CN112512550B

CN112512550B - 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途

Info

Publication number: CN112512550B
Application number: CN201980050112.9A
Authority: CN
Inventors: 田晨敏; 李皓; 刘洵
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd; Suzhou Suncadia Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd; Suzhou Suncadia Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2024-09-13
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN112512550A; TW202031279A; MX2021005018A; AU2019374363A1; JP2022512862A; JP7436477B2; US20220017601A1; UA127771C2; EP3878461A4; BR112021008288A2; EP3878461A1; TWI829799B; WO2020094122A1; KR20210090643A; CA3118415A1

Abstract

本公开公开了一种TGF‑β受体融合蛋白药物组合物及其用途。具体而言，该药物组合物包含在枸橼酸钠缓冲液中的TGF‑β受体融合蛋白，所述的TGF‑β受体融合蛋白包含PD‑L1抗体靶向部分和TGF‑βRII胞外区。除此之外，该药物组合物还可含有糖和非离子型表面活性剂。

Description

一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途

本申请要求2018年11月09日提交的专利申请201811328326.1的优先权，其通过引用整体并入此处。

技术领域

本公开属于药物制剂领域，具体涉及一种包含PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白的药物组合物，以及其作为药物的用途。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

在肿瘤治疗中，人们早已认识到化疗所带来的高毒性，以及化疗可导致耐药性癌细胞产生。即使是使用靶向性的治疗手段，来针对过度表达或过度激活的与肿瘤生存生长相关的蛋白，仍会有癌细胞通过变异来减少或逃脱对靶向性治疗所针对通路的依赖，并利用其它的通路继续生存。

肿瘤免疫治疗近年来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点，较难产生耐药性是该疗法的突出优势。肿瘤免疫治疗主要通过免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答。肿瘤免疫治疗将免疫细胞和效应分子输注宿主体内，两者协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。

程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)为CD28超家族成员。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞及髓系细胞。PD-1有两个配体，即程序性死亡配体-1(programmed deathligand 1，PD-L1)和PD-L2。PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。PD-1/PD-L1通路抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答，因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对肿瘤抑制有重要的意义。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β通过异源四聚体受体复合物传递信号，这个受体复合物是由两个I型和两个II型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成。

TGF-β是一种多功能的细胞因子，以细胞或背景依赖的方式发挥肿瘤抑制或肿瘤促进的作用。TGF-β的肿瘤抑制作用源于其诱导多个基因表达的能力。当肿瘤发展过程中引入突变或表观遗传修饰时，癌细胞逐渐耐受TGF-β的抑制作用，最终导致肿瘤的发展。

研究发现阻断TGF-β信号传导通路能够减少肿瘤的转移。运用截短的Smad2/3显负性突变体抑制乳腺肿瘤细胞系的TGF-β信号通路，结果发现肿瘤细胞的转移能力被抑制。结肠癌的微卫星不稳定性研究发现，TGF-βRII无活性的突变，使转移减少，增加了患者术后的存活率。但总体而言，在临床治疗中单独施用TGF-β信号通路的抑制剂，其效果微弱，可能是因为TGF-β主要在肿瘤细胞内异常性高表达，而单独的TGF-β信号通路的抑制剂很难集中靶向肿瘤，而导致药效不高或抑制剂的生物利用度不高。

因此，在肿瘤微环境中靶向并中和TGF-β基础上，抑制PD-1/PD-L1通路可以使T细胞恢复活性，增强免疫应答，更有效地提高抑制肿瘤发生和发展的效果。

本申请人在先的PCT申请PCT/CN2016/104320(公开号WO2017084495)提供了一种PD-L1抗体。目前已有抗体/TGF-β受体融合蛋白公开，如WO2006074451A2、WO2009152610A1、WO2011109789A2、WO2013164694A1、WO2014164427A1、WO2015077540A2、WO9309228A1、WO9409815A1、WO2015077540A2、WO2015118175A2等。其中，默克公开一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白Bintrafusp Alfa(WO2015118175，也称M7824、FP17022)，目前Bintrafusp Alfa已经在胃癌、肺癌、食管癌、NSCLC、胆道癌等肿瘤疾病中开展临床。但是，现有技术中的抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于给药，并且在储存及随后使用过程中能保持稳定性，发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。

