CN112553152B - 一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其关键在于：脂肪间充质干细胞经电磁辐射或/和利用激光辐射处理，连续至少7天，每天1次，每次20～40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养；所述电磁辐射时采用预活化液保护处理；所述激光辐射处理后采用糖膜蛋白修复液修复处理。本发明一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，该方法提高外泌体产量的关键因素为辐射及辐射条件的控制，通过辐射，可有效将外泌体保留在细胞中，待7天后富集外泌体，进而提高了外泌体的含量；同时使用预活化液和糖膜蛋白修复液对细胞进行保护，预防和修复辐射的伤害；同时能够保证外泌体保持原有的作用效果。

Description

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体的说，涉及一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法。

背景技术

外泌体是一种直径在40-100nm的脂质双分子层囊泡，最早在1983年研究羊的网织红细胞成熟过程中分泌的囊泡而提出，其可携带细胞特异表达的蛋白、脂质和核酸等物质，然后通过与细胞的接触直接将所携带的物质传递给邻近或者远距离的细胞。目前大量研究表明，间充质干细胞来源的外泌体可通过其内容的蛋白、RNA成分胞间转移，发挥与间充质干细胞相类似的组织修复、免疫抑制、调节免疫功能等作用。并且与细胞治疗相比较，外泌体性质更稳定，保存运输方便，没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险，因此有望成为一种新的治疗策略。

脂肪间充质干细胞作为重要的种子细胞之一，来源充足，可通过较简单的方法大量提取，具有广阔的研究和应用前景。而脂肪间充质干细胞储存条件苛刻，运输不便，移植至生物体内存活率较低，临床应用有一定困难。外泌体具有分泌细胞的特性，储存简单，能在4℃条件下保存较长时间，运输方便，免疫原性较脂肪间充质干细胞更低，为脂肪间充质干细胞在临床的应用提供了方向。但是干细胞的量非常少，并且随着个体年龄的增加，干细胞的数量逐渐减少、分泌活性逐渐降低，导致外泌体的总产量进一步减少，很难满足自体修复和临床治疗的需求，这限制了它的进一步的应用。因此对于干细胞外泌体的实际应用而言，需要通过扩增得到足够的细胞数目，并刺激单细胞分泌更多的外泌体。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法。

本发明目的是这样实现的：

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其关键在于：脂肪间充质干细胞经电磁辐射或/和利用激光辐射处理，连续至少7，每天1次，每次20～40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养；所述电磁辐射时采用预活化液保护处理；所述激光辐射处理后采用糖膜蛋白修复液修复处理。

优选地，上述电磁辐射的频率为30～70Hz、强度为1～5mt。进一步优选，所述电磁辐射的频率为50Hz、强度为3mt。

优选地，上述激光辐射的辐射能量为1～5j/cm²、波长为500～1000nm、功率输出为100～400mw、功率密度为0.1～0.4w/cm²。进一步优选，所述激光辐射的辐射能量为5j/cm²、波长为800nm、功率输出为200mw、功率密度为0.2w/cm²。

优选地，上述预活化液的添加量为1～5ng/mL。

优选地，上述预活化液由以下重量分数的组份组成：0.2-0.8％层粘连蛋白、0.1-0.5％胶原蛋白、0.2-0.6％纤连蛋白、余量为溶剂。

优选地，上述糖膜蛋白修复液的添加量1uL/mL。

优选地，上述糖膜蛋白修复液由以下重量分数的组份组成：0.1-0.4％卵磷脂、0.05-0.12％唾液酸、0.01-0.06％多种氨基酸、0.8-1.6％葡萄糖、余量为溶剂。

优选地，上述脂肪间充质干细胞培养所采用的培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

试验方法，具体步骤如下：

一、准备细胞：

1、取吸脂术后脂肪25ml，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的筋膜及红细胞后，加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液，在37℃、150r/min的条件下消化30min，3000r/min离心10min，去除上层油脂及中层液体，加入5ml红细胞裂解液重悬，室温静置5min，1500r/min离心5min，去除上清液，用PBS清洗沉淀，1500r/min离心5min，去除上清，用MSC培养基重悬，70μm细胞筛网过滤后，移入培养瓶原代培养。

