滤”及其任何语法变化意指拦截、阻碍、阻止或干扰流体(例如，液体流)中的颗粒的穿过。
然而，潜在问题是粘性介质(诸如甘油)可干扰凝血酶与其靶分子的相互作用，因此影响所形成的凝块的形成、动力学或质量。基于此，本领域技术人员不会设想到将凝血酶与高甘油浓度组合。
然而，本发明人令人惊讶地发现，该情况在体内不同。图3描述了使用包含甘油的液体凝血酶溶液制备的明胶的体内活性。明胶试剂盒
Figure BDA0002943753790000102
包含明胶和凝血酶粉末，它们刚好在施用在出血部位中/上之前混合在一起。由于凝血酶以粉末状态提供，因此其需要从业者加以重构。
与上文所讨论的粘度的问题相反，已发现用甘油重构的凝血酶中的增加的甘油浓度对应于制剂减少出血的增强的能力，如图4所示。另外，本发明的液体凝血酶制剂的重要优点是节省重构步骤，从而避免麻烦并且为从业者节省时间以及使污染的风险最小化。
术语“液体凝血酶组合物”、“液体凝血酶溶液”、“凝血酶溶液”和“液体凝血酶制剂”可在本文通篇中互换使用，并且是指包含凝血酶的液体组合物。在一些实施方案中，“液体凝血酶组合物”是水溶液，即包含1％至小于50％水(％体积/体积)。
术语“液体”是指可流动，没有固定形状，并且不是固体或气体的物质。
因此，本发明的稳定的液体凝血酶组合物可用于替代粉状或冷冻凝血酶作为止血材料。本发明的液体凝血酶可作为以下形式提供：独立凝血酶溶液，例如无菌且稳定的独立凝血酶溶液；或试剂盒(诸如
Figure BDA0002943753790000101
试剂盒中)的一部分；或纤维蛋白封闭剂试剂盒，而不是这些试剂盒中的凝血酶组分。
因此，本发明在一个方面提供了一种止血试剂盒，该止血试剂盒包括包含具有超过50％体积/体积甘油的液体凝血酶组合物的容器；以及包含明胶的容器。本发明还提供了一种止血试剂盒，该止血试剂盒包括包含具有超过50％体积/体积甘油的储存稳定的无菌液体凝血酶组合物的容器；以及包含明胶的容器。
术语“储存稳定的”应当理解为是指任选地存在于容器(例如，小瓶)中并且在预先选择的储存条件(参见下文)下稳定的制剂、组合物，所述预先选择的储存条件包括预先选择的储存温度、预先选择的制剂的物理状态(例如，流体/液体)。稳定性可通过本领域已知的方法来确定，例如通过在预先选择的储存条件下(例如，在制剂呈液体形式时)测试制剂中的可见聚集和/或纤维蛋白凝块的不存在。此外，根据本公开，当提及稳定的封闭剂制剂时，其应当理解为不论制剂的储存条件如何，在使用时都具有有效凝血时间的制剂，例如，不论储存在室温(例如，8至40℃)还是更低的温度(例如，低于8℃)，封闭剂制剂都在基本上相同的时间段凝结。
在一些实施方案中，预先选择的储存条件包括在室温(例如，10至30℃)下储存并且封闭剂制剂稳定至少5分钟，有时稳定至少15分钟、或至少1小时、至少一天、至少2、3、4、5、6或甚至7天，有时稳定例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或甚至24个月或更久，包括其间的任何值和范围。
在一些实施方案中，预先选择的储存条件包括在低温(例如，2至10℃)下储存并且封闭剂制剂稳定至少5分钟，有时稳定至少15分钟、或至少1小时、至少一天、至少2、3、4、5、6或甚至7天，有时稳定例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或甚至24个月或更久，包括其间的任何值和范围。
术语“容器”可指可包含例如液体的任何通用结构，诸如器皿或小瓶。
在一个实施方案中，该试剂盒储存在室温下，诸如在8至40℃范围内的温度下。
在另一个方面，本发明提供了一种用于储存在2至8℃下的止血试剂盒，该止血试剂盒包括包含液体凝血酶组合物的容器，该液体凝血酶组合物包含超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％或超过90％体积/体积甘油，例如60％至100％或80％至100％体积/体积甘油；以及包含明胶的容器。
本发明的止血试剂盒可为用于减少、防止或停止例如开放性伤口中的血流的试剂盒，并且其可用于在手术期间诸如在外科手术例如腹腔镜外科手术、神经外科手术、腹部外科手术、心血管外科手术、胸外科手术、头颈外科手术、盆腔外科手术及皮肤和皮下组织手术期间减少、防止或停止血流。该试剂盒可用于减少或防止来自皮肤或内部器官中的血流。
术语“液体溶液”还涵盖粘稠溶液。术语“粘稠溶液”是指具有增加的流动阻力而又能够流动的溶液，该溶液通常但不仅仅具有大于约1厘泊单位且小于约10,000厘泊单位的粘度。
该试剂盒的液体凝血酶组合物可为无菌的并且从大规模生产方法获得，该大规模生产方法包括以下步骤：
a.通过将凝血酶与甘油溶液混合以获得具有超过50％体积/体积甘油的溶液来制备凝血酶溶液；
b.将所获得的凝血酶溶液加热到至少40℃；以及
c.通过使所述凝血酶溶液穿过孔径为0.22μm或更小的至少一个过滤器来对所述凝血酶溶液进行灭菌，
从而获得包含超过50％体积/体积甘油的液体无菌凝血酶溶液。
如本文所用，术语“大规模”涉及产生至少1升通常包含至少约400IU凝血酶的溶液的过程。
本发明的明胶源可为合成的(例如，重组明胶)或来源于动物诸如猪。明胶源可为无菌的并且可呈不同形式，诸如糊剂、粉末或海绵。如本文所用，术语“糊剂”涉及组合物在大约室温的至少一个温度下的稠度，并且可指固体颗粒的流体混合物。
本发明中使用的明胶可在其使用之前交联。明胶的交联可通过本领域所公开的任何数量的合适方法执行。例如，明胶可通过加热到150℃并持续3小时来交联(Nagura等人，2002年，Polymer Journal，34：761-766)。
在一些实施方案中，明胶溶解于溶剂中而形成明胶糊剂。在一些实施方案中，明胶糊剂包含甘油。在一些实施方案中，明胶糊剂包含超过30重量％固体的甘油。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物是无菌的。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％体积/体积甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％体积/体积甘油，包括其间的任何值和范围。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含100％体积/体积甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约50％与约80％体积/体积之间的甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约60％与约80％体积/体积之间的甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约60％与约100％体积/体积之间的甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约70％与约100％体积/体积之间的甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含约80％与约100％体积/体积之间的甘油。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过65％、超过67％或超过70％且至多约100％(按溶剂体积计)％体积/体积甘油。
