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CN112552414A - 一种lilrb4和b7-h3双靶向的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种lilrb4和b7-h3双靶向的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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CN112552414A CN202011596313.XA CN202011596313A CN112552414A CN 112552414 A CN112552414 A CN 112552414A CN 202011596313 A CN202011596313 A CN 202011596313A CN 112552414 A CN112552414 A CN 112552414A
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Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体领域，公开了一种嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包含依次连接的抗LILRB4单链抗体、抗B7‑H3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4‑1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN全长。细胞学实验结果表明，表达所述嵌合抗原受体的T细胞，对肿瘤细胞的杀伤效果优于单靶点同类型CAR‑T。动物实验结果表明，表达所述嵌合抗原受体的T细胞，可以显著延长动物的生存率，效果优于单靶点同类型CAR‑T。本发明还公开了一种LILRB4和B7‑H3双靶向的嵌合抗原受体的应用，用于制备治疗急性髓细胞白血病的药物。

Description

一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体技术领域，尤其是涉及一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗由于在血液肿瘤中取得了显著疗效，正在成为一种富有前景的免疫治疗策略。CAR-T细胞指的是一种经过人工基因改造的在细胞表面表达嵌合型抗原受体(CAR)的T细胞。CAR是CAR-T的核心部件，赋予T细胞以组织相容性抗原(HLA)非依赖的方式识别肿瘤表面肿瘤相关抗原(TAA)的能力。因此，CAR-T细胞在体内能特异性靶向表达有TAA表面标记的肿瘤细胞，并通过激活T细胞免疫反应杀伤肿瘤细胞。2010年，首例B细胞淋巴瘤患者接受靶向CD19的CAR-T细胞治疗并取得了令人振奋的积极效果。此后，越来越多的研究组通过临床试验证实了CAR-T技术治疗B细胞血液肿瘤的安全性和有效性。
急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是成人中最常见的、死亡率最高的一类白血病，在治疗上仍面临着挑战。目前，急性髓细胞白血病的治疗仍以化疗为主，病人达到完全缓解后桥接异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)。该方法可以使部分AML患者获得完全缓解，对于接受allo-HSCT的AML患者，5年无病生存期(Disease-free survival，DFS)可达到40-50％。但是，大约有43％的患者接受首次化疗后复发，而复发患者仅有一半能获得完全缓解，复发情况下的存活率低于15％。再者，有18％的患者在经历多次化疗诱导后仍无法达到完全缓解。
目前世界范围内有记录的CAR-T相关临床试验已超过1000项，并且有三款CAR-T产品被FDA批准上市，分别用于治疗急性B细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。然而，由于髓系血液肿瘤的异质性，目前CAR-T疗法在AML的治疗方面的进展情况并不理想。已经开展的靶向CD33，CD123等靶点的CAR-T疗法，在临床应用中普遍出现不同程度的造血系统损害。究其原因，主要是以上所述靶点均在正常造血祖细胞中有不同程度表达，所以CAR-T细胞在体内的持续存留可能对于造血系统造成不可逆转的脱靶毒性。
CAR-T细胞治疗在临床实践中，另一个亟待解决的重要问题是复发。在接受CD19CAR-T治疗并获得完全缓解的急性B淋巴细胞白血病患者中，大约有30-50％的患者最终复发，其中大多数患者在首次治疗后1年内复发。复发分为两种情况，CD19阳性肿瘤复发及CD19阴性肿瘤复发。接受CD19 CAR-T治疗的病例中，超过60％的复发是CD19阴性，即由于肿瘤细胞丢失CD19表面抗原引起。
因此，本技术领域亟需开发一种既能追杀发生抗原逃逸的急性髓系白血病肿瘤细胞又不会对造血系统造成不可逆转的脱靶毒性的CAR-T产品。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包括：
依次连接的抗LILRB4单链抗体、抗B7-H3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN蛋白肽；或
具有所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相似生物活性的嵌合抗原受体。
作为优选，所述嵌合抗原受体包括第一功能蛋白或第二功能蛋白；或
在所述第一功能蛋白或所述第二功能蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
所述第一功能蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示；
所述第二功能蛋白的氨基酸序列通过将所述第一功能蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到，所述第二功能蛋白与所述第一功能蛋白具有相同的生物活性。
具体地，所述抗LILRB4单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第22-280位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；和/或
所述抗B7-H3单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第296-525位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；和/或
所述人CD8铰链跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第526-594位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；和/或
所述人4-1BB胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第595-641位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；和/或
所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第642-760位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；和/或
所述人P2A肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第761-779位所示或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列；
所述人IFN为人IFNα2a或人IFNα2b或人IFNβ；
所述人IFNα2b的氨基酸序列如SEQ ID NO:4第780-967位氨基酸所示；或
与所述人IFNα2b具有相似生物学活性的氨基酸序列；
所述人IFNα2a的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第780-967位氨基酸所示；或
与所述人IFNα2a具有相似生物学活性的氨基酸序列；
所述人IFNβ的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第780-966位氨基酸所示；或
与所述人IFNβ具有相似生物学活性的氨基酸序列；
具有相似生物学活性的氨基酸是指具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸、具有非极性侧链的氨基酸、具有β-分支侧链的氨基酸和具有芳香侧链的氨基酸。
作为优选，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:4中第1-21位或与其具有相似生物学活性的氨基酸序列。
本发明的目的之二在于提供了一种多核苷酸序列。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码上述嵌合抗原受体。
