CN112553124B

CN112553124B - 一种植物乳杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN112553124B
Application number: CN202011575018.6A
Authority: CN
Inventors: 苏昊; 何志刚; 林晓姿; 梁璋成; 任香芸
Original assignee: Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Fujian Academy Of Agricultural Sciences Agricultural Product Processing Research Institute
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112553124A

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌菌株及其应用，所述菌株为植物乳杆菌RPC22，学名为Lactobacillus plantarum RPC22，于2019年4月26日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019297。植物乳杆菌RPC22具有耐受高酸、高糖及耐盐的优良抗逆性，以及产酸快且发酵风味好的特性，可用于果蔬酵素及杂粮米乳发酵及其加工，是食品发酵的优良菌种。

Description

一种植物乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌菌株及其应用。

背景技术

果蔬酵素是一种风靡于日本和我国台湾地区的一种植物性发酵饮料，近年来在我国大陆地区开始流行。制作方法主要是以蔬菜、水果为原料，加入糖或蜂蜜后，经多种复合型微生物长时间发酵。微生物酵素富含多种酶类、维生素、矿物质和微生物次级代谢产物，具有润肠通便、净化血液、改善体质、抗菌、促进细胞新生等作用。利用微生物加工果蔬酵素，既能保留果蔬主要营养成分，还能够产生有利于人体健康的微生物次级代谢产物，易于人体吸收。但目前果蔬酵素的加工还属于作坊式自然发酵方式，依赖原料中的野生微生物群落和自然环境温度，发酵过程并不受控制。在这种情况下必然存在过发酵或不完全发酵而导致一些感官缺陷的问题，甚至由于杂菌污染出现异味的酵素产品，所得酵素产品性状不稳定，质量难保证。解决这个问题的关键就是利用高活性的、稳定的发酵菌种进行一个可再现和连续生产性的发酵过程。

发酵米制品作为一种谷物饮料制品，米乳饮料能够保留了米中的蛋白质、维生素、膳食纤维以及矿物质等对人体健康有益的营养成分，并且以饮料的形式呈现，食用更为方便，营养成分更易吸收。但是目前发酵型米乳饮料还存在多种问题，如菌种单一、风味差、营养素损失多等问题。寻求一种适用于米乳饮料专用的发酵菌株，对于米制品的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌菌株，其分类命名为植物乳杆菌 RPC22，学名为Lactobacillus plantarum RPC22，于2019年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019297，保藏地址为中国. 武汉.武汉大学。

所述植物乳杆菌RPC22具有以下特性：耐高糖特性：可在浓度40％葡萄萄糖环境下自由生长；产酸快的特性：培养24h后产酸总量达到18.63g/L；较强的抗逆性：能耐受pH值2.0的酸度和达12％的盐浓度。所述植物乳杆菌RPC22 用于果蔬酵素发酵，在控制发酵品质的同时能增加酵素的风味口感，是酵素发酵的潜在优良菌源。

附图说明

图1为乳酸菌产酸曲线；

图2为菌株RPC22的菌落平板图；

图3为菌株RPC22的显微图片；

图4为基于16s rDNA片段的菌株RPC22的系统发育树。

具体实施方式

实施例1优良特性菌株的筛选

1材料与方法

1.1材料

1.1.1分离样品

福建南平市浦城县冬季自然发酵的长杆白菜泡菜卤水。

1.1.2培养基

(1)MRS琼脂培养基：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖 2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂1.4％，pH值调整至6.5±0.2。

(2)MRS肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖 2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，pH值调整至5.7±0.2。

1.2方法

1.2.1样品处理

无菌操作吸取5mL分离样品于45mL无菌水中，150转/分钟摇床振荡2h，备用。

1.2.2菌株分离纯化

用对数稀释涂布法，将合适的稀释梯度(使每个平板上的菌落数在10-30个) 样品涂布于MRS琼脂培养基平板上，37℃培养1-2天，根据菌落形态特征挑出不同菌株，接入另一空白平板中继续培养，反复多次直至菌株完全纯化，并转接于MRS琼脂斜面，37℃培养2-3天，待菌体长满后置4℃冰箱保存，备用。

1.2.3菌悬液的制备

用接种环挑取适量纯菌株接种于10mL MRS肉汤培养基中，37℃培养1天，后再吸取2mL培养液转入50mL MRS肉汤培养基中，37℃培养1天，使菌悬液中菌落总数达到1×10⁸个/mL。

1.2.4对照菌株信息

本专利实施案例中使用对照菌株来源：其中菌株编号14917(植物乳杆菌植物亚种)和19435(乳酸乳球菌乳酸亚种)来源于ATCC菌种保藏中心，编号6132 (罗伊氏乳杆菌)来源于CICC菌种保藏中心；代田菌分离自养乐多饮料；菌株 JJ4(酿酒酵母)，为自主选育菌种，现保存于CCTCC菌种保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2018219。

1.2.5耐酸菌株筛选

用6mol/L盐酸调节MRS肉汤培养基的pH值，以1％接种量将活化的各菌株和对照菌代田菌和6132的菌悬液接种至pH值为2.0、2.5和3.0的MRS肉汤培养基，于37℃培养箱培养1天，分别于600nm下测各菌液的接种培养0h和 24h的光密度。