除非另有说明，否则在甘油的上下文中将甘油浓度定义为“％体积/体积”或“％”涉及液体凝血酶组合物中的甘油体积占溶剂(例如，水)的总体积的百分比。如本文所用，术语“溶剂”是指溶解或分散另一种物质而不改变其物理状态的材料。
钙是凝血级联中的重要成分。因子XIII活化为因子XIIIa需要钙，该因子XIIIa交联并稳定纤维蛋白以生成不溶凝块。
因此，在一些实施方案中，其实施方案中的所公开的试剂盒和/或组合物还包含钙。与本发明一起使用的钙可呈盐(例如，氯化钙盐)的形式。另选地，可使用附加盐，诸如乙酸钙和/或柠檬酸钙。在该试剂盒中，可在液体凝血酶组合物中提供钙盐。另选地，可在该试剂盒中的单独容器中提供钙盐，或可在该试剂盒中的包含明胶组分的相同容器中提供钙盐。
本文所公开的任何方面的液体凝血酶组合物可包含以下赋形剂中的一者或多者：钙、白蛋白、糖、糖衍生物、多元醇、乙酸盐、柠檬酸盐、氨基酸、聚乙二醇、氯化钠和水。钙源可为氯化钙并且可在2mM至60mM的浓度范围内。白蛋白可在0.05％至1％(重量/体积)的浓度范围内或在0.5％至1％(重量/重量)的范围内。糖源可为蔗糖并且可处于5g/l浓度。糖衍生物源可为葡糖酸。多元醇源可为甘露醇并且可处于2％(重量/重量)浓度。乙酸盐源可为乙酸钠并且可处于10mM浓度。柠檬酸盐源可为柠檬酸钠。氨基酸可为组氨酸并且可处于10mM浓度。聚乙二醇源可为PEG-3350并且可例如处于0.03％浓度。氯化钠可在50mM至175mM的范围内。
凝血酶溶液可处于约5.0至8.5的pH范围。
如本文所用，术语“赋形剂”表示例如为提供所需的稠度或稳定效应而向药物组合物添加的非治疗剂。
凝血酶溶液的示例包括但不限于：在6.8至7.2的pH下的800IU至1200IU的凝血酶/ml、20mM乙酸钠、40mM CaCl2、110mM NaCl、0.5％重量/重量人白蛋白和2％重量/重量甘露醇；氯化钙(40μmol/m1)、白蛋白(人)、氯化钠、注射用水；500IU/ml的蛋白凝血酶、1％白蛋白、10mM乙酸钠和75mM氯化钠；500IU/ml的凝血酶、2％甘露醇、10mM组氨酸、0.03％的PEG-3350和175mM的氯化钠；在5.0与8.5之间的pH下的500IU的凝血酶/ml、0.1％与1％(重量/体积)之间的浓度的人白蛋白以及0.05M的浓度的氯化钠。
白蛋白为例如人白蛋白。然而，白蛋白也可来自非人来源或为重组白蛋白。在本文所公开的任何方面的一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含注射用水。
因此，在一些实施方案中，液体凝血酶组合物还包含选自但不限于氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠的赋形剂。
液体形式的浓缩纯化凝血酶在延长的储存期间表现出活性降低，这主要是由于自催化裂解。例如，1000国际单位(IU)/ml浓度的水性液体凝血酶可在室温下发生自催化裂解，从而引起凝血酶活性的显著损失。
在一些实施方案中，凝血酶溶液或组合物包含1至10,000或100至10,000IU凝血酶/ml，诸如100至4000或100至2500IU凝血酶/ml。如本文通篇中所用，术语“IU”表示“国际单位”，并且可相对于用于效能浓度测量的内参标准通过凝血测定来确定，该内参标准已相对于例如用于凝血酶的世界卫生组织(WHO)第二国际标准01/580(World HealthOrganization(WHO)Second International Standard for Thrombin，01/580)进行校准。单位(U)等同于国际单位(IU)。
在商业制品中，凝血酶通常以约400IU/ml至1,200IU/ml使用。
因此，在一些实施方案中，本发明的液体凝血酶组合物包含1IU/ml与2,500IU/ml之间的凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含100IU/ml与2,000IU/ml之间的凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含400IU/ml与1,200IU/ml之间的凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含800IU/ml与1,200IU/ml之间的凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含400IU/ml与800IU/ml之间的凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含400IU/ml与600IU/ml之间的凝血酶。
在一些实施方案中，凝血酶的浓度在约1μM与约20μM之间。在一些实施方案中，凝血酶的浓度在约5μM与约15μM之间。在一些实施方案中，凝血酶的浓度在约5μM与约10μM之间。
如上所讨论，凝血酶是自动催化酶，因此在液体形式下不稳定。当凝血酶浓度或温度升高时，稳定性降低。令人惊讶的是，包含超过50％甘油的本发明的液体凝血酶组合物在如本文所述的极高温度下稳定，这有利于通过加热进行灭菌、病毒灭活、在不冷藏的情况下运输、储存和处理液体凝血酶。
如本文所用，术语“稳定性”或“稳定的”涉及凝血酶在暴露于一定温度后的活性。一般来讲，在一定温度下一定持续时间之后，如果凝血酶具有至少70％活性，则液体凝血酶组合物被定义为稳定的。
因此，在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少80％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少90％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少90％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约50℃的温度下24小时之后具有至少90％活性。
