CN112543810A

CN112543810A - 治疗肢带型肌营养不良2a型的重组腺相关病毒产品和方法

Info

Publication number: CN112543810A
Application number: CN201980044250.6A
Authority: CN
Inventors: Z·萨亨克
Original assignee: Nationwide Childrens Hospital Inc
Current assignee: Nationwide Childrens Hospital Inc
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-03-23
Also published as: EP3814514A1; JP7507697B2; JP2024123110A; MX2020014119A; SG11202012715UA; CA3105216A1; CO2021000914A2; AU2019295779A1; TW202020161A; TWI854984B; CL2020003384A1; US20210277362A1; JP2021528983A; BR112020026853A2; WO2020006458A1; IL279789A; KR20210028162A

Abstract

本发明提供了用于治疗肢带型肌营养不良2A型的产品和方法。在所述方法中，重组腺相关病毒递送编码具有钙蛋白酶3活性的蛋白质的DNA。

Description

治疗肢带型肌营养不良2A型的重组腺相关病毒产品和方法

本申请要求2018年6月29日提交的美国临时专利申请号62/691,934和2019年6月21日提交的美国临时专利申请号62/865,081的优先权，每个专利申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本文提供了用于治疗肢带型肌营养不良2A型的产品和方法。在这些方法中，重组腺相关病毒递送编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的DNA。

序列表以引用的方式并入

作为公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表(文件名：52684P2_SeqListing.txt；23,755字节–ASCII文本文件，创建于2019年6月26日)，所述序列表以引用的方式整体并入本文。

背景技术

肌营养不良(MD)是一组遗传性疾病。该组的特征在于控制运动的骨骼肌进行性无力和退化。一些形式的MD发生在婴儿期或儿童期，而另一些则可能直到中年或更晚时期才出现。所述障碍在肌无力的分布和程度(一些形式的MD还会影响心肌)、发病年龄、进展速率和遗传方式方面有所不同。

一组MD是MD的肢带组(LGMD)。LGMD是一种罕见的病症，并且它们在发病年龄、肌无力的区域、心脏和呼吸器官受累、进展速率和严重性方面在不同人群中的表现不同。LGMD可以开始于儿童期、青春期、成年早期甚至更晚。两个性别受影响情况相等。LGMD导致肩膀和骨盆带无力，有时在大腿上部和手臂附近的肌肉也会随着时间而虚弱。腿部无力通常在手臂无力之前出现。面部肌肉通常不受影响。随着病症进展，人们可能具有行走问题并随着时间的推移可能需要使用轮椅。肩膀和手臂肌肉的受累可能导致难以举起手臂超过头顶和难以举起物体。在一些类型的LGMD中，心脏和呼吸肌可能受累。

存在至少十九种形式的LGMD，并且这些形式根据其相关的遗传缺陷进行分类。

LGMD的专门测试现在可通过国家诊断方案(国家委任小组(NCG))获得。

钙蛋白酶3基因(CAPN3)的突变导致全世界最常见的肢带型肌营养不良症之一LGMD2A。目前，尚无这种遗传疾病的治疗方法。先前的研究已经证明了CAPN3基因转移以纠正CAPN3缺陷小鼠的病理体征的潜力。然而，由结蛋白启动子驱动的CAPN3的表达导致心脏毒性[Bartoli等人,Mol.Ther.,13:250-259(2006)]。在后续研究中，研究了所述基因的骨骼肌表达[Roudaut等人,Circulation,128:1094-1104(2013)]。

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。有多种AAV血清型。AAV血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，在GenBank登录号NC_002077中提供了AAV-1的完整基因组；在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564{1983)中提供了AAV-2的完整基因组；在GenBank登录号NC_1829中提供了AAV-3的完整基因组；在GenBank登录号NC_001829中提供了AAV-4的完整基因组；在GenBank登录号AF085716中提供了AAV-5基因组；在GenBank登录号NC_00 1862中提供了AAV-6的完整基因组；在GenBank登录号AX753246和AX753249中分别提供了AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分；在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供了AAV-9基因组；在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供了AAV-10基因组；并且在Virology,330(2):：375-383(2004)中提供了AAV-11基因组。在美国专利9,434,928中提供了AAV rh.74基因组的序列，所述美国专利以引用的方式并入本文。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR内。三个AAV启动子(因其相对图谱位置而命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)导致从所述rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白拥有最终负责复制病毒基因组的多种酶促特性。cap基因从p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代的剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。在Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中综述AAV的生命周期和遗传学。

AAV拥有独特的特征，所述特征使其成为例如在基因治疗中将外源DNA传递至细胞的载体具有吸引力。培养物中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其他动物的自然感染是沉默的且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)在那些细胞的生命周期中基本上持续存在。将AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此基因组的内部大约4.3kb的一些或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可能被外源DNA替换。为了产生AAV载体，可以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个显著特征是它是一种非常稳定且旺盛的病毒。它容易地承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么关键。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。

本领域仍然需要针对LGMD2A的治疗。

发明内容

本文提供了用于递送编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的DNA的方法和产品。此类方法和产品可以用于治疗各种疾病，例如LGMD2A。

提供了编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的重组腺相关病毒(rAAV)。所述重组腺相关病毒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列。编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列例如与SEQ ID NO:2至少90％相同，或包含SEQ ID NO:2的序列。

例如，所提供的rAAV包含多核苷酸，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAV ITR。例如，编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同、或者与SEQID NO:2至少91％相同、与SEQ ID NO:2至少92％相同、与SEQ ID NO:2至少93％相同、与SEQID NO:2至少94％相同、与SEQ ID NO:2至少95％相同、与SEQ ID NO:2至少96％相同、与SEQID NO:2至少97％相同、与SEQ ID NO:2至少98％相同、或与SEQ ID NO:2至少99％相同。所述rAAV包含编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。

另外，所提供的rAAV包含编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:7至少90％相同、与SEQ ID NO:7至少91％相同、与SEQ ID NO:7至少92％相同、与SEQ ID NO:7至少93％相同、与SEQ ID NO:7至少94％相同、与SEQ ID NO:7至少95％相同、与SEQ ID NO:7至少96％相同、与SEQ ID NO:7至少97％相同、与SEQ ID NO:7至少98％相同、或与SEQ ID NO:7至少99％相同的氨基酸序列。所述rAAV包含编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

所提供的rAAV包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少90％相同、或者与SEQ ID NO:1至少91％相同、与SEQ ID NO:1至少92％相同、与SEQ ID NO:1至少93％相同、与SEQ ID NO:1至少94％相同、与SEQ ID NO:1至少95％相同、与SEQ ID NO:1至少96％相同、与SEQ ID NO:1至少97％相同、与SEQ ID NO:1至少98％相同、或与SEQ ID NO:1至少99％相同。rAAV包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，核苷酸序列在肌肉特异性启动子的转录控制下。例如，所述肌肉特异性启动子包含以下中的一种或多种：人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、结蛋白启动子、骨骼α肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短的MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a肌球蛋白重链增强子/MCK增强子启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠类肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导核因子(HIF)-反应元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素反应元件(gre)。在一个实施方案中，肌肉特异性启动子是tMCK启动子，其包含SEQ ID NO:3的序列。

例如，rAAV包含多核苷酸，所述多核苷酸在一个实施方案中包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、tMCK启动子、编码具有钙蛋白酶3活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAV反向末端重复序列(ITR)。AAV ITR(例如，第一和/或第二AAV ITR)是例如AAV2反向末端重复序列。rAAV的衣壳蛋白包含例如AAV rh.74衣壳蛋白或AAV9衣壳蛋白。

