CN112526123B - 一种dnp-bsa聚合度的质控方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫层析检测技术领域，具体公开了一种DNP‑BSA聚合度的质控方法。包括以下步骤：S1、喷金垫的制备：将待测BSA‑DNP采用胶体金标记后包被在喷金垫上；S2、包被膜的制备：通过点喷方式将检测抗体间隔包被在包被膜上形成检测线，在包被膜上按样品层析方向间隔设置有至少两条检测线；S3、检测试纸条的制备：将包被膜和样品垫、喷金垫、吸收垫黏接在一起并固定在基片区上；S4、在样品垫上滴加60‑120μl缓冲液，静置600s以上，观察结果。本申请的制备方法具有将聚合度符合使用条件的DNP‑BSA批次挑选出来的优点。
Description
技术领域
本申请涉及免疫层析检测技术领域，更具体地说，它涉及一种DNP-BSA聚合度的质控方法。
背景技术
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)的条状硝酸纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光或者胶体金标记的抗体或抗原固定于玻璃纤维材质的结合垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体或者抗原结合，当到达检测线时再与包被抗体或者抗原结合形成荧光条带或者金标条带，从而达到检测待测物的目的。
现有的免疫层析检测试纸条在生产、储存和运输过程中的失误会导致检测结果存在假阴性的情况。为了排除假阴性导致的检测失误，一般会在硝酸纤维素膜上添加一条质控线。常用的质控线系统有羊抗鼠多克隆抗体系统，鸡IgY和羊抗鸡IgY系统。DNP-BSA是最近兴起的一种质控线系统，由于2，4-二硝基苯酚是动植物体内天然不存在的小分子化合物，该技术使用抗2，4-二硝基苯酚(DNP)的抗体和偶联到牛血清白蛋白的2，4-二硝基苯酚(BSA-DNP)制作质控线，使得此系统有优良的稳定性并且极少对检测线产生干扰。
化学偶联方法合成的DNP-BSA是多个BSA和DNP交联形成的多聚物，制备过程中反应条件的变化会导致DNP-BSA的聚合度发生变化。高聚合度的BSA能够提高质控线的信号强度，但是过高的聚合度会产生信号堆积现象(质控线度的信号不均一，质控线样品垫一侧的信号会大大高于另一侧吸水垫的一侧)，导致荧光检测的精密度(CV)变大；过低的聚合度容易导致质控线信号强度较低的问题。
目前DNP-BSA的生产工艺无法很好的控制DNP-BSA的聚合度，不同批次的DNP-BSA的聚合度总是在一定的范围内变动，其中只有一部分能够满足层析纸条的使用条件。现有技术中体积排阻色谱法(SES)(也称凝胶渗透色谱法(GPC))是测量聚合物分子量的常用方法，但是BSA-DNP的分子量过大超出了该方法的测量范围，无法用来测量BSA-DNP的聚合度，导致无法将符合使用条件的DNP-BSA批次挑选出来。
发明内容
为了将聚合度符合使用条件的DNP-BSA批次挑选出来，本申请提供一种DNP-BSA聚合度的质控方法。
本申请提供的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，采用如下的技术方案：
一种DNP-BSA聚合度的质控方法，包括以下步骤：
S1、喷金垫的制备：将待测BSA-DNP采用胶体金标记后包被在喷金垫上；
S2、包被膜的制备：通过点喷方式将检测抗体间隔包被在包被膜上形成检测线，在包被膜上按样品层析方向间隔设置有至少两条检测线；
S3、检测试纸条的制备：将包被膜和样品垫、喷金垫、吸收垫黏接在一起并固定在基片区上；
S4、在样品垫上滴加60-120μl缓冲液，静置600s以上，观察结果。
通过采用上述技术方案，将待测的BSA-DNP标记后包被在喷金垫上，再朝滴加缓冲液，随着缓冲液的层析作用扩散至包被膜上，检测线对BSA-DNP进行拦截，若BSA-DNP聚合度过高则存在BSA-DNP无法通过检测线，并使得靠近样品垫的检测线的着色相对于远离样品垫检测线的着色更深，且着色程度差别较大，并着色程度依次变浅，由此可以判断出该批次BSA-DNP的聚合度过高无法用以制备质控线；若BSA-DNP聚合度过低，则BSA-DNP均能够通过检测线，使得多条检测线的着色较淡且较为均匀，由此可以判断出该批次BSA-DNP的聚合度过低，制备出质控线的检测质量信号较低；若BSA-DNP的聚合度适宜，则靠近样品垫的检测线颜色较浓，剩余检测颜色相对较淡且着色相近，该批次制得的BSA-DNP用于制备质控线具有优良的稳定性并且极少对检测线产生干扰。
优选的，所述检测线的数量为三条。