发明内容

本公开提供一种更利于生产和给药，性能更稳定的包含PD-L1/TGF-βRII融合蛋白的药物组合物，其包含：

-TGF-β受体融合蛋白，以及

-缓冲液，

所述缓冲液选自组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和枸橼酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，所述缓冲液为枸橼酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述的组氨酸盐缓冲液选自组氨酸-盐酸缓冲液，所述的琥珀酸盐缓冲液选自琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液，所述枸橼酸盐缓冲液选自枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液；在一些实施方案中，所述缓冲液选自枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述TGF-β受体融合蛋白浓度为大约0.5mg/ml至大约100mg/ml，优选为大约30mg/ml至大约70mg/ml。

在一些实施方案中，药物组合物中所述TGF-β受体融合蛋白浓度为0.5mg/ml至100mg/ml，优选为30mg/ml至70mg/ml。TGF-β受体融合蛋白浓度非限制性实施例包括：大约30mg/ml、大约35mg/ml、大约40mg/ml、大约45mg/ml、大约50mg/ml、大约55mg/ml、大约60mg/ml、大约65mg/ml、大约70mg/ml，优选大约50mg/ml；

在一些实施方案中，药物组合物中所述TGF-β受体融合蛋白浓度为30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml，更优选50mg/ml。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述缓冲液的pH值为大约5.0到大约7.5，优选为大约6.0至大约6.5，还可选为约6.0、约6.1、约6.2、约63、约6.4、约6.5，更优选为大约6.2；

在一些实施方案中，所述缓冲液的pH值为5.0至7.5或6.0至6.5，优选为6.0、6.1、6.2、63、6.4或6.5，更优选为6.2。

在可选的实施方案中，缓冲液的浓度为约5mM至约30mM，优选为大约5mM至大约20mM，非限制性实施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM，更优选为10mM。

在一些实施方案中，缓冲液的浓度为5mM至30mM，优选为5mM至20mM，在一些实施方案中，缓冲液的浓度为约10mM、约12mM、约14mM、约16mM、约18mM、约20mM，更优选为约10mM。

在可选的实施方案中，前述药物组合物还包含糖。本公开的“糖”包含常规组合物(CH₂O)_n或其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖、非还原性糖等等。在一些实施方案中，所述糖选自：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇(X ylitol)、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等等。优选的糖是非还原性二糖，更优选为海藻糖或蔗糖，最优选为蔗糖。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中糖的浓度为约50mg/ml至约100mg/ml，优选为约60mg/ml至约90mg/ml，非限制性实施例包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml，最优选为80mg/ml。

在一些实施方案中，糖的浓度为50mg/ml至100mg/ml，优选为60mg/ml至90mg/ml，在一些实施方案中，糖的浓度为约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml或约90mg/ml。

在可选的实施方案中，前述药物组合物还包含表面活性剂，可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更优选为聚山梨醇酯80。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.1mg/ml至约0.8mg/ml，更优选为约0.4mg/ml至约0.8mg/ml，在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为0.1mg/ml至0.8mg/ml，优选为0.4mg/ml至0.8mg/ml，更优选约0.4mg/ml、约0.45mg/ml、约0.5mg/ml、约0.55mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml。

在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml或0.8mg/ml，更具体为0.4mg/ml。

在可选的实施方案中，前述药物组合物，其包含：

(a)大约0.5mg/ml至大约100mg/ml的TGF-β受体融合蛋白，(b)大约5mM至大约30mM的枸橼酸盐缓冲液，(c)大约50mg/ml至大约100mg/ml的蔗糖，和(d)大约0.1mg/ml至大约0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，优选所述药物组合物的pH为大约5.0至大约7.5，更优选为大约6.0至大约6.5。

