CN112557347B - 一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，涉及粒子迁移模型的制备及检测技术领域，包括以下步骤：S1、获取动物肠黏液；S2、制备人工乳糜，在一定条件下保存；S3、将肠黏液加入样品瓶中，然后再加入人工乳糜。该黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，解决了常规动物实验周期长、操作难度大、涉及伦理道德等问题。

Description

一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法

技术领域

本发明涉及粒子迁移模型的制备及检测技术领域，具体为一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法。

背景技术

肠道是人体重要的消化器官，其表面覆盖一层黏液，通过黏液的持续分泌与更新将上皮细胞与肠道内的细菌、病毒等有害物质有效隔离和清除，从而对肠道黏膜起到润滑和保护的作用。黏液层是构成肠道屏障的重要组成成分。乳糜微粒在食物的消化吸收过程中起到重要作用。研究乳糜微粒的迁移可以揭示肠黏液中物质的吸收转运过程以及乳糜微粒在迁移过程中和肠黏液的相互作用。

以往研究黏液层中乳糜粒子的迁移往往会选择动物实验，但动物实验周期长，受环境影响大，花费较高，对于实验人员的专业技术要求较高。在解剖动物的过程中还涉及到伦理问题。外消化模型因其构建简单、廉价、可重复性高、可实现多样本同时检测、没有伦理限制等优点从而得到广泛应用。

本发明的目的是提供一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，通过制备的模型简单清晰的地表征乳糜粒子的迁移。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，解决了通过体外模拟黏液层从而简单清晰的研究乳糜粒子的迁移的问题。

（二）技术方案

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取动物肠黏液。

S2、制备人工乳糜，在一定条件下保存。

S3、将肠黏液加入样品瓶中，然后再加入人工乳糜。

步骤S1中，所述肠黏液来自猪的大肠，猪的大肠一定要新鲜，最好是屠宰后立即取猪大肠提取肠黏液，运输过程中可以放在冰块上保存，提取肠黏液前用PBS缓冲液轻轻洗净猪大肠表面的污物，但不要用力揉搓，清洗完成后将猪大肠剪成15~20cm的小段，用力揉搓大肠表面收集黏液，向肠黏液中加入蛋白酶抑制剂，在-20℃的条件下保存。

步骤S2中，首先将待检测的物质按所需浓度充分溶解，与模拟唾液按体积比1:1的比例混合，加入唾液淀粉酶，使唾液淀粉酶的酶活力值为70~100 U/mL，调节pH为7，在25℃静置2~5min；

然后将上述混合溶液与模拟胃液按体积比1:1的比例混合，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的活力值为1800~2200 U/mL，用1M的盐酸调pH为3，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min；

最后将上述混合溶液与模拟肠液按体积比1:1的比例混合，加入胰酶，使胰酶的活力值为80~120 U/mL，用1M的氢氧化钠调pH为7，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min制备成人工乳糜，所述人工乳糜在台式恒温振荡器中保存，温度设定为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min。

步骤S3中，所述样品瓶中肠黏液的厚度在0.5~1.5cm之间，人工乳糜的厚度在3~6cm之间，将肠黏液和人工乳糜按顺序添加；

首先将肠黏液加入到样品瓶中，然后加入人工乳糜，缓慢添加避免产生气泡，添加时溶液不要溅到瓶壁上，保证液面与样品支架平齐。

一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的检测方法，包括以下步骤：

S1、首先开启电脑和多重光散射仪，等待仪器自检完成，稳定30min仪器准备完毕后可以开始运行测试；

S2、然后打开电脑软件等待仪器初始化完成，之后将多重光散射仪的检测温度调整为37℃，等待仪器上升到指定温度，按下open按钮打开多重光散射仪的盖子，将制好的样品瓶放入多重光散射仪中，按下close按钮关闭仪器盖子，需要注意的是避免用手推，放样品过程中不要剧烈摇动样品瓶；

S3、最后在电脑上新建扫描程序，多重光散射仪的稳定时间设置为2~10min，检测频率设定为2~5min扫描一次，测定时间设定为8~12h，点击start按钮开始测试，通过仪器生成的指纹图谱分析乳糜粒子的迁移。