作为优选，包括第一基因序列或第二基因序列；或
通过将所述第一基因序列或所述第二基因序列进行核苷酸序列杂交得到的第三基因序列；
所述第一基因序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；
所述第二基因序列为与所述第一基因序列的同一性达75％以上的核苷酸序列。
具体地，所述抗LILRB4单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第64-840位多核苷酸序列所示；和/或
所述抗B7-H3单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第886-1575位多核苷酸序列所示；和/或
所述人CD8铰链跨膜区的编码序列为SEQ ID NO:1中第1576-1782位多核苷酸序列所示；和/或
所述人4-1BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1中第1783-1923位多核苷酸序列所示；和/或
所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1中第1924-2280位多核苷酸序列所示；和/或
所述人P2A肽的编码序列如SEQ ID NO:1中第2281-2337位多核苷酸序列所示；和/或
所述人IFN全长序列为人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ中任一基因的全长序列，或分别由人IFNα2a、人IFNα2b或人IFNβ经过基因优化得到的oIFNα2a、oIFNα2b和oIFNβ。
本发明的目的之三在于提供了一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞。所述LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞为将上述编码嵌合抗原受体的基因序列导入T细胞中制备得到。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于T细胞中稳定表达如权利要求1-3任意一项所述的嵌合抗原受体。
本发明通过在LILRB4-B7H3-CAR序列的C末端增加基因优化的人IFN全长编码序列，得到LILRB4-B7H3-CAR-IFN多核苷酸序列。其中IFN基因序列可以是人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ三者之中任一基因的全长序列。人IFNα2a和人IFNα2b的氨基酸序列高度相似，仅在第23位氨基酸不同(人IFNα2a第23位氨基酸是K，人IFNα2b第23位氨基酸是R，属于保守性取代)。而人IFNβ同样属于I型干扰素，与上述二者相比生物学功能相近，均具有诱导肿瘤细胞凋亡和调节免疫细胞活性的作用。临床研究中常常将IFNα2和IFNβ互相替代使用。动物实验表明，在B7H3-CAR的C末端增加人IFNα2b基因全长片段后，较B7H3-CAR序列相比，表达B7H3-CAR-IFNα2b的CAR-T细胞在动物体内具有更强的肿瘤杀伤能力。因此申请人认为上述三种基因的任一种均能起到对CAR-T细胞的增效作用。
适用于本发明的人CD8铰链跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8铰链跨膜区序列。作为示范性例子，本发明中人CD8α铰链跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4第526-594位氨基酸所示。
适用于本发明的人4-1BB胞内区可以是本领域已知的各种用于CAR的人4-1BB胞内区。作为示范性例子，本发明使用的人4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4第595-641位所示。
适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3ζ胞内区。作为示范性例子，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4第642-760位氨基酸所示。
适用于本发明的P2A肽可以是本领域常规用于CAR的各种自剪切序列。作为示范性例子，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4第761-779位氨基酸所示。本发明也包括SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明采用抗LILRB4单链抗体(具体是衍生自克隆号293623的scFv)和抗B7-H3单链抗体(具体是衍生自克隆号C11D5.3的scFv)的基因序列，或是经过噬菌体展示技术筛选获得的抗体构建的scFv序列。从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8铰链跨膜区、人的4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区、P2A肽和人IFN基因cDNA全长序列(包括人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ基因的cDNA全长序列)信息。所述人IFN基因的cDNA全长序列分别经过基因优化得到各自在人T细胞中表达效率最高的IFN全长序列(oIFN，包括oIFNα2a、oIFNα2b和oIFNβ)。
本发明通过全基因合成嵌合抗原受体抗LILRB4 scFv-B7-H3scFv-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-oIFN的基因片段，插入到逆转录病毒载体中。重组质粒在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。转导的核酸通过转录、翻译表达在CAR-T细胞表面。用流式细胞术，通过检测与抗B7-H3单链抗体κ链结合的protein L的含量，可以计算出逆转录病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。本发明通过逆转录病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高达80％。体外通过酶联免疫反应(ELISA)检测发现，CAR-T细胞能分泌大量的IFN至培养基上清，说明逆转录病毒成功转导至T细胞并表达分泌型的IFN。CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能可以通过CFSE标记实验进行检测。本发明制备的CAR-T细胞对LILRB4或B7-H3阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，在效靶比是1比1的情况下，杀伤效率超过80％。在效靶比是1比27的情况下，杀伤效率仍超过30％。在动物实验中，相比于单靶向LILRB4的CAR-T细胞，LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞能更有效和持久地杀灭移植到动物体内的U266肿瘤细胞(LILRB4+B7H3+)。
本发明的目的之四在于提供了一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞的应用，其特征在于将上述LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞用于制备治疗急性髓细胞白血病的药物。
本发明首次构建同时表达LILRB4和B7-H3双靶点scFv的CAR，并用于制备CAR-T细胞。同时在CAR的C末端增加人IFN全长基因，获得同时表达CAR和释放分泌型人IFN蛋白的CAR-T细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)LILRB4和B7-H3均证实在AML患者的肿瘤组织中高表达，并且其表达水平与预后呈正相关，暗示其在肿瘤发展过程中的重要功能，同时靶向这两个TAA的CAR-T细胞可有效抑制肿瘤生长；
2)LILRB4和B7-H3在不同分型的AML中表达略有区别，LILRB4主要在单核细胞AML(M4/M5)中表达，而B7-H3在M3和M5分型，以及NMP1突变的AML中表达较高，两个TAA的表达谱互补更有利于防止抗原逃逸；
3)LILRB4和B7-H3均具有免疫检查点的特性，同时靶向两种抗原可能具有额外的免疫激活功能；