在可选的实施方案中，前述药物组合物，其包含：

优选所述药物组合物的pH为5.0至7.5，更优选为6.0至6.5。

在可选的实施方案中，前述药物组合物包含：

(a)大约30mg/ml至大约70mg/ml的TGF-β受体融合蛋白，(b)大约5mM至大约20mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，(c)大约60mg/ml至大约90mg/ml的蔗糖，和(d)大约0.4mg/ml至大约0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，优选地，所述药物组合物的pH为大约6.0至大约6.5。

在可选的实施方案中，前述药物组合物包含：

所述药物组合物的pH为大约6.0至大约6.5。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)大约50mg/ml的TGF-β受体融合蛋白，(b)大约10mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，(c)大约80mg/ml的蔗糖，和(d)大约0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，优选所述药物组合物的pH约为6.2。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

优选所述药物组合物的pH约6.2。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述的TGF-β受体融合蛋白如通式(I)所示：

Ab-L-TGF-βRII ECD (I)

其中TGF-βRII ECD为TGF-βRII胞外区的截短形式；

Ab为PD-L1抗体或其抗原结合片段；

L为连接序列。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述的连接序列为(G₄S)_xG，其中x为3-6的整数。在可选的实施方案中，x为3、4、5或6，优选为4。

在可选的实施方案中，前述TGF-βRII胞外区的的截短形式是TGF-βRII胞外结构域序列(如SEQ ID NO：14所示)在其氨基端(也称N端)连续缺失至多26个氨基酸残基。在一些实施方案中，TGF-βRII胞外区的的截短形式是TGF-βRII胞外结构域序列在其N端连续缺失14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个氨基酸残基。在一些实施方案中，前述药物组合物中所述的TGF-βRII ECD的序列如SEQ ID NO：14、15、16或17所示；优选如SEQ ID NO：15所示的序列。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：

分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可选的实施方案中，前述药物组合物中所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段具有：

分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

如SEQ ID NO：7所示的重链可变区，和

如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区；

或，具有：

如SEQ ID NO：9所示的重链可变区，和

如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区。

在可选的实施方案中，前药物组合物中所述的PD-L1抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO：12所示或与SEQ ID NO：12所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；所述PD-L1抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示或与SEQ ID NO：13所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在可选的实施方案中，前述的药物组合物，其中所述TGF-β受体融合蛋白中，所述TGF-βRII ECD通过连接序列融合至PD-L1抗体重链羧基末端。

在一些实施方案中，所述TGF-β受体融合蛋白包含：

·融合有PD-L1抗体重链和TGF-βRII ECD的融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，以及

·PD-L1抗体轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示或与SEQ ID NO：13所示氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在另一些实施方案中，所述TGF-β受体融合蛋白包含：

·融合有PD-L1抗体重链和TGF-βRII ECD的融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，以及

本公开还提供制备前述药物组合物的方法，其中包括：使TGF-β受体融合蛋白和缓冲液接触的步骤，例如将TGF-β受体融合蛋白原液经缓冲液置换，所述缓冲液优选枸橼酸盐缓冲液，更优选为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，所述缓冲液浓度优选为大约5mM至大约20mM，非限制性实施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM，更优选为10mM；所述缓冲液pH为约6.0至约6.5，非限制性实施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5，优选6.2。在可选的实施方案中，所述缓冲液浓度为5mM至20mM，非限制性实施例包括大约5mM、大约6mM、大约7mM、大约8mM、大约9mM、大约10mM、大约12mM、大约14mM、大约16mM、大约18mM、大约20mM，更优选为大约10mM；所述缓冲液pH为6.0至6.5，非限制性实施例包括大约6.0、大约6.1、大约6.2、大约6.3、大约6.4、大约6.5，优选大约6.2。