（三）有益效果

本发明的有益效果在于：

1、该黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，解决了常规动物实验周期长、操作难度大、涉及伦理道德等问题。

2、该黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，实验周期短，对于操作人员的技术要求相对较低，在实验过程中不涉及伦理问题，实验所需花费少。

3、该黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，不但可以通过肉眼观察到样品的颜色形态变化，还可以通过样品的透射光和背散射光变化综合分析乳糜粒子的迁移行为。

4、该黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备及检测方法，本模型制备简单可以满足对样品进行长时间的连续观测，所得结果具有一定的代表性且重复性好。

附图说明

图1为本发明透射光参比谱图；

图2为本发明背散射光参比谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-2所示，本发明提供一种技术方案：一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取动物肠黏液；

S2、制备人工乳糜，在一定条件下保存；

S3、将肠黏液加入样品瓶中，然后再加入人工乳糜。

步骤S1中，肠黏液来自猪的大肠，猪的大肠一定要新鲜，最好是屠宰后立即取猪大肠提取肠黏液，运输过程中可以放在冰块上保存，提取肠黏液前用PBS缓冲液轻轻洗净猪大肠表面的污物，但不要用力揉搓，清洗完成后将猪大肠剪成15~20cm的小段，用力揉搓大肠表面收集黏液，向肠黏液中加入蛋白酶抑制剂，在-20℃的条件下保存；

步骤S2中，首先将待检测的物质按所需浓度充分溶解，与模拟唾液按体积比1:1的比例混合，加入唾液淀粉酶，使唾液淀粉酶的酶活力值为70~100 U/mL，调节pH为7，在25℃静置2~5min；

然后将上述混合溶液与模拟胃液按体积比1:1的比例混合，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的活力值为1800~2200 U/mL，用1M的盐酸调pH为3，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min；

最后将上述混合溶液与模拟肠液按体积比1:1的比例混合，加入胰酶，使胰酶的活力值为80~120 U/mL，用1M的氢氧化钠调pH为7，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min制备成人工乳糜，人工乳糜在台式恒温振荡器中保存，温度设定为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min；

步骤S3中，样品瓶中肠黏液的厚度在0.5~1.5cm之间，人工乳糜的厚度在3~6cm之间，将肠黏液和人工乳糜按顺序添加；

首先将肠黏液加入到样品瓶中，然后加入人工乳糜，缓慢添加避免产生气泡，添加时溶液不要溅到瓶壁上，保证液面与样品支架平齐。

一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的检测方法，包括以下步骤：

S1、首先开启电脑和多重光散射仪，等待仪器自检完成，稳定30min仪器准备完毕后可以开始运行测试；

S2、然后打开电脑软件等待仪器初始化完成，之后将多重光散射仪的检测温度调整为37℃，等待仪器上升到指定温度，按下open按钮打开多重光散射仪的盖子，将制好的样品瓶放入多重光散射仪中，按下close按钮关闭仪器盖子，需要注意的是避免用手推，放样品过程中不要剧烈摇动样品瓶；

S3、最后在电脑上新建扫描程序，多重光散射仪的稳定时间设置为2~10min，检测频率设定为2~5min扫描一次，测定时间设定为8~12h，点击start按钮开始测试，通过仪器生成的指纹图谱分析乳糜粒子的迁移。

实施例一

一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取动物肠黏液。

S2、制备人工乳糜，在一定条件下保存。

S3、将肠黏液加入样品瓶中，然后再加入人工乳糜。

步骤S1中，将猪的大肠建成15cm的小段，用PBS缓冲液冲洗猪大肠后提取肠黏液，PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄ 3.63g/L，KH₂PO₄ 0.24g/L，蛋白酶抑制剂Cocktail(100x，DMSO储存液)的添加量和肠黏液的体积比为1:100。

步骤S2中，首先将待检测的物质按所需浓度充分溶解，与模拟唾液按体积比1:1的比例混合，加入唾液淀粉酶，使唾液淀粉酶的酶活力值为70 U/mL，调节pH为7，在25℃静置2min；