现在参见图2A至图2B，其呈现了在各种温度下各种甘油浓度对凝血酶活性的影响。因此，在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。
所谓“至少6个月”意指例如6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月或更久，包括其间的任何值和范围。
所谓“至少50％”意指例如50％、55％、60％、65％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其间的任何值和范围。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约25℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含超过80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约0℃的温度下至少6个月之后具有至少80％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含超过50％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少80％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少80％活性。
在一些实施方案中，液体凝血酶组合物包含至少60％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少90％活性。在一些实施方案中，凝血酶组合物包含至少80％甘油，并且液体凝血酶组合物中的凝血酶在约100℃的温度下2分钟之后具有至少90％活性。
在一些实施方案中，所公开的液体凝血酶组合物中的凝血酶在室温(例如，约25℃)下24个月之后具有至少70％活性。在一些实施方案中，所公开的液体凝血酶组合物中的凝血酶在室温下24个月之后具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。在一些实施方案中，本发明的液体凝血酶组合物中的凝血酶在2至8℃的温度下24个月之后具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％活性。在一些实施方案中，所公开的液体凝血酶组合物中的凝血酶在2至8℃的温度下24个月之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，本发明的液体凝血酶组合物中的凝血酶在-20℃下2年之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，本发明的液体凝血酶组合物中的凝血酶在-20℃下3年之后具有至少70％活性。
在一些实施方案中，止血试剂盒包括包含液体凝血酶组合物的注射器和包含明胶的注射器。在一些实施方案中，试剂盒中的至少一个容器是预填充的注射器。在一些实施方案中，除了试剂盒的容器之外还提供了注射器。在一些实施方案中，容器为特定类型，诸如小瓶或施用装置。
上述试剂盒可包含凝血酶组分和明胶组分，它们在施用之前混合在一起。例如，由外科医生或另一从业者在需要减少出血时(例如在手术期间)混合这些组分。该试剂盒的这些组分的混合形成止血组合物。
因此，在另外的方面，本发明提供了一种包含凝血酶、明胶和甘油的止血组合物，该甘油在止血组合物中高于30％的固体的范围内。
在一些实施方案中，止血组合物包含超过31重量％、超过35重量％、超过40重量％、超过45重量％、超过50重量％、超过55重量％、超过60重量％、超过65重量％、超过70重量％、超过75重量％、超过80重量％、超过85重量％、超过90重量％、超过95重量％或接近100重量％的固体的甘油。
在一些实施方案中，本文所述止血组合物中的主要固体是明胶。
在进一步的方面，本发明提供了用于辅助止血的局部应用的本发明的止血组合物。
止血(hemostasis或haemostasis)是伤口愈合的第一阶段。其是使出血停止的过程。所谓“辅助止血”意指帮助减少或停止出血。
在另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含凝血酶和明胶、高于30重量％的固体的甘油以及药学上可接受的赋形剂。
例如用于药物组合物的赋形剂在上文有所描述，并且还可包括任何药学上合适的赋形剂，诸如氯化钙、人白蛋白、甘露醇、乙酸钠、氯化钠、柠檬酸钠二水合物、葡糖酸盐缓冲液、蔗糖、甘氨酸、乙酸钠、组氨酸和PEG。
用于治疗应用的任何制品必须是无菌的。尤其是在处理血液制品时，无菌问题至关重要，特别是病毒灭活的问题。一般来讲，病毒灭活可通过任何方法来执行，包括例如溶剂洗涤剂、热灭活、辐照和纳米过滤或它们的任何组合。通常，病毒灭活标准要求使用两种不同方法。另外，美国食品药品监督管理局(FDA)无菌标准要求过滤。
然而，由于液体凝血酶不稳定(尤其是在高温下)，使用热灭活或辐照对液体凝血酶进行灭菌是不切实际的，原因是这些方式对凝血酶活性有负面影响。另一方面，包含高浓度的甘油并因此更稳定的凝血酶的制品在室温下太粘而不能通过过滤进行灭菌。包含甘油的凝血酶制品不仅在高温下稳定，而且与不包含甘油的制品相比具有增强的体内活性，本发明的这一令人惊讶的发现有利于通过高温下(在高温下甘油不太粘)过滤进行灭菌。这允许大规模生产包含甘油的无菌且稳定的液体凝血酶组合物。另外，包含甘油的液体凝血酶在升高的温度下的稳定性还允许通过热处理进行病毒灭活。
如本文所用，术语“无菌的”意指具有低生物负荷，是有效无菌的，例如不含微生物(例如，细菌和病毒)。灭菌是将生物负荷降低到有效无菌水平的过程。无菌液体通常被定义为经历无菌过滤的液体。因此，在某个实施方案中，无菌凝血酶溶液或无菌液体凝血酶组合物是已通过无菌过滤(例如，通过穿过0.22μm或更小的过滤器)来灭菌的凝血酶溶液或液体凝血酶组合物。
如上所讨论，目前还没有大规模制备稳定且无菌的液体凝血酶组合物的方法。这是由于一方面凝血酶缺乏稳定性(尤其是在高温下)，另一方面甘油具有高粘度，这可能使得所需的过滤步骤很困难且耗时。包含甘油的液体凝血酶制剂不仅在高温下稳定，而且表现出增强的减少出血的能力，这一令人惊讶的发现为大规模制备无菌液体凝血酶组合物铺平了道路，该大规模制备包括在升高的温度下(在升高的温度下甘油不太粘)过滤。