本公开还提供制备前述药物组合物的方法，在TGF-β受体融合蛋白和缓冲液接触之后，进一步地还包括：向所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80(两者不区分先后次序)，再经缓冲液定容，其中缓冲液浓度优选为大约5mM至大约20mM，更优选为5mM至20mM，非限制性实施例包括5mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM；所述缓冲液pH为约6.0至约6.5，非限制性实施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。

本公开还提供一种制备包含TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂的方法，其中包括将前述药物组合物经冷冻干燥的步骤。

在可选的实施方案中，前述制备包含TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂的方法，其中所述冷冻干燥按照本领域公知的方法进行，例如但不限于包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。技术人员理解，任何将水从本公开所述药物组合物中移除的方法均适用于本公开。

本公开还提供一种含有TGF-β受体融合蛋白冻干制剂，其是经前述的制备冻干制剂的方法制备所得。

本公开还提供一种含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂，所述含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂经复溶后可形成前述的药物组合物。

在一些实施方案中，该冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。

本公开还提供一种含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液，其是通过将前述含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂复溶获得。

本公开还提供一种前述含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液的制备方法，其中包括：将前述冻干制剂经复溶的步骤，复溶所用溶液包括但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液，优选注射用水。

本公开进一步提供一种制品或试剂盒，其包含：根据本公开的药物组合物和容器。

在一些实施方案中，容器是玻璃瓶，例如但不限于中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。

本公开还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前述的药物组合物、或其冻干制剂、或冻干制剂的复溶溶液。

本公开还提供选自以下的任一项在制备药物中的用途：

前述的药物组合物、或冻干制剂、或冻干制剂的复溶溶液、或制品；所述药物用于治疗或抑制肿瘤细胞增殖或转移的疾病或病症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症为肿瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头部颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。

本公开还提供前一种治疗或抑制癌细胞增殖或转移的疾病或病症的方法，包括向所需受试者提供治疗有效量的前述药物组合物、或冻干制剂、或复溶溶液、或制品。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg的如前所述的TGF-β受体融合蛋白、药物组合物、或冻干制剂、或复溶溶液、或制品。在一些实施方案中，所述疾病或病症为肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头部颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。

本发明还提供一种用于治疗或抑制癌细胞增殖或转移的疾病或病症的前述TGF-β受体融合蛋白、药物组合物、或冻干制剂、或复溶溶液、或制品。在一些实施方案中，所述疾病或病症为肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头部颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。

如本领域技术人员所熟知的，本公开中所述各个实施方案的一项、一些或所有特性可以进一步组合以形成本公开的其它实施方案。本公开的以上实施方案和通过组合得到的其他实施方案通过下面的详述进一步说明。

附图说明

图1：融合蛋白结构示意图。

图2：融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果。

图3：融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果。

图4：融合蛋白体外结合人源PD-L1的结果。

图5：融合蛋白体外检测PD-1/PD-L1通路阻断实验结果。

图6：融合蛋白以剂量依赖性形式抑制TGFβ诱导的pSMAD3报告物活性。

图7：融合蛋白样品均能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ。

图8：融合蛋白对荷瘤小鼠瘤重的影响。

具体实施方式

术语

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的溶液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸盐、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸。

“组氨酸盐缓冲液”是包含组氨酸根离子的缓冲液。组氨酸盐缓冲液的示例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。组氨酸-盐酸盐缓冲液是组氨酸与盐酸配制而成。

“枸橼酸盐缓冲液”是包括枸橼酸根离子的缓冲液。枸橼酸盐缓冲液的示例包括枸橼酸-枸橼酸钠、枸橼酸-枸橼酸钾、枸橼酸-枸橼酸钙、枸橼酸-枸橼酸镁等。优选的枸橼酸盐缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠。

“琥珀酸盐缓冲液”是包括琥珀酸根离子的缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的示例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲液是琥珀酸-琥珀酸钠。