然后将上述混合溶液与模拟胃液按体积比1:1的比例混合，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的活力值为2000 U/mL，用1M的盐酸调pH为3，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为100 r/min；

最后将上述混合溶液与模拟肠液按体积比1:1的比例混合，加入胰酶，使胰酶的活力值为100 U/mL，用1M的氢氧化钠调pH为7，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为100 r/min制备成人工乳糜。所述的人工乳糜在台式恒温振荡器中保存，温度设定为37℃，振荡频率设定为100 r/min。

步骤S3中，肠黏液的厚度为0.8cm，人工乳糜的厚度为4cm，样品添加的高度符合检测对于高度的要求。

一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的检测方法，包括以下步骤：

S1、首先打开电脑和多重光散射仪；

S2、然后将多重光散射仪的检测温度调整为37℃，等待仪器上升到指定温度，接着将样品瓶放入多重光散射仪中，放样品过程中不要剧烈摇动样品瓶；

S3、多重光散射仪的稳定时间设置为5min，检测频率设定为3min扫描一次，测定时间设定为12h。通过仪器生成的指纹图谱分析乳糜粒子的迁移。

实验结果参考图1和图2如下：

通过肠黏液高度的变化判定乳糜粒子的迁移，由图中数据可知经过8h乳糜粒子完成迁移，肠黏液的高度增加1mm，计算得出粒子的沉淀率为0.125mm/h。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种黏液层中乳糜粒子迁移模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取动物肠黏液；

S2、制备人工乳糜，在一定条件下保存；

S3、将肠黏液加入样品瓶中，然后再加入人工乳糜；

步骤S1中，所述肠黏液来自猪的大肠，猪的大肠一定要新鲜，选用屠宰后立即取猪大肠提取肠黏液，运输过程中可以放在冰块上保存，提取肠黏液前用PBS缓冲液轻轻洗净猪大肠表面的污物，但不要用力揉搓，清洗完成后将猪大肠剪成15~20cm的小段，用力揉搓大肠表面收集黏液，向肠黏液中加入蛋白酶抑制剂，在-20℃的条件下保存；

步骤S2中，首先将待检测的物质按所需浓度充分溶解，与模拟唾液按体积比1:1的比例混合，加入唾液淀粉酶，使唾液淀粉酶的酶活力值为70~100 U/mL，调节pH为7，在25℃静置2~5min；

然后将上述混合溶液与模拟胃液按体积比1:1的比例混合，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的活力值为1800~2200 U/mL，用1M的盐酸调pH为3，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min；

最后将上述混合溶液与模拟肠液按体积比1:1的比例混合，加入胰酶，使胰酶的活力值为80~120 U/mL，用1M的氢氧化钠调pH为7，将溶液放在振荡培养箱中2h，温度为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min制备成人工乳糜，所述人工乳糜在台式恒温振荡器中保存，温度设定为37℃，振荡频率设定为80-150 r/min；

步骤S3中，所述样品瓶中肠黏液的厚度在0.5~1.5cm之间，人工乳糜的厚度在3~6cm之间，将肠黏液和人工乳糜按顺序添加；

首先将肠黏液加入到样品瓶中，然后加入人工乳糜，缓慢添加避免产生气泡，添加时溶液不要溅到瓶壁上，保证液面与样品支架平齐；

在对样品瓶中的样品进行检测时，黏液层中乳糜粒子迁移模型的检测方法，包括以下步骤：

S1、首先开启电脑和多重光散射仪，等待仪器自检完成，稳定30min仪器准备完毕后可以开始运行测试；

S2、然后打开电脑软件等待仪器初始化完成，之后将多重光散射仪的检测温度调整为37℃，等待仪器上升到指定温度，按下open按钮打开多重光散射仪的盖子，将制好的样品瓶放入多重光散射仪中，按下close按钮关闭仪器盖子，需要注意的是避免用手推，放样品过程中不要剧烈摇动样品瓶；

S3、最后在电脑上新建扫描程序，多重光散射仪的稳定时间设置为2~10min，检测频率设定为2~5min扫描一次，测定时间设定为8~12h，点击start按钮开始测试，通过仪器生成的指纹图谱分析乳糜粒子的迁移。