所提供的rAAV包含AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74和AAV rh.10衣壳蛋白中的一种或多种。

在另一个实施方案中，提供了包含任何所公开的rAAV的组合物。例如，将组合物配制成用于肌内注射或静脉内注射。

还提供了治疗受试者的肢带型肌营养不良2A型的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何所公开的rAAV或任何包含所公开的rAAV的组合物。在任何所提供的方法中，通过肌内注射或静脉内注射来施用rAAV。

例如，在这些方法中，治疗导致以下中的一种或多种：(a)肌纤维直径增加；(b)小叶状肌纤维数量减少；(c)具有内核的纤维数量减少；(d)肌内膜结缔组织含量降低；(e)肌肉萎缩的矫正，和(f)肌力产生增加。受治疗影响的肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

此外，在任何所提供的方法中，治疗导致以下中的一种或多种：(a)施用后4周每mm²的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(c)施用后4周每mm²的STO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或42％；(d)施用后4周STO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(e)施用后4周每mm²的FTO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％或20％；(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；(g)施用后4周每mm²的FTG肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％；以及(h)施用后4周FTG肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％。

在任何所提供的方法中，受试者的心肌显示出从任何所提供的rAAV或包含任何所提供的rAAV的组合物表达的最少的或低的钙蛋白酶3蛋白。受所述组合物的治疗影响的肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

提供了用于治疗肢带型肌营养不良2A型的组合物，所述组合物包含治疗有效量的任何所公开的rAAV或包含任何所公开的rAAV的组合物。用于治疗治疗肢带型肌营养不良2A型的这些组合物被配制成通过肌内注射或静脉内注射施用。另外，用任何所公开的组合物治疗肢带型肌营养不良2A型导致以下中的一种或多种：(a)肌纤维直径增加；(b)小叶状肌纤维数量减少；(c)具有内核的纤维数量减少；(d)肌内膜结缔组织含量降低；(e)肌肉萎缩的矫正，和(f)肌力产生增加。受所述组合物的治疗影响的肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

另外，用治疗肢带型肌营养不良2A型的任何所公开的组合物的治疗导致以下中的一种或多种：(a)施用后4周每mm²的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(c)施用后4周每mm²的STO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或42％；(d)施用后4周STO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(e)施用后4周每mm²的FTO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％或20％；(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；(g)施用后4周每mm²的FTG肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％；以及(h)施用后4周FTG肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％。

此外，用治疗肢带型肌营养不良2A型的任何所提供的组合物的治疗导致受试者的心肌显示出从任何所提供的rAAV或包含任何所提供的rAAV的组合物表达的最少的或低的钙蛋白酶3蛋白。在施用rAAV之后，心肌没有显示或几乎没有显示出毒性作用，例如炎症、坏死和/或再生。

本公开还提供了治疗有效量的任何所公开的rAAV或包含任何所公开的rAAV的组合物用于制备治疗肢带型肌营养不良2A型的药物的用途。例如，所述药物被配制成用于通过肌内注射或静脉内注射施用。

在任何所述用途中，用所述药物的治疗导致以下中的一种或多种：(a)肌纤维直径增加；(b)小叶状肌纤维数量减少；(c)具有内核的纤维数量减少；(d)肌内膜结缔组织含量降低；(e)肌肉萎缩的矫正，和(f)肌力产生增加。受所述药物的治疗影响的肌纤维是以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

另外，在治疗有效量的任何所公开的rAAV或所提供的组合物的任何所述用途中，用所述药物的治疗导致以下中的一种或多种：(a)施用后4周每mm²的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(c)施用后4周每mm²的STO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或42％；(d)施用后4周STO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(e)施用后4周每mm²的FTO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％或20％；(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；(g)施用后4周每mm²的FTG肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％；以及(h)施用后4周FTG肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％。

在治疗有效量的任何所公开的rAAV或所提供的组合物的任何所述用途中，在用所述药物治疗之后，所述受试者的心肌没有显示出从所公开的rAAV或所公开的组合物表达的最少的或低的钙蛋白酶3蛋白。

附图说明

图1A-1F示出了基因疗法恢复受损的CAPN3-KO肌肉再生。单链AAV9.CAPN3 rAAV的示意图如图1A所示。在5'与3'单链ITR(反向末端重复序列)之间，肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(563bp)驱动CAPN3开放阅读框(2466bp)的表达。还标记了聚腺苷酸化位点(聚A，53bp)。首先向来自CAPN3-KO小鼠的胫骨前(TA)肌注射CTX，并且2周后向左TA注射1x10¹¹ vg的AAV.CAPN3(图1B)或向右TA注射PBS(图1C)。与未治疗的CAPN3-KO肌肉相比，在rAAV注射后四周，肌肉直径增加并且小叶状纤维较不常见。在图1D中，具有肌浆下细胞器、线粒体分布(箭头)模式的小叶状纤维在较高的放大倍数下在未治疗的CAPN3-KO肌肉中表现出部分肌管融合。对于B-D，比例尺＝20μm。在图1E中，来自CAPN3-KO小鼠的治疗和未治疗的TA肌肉的肌纤维大小分布直方图(平均值±SEM/mm²面积；源自每组3只小鼠)显示在治疗的情况下向较大直径纤维变化以及在未治疗组中小直径亚群增加。在图1F中，慢缩氧化(STO)纤维大小分布直方图显示，与治疗的CAPN3-KO肌肉相比，在未治疗的CAPN3-KO肌肉中有更多数量的小纤维(例如，纤维直径等于或小于30μm)。

图2示出了本公开被称为“AAVrh.74.tMCK.CAPN3”的rAAV的示意图。

图3A-3B提供了在通过肌内注射(1E11 vg)和全身注射(3E12 vg和6E12 vg)施用AAVrh.74.tMCK.CAPN3之后的Western印迹(图A)和RT-PCR(图B)数据。将此数据与正常人的肌肉裂解物(与小鼠裂解物相比，60％总蛋白的凝胶加载量)和未治疗的CAPN3-KO小鼠进行比较。

图4提供了CAPN3 KO(注射过AAV.hCAPN3基因和未治疗的)和野生型(WT)TA肌肉的SDH染色组织切片的代表性图像。在用AAVrh.74.tMCK.CAPN3治疗的小鼠的TA肌肉中，慢缩氧化(STO，深色)、快缩氧化(FTO，中间)和快缩糖酵解(FTG，浅色)纤维的平均纤维大小出现趋于WT值的正常化。表4展示了经过治疗和没有治疗的情况下的纤维类型大小。

图5提供了在来自低剂量群组(3E12 vg、Z18-13、Z18-15、Z18-16、Z18-17、Z18-18)的WT(Z18-14)和TA肌肉中、以及来自高剂量群组(6E12 vg、Z18-20、Z18-21、Z18-23、Z18-24、Z18-22)的腓肠肌(胃)、心脏、四头肌、胫前肌(TA)和三头肌(UT：未治疗)中的相对CAPN3蛋白表达水平。

图6提供了在以下肌肉中的6E12载体基因组全身高剂量群组中的AAVrh74.tMCK.hCAPN3载体拷贝/μg基因组DNA：四头肌(quad)、心脏、胫前肌(TA)、腓肠肌(胃)、三头肌和肝脏。

图7提供了在以3E12和6E12 vg全身施用AAVrh.74.tMCK.CAPN3后来自左TA肌肉的慢缩氧化(STO，深色)、快缩氧化(FTO，中间)和快缩糖酵解(FTG，浅色)纤维的平均纤维直径。包括来自未治疗的CAPN3KO和WT小鼠的数据。