“磷酸盐缓冲液”是包括磷酸根离子的缓冲液。磷酸盐缓冲液的示例包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾等。优选的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。

“醋酸盐缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的示例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液是醋酸-醋酸钠。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。

本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。

“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经冷冻干燥步骤(例如真空冷冻干燥步骤)之后获得的制剂或药物组合物。

本文所用术语“约”或“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域中“约”或“大约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“大约”或“基本上包含表示至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。本公开中，除非另外说明，否则“约XX”或“大约XX”或“基本上包含XX”的含义是该具体值“XX”的可接受误差范围内的数值(包括数值“XX”本身，以及本领域一般技术人员测定该数值的可接受误差范围内的数值)。

本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中TGF-β受体融合蛋白或其药物组合物在贮藏后，基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性；优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量活性成分稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。

稳定的药物抗体或蛋白制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内或者在40℃保存28天的时段后表现出期望的特征。

稳定性的典型的可接受标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的活性成分(例如蛋白、抗体)发生降解。通过视觉分析，药物制剂是淡黄色近无色澄明液体或者无色，或澄清至稍微乳白色，或淡黄色近无色澄明液体。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。

如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述活性成分在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。

如果活性成分(例如蛋白或抗体)没有显示出显著的化学改变，那么所述活性成分(例如蛋白或抗体)在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白或抗体，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。

在给定时间内，如果活性成分(例如蛋白或抗体)的生物活性在制备药物制剂时所表现出的生物活性的预定范围内，那么所述活性成分(例如蛋白或抗体)在药物制剂中“保留它的生物活性”。活性成分(例如蛋白或抗体)的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。

在本公开中，本公开所述的抗体轻链可包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本公开中，本公开所述的抗体重链可包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR或VL)和重链可变区(HCVR或VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则，“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD)，“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

本公开中所述的“抗体或其抗原结合”或“功能片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及与抗体结合的Fv片段scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，是具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chainantibody)或单链Fv(sFv)。本公开的术语“与PD-L1结合”，指能与人PD-L1相互作用。本公开的术语“抗原结合位点”指抗体或抗原结合片段上不连续或连续的三维空间位点，其能识别靶抗原并与抗原特异性结合。

术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人PD-L1的单克隆抗体。制备时用PD-L1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将非人(例如小鼠)抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻非人(例如小鼠)抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌特异性单抗的杂交瘤，然后从杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将非人(例如小鼠)抗体可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的PD-LI嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的PD-LI嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将非人(例如小鼠)抗体CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量非人(例如小鼠)蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后获得的人源化抗体。

本公开中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合体，IgG4的F234A/L235A突变。

本公开中所述“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。本公开中的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National CenterFor Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。

术语“TGF-β受体II”或“TGFβRII”或“转化生长因子β受体II”是指结合配体(包括但不限于TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，并且由此引发细胞内的信号转导途径的细胞表面受体。

术语“PD-L1”是指程序性死亡配体1，也称为CD274和B7H1。PD-L1是具有胞外IgV样和IgC样结构域(全长PD-L1的氨基酸19-239)、跨膜结构域和约30个氨基酸的胞内结构域的290个氨基酸的蛋白质。PD-L1在许多细胞例如抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和B细胞)上以及造血细胞和非造血细胞(例如，血管内皮细胞、胰岛、和免疫赦免部位)上组成型表达。PD-L1也在多种肿瘤和病毒感染的细胞上表达，并且是免疫抑制环境(immunosuppressive milieu)的成员(Ribas 2012，NEJM 366：2517-2519)。PD-L1与两种T细胞共抑制剂PD-1和B7-1之一结合。

本公开所述的“PD-L1抗体或其抗原结合蛋白”可包括本领域中所述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。抗PD-L1抗体可以是市售可得的或已在文献中公开的PD-L1抗体。包括但不限于BMS-936559，MPDL3280A，MEDI4736，MSB0010718C(参见US2014341917、US20130034559、US8779108)等。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或人抗体。抗体片段包括具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及与抗体结合的Fv片段和scFv片段。