1.2.6耐酸菌株的耐高糖渗透压能力

将活化的各菌株和对照菌代田菌和6132培养液以5％(v/v)的接种量分别接种至糖度为30％和40％的MRS液体培养基，37℃培养箱培养，取样测定培养液的0h和24h的OD600，计算增殖菌量△OD600＝△OD24h-△OD0h。

1.2.6菌株产酸能力

将筛选到的耐酸耐糖性能优异的菌株和对照菌14917和19435以1％接种量接种于MRS肉汤培养基中，置于37℃下恒温培养，在培养时间为0h、3h、6h、 9h、12h、24h、36h、48h分别取样测定培养液的总酸含量(以乳酸计算)。

2.3菌株耐盐能力

将筛选到的耐酸耐糖性能优异的菌株和对照菌14917和19435以5％接种量接种于含有0％、3％、6％、9％、12％NaCL的MRS肉汤中，置于37℃下恒温培养24h，取样测定培养液的0h和24h的OD600，计算增殖菌量ΔOD600＝ΔOD_24h-ΔOD_0h。

2结果与分析

2.1耐酸菌株筛选

从采集的样品中共分离到菌株20株。菌株生长状况以ΔOD600＝ΔOD_24h-ΔOD_0h表示，如表1所示，各菌株均能在pH为2.5和3.0的 MRS肉汤中增殖生长，但只有RPC16、RPC20、RPC22、RPC37和RPC44能耐受pH为2.0的环境且增殖生长，表现出突出的耐酸特性。

表1乳酸菌耐酸性能

注：“--”为菌株未增殖。

2.2耐高糖渗透压菌株筛选

表2乳酸菌耐糖性能

注：“--”为菌株未增殖。

结果如表2所示，菌株RPC12、RPC16、RPC22、RPC26、RPC37能耐受高达40％葡萄糖渗透压环境，在培养基中生长24h后，其中增殖幅度最高的RPC22 达到0.3以上，与对照菌相比，表现出优良的高耐糖特性。

综合以上各菌株的耐酸和耐糖特性，筛选出具有高耐酸耐糖菌株RPC16、 RPC22和RPC37。

2.3菌株产酸能力

对以上试验筛选到的高耐酸耐糖菌株RPC16、RPC22和RPC37的产酸能力进行评估。结果显示，各菌株的产酸曲线(图1)上RPC22、RPC16和RPC37 分别在培养24h、36h、48h时总酸含量达到最高，其中RPC22产酸速率最快，最高值为18.63g/L，其次是RPC16和RPC37。

2.4菌株的耐盐能力

对以上试验筛选到的高耐酸耐糖菌株RPC16、RPC22和RPC37的耐盐能力进行评估。结果显示随着培养液中NaCL浓度的提高，乳酸菌RPC16、RPC22 和RPC37的增殖菌量呈下降趋势(表3)，其中RPC16可生长的最高NaCL含量为9％，RPC37和RPC22在含12％的NaCL培养液中依然能微量增殖，表现出良好的耐盐特性。

表3乳酸菌耐盐性能

综合以上菌株特性研究结果，筛选出高耐酸耐糖耐盐性能好、产酸速率快的优异菌株RPC22。

实施例2菌株RPC22的形态学观察和分子生物学鉴定

1.形态学观察

所筛选的乳酸菌RPC22在MRS固体培养基37℃培养48h后，菌落呈圆形，表面光滑，边缘完整，中央突起，乳白色，不透明(图2)；细胞形态为杆状或椭圆，细胞常呈单个排列，无芽孢，不运动(图3)。

2.分子生物学鉴定

挑取RPC22接种于10mL MRS肉汤中培养，37℃恒温培养18-24h至菌量达到0.5×10⁹cfu/mL，取1mL培养液于离心机中12000r/min离心1分钟，弃上清获得菌体沉淀，并用生理盐水清洗两遍。使用细菌基因组提取试剂盒抽提乳酸菌的总DNA，扩增16S rDNA片段，电泳胶回收目的片段，送测序公司完成测序。其中，PCR扩增引物为：27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；PCR反应条件为：94℃，预变性4min； 94℃，变性30S；55℃，退火30S；72℃延伸1min，35个循环；72℃，延伸10min； 4℃保存。

将16S rDNA基因测序结果序列通过NCBI在GenBank数据库中进行同源比对分析鉴定，分析发现，该乳酸菌和植物乳杆菌同源性为99％。同时以RPC22 与GenBank数据库中下载的乳杆菌属标准菌株的16S rDNA序列联合分析建立菌株RPC22的遗传学系统发育树。从RPC22系统发育树图(图4)上，可以看见菌株RPC22与Lactobacillus plantarum聚类在同一分支，可以判定菌株RPC22 为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