图8提供了跑至耗竭测试(run-to-exhaustion test)的数据。图8A提供了在全身施用后4周，接受3E12 vg的AAVrh.74.tMCK.CAPN3的低剂量群组、以及接受6E12 vg的AAVrh.74.tMCK.CAPN3的高剂量群组的数据。与未治疗的对应小鼠相比，治疗的CAPN3 KO的小鼠在跑至耗竭测试中表现更好。图8B提供了其中小鼠在全身施用6E12 vg的AAVrh.74.tMCK.CAPN3后20-24周进行了测试的高剂量群组(n＝5)和未治疗的对应物(n-16)的数据。

图9提供了来自在以3E12 vg和6E12 vg剂量全身注射AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体后4周的CAPN3 KO小鼠以及匹配的未治疗对照的代表性心脏样品的苏木精和曙红(H&E)染色的左心室新鲜冷冻切片。

图10提供了来自高剂量群组(其接受了6E12 vg的AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3)的心脏组织的Western印迹分析。此分析表明在治疗动物的心脏中没有或有最少的可检测钙蛋白酶3蛋白。动物识别号Z18-19和22代表来自未治疗的CAPN3 KO小鼠的裂解物。

具体实施方式

本文所提供的重组AAV(rAAV)包含多核苷酸，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAV ITR。在一个实施方案中，所述核苷酸编码CAPN3。实施方案包括但不限于包含编码CAPN3或具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列的rAAV，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％相同。另外的实施方案包括但不限于，包含与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核苷酸序列并编码具有CAPN3蛋白水解活性的多肽的rAAV。在本领域中，CAPN3蛋白水解活性被理解为蛋白水解潜在底物(诸如胞衬蛋白和HSP60)的活性，和/或被理解为自溶自切割的活性。因此，如本文所用，术语“具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质”是指具有CAPN3蛋白水解活性的蛋白质，所述CAPN3蛋白水解活性包括但不限于蛋白水解底物(诸如胞衬蛋白和HSP60)的活性、和/或自溶自切割的活性。具有CAPN3活性的蛋白质可以具有全长钙蛋白酶3蛋白质的全部或部分活性。在一个实施方案中，具有CAPN3活性的蛋白质具有全长CAPN3蛋白的活性的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％。在另一个实施方案中，具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码具有CAPN3活性的蛋白质的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。在另一个实施方案中，具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，具有CAPN3活性的蛋白质包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一个实施方案中，rAAV的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的序列。

在另一个方面，本文描述了包含如下核苷酸序列的重组AAV，所述核苷酸序列编码具有CAPN3活性的蛋白质和/或包含在严格条件下与SEQ ID NO:2的核酸序列杂交的核苷酸序列或其互补序列。术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂(诸如甲酰胺)的浓度决定。杂交和洗涤的严格条件的实例是在65-68℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、或在42℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,(Cold Spring Harbor,N.Y.1989)。

在本文所述的重组基因组中，CAPN3多核苷酸可操作地连接至转录控制元件(包括但不限于启动子、增强子和/或内含子)，特别是在所关注的靶细胞中起作用的转录控制元件。例如，各种实施方案提供了使用如下的控制元件来转导肌细胞的方法：肌肉特异性转录控制元件，包括但不限于源自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族诸如源自myoD基因家族的那些[参见Weintraub等人,Science,251:761-766(1991)]、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson,Mol Cell Biol,11:4854-4862(1991)]；源自人骨骼肌动蛋白基因的控制元件[Muscat等人,Mol Cell Biol,7:4089-4099(1987)]、肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人,Mol Cell Biol,9:3393-3399(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；源自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心脏肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因、低氧诱导核因子的控制元件[Semenza等人,Proc Natl Acad Sci USA,88:5680-5684(1991)]；类固醇诱导元件和启动子，包括糖皮质激素反应元件(GRE)[参见Mader和White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5603-5607(1993)]；tMCK启动子[参见Wang等人,GeneTherapy,15:1489-1499(2008)]；CK6启动子[参见Wang等人，出处同上]和其他控制元件。在一个实施方案中，编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连接至肌肉特异性启动子。在一个实施方案中，所述肌肉特异性启动子包含以下中的一种或多种：人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、结蛋白启动子、骨骼α肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短的MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a肌球蛋白重链增强子/MCK增强子启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠类肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导核因子(HIF)-反应元件(HRE)、类固醇诱导元件、糖皮质激素反应元件(gre)。在另一个实施方案中，肌肉特异性启动子是MCK启动子、tMCK启动子或MHCK7启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子是包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的tMCK。

先前的研究表明，由结蛋白启动子驱动的CAPN3的表达导致心脏毒性。在后续研究中，所述基因的选择性骨骼肌表达消除了心脏缺陷。本文所公开的AAV基因组包含肌肉特异性启动子tMCK，以将CAPN3表达限制在骨骼肌上，并且在基因注射后4周以6E12 vg(建议的初始高剂量的两倍)全身性递送病毒后没有显示出心脏毒性。

本文所述的rAAV基因组缺乏AAV rep和cap DNA。所提供的rAAV基因组包含如上所述的CAPN3多核苷酸和在所述多核苷酸侧翼的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAVDNA可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.74和AAV rh.10。也考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。如上面背景技术章节中所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了促进骨骼肌特异性表达，可以使用AAV1、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。

所提供的DNA质粒包含rAAV基因组。将DNA质粒转移至允许被AAV的辅助病毒(包括但不限于腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，以将rAAV基因组组装成感染性病毒颗粒。其中将待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞的生产rAAV颗粒的技术是本领域的标准技术。生产rAAV需要在单个细胞(在本文中称为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与所述rAAV基因组分离(即不在其中)的AAV rep和cap基因以及辅助病毒功能。AAV ITR以及rep和cap基因可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，并且可以来自除rAAV基因组ITR以外的不同AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10,AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.10和AAV rh.74。在例如WO 01/83692中公开了假型rAAV的生产，所述专利以引用的方式整体并入本文。因此，在一个实施方案中，rAAV包含以下中的一种或多种：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.74或AAV rh.10衣壳蛋白。在另一个实施方案中，rAAV包含AAV rh.74衣壳蛋白或AAV9衣壳蛋白。

产生包装细胞的方法是产生稳定地表达用于AAV颗粒生产的所有必需组分的细胞系。例如，将包含缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与所述rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择标记(诸如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。已经通过如下程序将AAV基因组引入细菌质粒中，所述程序诸如为GC拖尾[Samulski等人,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081(1982)]、添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成接头[Laughlin等人,Gene,23:65-73(1983)]或通过直接平末端连接[Senapathy和Carter,J.Biol.Chem.,259:4661-4666(1984)]。然后用辅助病毒诸如腺病毒感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适方法的其他实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。

rAAV生产的一般原理在以下文献中进行了综述：例如，Carter,Current Opinionsin Biotechnology,1533-1539(1992)；和Muzyczka,Curr.Topics in Microbial.andImmunol.,158:97-129(1992)。在以下文献中描述了各种方法：Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.,4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol.,5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,62:1963(1988)；Lebkowski等人,Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)；Samulski等人,J.Virol.,63:3822-3828(1989)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365以及对应的美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人,Vaccine,13:1244-1250(1995)；Paul等人,Human GeneTherapy,4:609-615(1993)；Clark等人,Gene Therapy 3:1124-1132(1996)；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；美国专利号6,258,595；以及McCarty,Mol.Ther.,16(10):1648-1656(2008)。前述文件据此以引用的方式整体并入本文，特别着重于文件中关于rAAV生产的那些部分。