4)双靶向LILRB4和B7-H3的CAR-T细胞，配合IFN的增效作用，可最大限度地激活微环境免疫细胞，防止抗原免疫逃逸作用。其中，IFN增效的四代CAR也是本团队的独创设计。细胞因子可以调节肿瘤组织周围的免疫微环境，同时作为第三信号，进一步提高CAR-T细胞的应答水平。细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，种类多达数百种。而选择I型干扰素作为第三信号，是基于已有的研究成果和申请人的大量前期研究工作。首先I型干扰素是目前研究最早的干扰素类型，对其生理功能和潜在副作用已有较深入和全面的认识；其次，I型干扰素具有多重调节作用，一方面可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面也能调控T细胞活性；最后，人工制备的I型干扰素重组蛋白，例如INFα2a，IFNα2b和IFNβ等，在临床上已应用于多种类型肿瘤治疗，但是由于直接注射的干扰素重组蛋白在体内半衰期短，且不易到达病灶部位，因此，I型干扰素与CAR-T细胞疗法联合使用有利于在正确的时间和地点最大限度发挥IFNα2b的生物学功能。人IFN基因序列可以是人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ三者之中任一基因的全长序列。该设计的精妙之处在于，CAR基因和IFN基因之间用P2A肽分隔，因此可以同时表达CAR和分泌型的IFN蛋白。在CAR-T细胞到达肿瘤病灶并激活CAR基因的同时，P2A肽在细胞内的蛋白酶的作用下水解，释放游离的IFN，分泌到胞外发挥免疫激活功能。IFN的表达受到CAR基因的调控，因此可以在病灶部位释放IFN活性，起到精准增效的作用。
附图说明
图1为CAR序列示意图；ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区。A.LILRB4-CAR T；B.B7H3-CAR T；C.LILRB4-CAR-IFN T；D.LILRB4-B7H3-CAR-IFN T；
图2A，流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4+亚群和CD8+亚群的CAR-T细胞表面Protein L的阳性率，即CAR的表达效率；B，酶联免疫反应(ELISA)检测逆转录病毒感染后，CAR-T细胞培养基上清中IFNα2的含量；
图3为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE标记法检测靶细胞裂解率；
图4为U266肿瘤移植模型中，尾静脉注射CAR-T细胞后，D-luciferin钠盐成像，观察小鼠体内的肿瘤细胞残留情况；A，主要实验流程；B，图片显示各组别小鼠钠盐成像结果。C，统计不同时间点各组别小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1：
1)LILRB4-B7H3-CAR-IFNα2b T基因序列的确定和逆转录病毒载体的构建：
LILRB4的scFv序列衍生自克隆#293623；B7H3的scFv序列衍生自克隆号C11D5.3。从NCBI网站数据库搜索到人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区和人IFNα2b全长cDNA序列信息。野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列称为nIFNα2b。将nIFNα2b序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化得到oIFNα2b，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
按照LILRB4 scFv、linker、B7-H3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、oIFNα2b的顺序得到LILRB4-B7H3-CAR-IFNα2b全长多核苷酸序列。同时构建仅包含LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区的LILRB4-CAR，包含LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人IFN全长的LILRB4-CAR-IFN，以及包含B7-H3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人IFN全长的B7H3-CAR-IFN三个全长多核苷酸序列作为对照。同时构建靶向CD19的CAR(CTR-CAR)作为阴性对照。LILRB4-B7H3-CAR-IFNα2b全长多核苷酸序列和氨基酸序列信息见核苷酸序列表(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4)。LILRB4-CAR全长多核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示。LILRB4-CAR-IFN全长多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。B7H3-CAR-IFN全长多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。CTR-CAR全长多核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。以上全部多核苷酸在擎科生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体上，并再次测序确定。
用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切以上各种CAR的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连接后，插入逆转录病毒(MP71)的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。
使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的以上各种CAR质粒可进行逆转录病毒包装实验。最终获得5种表达不同序列的CAR的逆转录病毒。
本步骤所构建得到的质粒图谱如图1所示。
2)逆转录病毒包装和产毒株的建立：
使用步骤1)制备得到的表达各种CAR的逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装5种逆转录病毒：
1.第1天：Phoenix Ecotropic(ECO)细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×106/ml细胞密度铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；
2.第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒MP71-目的基因12.5μg，1.25M CaCl2 250μl，H2O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2×HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。
3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后，即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。
4.产毒株的建立：从上得到的逆转录病毒再感染HY268细胞，感染两天后进行流式细胞分选，筛选分泌逆病毒滴度最高的单细胞来源的细胞株并长期保存。利用此细胞株可以大规模制备逆转录病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。
3)逆转录病毒感染人的T细胞：
1.复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1-2×106/ml。
2.Ficoll分离液(天津灏洋)收集PBMC，磁珠法分离获得较纯的CD3+T细胞，按磁珠:CD3+细胞比为3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。
3.T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2ml。避光，4℃过夜备用。
4.T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。
5.将步骤2)制得的逆转录病毒液加入孔内，每孔加5-6ml，32℃，2000×g，离心2h。每孔加入含hIL-2(500U/ml)的新鲜完全培养基3ml，继续培养1天。
6.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100U/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×105/ml左右，便于细胞扩增。
7.由此获得分别感染了步骤2)制备的五种逆转录病毒的CAR-T细胞(LILRB4-B7H3-CAR-IFN T，LILRB4-CAR-IFN T，LILRB4-CAR T，B7H3-CAR-IFN T和CTR-CAR T)。
4)酶联免疫法检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白和IFNα2b蛋白的表达：
由于抗B7-H3单链抗体的轻链是κ链能结合Protein L，因此我们用FACS方法通过检测与CAR-T细胞结合的生物素标记的Protein L来说明CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达。