本公开示例性的PD-L1抗体的制备过程已在PCT申请PCT/CN2016/104320(公开号W02017084495)中公开，包括如下所述的重链可变区的CDR序列：

HCDR1：SYWMH SEQ ID NO：1

HCDR2：RIX₁PNSG X₂TSYNEKFKN SEQ ID NO：2

HCDR3：GGSSYDYFDY SEQ ID NO：3

在可选的实施方案中，X₁选自H或G，X₂选自G或F。

在另一个实施方案中，本公开示例性的PD-L1抗体进一步包括如下所述的轻链可变区的CDR序列：

LCDR1：RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：4

LCDR2：AASNLES SEQ ID NO：5

LCDR3：QQSFEDPLT SEQ ID NO：6；

在另一个实施方案中，本公开对上述的CDR区采用CDR移植策略进行抗体人源化，人源化构架的人源化轻链模板为IGKV7-3*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可变区序列如下：

人源化PD-L1抗体重链可变区：

SEQ ID NO：7，其中X₁选自H或G，X₂选自G或F。

人源化PD-L1抗体轻链可变区：

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列(CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释)。

在另一个实施方案中，对本公开人源化抗体的回复突变设计，回复突变设计见下表1：

表1.回复突变设计

注：如Y91F表示将第91位(自然顺序编号)Y突变回F。“植入”代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

将表1中各种轻重链的突变组合可得到新的人源化抗体。

本公开的另一方面，提供一种构建人源化克隆的实施例，如下：

设计引物，PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr。

1.引物设计：利用在线软件DNAWorks(v3.2.2)(http：//helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计多条引物合成VH/VK含重组所需基因片段：5’-30bp信号肽+VH/VK+30bpCH1/CL-3’。

2.片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，用上面设计的多条引物，分两步PCR扩增得到VH/VK含重组所需基因片段。

3.表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)构建及酶切

利用一些特殊的限制性内切酶，如BsmBI，识别序列与酶切位点不同的特性设计构建表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)。BsmBI酶切载体，切胶回收备用。

4.重组构建表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK含重组所需基因片段与BsmBI酶切回收表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)按3∶1比例分别加入DH5H感受态细胞中，0℃冰浴30min，42℃热击90s，加入5倍体积LB介质，37℃孵育45min，涂布LB-Amp平板，37℃培养过夜，挑取单克隆送测序得到各目的克隆。

5.根据本实施例的设计方案构建质粒，然后表达纯化蛋白，用检测例SPR测定所得蛋白亲和力。

6.最终用BIACORE测试人源化回复突变体与人源PD-L1-his或杂交瘤抗体的亲和力，筛选得到的人源化回复突变位点的选择及序列组合如下：

PD-L1抗体重链可变区：

其中，HCDR2为SEQ ID NO：7的X₁为G，X₂为F，即序列为：RIGPNSGFTSYNEKFKN SEQ IDNO：10

PD-L1抗体轻链可变区：

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列；下划线为CDR序列(CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释)。

本公开的另一方面，提供一种构建和表达抗PD-L1人源IgG4类型的实施例，并进一步用于融合蛋白构建的PD-L1抗体。该PD-L1抗体也可用作本公开中的测试例对照分子。

由于PD-L1在活化T细胞中也有表达，如果采用野生型IgG1恒定区会引起Fc介导的效应作用，比如ADCC和CDC，从而导致活化T细胞的消减。本公开选择突变IgG4以得到无ADCC和CDC的抗体。将亲合力成熟得到的克隆转换成IgG4类型，IgG4的核心铰链区包含S228P(对应于序列SEQ ID NO：12的自然顺序第227位)突变。并进一步引入F234A(对应于序列SEQ IDNO：12的自然顺序第233位)和L235A(对应于序列SEQ ID NO：12的自然顺序第234位)突变(mAbs 4：3，310-318；2012五月/六月)。同时，为防止抗体重链C末端在引入连接肽连接TGF-βRII胞外区时发生断裂，又将PD-L1抗体重链的最后一位K突变成A(对应于序列SEQ ID NO：12的最后一位)，以增加融合蛋白的稳定性。本公开用于融合蛋白构建的PD-L1抗体序列如下：