因此，提供了生产感染性rAAV的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，诸如HeLa细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施方案中，包装细胞是如下细胞，所述细胞是未转化的癌细胞，诸如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。

因此，本文所提供的重组AAV是包含重组基因组的复制缺陷型感染性衣壳化病毒颗粒。实例包括但不限于：包含含有SEQ ID NO:1所示的编码CAPN3的序列的基因组的rAAV；包含基本上由SEQ ID NO:1所示的编码CAPN3的序列组成的基因组的rAAV；和包含由SEQ IDNO:1所示的编码CAPN3的序列组成的基因组的rAAV(命名为“AAVrh.74.tMCK.CAPN3”)。rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，也就是说，rAAV基因组的ITR之间没有AAV rep或capDNA。

AAVrh.74.tMCK.CAPN3序列的序列如SEQ ID NO:1所示，其中AAV2 ITR跨越核苷酸1-128，tMCK启动子跨越核苷酸165-884，嵌合内含子跨越核苷酸937-1069，Kozak序列跨越核苷酸1101-1106，CAPN3多核苷酸跨越核苷酸1107-3572，聚A信号跨越核苷酸3581-3780，并且第二AAV2 ITR跨越核苷酸3850-3977。

可以通过本领域已知的方法诸如通过柱色谱法或氯化铯梯度来纯化rAAV。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括例如在以下文献中所公开的方法：Clark等人,Hum.Gene Ther.,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,MethodsMol.Med.,69:427-443(2002)；美国专利号6,566,118；和WO 98/09657。

在另一个实施方案中，提供了包含本文所述的rAAV的组合物。所提供的组合物包含在药学上可接受的载体中的rAAV。所述组合物还可以包含其他成分，诸如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者无毒并且优选地在所用剂量和浓度下为惰性，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如Tween、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。

按本文所述的方法施用的rAAV的滴度可以根据例如特定rAAV、施用方式、治疗目标、个体、和一种或多种所靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准的方法来确定。rAAV的滴度可以在从每ml约1x10¹⁰个、约1x10¹¹个、约1x10¹²个、约1x10¹³个、至约1x10¹⁴个或更多个耐DNA酶颗粒(DRP)的范围内。剂量也可以以病毒基因组(vg)为单位表达。所公开的示例性剂量包括1E11 vg、3E12 vg和6E12 vg。

本文考虑了用rAAV体内或体外转导靶细胞诸如肌细胞的方法。体内方法包括将有效剂量或多个有效剂量的包含本文所提供的rAAV的组合物施用至有需要的受试者(例如，包括但不限于人类患者的动物)的步骤。如果在障碍/疾病发生之前施用所述剂量，则所述施用是预防性的。如果在障碍/疾病发生之后施用所述剂量，则所述施用是治疗性的。有效剂量是缓解(消除或减轻)与所治疗的障碍/疾病状态相关的至少一种症状，减慢或防止进展为障碍/疾病状态，减慢或防止障碍/疾病状态的进展，减少疾病的程度，导致疾病(部分或全部)缓解和/或延长存活期的剂量。与治疗前的受试者相比，本文的方法导致以下中的一种或多种：肌纤维直径增加、小叶状肌纤维数量减少、具有内核的纤维数量减少、肌内膜结缔组织含量降低、肌肉萎缩的矫正、和肌力产生增加。在一个实施方案中，肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。在一个实施方案中，所述治疗导致以下中的一种或多种：(a)施用后4周每mm²的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(c)施用后4周每mm²的STO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或42％；(d)施用后4周STO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；(e)施用后4周每mm²的FTO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％或20％；(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；(g)施用后4周每mm²的FTG肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％；以及(h)施用后4周FTG肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一个实施方案中，本公开的方法导致在施用过rAAV的受试者的心肌中从rAAV不表达、表达最少或低的钙蛋白酶3蛋白。

检查这些结果的测定是本领域所理解的和/或在本文的实施例中所描述的。考虑了使用本文所述的方法来预防或治疗由CAPN3活性缺陷或CAPN3表达缺陷引起的障碍/疾病(例如，肌营养不良)。LGMD2A是考虑根据所述方法进行预防或治疗的疾病的实例。

还考虑了组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗或顺序治疗。特别考虑了本文所述的方法与标准药物治疗(例如，皮质类固醇)的组合、以及与新型疗法的组合。

有效剂量的组合物的施用可以通过本领域标准的途径进行，本领域标准的途径包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、鞘内、口服、经颊、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到待治疗的感染和/或疾病状态和要表达CAPN3的一种或多种靶细胞/组织，本领域技术人员可以选择和/或匹配rAAV的施用途径和AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的血清型。在一个实施方案中，通过肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、表皮施用、阴道内注射、皮内施用或鼻内施用来施用rAAV。在另一个实施方案中，通过肌内注射或静脉内注射来施用rAAV。

特别地，本文所述的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV重组载体运输到动物的靶组织中的任何物理方法来实现。施用包括但不限于注射到肌肉中、血流和/或直接注射到肝脏中。已经证明简单地将rAAV重悬浮于磷酸盐缓冲盐水中足以提供对肌肉组织表达有用的媒介物，并且对可以与rAAV共同施用的载体或其他组分没有已知的限制。可以修饰rAAV的衣壳蛋白，从而使rAAV靶向特定的所关注的靶组织诸如肌肉。参见例如WO 02/053703，其公开内容以引用方式并入本文。药物组合物可以制备为可注射配制品或局部配制品，以通过经皮运输递送至肌肉。先前已经开发了用于肌内注射和经皮运输的多种配制品，并且可以将其用于所述方法的实践中。rAAV可以与任何药学上可接受的载体一起使用，以易于施用和处理的。

出于肌内注射的目的，可以使用在佐剂诸如芝麻油或花生油中的溶液或在水性丙二醇中的溶液以及无菌水性溶液。如果需要，可以缓冲此类水性溶液，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备rAAV作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)的溶液或作为药理学上可接受的盐的溶液。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中和在油中制备rAAV的分散体。在常规的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质全部可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

适合于全身性(例如，静脉内)注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式都必须是无菌的，并且必须以易于注射的程度流动。它必须在旨在和存储条件下保持稳定，并且必须加以保存以防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、它们合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散液体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的rAAV根据需要与的上文列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中、随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和上文列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，在一些实施方案中，所述制备方法包括真空干燥和/或冷冻干燥技术，它们各自可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。

rAAV的转导也可以在体外进行。在一个实施方案中，将所需的靶肌细胞从受试者中去除，用rAAV转导并再引入受试者中。或者，可以使用同种或异种肌细胞，其中那些细胞将不在受试者中产生不适当的免疫应答。

用于转导和将转导的细胞再引入受试者中的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，可以通过以下方式在体外转导细胞：例如在合适的介质中将rAAV与肌细胞组合，并且使用常规技术诸如Southern印迹和/或PCR或者通过使用选择标记来筛选那些具有所关注DNA的细胞。然后可以将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术(诸如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射或者通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中)将所述组合物引入受试者中。

通过本文所述的方法用rAAV转导细胞导致CAPN3或具有CAPN3活性的蛋白质的持续表达。因此，提供了向受试者(优选人类)施用表达CAPN3或具有CAPN3活性的蛋白质的rAAV的方法。本公开的受试者包括但不限于人、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、啮齿动物(例如，大鼠和小鼠)和灵长类动物。这些方法包括用本文所述的一种或多种rAAV转导组织(包括但不限于组织(诸如肌肉)、器官(诸如肝和脑)以及腺体(诸如唾液腺))。