分别离心收集感染后72小时的步骤3)制备得到的两种CAR-T细胞(LILRB4-B7H3-CAR-IFN T、LILRB4-CAR T，实验组)和Control T细胞(CTR-CAR T，对照组)，1％BSA-PBS洗涤1次后弃上清，加入生物素(biotin)标记的protein L抗体避光30min后1％BSA-PBS洗涤3次，重悬；再加入PE标记的亲和素(Streptavidin)，避光10min后1％BSA-PBS洗涤，重悬；最后流式细胞仪检测PE的荧光强度。
图2中A显示，使用步骤3)制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4+T细胞和CD8+T细胞中Protein L(CAR)的阳性率均达到80％。
IFNα2b和IFNα2a同属于IFNα2亚家族，具有高度的序列同源性，通过ELISA检测上清中IFNα2的含量，可以验证IFNα2b的表达水平。以步骤3)获得的五种CAR-T细胞为供试细胞，按照如下步骤进行操作：分别离心收集感染后72小时的供试细胞，收集培养后的上清液，ELISA(Biolegend)检测上清液中IFNα2的含量。
图2中B显示ELISA的检测结果，LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞上清中的IFNα2b含量显著高于CTR-CAR T和LILRB4-CAR T细胞。该结果确证LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞可以表达分泌型的IFNα2b。
5)CFSE标记法检测CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用：
CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为：靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算CAR T细胞对靶细胞的杀伤率。具体步骤如下：
1、将对数期的THP-1细胞300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×107个/ml。
2、将细胞密度为(1-2)×107个/ml的HepG2细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE(5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光37℃孵育10min。
3、加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。
4、去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。
5、将染色的THP-1细胞接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种THP-1细胞(5×104个/100μl)，分别加入不同数量的各种CAR-T细胞，使CAR-T细胞与THP-1细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:27；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种THP-1细胞(5×104个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。
6、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。
7、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值。
8、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和低标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：
T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。
实验结果如图3和表1所示。结果显示：使用LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞和靶细胞THP-1按照不同效靶比共培养后，在效靶比为1:1时，细胞裂解率达到90％以上；效靶比为1:27时，细胞裂解率仍有30％以上。其杀伤效果略优于LILRB4-CAR-IFN T，远优于B7H3-CAR-IFN T和CTR CAR T。
表1 CAR T细胞杀伤肿瘤细胞的裂解率(％)统计。
Figure BDA0002869046270000161
6)肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用：
1.B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图)的尾静脉接种带有荧光素标记的人骨髓瘤细胞U266-luc(上海晶抗)。接种量为1×107/0.3ml。随机分为3个组别，分别为CTR-CART，LILRB4-CAR T细胞对照组，和LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞组，每组各6只小鼠。(图4中A)
2.接种肿瘤细胞15天后，在小鼠尾静脉分别注射不同类型的CAR-T细胞，注射的CAR-T细胞量为5×106CAR+T/0.3ml。
3.分别在注射CAR-T细胞7天、14天和21天后，在小鼠腹腔注射3mg的D-luciferin进行钠盐成像。观察小鼠体内残留肿瘤细胞的数量，统计荧光素强度(光子密度)。
图4中B显示，与CTR-CAR T对照组和LILRB4-CAR T相比，注射LILRB4-B7H3-CAR-IFN T的小鼠体内的人骨髓瘤细胞残留明显减少。说明LILRB4-B7H3-CAR-IFN T细胞杀伤肿瘤的效果更好。图4中C显示，注射CAR-T后40天左右，注射LILRB4-B7H3-CAR T细胞的小鼠死亡率远低于LILRB4-CAR T细胞和CTR-CAR T细胞的小鼠。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司
<120> 一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体及其应用
<141> 2020-12-29
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2904
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctatggctc tgcctgtgac cgccctgctg ctgcctctgg ctctgctgct gcacgccgct 120
cggcctgagg tgaacctgga ggagagcggg ggggggctgg tgcagcctgg aggaagtatg 180
aagctgagct gtattgccag cggattcaca tttagcaact attggatgaa ctgggtgagg 240
cagagtcccg agaagggact ggagtgggtg gcagaaatta gactgaagta caacaactac 300
gccacacact acgcagaaag cgtgaagggg agattcacca tcagcagaga cgatagcaag 360
agcaccgtgt acctgcagat gaacaatctg agagccgagg acaccgggat ctactactgt 420
accggcacaa gatacggaag cagcctggac tactggggcc aggggacaag cgtgacagtg 480
agctccggcg gcgggggttc tgacattgtg atgagccaga gcccctcctc cctggcagtg 540
agcgtgggag aaaaagtgac catgagctgc aagagcagcc agaacctgtt ttacagcacc 600
aaccagaaaa actacctggc ctggtaccag cagaagcccg gccagtctcc caagctgctg 660
atttattggg ccagcacaag agagagcggc gtgcccgaca gattcaccgg aagcggcagc 720
ggaacagcct tcaccctgac tatcagcagc gtgaaagctg aggacctggc cgtgtactac 780
tgtcagcagt actacaacta cccactgacc ttcggcgcag gcaccaagct ggagctgaag 840
ggcggcgggg gttctggtgg cggcggcagc ggcggtggag gatcagacat tgtgatgacc 900