术语“制品”是指适用于治疗应用的生理上可接受的制品。
在某方面，提供了一种包含凝血酶和超过50％体积/体积甘油的封闭剂制剂。
在本发明的上下文中，术语“封闭剂制剂”应当理解为单组分/一组分粘合剂/胶粘剂/止血剂，该制剂具有这样的成分，其在与组织和/或血液接触(例如，接近组织)时作出反应而随后形成凝块，充当组织粘合剂并由此防止、减少或停止血流，接合结构和/或封闭生理渗漏，例如脑脊液(CSF)、淋巴、胆汁、胃肠(GI)内容物的渗漏、肺的空气渗漏等。在一些实施方案中，封闭剂制剂还包含治疗剂，使得在身体中形成的凝块自然降解时，该治疗剂释放。治疗剂可以是(而不限于)药物(诸如抗生素、止痛药、抗炎药、抗癌药等)、细胞，该细胞包括例如任何类型的干细胞，例如来自人或其它来源的胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、多能干细胞(iPSC)等。
纤维蛋白封闭剂还可能包含促进凝块的形成的组分，诸如Ca、因子VIII、纤连蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(vWF)，这些组分可作为单独组分提供或与液体组分一起配制。
有时，封闭剂制剂被称为“基于凝血酶的封闭剂”，并且在本文所公开的上下文中，其应当理解为形成或意指以下物质的制剂：纤维蛋白胶、纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白粘合剂、纤维蛋白膜、纤维蛋白网、纤维蛋白晶格、纤维蛋白网孔、纤维蛋白网格和纤维蛋白凝胶。
可使用分配器将其任何方面的所公开的制剂(例如，液体封闭剂制剂)施用到组织上，该分配器在有或没有空气喷雾(例如，通过滴落)的情况下将封闭剂直接喷射到组织或其它基底或工作表面上。在本发明的一个实施方案中，以15PSI的空气压力喷射封闭剂。美国专利4,631,055、4,846,405、5,116,315、5,582,596、5,665,067、5,989,215、6,461,361及6,585,696、6,620,125和6,802,822以及PCT公布WO 96/39212、WO 2007/059801和WO 2010/095128中示出了组织封闭剂分配器的示例，这些专利均以引用方式并入本文。
上文所述的液体凝血酶组合物和无菌液体凝血酶组合物的实施方案并入到所公开的封闭剂制剂的该方面。
因此，在一些实施方案中，封闭剂制剂包含凝血酶和超过50％体积/体积甘油。在一些实施方案中，封闭剂制剂包含约60％至约100％体积/体积甘油。在一些实施方案中，封闭剂制剂还包含钙。在一些实施方案中，封闭剂制剂包含约1IU/ml与约5,000IU/ml之间、约1IU/ml与约2,000IU/ml之间或约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
因此，在进一步的方面，本发明提供了一种用于大规模生产包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过将凝血酶与甘油溶液混合以获得具有超过50％体积/体积甘油的溶液来制备凝血酶溶液；
b.将所获得的凝血酶溶液加热到至少40℃；以及
c.通过使所述凝血酶溶液穿过孔径为0.22μm或更小的至少一个过滤器来对所述凝血酶溶液进行灭菌，
从而获得包含超过50％体积/体积甘油的液体无菌凝血酶溶液。
如本文所用，术语“大规模”涉及产生至少1升通常包含至少约400IU凝血酶的溶液的过程。
在一些实施方案中，将该溶液加热到至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃或约100℃。
在一些实施方案中，过滤器可为疏水性过滤器。
在一些实施方案中，使用超过一个过滤器。在一些实施方案中，使用至少两个过滤器。在一些实施方案中，使用至少三个过滤器。
通常，过滤是无菌过滤，其被定义为在经测试具有至少107个生物体/cm2有效过滤面积时不允许微生物通过的过滤过程。此类过滤器通常具有0.22μm或更小的额定孔径(参见2004FDA根据无菌工艺生产的无菌药物产品的工业指南-现行良好生产规范(2004FDAGuidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice))。
可在过滤过程之前和/或期间对凝血酶溶液和/或过滤元件(诸如过滤器)进行温度控制。可通过各种装置(诸如受控循环温度浴)执行温度控制。
为了放大到更大容量(诸如几千克滤液)，可使用膜滤芯(诸如颇尔公司(Pall
Figure BDA0002943753790000221
)的Supor EX级ECV，规格5″部件号AB05UECV2PH4、10″AB1UECV7PH4、20″AB2UECV2PH4或30″AB3UECV2PH4)。在示例性实施方案中，使用以下实施例3中提及的MinikleenpakTM囊式滤器(表面积0.023m2)，这是由于其具有滤液与过滤器表面积之间的已知比率，可通过使用如上提及的滤芯以更大规模重复该已知比率。
应当理解，包含高甘油含量的液体凝血酶制剂还在升高的压力下更稳定。该特征在系统中压力随机升高(这通常导致凝血酶活性丧失)时或在需要升高压力以减少处理时间时可派上用场。
可将包含待过滤的溶液的器皿连接到能量源，该能量源可推动该液体穿过该过滤器。该能量源可为压缩空气。可通过监测和/或控制能量输出的一个或多个元件将该器皿连接到该能量源。此类元件可为压力阀或压力计。可限制允许施用在凝血酶溶液上的能量的量。该限制可为凝血酶溶液上的至多1巴的压力。
因此，在一些实施方案中，在约1巴的压力下进行过滤。在一些实施方案中，在高于1巴的压力下进行过滤。在一些实施方案中，在高于1.5巴、高于2巴、高于2.5巴、高于3巴、高于3.5巴、高于4巴、高于4.5巴或高于5巴的压力下进行过滤。
在一些实施方案中，过滤速率小于1小时/1kg溶液。在一些实施方案中，过滤速率小于30分钟/1kg溶液。在一些实施方案中，过滤速率在约20与约30分钟/1kg溶液之间。
在谈及人源产品的风险时，病毒安全性是关键问题。由于可能在人源产品的过程中遗留病毒，因此这些产品必须经历病毒灭活步骤以确保其安全性。传统上，独立地使用两种病毒灭活方法来确保病毒潜在载量的有效降低。下面描述所使用的病毒灭活方法的一些示例：
通过纳米过滤进行的病毒灭活-该方法可利用尺寸排阻来滤除包膜病毒和无包膜病毒。所使用的过滤器通常具有小于70nm的孔径，诸如Planova 20N、Planova 35N、Viresolve 70、Viresolve 180。