肌肉组织是体内DNA传递的诱人靶标，因为它不是至关重要的器官并且易于进入。本文的方法提供了CAPN3从转导的肌细胞的持续表达。

“肌细胞”、“肌纤维”或“肌肉组织”意指源自任何种类的肌肉(例如，骨骼肌和平滑肌(例如，来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)]的一个细胞或一组细胞。此类肌细胞可以是分化的或未分化的，诸如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。

术语“转导”用于指经由所描述的导致接受者细胞表达CAPN3的rAAV，体内或体外将CAPN3施用/递送至接受者细胞。

因此，提供了将编码CAPN3的rAAV的有效剂量(或基本同时施用的剂量或间隔给予的剂量)施用至有需要的受试者的方法。

如上所述，与治疗前的受试者相比，本文所述的方法导致在受试者中以下中的一种或多种：肌纤维直径增加、小叶状慢缩氧化(STO)肌纤维数量减少、具有内核的纤维数量减少、肌内膜结缔组织含量降低、肌肉萎缩的矫正、和肌力产生增加。

实施例

通过以下实施例来说明各个方面和实施方案。实施例1描述AAV9.MCK.CAPN3的生产。实施例2描述AAV9.MCK.CAPN3的肌内施用。实施例3描述AAVrh.74.tMCK.CAPN3的生产。实施例4描述AAVrh.74.tMCK.CAPN3的肌内施用。实施例5描述AAVrh.74.tMCK.CAPN3的静脉内施用。实施例6描述终点研究。实施例7描述毒理学和生物分布研究。实施例8描述肌内注射后的体内生物效能测试。实施例9描述全身注射后的体内生物效能测试。实施例10描述全身性AAVrh.74.tMCK.CAPN3基因递送的评估。实施例11描述全身注射AAVrh.74.tMCK.CAPN3载体后的心脏毒性评估。实施例12描述体内生理分析。

实施例1

AAV9.MCK.CAPN3的生产

生产了携带在肌肉特异性MCK启动子下的CAPN3基因的AAV载体(命名为AAV.CAPN3)(图1A)。由美国Eurofin Genomics合成了包含在两个Not1限制性位点之间的小鼠CAPN3(NM_007601.3)开放阅读框的DNA，然后将其亚克隆到先前在Rodino-Klapac等人,Journal of Translational Medicine,5:45-55(2007)]中所描述的单链AAV.MCK(肌肉肌酸激酶)载体中。rAAV载体通过改良的交叉包装方法生产，由此可以将AAV 2型载体基因组包装为多AAV衣壳血清型。[Rabinowitz等人,J Virol.76(2):791-801(2002)]。使用HEK293细胞使用标准的三质粒DNA/CaPO4沉淀方法实现生产。将293细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)以及青霉素和链霉素的DMEM中。生产质粒是：(i)pAAV.MCK.microdys，(ii)编码cap血清型1、6或8-样分离物的经rep2-capX修饰的AAV辅助质粒，和(iii)表达腺病毒E2A、E4ORF6、和VA I/II RNA基因的5型腺病毒辅助质粒(pAdhelper)。为了进行血清型之间的比较，使用了基于定量PCR的滴定方法，以利用Prism 7500Taqman检测器系统(PE AppliedBiosystems)确定衣壳化载体基因组(vg)滴度。[Clark等人,Hum Gene Ther.10(6):1031-1039(1999)]。引物和荧光探针靶向MCK启动子并且为如下：MCK正向引物：5-CCCGAGATGCCTGGTTATAATT-3(SEQ ID NO:4)；MCK反向引物：5-GCTCAGGCAGCAGGTGTTG-3(SEQID NO:5)；以及MCK探针：5-FAM-CCAGACATGTGGCTGCTCCCCC-TAMRA-3(SEQ ID NO:6)。利用Prism 7500实时检测器系统(PE Applied Biosystems,Grand Island,NY,USA)，使用针对MCK启动子的特异性引物和探针，通过定量逆转录酶PCR确定最终滴度(vg ml^-1)。将等分的病毒保存在-80℃直至使用。

实施例2

AAV9.MCK.CAPN3的肌内施用

为了证明WT CAPN3是否可以恢复在CAPN3敲除(CAPN3-KO)小鼠中受损的再生过程，向来自在麻醉下的CAPN3-KO小鼠(n＝4)[Kramerova等人,Hum Mol Genet 13(13):1373-1388(2004)]]的TA肌肉首先注射30μl CTX，并且2周后使用AAV9.MCK.CAPN3以1x10¹¹vg在20μl体积中通过肌内注射转导以表达野生型CAPN3。来自另一群组的CAPN3-KO(n＝4)的TA肌肉用作对照，在CTX注射后2周接受相同体积的PBS。

CTX注射后6周将小鼠处死，并取出TA肌肉并进行低温恒温切片。首先用H&E对12μm厚的横截面切片进行染色以进行常规的组织病理学评价；肌纤维类型特异性直径测量是从每组3只小鼠的TA的SDH染色横截面切片中获得的。在X20倍放大率下拍摄了三张TA的随机图像(每只动物每个切片)，并生成了纤维直径测量值和纤维类型特异性直方图。

琥珀酸脱氢酶(SDH)酶的组织化学用于评估代谢纤维类型分化[慢缩氧化(STO)、快缩氧化(FTO)和快缩糖酵解(FTG)]。在最后一次心脏毒素注射后4周和12周，使用12μm厚的SDH染色的横截面切片获得肌纤维类型特异性直径测量值。使用Olympus BX41显微镜和SPOT照相机(Olympus BX61,Japan)以X20倍放大率拍摄沿中线轴(每只动物每个切片)的三个图像，每个图像代表腓肠肌的三个不同区域(主要由STO构成的深层区域、显示STO和FTO或FTG的方格图案外观的中间区域以及主要由FTG纤维构成的浅表区域)。选择此方法来捕获响应于再生期间的代谢变化的在每个区域中的纤维的氧化状态变化。通过使用ZeissAxiovision LE4软件(v.4.8)测量跨肌纤维的最短距离，确定深色(STO)、中间(FTO)和浅色(FTG)纤维的直径。单独为STO生成纤维直径直方图；将FTG和FTO组合起来以代表来自3只动物的总快缩纤维群(FTG/O)并表示为每mm²肌内膜面积的数量(平均值±SEM)。通过组合所有三种纤维类型推导出平均纤维直径。每组测量平均900-1700根纤维。TA肌肉用于评估纤维化(参见下文)

在AAV9.MCK.CAPN3注射后四周，观察到肌肉直径显著增加，内部核明显减少，带有小叶状图案的小纤维数量少得多(图1B)。未治疗的CAPN3-KO肌肉每mm²面积具有31.6％更多的纤维，主要由小的且呈小叶状的STO纤维构成，表明所述治疗改善了肌管融合，因此减少了每单位面积的单个小纤维数量(图1，C和D；表1)。

表1–胫前肌纤维大小

*与相同的野生型参数相比p<0.0001

治疗的TA肌肉的纤维大小分布直方图显示在治疗后纤维向较大直径的纤维变化，并且在未治疗的CAPN3-KO对照肌肉中的过多的小纤维属于STO组织化学纤维类型(图1E和1F)。总之，这些发现表明，通过基因疗法在CAPN3-KO肌肉中进行的CAPN3替换可以挽救缺陷型再生，这可以通过纤维大小趋于正常化和STO纤维群数量减少来证明。