cagagccaca aatttatgag caccagcatt ggagcccgcg tgagcattac ctgcaaggcc 960
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ctgctgatct acagcgccag ctacagatac accggcgtgc ccgaccgctt caccggaagc 1080
ggaagcggaa ccgacttcac cttcaccatc agcagcgtgc aggctgaaga cctggccgtg 1140
tactactgcc agcagcacta cggaaccccc ccctggacct tcggaggagg caccaaactg 1200
gaaatcaaag gtggcggcgg cagcgaggtg cagctggtgg aaagcggggg aggactggtg 1260
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gccatgagct gggtgagaca gacacccgag aagagactgg agtgggtggc agccatcagc 1380
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gacaacgcta agaacttcct gtacctgcag atgagcagcc tgagaagcga ggacacagca 1500
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tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 1800
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acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 1920
ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 1980
ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 2040
ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 2100
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agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 2220
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gcgacgaact ttagtttgct gaagcaagct ggggatgtag aggaaaatcc gggtcccatg 2340
gccctgacct tcgccctgct ggtggccctg ctggtcctga gctgcaagag ctcctgcagc 2400
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cctcaggagg aatttggaaa ccagttccag aaggccgaaa ccatccccgt gctgcacgag 2580
atgatccagc agatcttcaa cctgttctcc accaaagata gcagcgcagc ctgggacgaa 2640
accctgctgg acaagttcta caccgagctg taccagcagc tgaacgacct ggaggcctgc 2700
gtgatccagg gcgtgggagt gaccgagaca ccactgatga aagaggatag cattctggcc 2760
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<211> 2904
<212> DNA
<213> 人工合成
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cggcctgagg tgaacctgga ggagagcggg ggggggctgg tgcagcctgg aggaagtatg 180
aagctgagct gtattgccag cggattcaca tttagcaact attggatgaa ctgggtgagg 240
cagagtcccg agaagggact ggagtgggtg gcagaaatta gactgaagta caacaactac 300
gccacacact acgcagaaag cgtgaagggg agattcacca tcagcagaga cgatagcaag 360
agcaccgtgt acctgcagat gaacaatctg agagccgagg acaccgggat ctactactgt 420
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485 490 495
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Asp Gly Tyr Leu
500 505 510
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
515 520 525
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
530 535 540
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
545 550 555 560
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
565 570 575
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
580 585 590
Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
595 600 605
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
610 615 620
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
625 630 635 640
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
645 650 655
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
660 665 670
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
675 680 685
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
690 695 700
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
705 710 715 720
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
725 730 735
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
740 745 750
Arg Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
755 760 765
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Asn Lys Cys
770 775 780
Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser
785 790 795 800
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
805 810 815
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
820 825 830
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
835 840 845
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
850 855 860
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
865 870 875 880
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
885 890 895
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
900 905 910
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