实施例3菌株RPC22在枇杷果蔬酵素发酵上的应用

1材料

1.1菌种

植物乳杆菌RPC22和酿酒酵母JJ4：均由本实验室自主选育。

1.2培养基

MRS肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，pH值调整至5.7±0.2。

MRS琼脂培养基：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂1.4％，pH值调整至6.5±0.2。

麦芽汁培养基：麦芽浸粉13％，(固体培养基添加15％琼脂)，pH值调整至5.6±0.2。

1.3果蔬及其他

枇杷、橘子﹑苹果﹑柠檬﹑土豆﹑藕﹑西红柿、白砂糖，市售。

2方法

2.1发酵菌剂的活化

(1)将RPC22划线接种于MRS培养基，37℃恒温培养1-2天，挑取单一菌落于20mLMRS肉汤培养基中，37℃恒温培养1天得到，菌量达到1×10⁹ cfu/mL。

(2)将JJ4划线接种于麦芽汁培养基，30℃恒温培养1-2天，挑取单一菌落于20mL麦芽汁肉汤培养基中，30℃恒温培养1天得到，菌量达到1×10⁸cfu/mL。

2.2混合果蔬基料制备

将枇杷、橘子﹑苹果﹑柠檬﹑土豆﹑藕﹑西红柿等果蔬洗净后，去皮去核后，按1:1质量比混合并打浆，添加35％质量的白砂糖混匀得到混合果蔬基料。

2.3接种

将活化好的RPC22和JJ4菌液分别以5％接种量接入混合果蔬基料中，混匀后装罐密封，装罐量为容积的80％。

2.4发酵

前发酵：在35℃条件下进行恒温发酵15d，前7d每天搅拌一次。

过滤：前发酵完成后用双层纱布过滤。

二次发酵：将过滤后的前发酵液密封后于常温避光处后发酵30d成熟，得枇杷果蔬酵素。所得酵素原液具有独特的枇杷原料发酵香，口感怡人。

实施例4菌株RPC22在龙眼果蔬酵素发酵上的应用

1材料

1.1菌种

植物乳杆菌RPC22和酿酒酵母JJ4：均由本实验室自主选育。

1.2培养基

1.3果蔬及其他

龙眼、橘子﹑苹果﹑梨﹑萝卜﹑土豆﹑西红柿、红砂糖，市售。

2方法

2.1发酵菌剂的活化

2.2混合果蔬基料制备

将龙眼、橘子﹑苹果﹑梨﹑萝卜﹑土豆﹑西红柿等果蔬洗净后，去皮去核后，按1:1质量比混合并打浆，添加30％质量的红砂糖混匀得到混合果蔬基料。

2.3接种

将活化好的RPC22和JJ4菌液分别以6％接种量接入混合果蔬基料中，混匀后装罐密封，装罐量为容积的80％。

2.4发酵

前发酵：在35℃条件下进行恒温发酵12d，前5d每天搅拌一次。

过滤：前发酵完成后用双层纱布过滤。

二次发酵：将过滤后的前发酵液密封后于常温避光处后发酵25d成熟，得龙眼果蔬酵素。所得酵素原液具有独特的龙眼原料发酵香，口感怡人。

实施例5菌株RPC22在糙米乳饮料加工中的应用

1.菌种

1.1本实验室分离、鉴定并保存菌种：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RPC22，保藏号CCTCC M:2019297；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JJ4，保藏号CCICC NO：M:2018219；副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)RP38，保藏号CCICC NO：M:2019322，均由福建省农产品(食品) 加工重点实验室提供。

1.2购自中国工业微生物菌种保藏中心：瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus) CICC 20243、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CICC 6084、类干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)CICC 22709。

2.原料：液化糖化后的糙米浆基质。

3.试验方法

各菌种分别扩培2次，使菌体生物量达10⁸CFU/mL以上，经4800r/10min 离心取菌泥，用无菌水洗脱，按原体积复原备用，按糙米浆重量的2％接种，置于30℃发酵10h，检测发酵过程的pH值变化，发酵结束后沸水浴杀菌，中心温度100℃维持15min，冷却后进行风味评价。

感官评价方法按照[GB/T 29605-2013]中所述方法设置感官评价指标，选取 10名评价员，对糙米发酵的甜味、酸味、米香味和奶香味进行感官品评并打分，采用10分制，每个指标赋予权重25％。

表4糙米发酵的感官评定标准表

4.菌种筛选试验结果

发酵结果见表5。单菌发酵处理组里，处理1-1pH值最低即产酸高，感官评价最好。复配发酵处理组的感官评分均高于单菌发酵组，其中，处理2-1、2-2、2-3的pH值均低于5，感官评分均达9.2分以上。综上，菌株RPC22具有产酸能力强且产香増味的特点，是适用于糙米乳发酵的理想菌种，适宜与酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)JJ4、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)RP38和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CICC 20243复配发酵，用于杂粮米乳的发酵加工。

表5发酵结果

Claims

1.一种植物乳杆菌菌株，其特征在于：分类命名为植物乳杆菌RPC22，学名为Lactobacillus plantarum RPC22，于2019年4月26日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019297。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌RPC22在果蔬酵素发酵中的应用。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌RPC22在米制品发酵中的应用。