2、24h后全量换液，去除表面漂浮油脂和未贴壁细胞，每隔2-3天换液，细胞融合度80％-90％时，用体积分数0.25％胰蛋白酶消化后，按10000个/cm2密度，传代培养。

3、传至第3代细胞，分别设置空白组、联合处理组。

二、对比实验：

1、空白组不做处理；联合组，细胞接种后，加入5ng/ml的层连蛋白，通过频率50Hz、强度为3mt的磁垫表面施加电磁场，同时施加辐射能量3j/cm2，波长808nm，功率输出为200mw，功率密度为0.2w/cm2的照射后立即加入糖膜蛋白修复液，连续7天，每天一次，持续30分钟，37摄氏度，5％CO2浓度，饱和湿度培养箱中培养。

2、MSCs-EXO的提取和分离

2.1提取MSCs-EXO时，将培养基更换为无血清培养基(配方为含有2％μLtroser G的LONZA培养基)，37℃、5％CO₂培养箱中饥饿培养。富集exosomes采用了以下两种方法。

2.1.1试剂絮凝法：采用EXOquick-TC试剂(美国SBI公司)来进行富集过程，具体操作过程如下：①收集培养基，3000g离心15min，以去除细胞及细胞碎片；②将上清收集入新离心管中，按体积比培养液：EXOquick-TC提取试剂＝5:1混匀，4℃孵育过夜；③1500g离心30min，小心弃去上清；④1500g再离心5min，小心吸弃管底部的所有液体，离心管底部的米黄色沉淀即为富集的exosomes。可用100-500μL适当的Buffer溶解exosomes沉淀，备于后续实验。⑤备注：为了更好的进行后续实验，培养基至少为10mL，按5:1加入2mLEXOquick-TC提取试剂。

2.1.2超速离心法：①收集无血清的培养基上清，4℃，400g离心15min，以去除漂浮细胞及部分细胞碎片；②收集离心后的上清，4℃，10000g离心15min，进一步离去细胞碎片；③用0.20μm的滤器过滤上述离心后的上清液，将滤后的液体收集到超速离心管中，质量配平后，在超速离心机中4℃，100000g离心70min。④弃去上清，管底沉淀即为exosomes，用200-500μLPBS轻轻将沉淀吹起以脱离超速离心管管底，注意切勿使劲吹吸与震荡，收集到1mLEP管中，备于后续试验。后续试验使用时，需将EP管中的exosomes重新沉淀，可4℃，14000g离心10-15min，弃去上清收集exosomes沉淀；也可采用上述试剂提取法，按体积比加入提取试剂，上下颠倒EP管4-5次混匀，忌涡流，4℃孵育30min-1h，14000g、4℃离心10min得到exosomes沉淀。

2.2各组细胞所获取外泌体蛋白浓度的测定(微量BCA法，博士德公司)

2.3各组细胞所获取的外泌体粒径检测：PBS重悬后上机检测。

3、透射电镜观察MSCs-EXO

电镜标本制作过程如下：①向上述米黄色沉淀中加入预冷新鲜3％戊二醛前固定液，PH7.4，4℃；PB浸洗，4℃，15min×3次；②将标本置于1％锇酸(OsO₄)后固定液，室温固定2h，PB浸洗，15min×3次；③乙醇和丙酮联合梯度脱水：30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％丙酮各1次，每次10min，100％丙酮，3次，每次10min；④梯度浸透(包埋液用Epon812系列)：丙酮:包埋液＝3:1，37℃，1h；丙酮:包埋液＝1:1，37℃，1h；丙酮:包埋液＝1:3，37℃，过夜；⑤包埋与聚合：把标本置于包埋板，注入Epon812纯包埋液，37℃，8h；45℃，12h；67℃，24h；⑥切片、染色和观察：用LKB-V型超薄切片机行半薄切片，光镜定位后行超薄切片，厚度约70nm。经过醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后，JEOL-1200EX透射电镜观察记录。