915 920 925
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
930 935 940
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
945 950 955 960
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
965
<210> 7
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctagctacg tgctgaccca gcccccctcc gtgagcgtgg cacctggaaa aacagccaga 120
atctcctgcg gaggaaacaa catcggaacc aagaacgtgc actggtacca gcagaaaccc 180
ggacaggccc ccgtgctggt ggtgtacgcc gacagcgacc gccccagcgg aatcccagag 240
agattcagcg gcagcaacag cggaaacacc gccaccctga ccatcagcag agtggaagtg 300
ggagacgaag ccgactatta ttgccaggtg tgggactccg tgagctatca cgtggtgttc 360
ggcggaggaa caacactgac agtgctgggg ggcggcgggg gttctggtgg cggcggcagc 420
ggcggtggag gatcacaggt gcagctggtg gaaagtggcg gcggcgtggt gcagcccgga 480
ggaagcctga gactgagctg cgcccccagc ggcttcgtgt tcagatccta tggcatgcac 540
tgggtgagac agacacctgg caaagggctg gagtgggtga gtctgatttg gcacgacggc 600
agcaaccggt tctacgccga cagcgtgaag ggcagattca ccattagcag agacaacagc 660
aaaaacacac tgtatctgca gatgaacagc ctgagagccg aagacaccgc catgtatttc 720
tgcgctaggg agagactgat cgccgcccct gccgccttcg acctgtgggg acagggcacc 780
ctggtgaccg tgtccagcac tacaactcca gcacccagac cccctacacc tgctccaact 840
atcgcaagtc agcccctgtc actgcgccct gaagcctgtc gccctgctgc cgggggagct 900
gtgcatactc ggggactgga ctttgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggtt cagtgtcgtg 1020
aagagaggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgag gcccgtgcag 1080
actacccagg aggaagatgg atgcagctgt agattccctg aagaggagga aggaggctgt 1140
gagctgagag tgaagttctc ccgaagcgca gatgccccag cctatcagca gggacagaat 1200
cagctgtaca acgagctgaa cctgggaaga cgggaggaat acgatgtgct ggacaaaagg 1260
cggggcagag atcctgagat gggcggcaaa ccaagacgga agaaccccca ggaaggtctg 1320
tataatgagc tgcagaaaga caagatggct gaggcctact cagaaatcgg gatgaagggc 1380
gaaagaagga gaggaaaagg ccacgacgga ctgtaccagg ggctgagtac agcaacaaaa 1440
gacacctatg acgctctgca catgcaggct ctgccaccaa gacgagctaa acgaggctca 1500
ggctga 1506
<210> 8
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctatgatcc ccaccttcac cgccctgctg tgcctgggcc tgagcctggg acctagaacc 120
cacatgcagg ccggccccct gcccaagcct accctgtggg ctgagcccgg cagcgtgatc 180
agctggggca actccgtgac catttggtgc cagggaaccc tggaggctag agagtacaga 240
ctggacaagg aggagagccc cgccccctgg gatagacaga accccctgga gcccaagaac 300
aaggctagat tcagcatccc cagcatgacc gaagactacg ccggaagata taggtgctac 360
tatagaagcc ccgtgggctg gagccagccc agcgatccac tggaactggt gatgacagga 420
gcctacagca aacccaccct gagcgccctg cccagccctc tggtgaccag cggaaagagc 480
gtgaccctgc tgtgtcagag cagaagcccc atggacacct ttctgctgat caaagagaga 540
gccgcccacc ccctgctgca cctgagaagc gaacacggag cccagcagca tcaggccgag 600
ttccccatga gcccagtgac aagcgtgcac ggcggcacct acagatgctt cagcagccac 660
ggcttctccc actacctgct gagccacccc agcgaccccc tggaactgat cgtgagcggc 720
agcctggaag gccctagacc cagtcccacc agaagcgtga gcaccgccgc cggacccgag 780
gatcagccac tgatgcccac cggatccgtg ccccatagcg gcctgaggag acactgggaa 840
gtgctgatcg gcgtgctggt ggtgagcatc ctgctgctga gcctgctgct gttcctgctg 900
ctgcagcact ggagacaggg gaagcataga accctggctc agagacaggc cgattttcag 960
agaccccctg gcgccgctga gcccgaacct aaagacgggg gcctgcagag aagaagcagc 1020
cccgccgccg acgtgcaggg agaaaacttc tgcgccgccg tgaagaacac ccagcccgaa 1080
gacggcgtgg aaatggacac cagacagagc ccacatgacg aagaccccca ggccgtgacc 1140
tacgccaagg tgaagcacag cagacccaga agagagatgg ccagcccccc cagcccactg 1200
tctggcgaat ttctggacac caaggacaga caggctgaag aagacagaca gatggacacc 1260
gaagccgccg cctccgaggc ccctcaggat gtgacctacg ctagactgca ctccttcacc 1320
ctgaggcaga aggccacaga acccccaccc tcccaggaag gcgccagccc tgctgaaccc 1380
tccgtgtacg ccaccctggc catccacact acaactccag cacccagacc ccctacacct 1440
gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 1500
gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1560
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1620
agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1680
cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1740
ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1800
ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1860
gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1920
gaaggtctgt ataatgagct gcagaaagac aagatggctg aggcctactc agaaatcggg 1980
atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 2040
gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 2100
cgaggctcag gctga 2115
<210> 9
<211> 2736
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctatgatcc ccaccttcac cgccctgctg tgcctgggcc tgagcctggg acctagaacc 120
cacatgcagg ccggccccct gcccaagcct accctgtggg ctgagcccgg cagcgtgatc 180
agctggggca actccgtgac catttggtgc cagggaaccc tggaggctag agagtacaga 240
ctggacaagg aggagagccc cgccccctgg gatagacaga accccctgga gcccaagaac 300
aaggctagat tcagcatccc cagcatgacc gaagactacg ccggaagata taggtgctac 360
tatagaagcc ccgtgggctg gagccagccc agcgatccac tggaactggt gatgacagga 420
gcctacagca aacccaccct gagcgccctg cccagccctc tggtgaccag cggaaagagc 480
gtgaccctgc tgtgtcagag cagaagcccc atggacacct ttctgctgat caaagagaga 540
gccgcccacc ccctgctgca cctgagaagc gaacacggag cccagcagca tcaggccgag 600
ttccccatga gcccagtgac aagcgtgcac ggcggcacct acagatgctt cagcagccac 660
ggcttctccc actacctgct gagccacccc agcgaccccc tggaactgat cgtgagcggc 720
agcctggaag gccctagacc cagtcccacc agaagcgtga gcaccgccgc cggacccgag 780
gatcagccac tgatgcccac cggatccgtg ccccatagcg gcctgaggag acactgggaa 840
gtgctgatcg gcgtgctggt ggtgagcatc ctgctgctga gcctgctgct gttcctgctg 900
ctgcagcact ggagacaggg gaagcataga accctggctc agagacaggc cgattttcag 960
agaccccctg gcgccgctga gcccgaacct aaagacgggg gcctgcagag aagaagcagc 1020
cccgccgccg acgtgcaggg agaaaacttc tgcgccgccg tgaagaacac ccagcccgaa 1080
gacggcgtgg aaatggacac cagacagagc ccacatgacg aagaccccca ggccgtgacc 1140
tacgccaagg tgaagcacag cagacccaga agagagatgg ccagcccccc cagcccactg 1200
tctggcgaat ttctggacac caaggacaga caggctgaag aagacagaca gatggacacc 1260
gaagccgccg cctccgaggc ccctcaggat gtgacctacg ctagactgca ctccttcacc 1320
ctgaggcaga aggccacaga acccccaccc tcccaggaag gcgccagccc tgctgaaccc 1380
tccgtgtacg ccaccctggc catccacact acaactccag cacccagacc ccctacacct 1440
gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 1500
gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1560
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1620
agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1680
cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1740
ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1800
ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1860
gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1920
gaaggtctgt ataatgagct gcagaaagac aagatggctg aggcctactc agaaatcggg 1980
atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 2040
gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 2100
cgaggctcag gcgcgacgaa ctttagtttg ctgaagcaag ctggggatgt agaggaaaat 2160
ccgggtccca tggccctgac cttcgccctg ctggtggccc tgctggtcct gagctgcaag 2220
agctcctgca gcgtggggtg cgacctgccc cagacccaca gcctgggctc cagaagaacc 2280
ctgatgctgc tggcccagat gagaagaatc agtctgttca gctgcctgaa agacagacac 2340
gactttggct tccctcagga ggaatttgga aaccagttcc agaaggccga aaccatcccc 2400
gtgctgcacg agatgatcca gcagatcttc aacctgttct ccaccaaaga tagcagcgca 2460
gcctgggacg aaaccctgct ggacaagttc tacaccgagc tgtaccagca gctgaacgac 2520
ctggaggcct gcgtgatcca gggcgtggga gtgaccgaga caccactgat gaaagaggat 2580
agcattctgg ccgtgaggaa atacttccag agaatcaccc tgtacctgaa agagaaaaag 2640
tacagtccct gcgcctggga ggtggtgaga gccgagatca tgagaagctt cagcctgagc 2700
accaatctgc aggaaagcct gagaagcaag gagtga 2736
<210> 10
<211> 2994
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctatgctga gacggagggg gagccccggg atgggagtgc atgtgggagc cgccctgggg 120
gctctgtggt tctgcctgac cggggccctg gaggtgcagg tgcctgagga ccccgtggtg 180
gccctggtgg gaactgatgc caccctgtgc tgttcttttt ctcccgagcc tgggttttct 240
ctggctcagc tgaacctgat ttggcagctg accgacacca agcagctggt gcactccttt 300
gccgaggggc aggaccaggg ctccgcctat gccaacagga ccgccctgtt ccccgacctg 360
ctggcccagg gaaacgcctc cctgcgcctg cagagagtga gagtggctga tgagggcagc 420
tttacctgct ttgtgtccat cagagacttc ggcagcgccg ccgtgtccct gcaggtggct 480
gctccttact ccaagcccag catgaccctg gagcccaaca aggatctgag acccggagac 540
accgtgacca ttacctgcag cagctaccag gggtatcctg aagccgaagt gttttggcag 600