实施例3

AAVrh.74.tMCK.CAPN3的生产

生产了携带在截短的肌肉特异性MCK启动子(tMCK启动子)下的CAPN3基因的AAV载体(命名为AAVrh74.tMCK.CAPN3)。由美国Eurofin Genomics合成了包含在两个Not1限制性位点之间的小鼠CAPN3(NM_007601.3)的开放阅读框的DNA，并且然后将其插入AAV生产质粒中。质粒的图谱如图2所示。

然后通过实施例1中所描述的方法生产rAAV载体。

实施例4

AAVrh.74.tMCK.CAPN3的静脉内施用

6个月大的CAPN3-KO小鼠通过注射到尾静脉中以低剂量(3x10¹²vg)和高剂量(6x10¹² vg)接受了AAVrh.74.tMCK.CAPN3。将小鼠基因注射后20周处死用于终点研究。年龄匹配的媒介物治疗的CAPN3-KO小鼠用作对照。

表2-治疗群组

如以下实施例7所述进行的终点研究包括肌肉生理学(TA力产生或体内肌肉收缩性测定、以及对离心收缩的保护)、肌肉组织病理学、使用qPCR的hCAPN3检测和Western印迹分析。

实施例5

AAVrh.74.tMCK.CAPN3的肌内施用

在通过rAAV治疗将CAPN3引入再生肌肉中后，测量了年长和年轻CAPN3-KO肌肉对心脏毒素(CTX)诱导的同步坏死的再生反应。

在年轻(2个月大)和年长小鼠(6个月大)的群组中，在将rAAV注射到左TA肌肉前2周，将CTX注射到两侧TA肌肉中以诱导同步坏死。通过肌内注射施用在20μl体积中的1x10¹¹vg的AAVrh.74.tMCK.CAPN3。在基因转移(以我们先前研究确定的具有功效的1x10¹¹vg剂量)后8周进行终点研究，以通过比较从左TA到未治疗的右TA的定量组织学和生理结果来评估对再生缺陷的纠正。

表3–治疗群组

在rAAV注射后八周，如以下实施例6所述进行的终点研究包括肌肉生理学(TA力产生和对离心收缩的保护)、定量肌肉组织病理学、使用qPCR的hCAPN3检测和western印迹分析。

实施例6

终点研究

TA力产生和对离心收缩的保护

在从小鼠中提取的肌肉上执行了评估TA肌肉的功能结果的方案[Wein等人,Nature Medicine,20(9):992-1000(2014)]。使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。使用解剖镜，去除后肢皮肤，以暴露出TA肌肉和髌骨。解剖远侧TA肌腱，并用4-0缝合线在肌腱周围打一个双方结，并尽可能靠近肌肉，并且切断肌腱。暴露的肌肉不断被盐水浸湿。然后将小鼠转移至热控制平台并保持在37度。将膝盖通过髌骨肌腱用针固定到平台上，将远侧TA肌腱缝合到力传感器(Aurora Scientific,Aurora,ON,Canada)的水平臂上，并将脚用胶带固定。通过双极铂电极刺激坐骨神经引起TA肌肉收缩。一旦肌肉稳定下来，就通过逐渐拉伸肌肉直到实现最大的拉力来确定最佳长度。休息3min时间后，以50,100,150和200Hz刺激TA，让每个刺激之间有1min的休息时间以确定最大强直力。测量肌肉长度。5min休息后，评估TA肌肉对收缩诱导的损伤的敏感性。刺激500ms后，肌肉被伸长最佳长度的10％。这包括以150Hz刺激肌肉700ms。刺激后，肌肉回到最佳长度。每分钟重复一次所述循环，共10个循环。通过将最大强直力除以TA肌肉横截面积来计算比力。离心收缩后，然后对小鼠实施安乐死，并将TA肌肉解剖出、称重和冷冻以进行分析。数据分析是盲目的而不是随机进行的。

体内肌肉收缩测定

此测定测量由下肢的足底或背屈肌产生的总扭矩，并使用肌肉生理仪器(AuroraScientific,ON,Canada)进行。用异氟烷麻醉动物。一旦麻醉动物后，将根据需要使用推剪将背部和后肢的毛发去除。如果用推剪去除毛发不充分，应用一层薄薄的脱毛膏(Nair)，并用温水彻底清洁部位以防止不适。用胶带将待测量的后肢附接到脚踏板上。肢体在钝钳中保持僵硬。坐骨神经的胫骨或腓骨部分将被两个无菌的、一次性使用的28号单极电极刺激，这些电极通过皮肤皮下插入神经附近。小鼠温度将通过导电的温度调节加热垫(设置为37℃)或辐射热源来维持，并通过温度探头进行监测。

组织病理学

为了进行组织学分析，将所有肌肉和器官包埋在7％的黄芪胶中，并在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻。收集冷冻切片(12μm)用于免疫组织化学和western印迹分析。

用于检测人CAPN3的Western印迹分析

使用Western印迹法评估小鼠肌肉组织中的CAPN3蛋白定量。CAPN3酶通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分解，并使用Novocastra的识别N末端的临床级抗体NCL-CALP-12A2与大约60kDa的自溶产物一起迁移为94kDa的条带。另外，NCL-CALP-2C4抗体识别这种相同的CAPN3分子量(94kD)和骨骼肌中的另一个片段(30kD)；两种抗体都适合用于蛋白质检测。递送治疗性rAAV载体后，在钙蛋白酶敲除小鼠样品中对CAPN3蛋白表达水平进行了半定量测量，并将其与未治疗的对照进行了比较。

定量肌肉组织学

用AAVrh.74.tMCK.CAPN3治疗与未注射的对照小鼠的TA肌肉和四头肌的横截面切片用苏木精和曙红染色，并使用Zeiss Axiovision L4软件拍照(每只动物每个切片4张随机20x图像)。比较治疗小鼠与对照小鼠之间的纤维大小直径。

统计分析

在适用的情况下，执行学生t检验或单因子方差多重比较检验。

实施例7

毒理学/生物分布研究

使用确立的有效剂量和一个对数较高剂量进行毒理学/生物分布研究。毒理学研究是通过向6-8周龄的CAPN3-KO小鼠全身性(尾静脉)递送rAAV进行的，包括与正常的C57Bl6正常小鼠进行的比较。包括6-10只小鼠的群组，并且使用类似GLP的方法进行完整的尸检。

将从血液样品中收集的血清用于临床化学：丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、胆红素(总和直接)、血尿素氮、肌酸酐、肌酸激酶、葡萄糖和总蛋白。

通过对动物内脏和尸体进行彻底和系统性检查和解剖来进行完整的尸检。收集的组织/器官包括性腺、脑、脾脏、肾脏、空肠、结肠、胰腺、心脏、肺、胃、肝脏、腹股沟淋巴结、脊髓腓肠肌和四头肌。收集用于组织病理学研究的组织/器官，并将其固定在10％中性缓冲福尔马林(10％NBF)中，但所有骨骼肌标本除外，这些骨骼肌标本用OCT固定在木块上，并在液氮冷却的甲基丁烷中快速冷冻进行冷冻切片。

实施例8

肌内注射后的体内生物效能测试

如上文实施例5中所述，在将AAVrh.74.tMCK.CAPN3(1E11 vg)肌内(IM)注射到CAPN3 KO小鼠(n＝3)的胫骨前(TA)肌肉中后进行了体内生物效能测试。