通过采用上述技术方案，检测线的数量为三条，对于新接触该检测方法的人来说，通过三条检测线的对比可得出该批次BSA-DNP聚合度是否符合制备质控线范围，对比结果明显，方便新人使用。
优选的，所述检测线的数量为两条。
通过采用上述技术方案，对于经常使用该方法检测BSA-DNP聚合度的实验人员来说，通过靠近样品垫的检测线与远离样品垫检测线的结果对比即可得出该批次BSA-DNP聚合度是否符合制备质控线的要求。
优选的，相邻所述检测线之间的距离为3-9mm。
通过采用上述技术方案，控制相邻检测线之间的距离，能够有利于提高检测线的检测性能，使得检测结果更为准确。
优选的，S1步骤的具体实现方式：
(A)在0.5-1.5ml浓度为0.02-0.06％的胶体金溶液中加入1-3μl浓度为2M的碳酸钾溶液混匀，然后加入10-30μg的DNP-BSA在旋转混合仪上室温混合15-20min。
(B)加入10-30％的BSA溶液5-15μl混合20-30min，以8000-12000rpm的转速离心3-10min。
(C)弃上清，加入50-150μl的复溶液，吹打混匀。
(D)加入450-1200μl的干燥液，混匀后加入到喷金垫上。
通过采用上述技术方案，DNP-BSA和胶体金进行混合，使得胶体金标记在DNP-BSA上，并通过复合液和缓冲液的处理，使得DNP-BSA标记物更加稳定，使其能够稳定的发挥作用。
优选的，所述复溶液为含有5％的BSA和0.05％的PEG20000浓度为10mM的Tris缓冲液，所述复溶液的pH为8-9。
通过采用上述技术方案，复合液的加入，能够提高溶液中蛋白质的浓度，避免DNP-BSA标记物失效。
优选的，所述干燥液为含有0.5％的酪蛋白和0.1％的吐温20浓度为10mM的Tris缓冲液，所述干燥液的pH为8。
通过采用上述技术方案，加入干燥液，酪蛋白作为无关蛋白对非特异位点进行封闭，提高检测的准确性。
优选的，所述检测抗体包括鼠抗人DNP单克隆或多克隆抗体、兔抗人DNP单克隆或多克隆抗体和羊抗人DNP单克隆或多克隆抗体。
优选的，所述检测线为检测抗体通过划膜喷金一体机以0.8-1.5μL/cm的喷涂速度喷涂在包被膜上干燥后得到的。
通过采用上述技术方案，采用划膜喷金一体机对检测线进行制备，效率较高、废品率底，且得到的检测线的线条均匀，使得检测的结果得到保障。
优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸收垫为吸水滤纸制成；样品垫和喷金垫由玻璃纤维棉制成；基片区可选用聚乙烯底板、聚氯乙烯底板、聚丙烯底板或聚苯乙烯底板中的一种。
通过采用上述技术方案，包被膜、吸收垫、样品垫、喷金垫和基片区均采用普通的材料制成，材料选取方便，成本较低，便于对BSA-DNP进行检测。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、将待测的BSA-DNP标记后包被在喷金垫上，再朝滴加缓冲液，随着缓冲液的层析作用扩散至包被膜上，检测线对BSA-DNP进行拦截，以此判断BSA-DNP的聚合度是否符合要求。
2、检测线的数量为三条，对于新接触该检测方法的人来说，通过三条检测线的对比可得出该批次BSA-DNP聚合度是否符合制备质控线范围，对比结果明显，方便新人使用。
3、本申请的方法，通过检测线的数量为两条，对于经常使用该方法检测BSA-DNP聚合度的实验人员来说，通过靠近样品垫的检测线与远离样品垫检测线的结果对比即可得出该批次BSA-DNP聚合度是否符合制备质控线的要求。
附图说明
图1是本申请提供的方法的流程图；
图2是实现本申请方法制得检测试纸条的示意图；
图3是本申请中三种DNP-BSA聚合度检测结果图。
附图标记：1、基片区；2、包被膜；3、检测线；4、喷金垫；5、样品垫；6、吸收垫。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
在以下实施例中所使用的原料来源如下表1所示：
表1-原料来源
| 原料 | 货号 | 产家 |
| 胶体金 | G7277 | Sigma |
| 碳酸钾溶液 | / | 市售 |
| DNP-BSA | / | Sigma |
| BSA | 69003431 | 国药试剂 |
| PEG20000 | / | Sigma |
| Tris缓冲液 | T6455 | Sigma |
| 吐温20 | 93773 | Sigma |
实施例
制备多批BSA-DNP，并分别通过本申请文件公开了一种DNP-BSA聚合度的质控方法进行检测。参照图1及图2，该质控方法包括以下步骤：
实施例1：
S1、喷金垫的制备；
S11、在0.5-1.5ml浓度为0.02-0.06％的胶体金溶液中加入1-3μl浓度为2M的碳酸钾溶液混匀，然后加入10-30μg的DNP-BSA在旋转混合仪上室温混合15-20min；