通过溶剂洗涤剂(S/D)进行的病毒灭活-该方法可利用洗涤剂和/或溶剂来消除存在于包膜病毒或脂质被膜病毒中的脂质。所使用的洗涤剂和/或溶剂诸如Triton X-45、Triton X-100或聚山梨酯80、磷酸三正丁酯(TnBP)、磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯使包膜病毒或脂质被膜病毒失活。传统上，10mg/ml至100mg/ml的溶剂洗涤剂以5-8范围内的pH水平在2-37℃范围内的温度下使用30分钟至24小时。在用S/D处理该产品之后，通常从该产品去除S/D。所使用的洗涤剂和溶剂的组合和浓度在本领域中是已知的。例如，可使用＞0.1％TnBP和＞0.1％Triton X-100的组合。在另一个示例中，可使用1％Triton X-100和0.3％TnBP的组合。
通过热灭活进行的病毒灭活-热灭活(也称为巴氏消毒)利用高温，该高温可伤害若干类型的病原体，包括包膜病毒和无包膜病毒。巴氏消毒可通过通常对温度水平与暴露时间加以权衡的若干技术来实现。例如，温度可为60℃并持续10小时的时间。在另一个示例中，使用高热瞬时技术，例如在100℃下持续小于2秒的时间。
然而，至少对于通过加热进行的病毒灭活而言，由于液体凝血酶缺乏稳定性，因此这种选项一直不能用于液体凝血酶。但是，鉴于本公开中描述的发现，所公开的包含高甘油含量的液体凝血酶组合物可经历热灭活。
因此，在某个实施方案中，本发明的用于大规模生产包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物的方法另外包括通过热灭活进行病毒灭活的步骤。
在一些实施方案中，可在约60至100℃下进行热灭活。在一些实施方案中，可在约60℃下进行约10小时的热灭活。在一些实施方案中，可在约100℃下进行小于2秒的热灭活。
在进一步的方面，本发明提供了一种通过上述方法获得的包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
在又一个方面，本发明提供了一种包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
本发明的液体凝血酶组合物可用作减少或停止出血的独立产品。其还可用作试剂盒的一部分以替换冷冻或粉状凝血酶或作为其它止血剂的补充。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗伤口的方法，该方法包括将其任何方面和实施方案中的液体组合物施用(例如，接触)到对其有需要的受检者的伤口上和/或中的步骤。
所谓“治疗伤口”进一步意在涵盖减少例如接受外科手术的患者中的组织的出血部位处的失血。
因此，在一些实施方案中，该方法用于减少例如接受外科手术的患者中的组织的出血部位处的失血，包括使其一个实施方案中的所公开的组合物或制剂与出血部位接触。
在一些实施方案中，用于减少组织的出血部位处的失血的组合物或制剂包含凝血酶和至少50％甘油，例如约60％至约100％或约80％至约100％体积/体积甘油。在一些实施方案中，组合物或制剂还包含例如补充量的明胶和/或水。
如本文所用，术语“受检者”应意指任何动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类或任何其它哺乳动物。在一些实施方案中，受检者是人，例如人类患者。受检者可为雄性或雌性。
在本申请的所有方面中旨在包括至少涉及％甘油、钙和赋形剂、凝血酶源和浓度以及上文所提及的凝血酶稳定性的实施方案。
如本文所用，术语“约”意指也旨在包括高于或低于所指示的值10％的值。一般来讲，本申请中的所有值旨在包括术语“约”。
术语“包含”、“含”、“具有”、“包括”、“含有”及其变化形式是指“包括但不限于”。术语“由...组成”是指“包括并且限于”。术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可包含附加成分、步骤和/或部件，但前提条件是该附加成分、步骤和/或部件不在本质上改变受权利要求书保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。
词语“示例性”在本文中用于指“用作示例、实例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不一定被理解为比其它实施方案优选或有利并且/或者不包括其它实施方案的特征。
词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方案中提供而在其它实施方案中不提供”。本发明的任何具体实施方案可包括多个“任选的”特征，除非此类特征有冲突。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括它们的混合物)。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这均适用。
每当本文指示数值范围时，其是指包括位于所指示范围内的任何列举的数字(分数或整数)。短语“范围是在”第一指示数字和第二指示数字之间以及“范围是从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换使用，并且是指包括第一指示数字和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，医疗上下文中的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状、或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。
如本文所用，术语“出血”是指血液从循环系统的任何组分外渗。因此“出血”涵盖与外科手术、创伤或其它形式的组织损伤有关的非期望、非受控且通常过多的出血以及患有出血性疾病的患者中的非期望的出血。
如本文所用，术语“控制”、“防止”或“减少”(它们可在本文中的出血上下文中互换使用，包括其任何语法变化)指示与所公开的组合物没有在出血部位中/上接触的情况相比，血液的渗出率基本上被消除或降低例如初始出血率的10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％。用于确定出血出现的水平的方法在本领域中是已知的。
此外，在一些实施方案中，出血上下文中的术语“控制”、“防止”或“减少”还意在涵盖至少部分地封闭出血部位处(例如，软组织中)的血管。