4、MSCs-EXO表面标记物的检测——Western Blotting分析

取稳定增殖的1×10⁶个huMSCs和按照上述方法之一得到的MSCs-EXO，将适量(100-200μL)预冷的RIPA裂解液(含蛋白抑制剂混合物)加入沉淀中，充分混匀，冰上裂解30min后4℃，12000g离心20min。吸出上清置于EP管中，利用少量进行BCA蛋白定量。调整蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液(5×LoadingBuffer)，100℃煮10min，用于WesternBlotting蛋白上样。其余冻存于－20℃。选用CD63，CD9，Hsp70，CD81，Calnexin和Lamp1蛋白作为检测指标，其蛋白分子量分别为26kDa，25kDa，40-70kDa，26kDa，90kDa，90-120kDa。上述蛋白一抗的稀释比均为1:1000。上样——电泳——转膜——封闭——孵育一抗——孵育二抗——上机曝光：使用LI-COR3600曝光仪曝光，用ImageStudioDigitsVer4.0软件对结果进行分析。

5、靶细胞对MSCs-EXO的摄取和吞噬——共聚焦显微镜观察

用荧光染料DIO，DID，DAPI分别对MSCs-EXO，靶细胞细胞膜和细胞核分别染色，三种染料在一定激发光下分别呈现出绿色、红色和蓝色，继而在共聚焦显微镜下观察靶细胞对MSCs-EXO的摄取和吞噬，过程如下：①DIO，DID均用DMSO溶液，配制成浓度为20mg/mL的储存液，DIO，DID的工作终浓度为5ug/mL。②富集MSCs-EXO，用500μL PBS重悬，加入适当体积的DIO染液，37℃孵育20min。加入100μLEXOquick-TC试剂，4℃孵育30min，14000g、4℃离心10min，重新沉淀MSCs-EXO。PBS洗涤2次，沉淀方法如上，染好色的MSCs-EXO暂时避光置于4℃备用。③待6孔板中的原代靶细胞贴壁至约30％时，用于实验，吸出培养基，用PBS清洗2次去除漂浮的死细胞，换新鲜培养基1mL，加入适当体积的DID染液，轻微晃动孔板混匀，37℃孵育20min后弃去培养上清，用PBS洗涤细胞2次。将染好色的MSCs-EXO用1mL新鲜培养基重悬，加入孔板中，放入培养箱，37℃、5％CO₂下避光培养2h。④2h后取出孔板，在培养基中加入少量DAPI染液，染色2min后，吸出培养基，用PBS洗2次，换新鲜培养基，置于共聚焦显微镜下观察，照相记录结果。⑤整个操作过程注意避光，轻柔振荡，切勿使劲反复吹吸孔板内的贴壁细胞。

荧光试剂Exo-Green可标记MSCs-EXO中的蛋白成分，在荧光显微镜下呈现绿色，细胞摄取了该MSCs-EXO也会激发出绿色荧光；同理，荧光试剂Exo-Red可标记MSCs-EXO中含有的micro-RNAs，在荧光显微镜下呈现红色，细胞摄取了MSCs-EXO中的micro-RNAs就会激发出红色荧光。具体步骤如下：①用500μLPBS重悬MSCs-EXO，共2份，标记为G和R。G管加入50μL10×Exo-Green试剂，R管加入50μL10×Exo-Red试剂，上下颠倒以混匀，注意不可涡流，混合物置于37℃孵育10min。②在两管中分别加入100μLEXOquick-TC以终止标记反应，上下颠倒以混匀，4℃孵育30min，14000g、4℃离心10min，重新沉淀MSCs-EXO。PBS洗涤2次，沉淀方法如上，染好色的两管MSCs-EXO暂时避光置于4℃备用。③待6孔板中的原代靶细胞贴壁至约30％时，一孔标记为G孔，另一标记为R孔，吸出培养基，用PBS清洗2次去除漂浮的死细胞。将G管的MSCs-EXO用2mL新鲜培养基重悬，加入对应的G孔中，放入培养箱，37℃、5％CO₂下避光培养2h后，弃去上清，PBS洗2次，加入新鲜培养基后置于荧光显微镜下观察细胞绿色荧光的情况。同理，R管的MSCs-EXO作用于R孔细胞，但是需培养24h，24h后观察细胞红色荧光。拍照并记录。