施用后4周，通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)和western印迹分析来分析基因递送。对于Western印迹分析，将与50μg全肌肉蛋白质提取物对应的样品在3-8％丙烯酰胺、Tris-乙酸盐SDS凝胶上分离，并转移到PVDF膜上。使用针对含有人钙蛋白酶3序列AA 1-19的合成肽的单克隆抗体(Leica)和作为加载对照的肌肉特异性肌动蛋白抗体(Leica)进行免疫检测。图3A证明肌内注射后在TA肌肉中存在94kD钙蛋白酶3蛋白。RT-qPCR分析证明，与WT小鼠相比，基因转移后4周人钙蛋白酶3基因的相对表达水平回到正常水平(参见图3B)。将小鼠GAPDH用作参考基因，并且将WT C57BL/6用于校准RT-qPCR数据。

另外，肌内施用后进行定量组织病理学分析。如图所示，将治疗过的CAPN3 KO小鼠的TA肌纤维的直径与未治疗的对照(林格乳酸盐注射的TA)肌肉的直径进行比较。在AAV.hCAPN3注射的TA肌肉中，慢缩氧化(STO，深色)、快缩氧化(FTO，中间)和快缩糖酵解(FTG，浅色)纤维的平均纤维大小出现趋于WT值的正常化。纤维类型大小的定量如表4中所提供，并展示了在治疗情况下的增加。

表4

总之，在CAPN3 KO小鼠(n＝2)中将载体(1E11 vg)IM注射到胫骨前(TA)肌肉中之后的体内生物效能测试表明，在基因递送后4周，1)RT-qPCR和western印迹分析显示CAPN3转录物和94kDa全长钙蛋白酶3蛋白的表达；和2)组织学分析显示与对照(林格氏乳酸盐注射的TA)肌肉相比TA的肌纤维直径增加。

实施例9

全身注射后的体内生物效能测试

通过CAPN3-KO小鼠的尾静脉全身注射AAVrh.74.tMCK.CAPN3(3E12 vg或6E12 vg)后进行体内生物效能测试。低剂量CAPN3KO群组(n＝5；小鼠表示为Z18-13、Z18-15、Z18-16、Z18-17、Z18-18)接受在300μl林格氏乳酸盐中的3E12 vg。在基因注射后4周，通过跑至耗竭跑步机测试评价小鼠的跑步疲劳，并且然后将小鼠安乐死以收集组织。除去上肢和下肢(TA、腓肠肌(GAS)、四头肌、三头肌)、心脏、肝脏、脾脏、肺、卵巢和睾丸的肌肉，并且将组织样品冷冻在异戊烷中，并在液氮中冷却。

在TA肌肉中评价RT-qPCR CAPN3表达。对于3E12 vg低剂量，如通过高CT值(>27)观察到，CAPN3 mRNA表达水平低。Western印迹分析显示无法检测到对应的蛋白条带。即使对于低剂量在此组织中观察到低表达数据，但全身施用3E12 vg仍表现出功能和组织学益处。

随后，全身施用较高剂量(6E12 vg)以研究在较高剂量的载体递送下是否可以检测到蛋白质表达。高剂量群组(小鼠表示为Z18-20、Z18-21、Z18-23和Z18-24)CAPN3-KO小鼠接受了6E12 vg AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体(通过全身注射到尾静脉的低剂量群组中使用的剂量的两倍)，并在注射后4周实施被实施安乐死。RT-qPCR在四头肌、三头肌、GAS、TA和心肌中显示出不同的CAPN3表达水平。

为了确定CAPN3 mRNA的相对表达，从以3E12 vg(低剂量群组1)和6E12 vg(高剂量群组2)的剂量用tMCK.hCAPN3载体治疗的CAPN3KO小鼠中收集肌肉组织样品。从两个群组中分离出总RNA，并且与来自通过IM注射(1E11 vg；参见上文实施例8)接受载体的群组的先前样品一起测定了CAPN3相对于小鼠GAPDH的qPCR。

通过以下方法确定CAPN3的相对表达：

CT＝CT_CAPN3–CT_mGAPDH

ΔΔCT＝ΔCT–ΔCT_校准器*

CAPN3的相对表达＝2^-ΔΔCT

下表5和图5中显示了每种组织中CAPN3的相对表达和原始CT值。表5提供了IM递送(小鼠编号Z18-11和Z18-12)和全身递送的数据

表5：CAPTN3 RT-PCR：

总体而言，与1E11 vg的IM递送(<1％的IM递送)相比，全身递送后在CAPN3 KO肌肉中CAPN3 mRNA的表达具有动物和组织特异性变异性和较低的相对表达；这对于3E12低剂量群组尤其如此。因此，全长94kDa蛋白低于通过Western印迹检测的极限。然而，在高剂量群组中在全身注射6E12 vg全身剂量后表现出稳健的基因表达和大量的全长钙蛋白酶3蛋白。

实施例10

全身性AAVrh74.tMCK.hCAPN3基因递送的评估

通过qPCR评估基因转移效率，从而计算以6E12 vg全身递送AAVrh74.tMCK.hCAPN3后在CAPN3 KO小鼠组织样品中的载体基因组拷贝。确定了下肢和上肢骨骼肌(四头肌、TA、腓肠肌、三头肌)、心脏和肝脏的载体基因组负荷。从冷冻组织样品中分离基因组DNA。使用以下引物组在ABI 7500(Applied Biosystems)上进行qPCR测定：“5’-CGGAGAGCAACTGCATAAG-3’(正向；SEQ ID NO:8)；

“5'-GGCTGATGATGGCTGAATAG-3’(反向；SEQ ID NO:9)。引物对专门从hCAPN3 ORF的5'区域和表达载体独特的下游区域(包括内含子元件的部分)扩增产物。最终结果报告为每微克基因组DNA的AAVrh74载体平均拷贝数。

如图6所示，在全身性载体递送后在肝脏中存在最高的载体基因组拷贝数。载体基因组分布在肌肉群之间是可变的。总体而言，与其他肌肉相比，四头肌和心脏组织中的值更高。还注意到实验变异性；就像小鼠编号Z18-21与其他3只小鼠相比在所有肌肉群中均显示出相对较低的拷贝数一样。

在3E12 vg全身治疗的CAPN3 KO小鼠中观察到功能和组织学特征均得到改善，然而，通过RT-qPCR在总RNA分离物中仅检测到低水平的肌肉钙蛋白酶3表达，并且对于特定的肌肉组织通过Western印迹无法检测到全长94kDa蛋白(参见图3A)。然而，在6E12 vg全身剂量后表现出稳健的基因表达和大量的全长钙蛋白酶3蛋白(参见图3B)。数据证明，在AAVrh74.tMCK.hCAPN3颗粒的基因转移后4周之后，与WT小鼠相比，钙蛋白酶3基因表达回到正常水平。将小鼠GAPDH用作参考基因，并且将WT C57BL/6用于校准RT-qPCR数据。

组织病理学

如上所讨论，在注射后4周观察到功效趋势。在两个群组中(3E12和6E12)在注射后4周在全身递送AAVrh.74.tMCK.hCAPN3后的CAPN3 KO小鼠的TA肌肉中观察到纤维大小显著增加。如图7所示，与未治疗的KO对应群组相比，两个治疗群组中的总纤维直径均显著增加(p<0.00001)。治疗导致纤维大小正常化，并且治疗群组之间没有剂量相关的差异(p＝0.78058)。表6提供了在3E12和6E12 vg的全身性AAV.hCAPN3基因疗法后在野生型和CAPN3KO小鼠的肌纤维大小。

表6

在任何一个群组中在全身注射AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体后的4周时，均没有心脏毒性的组织病理学证据。在心脏组织中发现了可变量的病毒，然而在任何一个群组中，通过Western印迹在心脏组织中均未检测到蛋白质条带。