在其中使用类似于“A、B和C中的至少一者等”的惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在具有本领域的技术人员将理解所述惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一者的系统”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的系统)。本领域的技术人员还应当理解，实际上，无论在具体实施方式、权利要求还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的转折性词语和/或短语应被理解为涵盖包括所述术语中的一者、所述术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
应理解，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为简明起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种结构也可单独地或以任何合适的子组合形式提供，或如其所适当地提供于本发明的任何其它所述实施例中。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不应视为那些实施方案的基本特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。
如上文所述以及如下文的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例连同以上描述以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。
材料和方法
各种甘油浓度的制备：对于每种甘油浓度而言，将一定体积的DDW抽取到5ml注射器(Yoel Naim 5ml注射器批次：20130815)中并且添加到小瓶中。将一定体积的甘油(贝克公司(J.T Baker)500ml无水甘油批次：0000136697)抽取到5ml注射器中并且添加到相同小瓶中。然后用涡旋仪(科学工业公司(Scientific industries)，Vortex-genie 2型号G560E，速度设置5)将包含DDW和/或甘油的每个小瓶在环境温度下混合30秒。
凝血酶重构：对于每种甘油浓度而言，将2ml包含不同甘油浓度的液体抽取到5ml注射器中。将2ml的液体注射到包含约2000IU的冻干凝血酶小瓶中并且在滚轴(Stuart，滚轴混合器型号SRT6)上放置24至72小时(h)以便在环境温度下重构。
简而言之，在4至10国际单位(IU)/ml之间建立凝血酶标准曲线。然后将40ml的凝血酶或稀释样品添加到测试小杯中的160ml的0.1％纤维蛋白原溶液。在自动凝血机(Stat4，Stago Diagnostica)中分析凝血时间。该机器生成振荡电磁场，该振荡电磁场使小金属球在小杯内移动。在检测到球移动已停止时即确定已发生凝血。参照标准曲线从凝血时间外推测试样品中的凝血酶浓度。
实施例1：液体凝血酶稳定性
50℃下的24小时稳定性：如上所述的那样根据呈现具有各种甘油浓度的凝血酶溶液的制备的下表1来制备若干甘油浓度。
表1
甘油％(按溶剂体积(体积/体积)计) 甘油量 DDW量 总量
0％ 0ml 5ml 5ml
50％ 2.5ml 2.5ml 5ml
60％ 3ml 2ml 5ml
80％ 4ml 1ml 5ml
如上所述的那样重构凝血酶，并且使用1ml注射器(Terumo 1ml注射器批次：1001015)取300μl样品到Eppendorf管(Sarstedt，1.5微米管72.690.001)中并且冷冻(-20℃)以便未来按时间点0(0小时)进行分析。根据需要将包含剩余重构凝血酶的小瓶放入所指示的温度(例如，50℃)的烘箱(venticell 222，SN：B020251)中并持续所指示的时间(例如，24小时)。在每个时间点，即：1、4.5、8和24小时；使用1ml注射器取300μl样品到Eppendorf管中并且冷冻以便未来对相应时间点进行分析。基于如上所述的标准曲线来评估测试样品中的凝血酶活性。
图1中呈现了50℃下的24小时稳定性研究中不同甘油浓度下的凝血酶活性的4次重复的平均结果。如图1所示，在50％、60％和80％的甘油浓度下，凝血酶的活性在50℃下完全保持25小时。
长期稳定性：进一步测试了各种温度(℃)下各种甘油浓度对凝血酶活性的影响。将凝血酶悬浮于DDW中的若干不同浓度的甘油中并且在25℃下放置6个月并在4℃下放置12个月，图2A呈现了在25℃下在3和6个月时测得的活性。图2B呈现了在4℃下在12个月时测得的活性。结果证实了所测试的甘油样品的长期稳定性，因为对于每个所指示的时间而言，均保持约90％至约100％的活性。
实施例2：100℃下的液体凝血酶2分钟稳定性
如上所述的那样根据上表1制备若干甘油浓度(50％、60％和80％)。
如上所述的那样重构凝血酶，并且使用1ml注射器(Terumo 1ml注射器批次：1001015)取300μl样品到Eppendorf管(Sarstedt，1.5微米管72.690.001)中以便未来按时间点0(0分钟)进行分析。将包含剩余重构凝血酶的小瓶放入设置为100℃下持续2分钟的烘箱(venticell 222，SN：B020251)中。2分钟后，使用1ml注射器从每种浓度取300μl样品到Eppendorf管中。基于如上所述的标准曲线来评估测试样品中的凝血酶活性，并且通过时间点0的0％甘油的结果对凝血酶活性进行归一化。
图3中呈现了100℃下的2分钟稳定性研究中不同甘油浓度下的凝血酶活性的2次重复的平均结果。从图3中可以看出，在100℃下2分钟后，在有50％甘油的情况下保持小于75％的凝血酶活性，而在60％和80％甘油的溶液中，保持90％的凝血酶活性。
实施例3：无水甘油在各种温度下的过滤速率
为了使用过滤来产生无菌液体，液体必须穿过孔径等于或低于0.22μM的过滤器(2004FDA根据无菌工艺生产的无菌药物产品的工业指南-现行良好生产规范(2004FDAGuidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice))。然而，已知的是粘性液体(诸如甘油)难以穿过这种过滤器，这使得程序很漫长，使过滤充其量是低效的。因此，本发明人测试了升高过滤温度是否可使甘油不太粘并且过滤更有效。然而，只有在凝血酶活性在该过程中不受影响时才可执行该测试。如以上在实施例1中所示，本发明人现已确定高于50％甘油中的凝血酶在50℃下稳定24小时。另外，如实施例2中所示，本发明人还已确定超过50％甘油的溶液中的凝血酶在100℃下稳定2分钟。因此，更高的温度也可用于过滤过程。在该实施例中，本发明人检查了温度对甘油的过滤速率的影响。