PD-L1抗体重链序列：Ig G4(AA)(S228P)

备注：下划线部分为重链可变区序列，无下划线部分为重链恒定区序列(斜体部分为突变位点)；

PD-L1抗体轻链序列：

备注：下划线部分为轻链可变区序列，无下划线部分为轻链恒定区序列。

本公开中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组得到的两个基因共表达的蛋白产物。现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法(如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章)。例如，小鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PD-L1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

本公开所述的“免疫调节分子”可用于削弱癌细胞的免疫耐受性。本公开采用TGF-βRII胞外结构域的截短形式作为融合蛋白中免疫调节分子部分。“TGF-β受体II(TGF-βRII)”以高亲和力结合配体TGF-β1和TGF-β3。TGF-β RII/TGF-β复合物招募TGF-β RI以形成信号转导复合物(Won等，Cancer Res 1999；59：1273-7)。TGF-βRII的胞外结构域是TGF-βRII细胞外自N端开始的一段长136个氨基酸残基的肽段，其中一个示例性的例子如SEQ IDNO：14所示。其他长度约为136个氨基酸，并且来源于人的具有TGF-βRII的胞外区的能够与TGF-β1和TGF-β3相结合的变体同样属于本公开TGF-βRII的胞外结构域的范围。本公开研究发现，TGF-βRII胞外结构域N端连续截短形式的结构和功能较未截短分子稳定。含TGF-βRII胞外结构域N端未截短(SEQ ID NO：14所示的1-136多肽)形式的融合蛋白容易断裂。尤其是在TGF-βRII胞外结构域N端作连续26个以下氨基酸的截短后更为稳定，优选N端作连续14-26个氨基酸的截短，更优选N端作14-21个氨基酸截短形式，具有更高的表达量，最优选N端作连续19或21个氨基酸的截短。

术语“TGF-β受体融合蛋白”是包含TGF-β受体的融合蛋白。在一些实施方案中，本公开的TGF-β受体融合蛋白为描述于国际专利申请PCT/CN2018/086451(WO 2018205985A1)中的TGF-β受体融合蛋白，WO 2018205985 A1的全文内容全部引入本公开。在一些实施方案中，所述TGF-β受体融合蛋白为PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白(PD-L1/TGF-βtrap)，其以TGF-βRII胞外结构域作为融合蛋白的免疫调节分子部分，PD-L1抗体作为融合蛋白的靶向部分，TGF-βRII胞外结构域(例如SEQ ID NO：14、15、16或17所示)通过连接序列(例如(G₄S)_xG，x为3-6)与PD-L1抗体的重链C末端(也称羧基末端)连接形成融合序列，融合序列与PD-L1抗体轻链通过链间二硫键连接最终形成PD-L1/TGF-β trap融合蛋白，其结构如图1所示。在一些实施方案中，所述TGF-β受体融合蛋白为本公开实施例1的表2所述融合蛋白。

术语“Linker”或“接头”或“连接子”或“连接序列”指用于连接蛋白质结构域的连接性多肽序列，通常具有一定的柔性，接头的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。本公开的一些实施方案中，连接序列为(G₄S)_xG，其中x为3-6，例如连接序列为：(G₄S)₃G、(G₄S)₄G、(G₄S)₅G或(G₄S)₆G等多肽。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“施用”或“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的的组合物，所述受试者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。