gacggccagg gagtgcccct gacaggcaac gtgaccacca gccagatggc caatgagcag 660
ggactgttcg acgtgcacag catcctgaga gtggtgctgg gagccaatgg cacctacagc 720
tgcctggtga gaaaccccgt gctgcagcag gacgcccaca gcagcgtgac catcacaccc 780
cagaggagcc ccaccggcgc cgtggaggtg caggtgcccg aagaccccgt ggtggctctg 840
gtgggaacag acgccaccct gagatgcagc ttcagcccag agcctggctt cagcctggcc 900
cagctgaacc tgatctggca gctgacagac accaaacagc tggtgcatag cttcaccgag 960
ggcagagacc agggcagcgc ctacgccaac agaaccgccc tgtttcccga cctgctggct 1020
cagggcaacg cctctctgag actgcagaga gtgagggtgg ctgacgaagg cagcttcaca 1080
tgctttgtgt ctatcagaga ctttggcagc gccgctgtga gcctgcaggt ggccgctcct 1140
tacagcaagc cctccatgac cctggaaccc aacaaggacc tgaggcccgg cgacaccgtg 1200
actattacct gcagtagcta cagaggatat ccagaggccg aagtgttctg gcaggacggg 1260
cagggagtgc ctctgacagg caatgtgacc acctcccaga tggccaacga gcagggactg 1320
tttgacgtgc actccgtgct gagggtggtg ctgggcgcca acggcactta ctcctgtctg 1380
gtgcggaatc ctgtgctgca gcaggatgcc cacggcagcg tgaccattac agggcagccc 1440
atgaccttcc cccccgaagc cctgtgggtg actgtgggac tgagcgtgtg tctgatcgcc 1500
ctgctggtgg ccctggcctt tgtgtgttgg agaaagatta agcagtcatg cgaggaggag 1560
aacgccggcg ccgaggatca ggacggcgaa ggagagggca gcaagaccgc cctgcagccc 1620
ctgaagcact ccgactctaa ggaggatgac ggacaggaga ttgccactac aactccagca 1680
cccagacccc ctacacctgc tccaactatc gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa 1740
gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg catactcggg gactggactt tgcctgtgat 1800
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1860
accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag agaggccgga agaagctgct gtacatcttc 1920
aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact acccaggagg aagatggatg cagctgtaga 1980
ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat 2040
gccccagcct atcagcaggg acagaatcag ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg 2100
gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca 2160
agacggaaga acccccagga aggtctgtat aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag 2220
gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg 2280
taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg 2340
ccaccaagac gagctaaacg aggctcaggc gcgacgaact ttagtttgct gaagcaagct 2400
ggggatgtag aggaaaatcc gggtcccatg gccctgacct tcgccctgct ggtggccctg 2460
ctggtcctga gctgcaagag ctcctgcagc gtggggtgcg acctgcccca gacccacagc 2520
ctgggctcca gaagaaccct gatgctgctg gcccagatga gaagaatcag tctgttcagc 2580
tgcctgaaag acagacacga ctttggcttc cctcaggagg aatttggaaa ccagttccag 2640
aaggccgaaa ccatccccgt gctgcacgag atgatccagc agatcttcaa cctgttctcc 2700
accaaagata gcagcgcagc ctgggacgaa accctgctgg acaagttcta caccgagctg 2760
taccagcagc tgaacgacct ggaggcctgc gtgatccagg gcgtgggagt gaccgagaca 2820
ccactgatga aagaggatag cattctggcc gtgaggaaat acttccagag aatcaccctg 2880
tacctgaaag agaaaaagta cagtccctgc gcctgggagg tggtgagagc cgagatcatg 2940
agaagcttca gcctgagcac caatctgcag gaaagcctga gaagcaagga gtga 2994

Claims (7)

1.一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包括：
依次连接的抗LILRB4单链抗体、抗B7-H3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN蛋白肽；或
具有所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相似生物活性的嵌合抗原受体。
2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗LILRB4单链抗体的编码序列N端还含有信号肽。
3.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括第一功能蛋白或第二功能蛋白；或
在所述第一功能蛋白或所述第二功能蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
所述第一功能蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示；
所述第二功能蛋白的氨基酸序列通过将所述第一功能蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到，所述第二功能蛋白与所述第一功能蛋白具有相同的生物活性。
4.一种多核苷酸序列，其特征在于所述多核苷酸序列编码如权利要求1-3任意一项所述的嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的一种多核苷酸序列，其特征在于包括第一基因序列或第二基因序列；或
通过将所述第一基因序列或所述第二基因序列进行核苷酸序列杂交得到的第三基因序列；
所述第一基因序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；
所述第二基因序列为与所述第一基因序列的同一性达75％以上的核苷酸序列。
6.一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于T细胞中稳定表达如权利要求1-3任意一项所述的嵌合抗原受体。
7.一种LILRB4和B7-H3双靶向的嵌合抗原受体T细胞的应用，其特征在于将权利要求6所述的嵌合抗原受体T细胞用于制备治疗急性髓细胞白血病的药物。
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