在示例性程序中，将甘油(贝克公司(J.T Baker)无水甘油批次：0000136697)放入压力器皿(赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim)型号17530)中并且使用硅胶管和连接到压力计(至多1巴)的压缩空气(CA)系统(以在该过程中保持0.9至1巴的压力)来过滤穿过0.2μM Mini KleenpakTM囊式滤器(颇尔公司(PALL
Figure BDA0002943753790000291
)REF KA02ECV2FT，批次IB2616)。在过滤过程之前和期间将具有甘油的压力器皿和过滤器在受控循环温度浴内温育45分钟。为了评估温度对过滤速率的影响，将受控循环温度浴设定到三个不同温度之一，每个测试一个温度。所检查的温度是：25℃、40℃和50℃。
通过随时间推移称量滤液来测量过滤速率。结果示于下表2中，该表展示了过滤温度对过滤速率的影响。
表2
过滤温度(℃) 流速(kg/h)
25 0.42
40 1.02
50 2.22
从表2中可以看出，甘油在25℃下的过滤流速相对较低，即低于0.5kg/h，从而使过滤是低效的。然而，甘油在40℃和50℃下的过滤流速比室温下的过程快约2.5倍和约5倍，从而使该过程在高温下进行时更加有效。因此，大规模制备所需的大约1kg甘油的过滤在50℃下可在半小时完成，而在25℃下可需大约2.5小时。
实施例4：稳定的无菌液体凝血酶溶液的大规模制备
基于说明凝血酶在高温下的稳定性的实施例1和2以及说明甘油在升高的温度下的更高过滤速率的实施例3中的组合发现，可通过升高溶液温度并使其穿过孔径为0.22μM或更小的过滤器来对包含超过50％甘油的液体凝血酶溶液进行无菌过滤。
在示例性程序中，将凝血酶与甘油(贝克公司(J.T Baker)无水甘油)和DDW混合，得到包含80％甘油体积/体积中的1000IU/ml凝血酶的2升凝血酶溶液的最终体积。将凝血酶溶液放入赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim)型号17530内，该器皿通过压力计和阀来连接到0.2μM Mini KleenpakTM囊式滤器(颇尔公司(PALL
Figure BDA0002943753790000301
)REFKA02ECV2FT，批次IB2616)和压缩空气(CA)系统。将包含凝血酶溶液的压力器皿和过滤元件放入设定到50℃的受控循环温度浴内。在凝血酶溶液和过滤元件达到50℃之后，通过由压力阀和压力计控制压缩空气流来将压力调节到0.9至1巴。预计流速高于0.5千克/小时，从而在小于2小时内产生1千克滤液，即无菌凝血酶溶液。实际上，基于实施例3中的实验，可预计流速为大约2千克/小时，从而在小于半小时内产生1千克滤液，即无菌凝血酶溶液。应当理解，将温度升得更高预计将得到甚至更高的过滤速率。
实施例5：液体凝血酶与明胶组合的体内测试
如上所述的那样根据与表1中所示类似的表3来制备若干甘油浓度：
表3
甘油浓度(按溶剂体积计) 甘油量 DDW量 总量
50％ 2.5ml 2.5ml 5ml
60％ 3ml 2ml 5ml
100％ 5ml 0ml 5ml
对于每种甘油浓度而言，使用用2ml各种甘油浓度重构的1,600至2,400IU凝血酶(而不是根据试剂盒用水重构的凝血酶)来制备8ml的明胶糊剂(来自
Figure BDA0002943753790000302
试剂盒)。所测试的所有止血组合物包含：凝血酶、明胶和甘油，其中甘油的浓度为高于30重量％的固体。
在每个所准备的注射器上标记用于凝血酶重构的甘油浓度。使用如下所述的体内猪穿孔活检模型来测试凝血酶活性。
所使用的动物程序类似于先前在MacDonald等人，2017年，Medical Devices：Evidence and Research，10：273-279中报道的程序，但有下列修改：
-使用具有设置为4mm的阻挡件的8mm的一次性活检穿孔器；
-在测试制品施用之后施用棉塞10秒，并且监测所存在的自由流动血液2分钟；以及
-记录实现无自由流动血液所需的棉塞数。
简而言之，执行腹侧中线腹部切口，并且延长中线切口的颅侧部分以改善肝脏的暴露。将肝脏根据需要进行定位以使测试表面可用性最大化。在整个手术过程中，腹部器官利用盐水和盐水浸渍的剖腹手术海绵来保持湿润。利用具有设置为4mm的深度阻挡件的一次性8mm活检穿孔器在左叶、右叶和方叶的可触及区域的膈表面上产生肝实质缺损。抓紧活检组织的芯部，并且进行剧烈地切割以使其游离于底部表面，从而导致轻度至中度出血。
在产品施用之前允许缺损部位出血几秒钟，以允许表征所得的出血。在伤口形成时且在治疗之前按0至5的范围对每个缺损部位处的出血进行分类。排除分类为1或更小的缺损并且不对其进行测试。利用纱布吸干试验部位，并且随后施用测试制品中的一者。出于本研究的目的，将有效止血定义为自由流动出血的停止。出现但不增长的小点或瘀点出血不被视为自由流动出血。通过
Figure BDA0002943753790000311
施用装置将测试制品分配到该缺损(出血部位)上。利用数字压力计在纱布上施用初始棉塞大约10秒。在棉塞的初始10秒之后，移除敷料。如果120秒后未实现止血，则重新施用棉塞并且将棉塞保持附加10秒，之后是另一观察时间段。重复该过程直至实现有效止血，并且记录所需棉塞的数量。
图4中呈现了猪穿孔活检体内模型中用甘油与明胶的组合重构的凝血酶的功效结果的5次重复的平均值。
从图4中可以看出，凝血酶溶液中的％甘油直接影响结果，其中50％甘油平均引起约2.8次棉塞重复，60％甘油引起平均约1.8次棉塞重复，并且100％甘油引起平均小于1.5次棉塞重复。
为了比较，先前已报道
Figure BDA0002943753790000312
(可吸收止血粉)在类似模型中优于AR(AristaTMAH可吸收止血颗粒)和PC(
Figure BDA0002943753790000313
多糖止血系统)(MacDonald等人，2017年，如上所提及)。在该模型中，AristaTM和
Figure BDA0002943753790000314
均具有等于或超过4.75分钟的止血时间。由于每个棉塞后的每次观察最长为2分钟，因此Arista和
Figure BDA0002943753790000315
的结果相当于等于或超过2.3个棉塞。