S12、加入10-30％的BSA溶液5-15μl混合20-30min，以8000-12000rpm的转速离心3-10min；
S13、弃上清，加入50-150μl的复溶液，复溶液的pH为8-9，吹打混匀；
S14、加入450-1200μl的干燥液，干燥液的pH为8，混匀后加入到喷金垫4上。
S2、包被膜的制备：通过划膜喷金一体机以0.8-1.5μL/cm的喷涂速度将检测抗体喷涂在包被膜2上干燥后得到的，在包被膜2上按样品层析方向间隔设置有三条检测线3；
S3、检测试纸条的制备：将包被膜2和样品垫5、喷金垫4、吸收垫6黏接在一起并固定在基片区1上；
S4、在样品垫5上滴加60-120μl缓冲液，静置600s以上，观察结果。
其中，复溶液为含有5％的BSA和0.05％的PEG20000浓度为10mM的Tris缓冲液；干燥液为含有0.5％的酪蛋白和0.1％的吐温20浓度为10mM的Tris缓冲液；包被膜2为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸收垫6为吸水滤纸制成；样品垫5和喷金垫4由玻璃纤维棉制成；基片区1为聚乙烯底板、聚氯乙烯底板、聚丙烯底板或聚苯乙烯底板中的一种。
实施例2，与实施例1区别点在于：检测线3的数量为三条。
实施例3-4，与实施例1区别点见表2；
表2
挑选出图3三种检测结果的BSA-DNP，将三批BSA-DNP通过公开号为CN103869079B记录的一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸进行制备胶体金试纸，并用胶体金试纸快速定量检测半乳糖凝集素-3。结果见表3。
表3
根据表3可以看出，通过本申请文件中的质控方法能够挑选出适合制备质控线的BSA-DNP。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、喷金垫的制备：（A）在0.5-1.5ml浓度为0.02-0.06%的胶体金溶液中加入1-3μl浓度为2M的碳酸钾溶液混匀，然后加入10-30μg的DNP-BSA在旋转混合仪上室温混合15-20min；
（B）加入10-30%的BSA溶液5-15μl混合20-30min，以8000-12000rpm的转速离心3-10min；
（C）弃上清，加入50-150μl的复溶液，吹打混匀；
（D）加入450-1200μl的干燥液，混匀后加入到喷金垫（4）上；
S2、包被膜的制备：通过点喷方式将检测抗体间隔包被在包被膜（2）上形成检测线（3），在包被膜（2）上按样品层析方向间隔设置有至少两条检测线（3）；
S3、检测试纸条的制备：将包被膜（2）和样品垫（5）、喷金垫（4）、吸收垫（6）黏接在一起并固定在基片区（1）上；
S4、在样品垫（5）上滴加60-120μl缓冲液，静置600s，观察结果；
所述检测抗体包括鼠抗人DNP单克隆或多克隆抗体、兔抗人DNP单克隆或多克隆抗体和羊抗人DNP单克隆或多克隆抗体；
所述复溶液为含有5%的BSA和0.05%的PEG20000浓度为10mM的Tris缓冲液，所述复溶液的pH为8-9；
所述干燥液为含有0.5%的酪蛋白和0.1%的吐温20浓度为10mM的 Tris缓冲液，所述干燥液的pH为8。
2.根据权利要求1所述的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，所述检测线（3）的数量为三条。
3.根据权利要求1所述的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，所述检测线（3）的数量为两条。
4.根据权利要求1所述的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，相邻所述检测线（3）之间的距离为3-9mm。
5.根据权利要求1所述的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，所述检测线（3）为检测抗体通过划膜喷金一体机以0.8-1.5μL/cm的喷涂速度喷涂在包被膜（2）上干燥后得到的。
6.根据权利要求1所述的一种DNP-BSA聚合度的质控方法，其特征在于，所述包被膜（2）为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸收垫（6）为吸水滤纸制成；样品垫（5）和喷金垫（4）由玻璃纤维棉制成；基片区（1）选用聚乙烯底板、聚氯乙烯底板、聚丙烯底板或聚苯乙烯底板中的一种。
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