6、MSCs-EXO对化疗药物损伤的靶细胞的救治作用

在6孔板中培养靶细胞，待细胞贴壁融合至40-50％时用于以下实验。实验分组：A为空白对照组，B为顺铂损伤组，C为MSCs-EXO共培养组。每组两个副孔。以下实验中细胞培养基均为无血清培养基，配方如上。A组细胞换新鲜的无血清培养基，B组换顺铂浓度为4μg/mL的无血清培养基，C组换含有MSCs-EXO的顺铂(4μg/mL)无血清培养基，每孔加入20mLhuMSCs培养基提取的MSCs-EXO，如下图所示。6孔板在37℃，5％CO₂的培养箱中培养48h。48h后按下述方法处理各组细胞。

GROUP	A	B	C
				顺铂(4μg/mL)	－	+	+
MSCs-EXO	－	－	+

6孔板置于细胞培养箱培养48h后，用Annexin-V/PI双染法利用流式细胞仪检测活细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞比例。具体步骤如下：①把各组培养液上清吸出至各组对应的离心管中，PBS洗涤1次，吸出PBS至对应离心管中，加入适量0.25％胰蛋白酶(含0.01％EDTA)消化细胞，避免过度消化。②轻柔吹打细胞使其脱离底壁，吸出加入步骤1收集的培养液中，1000g离心5min，小心弃去上清，用PBS重悬各组细胞并计数。③各组取0.5-1×10⁵个细胞，1000g离心5min，弃去上清，用100μL Blinding Buffer重悬细胞，各组加入5μLAnnexin-V-FITC，混匀，静置1min后各组加入10μL PI，轻轻混匀后室温避光静置20min。④各管加入100μL Blinding Buffer轻轻吹吸混匀，以充分洗涤细胞。⑤上机检测各组细胞凋亡情况。Annexin-V-FITC激发绿色荧光，PI激发红色荧光。用GuavaSoft 3.1.1软件分析实验结果。

结果：

1.蛋白浓度与粒径检测结果

检测结果显示，联合处理组细胞获取的外泌体数量较对照组有所增加，具有统计学差异(P<0.05)。

2.MSCs-EXO的显微形态和表面标记物的表达

MSCs脂质双分子层内陷形成胞内的多腔囊泡，成为多囊小体。多囊小体结合到细胞膜上并向细胞外释放出小囊泡，这些小囊泡即为exosomes，见Figure 3A、B。利用EXOquick-TC提取法和超速离心法均可成功富集出MSCs-EXO，沉淀聚集在离心管底，呈米黄色。在透射电镜(TEM)下可以观察到它的显微形态，显示hucMSCs-EXO是一类直径位于30-200nm之间的、有双层膜的囊泡状结构，与以往文献叙述一致，说明通过上述方法成功富集了huMSCs培养上清中的MSCs-EXO。见图1A(试剂盒法)和图1B(超速离心法)。

Western Blotting蛋白分析显示MSCs-EXO表面表达CD63，CD9，Hsp70，CD81蛋白，这些蛋白均是exosomes表面标记蛋白；但不表达内质网标记Calnexin和溶酶体标记Lamp1，说明上述方法富集的MSCs-EXO不包含内质网碎片和溶酶体成分。见图2，A为试剂盒法和B为超速离心法。