因此，该研究的结果证实了与在不含甘油的水中重构的凝血酶的现有产品相比，在60％或更高甘油中重构的凝血酶具有增强的功效。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变型对于本领域中那些技术人员而言是显而易见的。因此，本文旨在涵盖落入所附权利要求书的实质和广义范围内的所有此类另选形式、修改和变型。

Claims (34)

1.一种止血试剂盒，所述止血试剂盒包括：
a.包含具有超过50％体积/体积甘油的液体凝血酶组合物的容器；以及
b.包含明胶的容器。
2.根据权利要求1所述的止血试剂盒，其中所述液体凝血酶组合物包含约60％至约100％体积/体积甘油，任选地约80％至约100％体积/体积甘油。
3.根据前述权利要求中任一项所述的止血试剂盒，其中所述试剂盒还包含钙。
4.根据前述权利要求中任一项所述的止血试剂盒，其中所述液体凝血酶组合物还包含一种或多种赋形剂，所述一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。
5.根据前述权利要求中任一项所述的止血试剂盒，其中所述液体凝血酶组合物包含约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的止血试剂盒，其中所述液体凝血酶组合物中的所述凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。
7.根据前述权利要求中任一项所述的止血试剂盒，其中所述液体凝血酶组合物中的所述凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。
8.一种止血组合物，所述止血组合物包含凝血酶、明胶和浓度范围高于30重量％的固体的甘油。
9.根据权利要求8所述的止血组合物，所述止血组合物还包含钙。
10.根据权利要求8或9所述的止血组合物，所述止血组合物还包含一种或多种赋形剂，所述一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的止血组合物，所述止血组合物包含约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的止血组合物，所述止血组合物用于辅助止血的局部应用。
13.一种用于大规模生产包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.通过将凝血酶与甘油溶液混合以获得具有超过50％体积/体积甘油的溶液来制备凝血酶溶液；
b.将所获得的凝血酶溶液加热到至少约40℃；以及
c.通过使所述凝血酶溶液穿过孔径为约0.22μm或更小的至少一个过滤器来对所述凝血酶溶液进行灭菌，
从而获得包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括通过热灭活执行的病毒灭活的步骤。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述凝血酶溶液包含约60％至约100％体积/体积甘油，任选地约80％至约100％体积/体积甘油。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述凝血酶溶液还包含钙。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述凝血酶溶液还包含一种或多种赋形剂，所述一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述凝血酶溶液包含约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述液体凝血酶组合物中的所述凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述液体凝血酶组合物中的所述凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。
21.一种包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物通过根据权利要求13至20中任一项所述的方法来获得。
22.一种包含超过50％体积/体积甘油的无菌液体凝血酶组合物。
23.根据权利要求22所述的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物包含约60％至约100％体积/体积甘油，任选地约80％至约100％体积/体积甘油。
24.根据权利要求22或23所述的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物还包含钙。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物还包含一种或多种赋形剂，所述一种或多种赋形剂选自氯化钠、甘露醇、白蛋白和乙酸钠。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物包含约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的无菌液体凝血酶组合物，其中所述凝血酶在约50℃的温度下约20小时之后具有至少70％活性。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的无菌液体凝血酶组合物，其中所述凝血酶在约100℃的温度下约2分钟之后具有至少70％活性。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的无菌液体凝血酶组合物，所述无菌液体凝血酶组合物还包含明胶。
30.一种封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含凝血酶和超过50％体积/体积甘油。
31.根据权利要求30所述的封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含约60％至约100％体积/体积甘油，任选地约80％至约100％体积/体积甘油。
32.根据权利要求30或31所述的封闭剂制剂，所述封闭剂制剂还包含钙。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含约100IU/ml与约2,000IU/ml之间的凝血酶。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含纤维蛋白原组分。
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