功能性研究：跑至耗竭测试

小鼠习惯于在跑步机(Columbus Instruments)上每天以10m/min跑步15分钟持续3天，然后获取关于跑至耗竭测试的数据。所使用的方案要求将小鼠放在倾斜15度的跑步机上。跑步机以1m/min的速度打开，并且速度每分钟增加1m，直到小鼠耗竭为止。当小鼠坐在休息垫上至少15秒钟时确定耗竭。记录达到耗竭的时间、速度和距离。

图8A提供了如在全身施用后4周评估的接受3E12 vg的AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3的低剂量群组以及接受6E12 vg的AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3的高剂量群组2的跑至耗竭测试的数据。与未治疗的对应小鼠相比，在两个群组中的治疗的CAPN3 KO小鼠在跑至耗竭测试中表现更好。在低剂量群组和高剂量群组之间，在跑至耗竭测试表现方面没有明显的剂量相关差异或在肌纤维直径方面没有的统计学差异。

在施用6E12 vg的AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3后20-24周，进一步对来自高剂量群组2(n＝16)的小鼠进行分析。如图8B所示，与未治疗的对应小鼠相比，治疗的CAPN3 KO小鼠在跑至耗竭测试中继续表现更好(p<0.00001)。

实施例11

在全身注射AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体后的心脏毒性评估

在注射后4周是对一个群组的小鼠实施安乐死后，收集血清和器官样品。低剂量群组1CAPN3KO群组(n＝5)通过尾静脉注射接受在300μl林格氏乳酸盐中的3E12 vg的AAVrh.74.tMCK.hCAPN3载体。高剂量群组2CAPN3-KO小鼠通过尾静脉接受了6E12 vgAAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体，并且在注射后4周对这两个群组实施安乐死。检查了穿过心脏顶点的两个切片，即心室的浅表区域和深层区域。在注射后4周以两种不同剂量全身性递送AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体后，未在组织切片中发现炎症、坏死或再生，表明在心肌上未观察到毒性作用。小鼠编号Z18-19和Z18-22(林格氏乳酸盐注射的/未治疗的)用作对照KO动物。图9提供了H&E染色的心脏新鲜冷冻切片。未见肌纤维坏死、再生或炎症。即使心脏组织中存在可变量的病毒，但是在任何一个群组中通过Western印迹均未检测到蛋白质条带。图10提供了Western印迹分析，其表明全长钙蛋白酶3蛋白低于转导后在心脏组织中检测的极限。

实施例12

体内生理分析

在IM或全身施用AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3载体后进行生理评估。在体内生理评估期间，用吸入异氟烷麻醉小鼠。一旦麻醉动物后，根据需要使用推剪将背部和后肢的毛发去除。如果用推剪脱毛不充分，则应用一层薄薄的脱毛膏。在体内生理力测量期间，在坐骨神经受到超大刺激后，通过连接到力检测马达(Aurora Scientific,Canada)的无创力脚踏板测量后肢的扭矩。用胶带将待测量的后肢附接到脚踏板上。肢体在钝钳中保持僵硬。坐骨神经的胫骨或腓骨部分被两个无菌的、一次性使用的28号单极电极刺激，这些电极皮下插入神经附近。小鼠温度通过导电的温度调节加热板(设置为37℃)或辐射热源来维持，并通过红外线温度探头进行监测。

尽管本公开提供了具体实施方案，但是应当理解，本领域技术人员将想到各种变化和修改。因此，仅应将权利要求中出现的此类限制应用于本发明。

本申请中提及的所有文件均据此以引用的方式整体并入。

Claims

1.一种包含多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)，所述多核苷酸包含第一AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、编码具有钙蛋白酶3(CAPN3)活性的蛋白质的核苷酸序列和第二AAV ITR。

2.根据权利要求1所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2至少95％相同。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的rAAV，其中编码所述具有CAPN3活性的蛋白质的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含与SEQ ID NO:7至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV，其中所述具有CAPN3活性的蛋白质包含SEQID NO:7的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的序列。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的rAAV，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的rAAV，其中所述启动子是肌肉特异性启动子。

12.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子包含以下中的一种或多种：人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、结蛋白启动子、骨骼α肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短的MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a肌球蛋白重链增强子/MCK增强子启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠类肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导核因子(HIF)-反应元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素反应元件(gre)。

13.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子是MCK启动子、tMCK启动子或MHCK7启动子。

14.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述肌肉特异性启动子是包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的截短的MCK启动子。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的rAAV，其中所述第一AAV反向末端重复序列和第二AAV反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV包含以下中的一种或多种：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74和AAV rh.10衣壳蛋白。

17.根据权利要求16中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV包含rh.74衣壳蛋白或AAV9衣壳蛋白。

18.一种组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV。

19.一种治疗受试者的肢带型肌营养不良2A型的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗导致以下中的一种或多种：

(a)肌纤维直径增加；

(b)小叶状肌纤维数量减少；

(c)具有内核的纤维数量减少；

(d)肌内膜结缔组织含量降低；

(e)肌肉萎缩的矫正，和

(f)肌力产生增加。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述治疗导致以下中的一种或多种：

(a)施用后4周每mm²的总肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％或40％；

(b)施用后4周肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；

(c)施用后4周每mm²的STO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或42％；

(d)施用后4周STO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％；

(e)施用后4周每mm²的FTO肌纤维数量减少至少5％、10％、15％或20％；

(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；

(g)施用后4周每mm²的FTG肌纤维数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％；以及

(h)施用后4周FTG肌纤维直径增加至少5％、10％、15％、20％或25％。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述施用是通过肌内注射或静脉内注射进行。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述受试者的心肌显示出从根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物表达的最少或低的钙蛋白酶3蛋白。

25.一种用于治疗肢带型肌营养不良2A型的组合物，所述组合物包含治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中用所述组合物进行的治疗导致以下中的一种或多种：

(a)肌纤维直径增加；

(b)小叶状肌纤维数量减少；

(c)具有内核的纤维数量减少；

(d)肌内膜结缔组织含量降低；

(e)肌肉萎缩的矫正，和

(f)肌力产生增加。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的组合物，其中用所述组合物进行的治疗导致以下中的一种或多种：

(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；

29.根据权利要求25-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成通过肌内注射或静脉内注射来施用。

30.根据权利要求25-28中任一项所述的组合物，其中在用所述组合物治疗之后，所述受试者的心肌显示出从根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物表达的最少或低的钙蛋白酶3蛋白。

31.治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物用于制备治疗肢带型肌营养不良2A型的药物的用途。

32.根据权利要求31所述的用途，其中用所述药物进行的治疗导致以下中的一种或多种：

(a)肌纤维直径增加；

(b)小叶状肌纤维数量减少；

(c)具有内核的纤维数量减少；

(d)肌内膜结缔组织含量降低；

(e)肌肉萎缩的矫正，和

(f)肌力产生增加。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述肌纤维包含以下中的一种或多种：慢缩氧化(STO)肌纤维、快缩氧化(FTO)肌纤维和快缩糖酵解(FTG)纤维。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的用途，其中用所述药物进行的治疗导致以下中的一种或多种：

(f)施用后4周FTO肌纤维直径增加至少5％、10％、15％或20％；

35.根据权利要求31-34中任一项所述的用途，其中所述药物被配制成通过肌内注射或静脉内注射来施用。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的用途，其中在用所述药物治疗之后，所述受试者的心肌显示出从根据权利要求1-17中任一项所述的rAAV或根据权利要求18所述的组合物表达的最少或低的钙蛋白酶3蛋白。