3.MSCs-EXO对靶细胞的作用

3.1靶细胞有效结合和吞噬MSCs-EXO

共聚焦显微镜下，观察到经过荧光染料DIO，DID，DAPI标记后的MSCs-EXO，靶细胞细胞膜和细胞核在一定激发光下分别呈现出绿色、红色和蓝色荧光，图片重叠合成后发现绿色的MSCs-EXO吸附在靶细胞上或已被吞噬在靶细胞质内，说明MSCs-EXO成功进入了靶细胞。见图3。上述观察结果验证了靶细胞可以有效地结合和吞噬MSCs-EXO，其内容物进入细胞后会产生各种生物学行为，靶细胞对EXO的吞噬荧光显微镜观察结果：荧光显微镜下靶细胞摄取了被Exo-Green标记的MSCs-EXO，呈现绿色荧光；同理，靶细胞摄取了被Exo-Red标记的MSCs-EXO，呈现红色荧光，见Merge(40×)。

3.2MSCs-EXO可有效保护顺铂诱导损伤的靶细胞，抵抗细胞凋亡

Annexin-V-FITC/PI双染法检测对照组(A组)活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例分别为85.50±4.45％、5.86±0.50％、8.69±2.15％；损伤组(B组)分别为71.37±3.10％、8.58±2.04％、17.26±2.67％；HucMSCs-EXO共培养组(C组)分别为80.09±4.00％、5.72±2.15％、10.27±1.46％。根据SPSS 19.0软件进行统计分析，A与B组的活细胞比例具有统计学差异(P<0.05)，B与C组的活细胞比例也具有统计学差异(P<0.05)。A与B组的早期凋亡细胞比例无统计学差异(P>0.05)，而B与C组的早期凋亡细胞比例具有统计学差异(P<0.05)。A与B组的晚期凋亡细胞比例具有统计学差异(P<0.05)，同样B与C组的晚期凋亡细胞比例也存在统计学差异(P<0.05)。见图4。Annexin-V-FITC/PI双染法分别检测A、B、C三组活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例。MSCs-EXO可有效保护顺铂诱导的细胞凋亡。

有益效果：

本发明一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，该方法提高外泌体产量的关键因素为辐射及辐射条件的控制，通过辐射，可有效将外泌体保留在细胞中，待7天后富集外泌体，进而提高了外泌体的含量；同时使用预活化液和糖膜蛋白修复液对细胞进行保护，预防和修复辐射的伤害；同时能够保证外泌体保持原有的作用效果。

附图说明

图1为透射电镜观察外泌体形态图，其中A为试剂盒法，B为超速离心法；

图2为Western blotting检测外泌体标志性蛋白；

图3为靶细胞对EXO的吞噬荧光显微镜观察图；

图4为Annexin-V-FITC/PI双染法分别检测A、B、C三组活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例图；

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.8％层粘连蛋白、0.1％胶原蛋白、0.6％纤连蛋白、98.5％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入1ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为30Hz、强度为5mt，连续7天，每天1次，每次40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例2

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.2％层粘连蛋白、0.5％胶原蛋白、0.2％纤连蛋白、99.1％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入5ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为70Hz、强度为1mt，连续7天，每天1次，每次20min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例3

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.6％层粘连蛋白、0.3％胶原蛋白、0.4％纤连蛋白、98.7％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入3ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为50Hz、强度为3mt，连续7天，每天1次，每次30min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例4

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备糖膜蛋白修复液：0.4％卵磷脂、0.05％唾液酸、0.06％多种氨基酸、0.8％葡萄糖、98.69％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、脂肪间充质干细胞利用利用激光辐射处理，辐射能量为5j/cm²、波长为800nm、功率输出为200mw、功率密度为0.2w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次30min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例5

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备糖膜蛋白修复液：0.1％卵磷脂、0.12％唾液酸、0.01％多种氨基酸、1.6％葡萄糖、98.17％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、脂肪间充质干细胞利用利用激光辐射处理，辐射能量为1j/cm²、波长为1000nm、功率输出为100mw、功率密度为0.4w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次20min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例6

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备糖膜蛋白修复液：0.3％卵磷脂、0.09％唾液酸、0.03％多种氨基酸、1.2％葡萄糖、98.38％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、脂肪间充质干细胞利用利用激光辐射处理，辐射能量为3j/cm²、波长为500nm、功率输出为400mw、功率密度为0.1w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例7

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.8％层粘连蛋白、0.1％胶原蛋白、0.6％纤连蛋白、98.5％溶剂，混合均匀并备用。

准备糖膜蛋白修复液：0.4％卵磷脂、0.05％唾液酸、0.06％多种氨基酸、0.8％葡萄糖、98.69％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入1ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为50Hz、强度为3mt，同时利用激光辐射处理，辐射能量为5j/cm²、波长为800nm、功率输出为200mw、功率密度为0.2w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次30min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例8

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.2％层粘连蛋白、0.5％胶原蛋白、0.2％纤连蛋白、99.1％溶剂，混合均匀并备用。

准备糖膜蛋白修复液：0.1％卵磷脂、0.12％唾液酸、0.01％多种氨基酸、1.6％葡萄糖、98.17％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入5ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为30Hz、强度为5mt，同时利用激光辐射处理，辐射能量为1j/cm²、波长为1000nm、功率输出为100mw、功率密度为0.4w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次20min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

实施例9

一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法：

1、准备预活化液：0.6％层粘连蛋白、0.3％胶原蛋白、0.4％纤连蛋白、98.7％溶剂，混合均匀并备用。

准备糖膜蛋白修复液：0.3％卵磷脂、0.09％唾液酸、0.03％多种氨基酸、1.2％葡萄糖、98.38％溶剂，混合均匀并备用。

2、取吸脂术后脂肪进行脂肪间充质干细胞的分离与培养；取所述的脂肪间充质干细胞P3-P5代细胞，细胞计数后等密度接种于培养瓶中。培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。

3、在培养瓶中加入3ng/mL预活化液，脂肪间充质干细胞利用电磁辐射处理，频率为70Hz、强度为1mt，同时利用激光辐射处理，辐射能量为3j/cm²、波长为500nm、功率输出为400mw、功率密度为0.1w/cm²，激光辐射处理后，立即加入1uL/mL糖膜蛋白修复液修复处理；连续7天，每天1次，每次40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养。最后收集细胞。

最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：脂肪间充质干细胞经电磁辐射和利用激光辐射同时处理，连续至少7天，每天1次，每次20～40min，并在37℃、5％CO₂浓度、饱和湿度的培养箱中培养；所述电磁辐射时采用预活化液保护处理；所述激光辐射处理后采用糖膜蛋白修复液修复处理；所述电磁辐射的频率为30～70Hz、强度为1～5mt；所述激光辐射的辐射能量为1～5j/cm²、波长为500～1000nm、功率输出为100～400mw、功率密度为0.1～0.4w/cm²；

所述预活化液由以下重量分数的组份组成：0.2-0.8％层粘连蛋白、0.1-0.5％胶原蛋白、0.2-0.6％纤连蛋白、余量为溶剂；

所述糖膜蛋白修复液由以下重量分数的组份组成：0.1-0.4％卵磷脂、0.05-0.12％唾液酸、0.01-0.06％多种氨基酸、0.8-1.6％葡萄糖、余量为溶剂。

2.根据权利要求1所述的一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：所述电磁辐射的频率为50Hz、强度为3mt。

3.根据权利要求2所述的一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：所述激光辐射的辐射能量为5j/cm²、波长为800nm、功率输出为200mw、功率密度为0.2w/cm²。

4.根据权利要求1所述的一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：所述预活化液的添加量为1～5ng/mL。

5.根据权利要求1所述的一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：所述糖膜蛋白修复液的添加为1uL/mL。

6.根据权利要求1所述的一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：所述脂肪间充质干细胞培养所采用的培养基为Lonza无血清培养基+PALL的血清替代物+Gibco的谷氨酰胺混合液。