“置换”是指溶解抗体蛋白的溶剂体系的置换，例如，使用稳定制剂的缓冲体系经物理操作方式将含抗体蛋白的高盐或高渗溶剂体系置换，从而使抗体蛋白存在于稳定制剂中。所称物理操作方式包括但不限于超滤、透析或离心后复溶。

具体实施方式

通过以下实施例、测试例或制备例进一步详细说明本公开。这些实施例、测试例或制备例仅用于说明性目的，而并不用于限制本公开的范围。

本公开实施例、测试例或制备例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例

实施例1.融合蛋白PD-L1/TGF-β trap克隆和表达

采用TGF-βRII胞外结构域(SEQ ID NO：14的全长或截短形式)作为融合蛋白中免疫调节分子部分，将PD-L1抗体作为融合蛋白的靶向部分，形成PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白(PD-L1/TGF-βtrap)。

出乎意料地发现，TGF-βRII胞外结构域截短形式的结构和功能较为稳定，尤其是在其N端作26个以下氨基酸的截短后更为稳定，优选14-26个氨基酸的截短，更优选N端截短14-21个连续氨基酸的形式，具有更高的表达量和稳定的结构，更优选N端截短14、19或21个连续氨基酸的形式。

本公开TGF-βRII胞外结构域及其截短形式的非限制性实施例序列如下：

TGF-βRII胞外结构域序列：ECD(1-136)

TGF-βRII胞外结构域序列在N端有19个氨基酸的截短或缺失：ECD(20-136)

TGF-βRII胞外结构域序列在N端有21个氨基酸的截短或缺失：ECD(22-136)

TGF-βRII胞外结构域序列在N端有14个氨基酸的截短或缺失：ECD(15-136)

示例性地，利用同源重组技术将本公开PD-L1抗体(如重链如SEQ ID NO：12所示，轻链如SEQ ID NO：13所示的PD-L1抗体)的重链C末端氨基酸通过连接子((G₄S)_xG，x为3-6)连接不同长度的TGF-βRII胞外区，并与PD-L1抗体轻链一起，通过293表达系统进行常规表达，得到如表2所示的融合蛋白：

表2.PD-L1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白

注：Ab为本公开所述重链序列如SEQ ID NO：12所示，轻链序列如SEQ ID NO：13所示的PD-L1抗体，序列描述中ECD(n-136)为TGF-βRII胞外区的全长或截短形式，n为TGF-βRII胞外区截短后的氨基酸起始位数。本公开融合蛋白结构如图1所示；N19A是全长TGF-βRII胞外区(如SEQ ID NO：14所示)的第19位氨基酸由N突变为A。

编码PD-L1抗体的核苷酸序列、编码TGF-βRII胞外区的核苷酸序列、接头蛋白片段((G₄S)_xG)的核苷酸序列通过所属领域常规技术手段获得。利用同源重组技术将PD-L1抗体的C末端核苷酸通过接头蛋白连接不同长度TGF-βRII胞外区的N末端核苷酸，克隆到Phr-BsmbI载体上。重组的PD-L1/TGF-β trap在293细胞表达，通过实施例2进行纯化。纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。

实施例2.PD-L1/TGF-βtrap融合蛋白纯化

细胞培养液高速离心后收集上清，利用亲合层析进行第一步纯化。层析介质为与Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的Mabselect。平衡缓冲液为1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，pH7.4)，平衡5倍柱体积后，将细胞上清上样结合，流速控制为样品在柱上保留时间≥1min。上样结束后，用1×PBS(pH7.4)冲洗柱子，直至A280紫外吸收降至基线。然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)的洗脱缓冲液冲洗层析柱，根据A280紫外吸收峰收集洗脱峰，收集的洗脱样品用1M Tris(pH8.5)中和。

将上述中和后的洗脱样品超滤浓缩后进行体积排阻层析，缓冲液为1×PBS，层析柱为XK26/60 Superdex200(GE)，流速控制在4ml/min，上样体积小于5ml，根据A280紫外吸收合并目的蛋白峰。收集的蛋白经SEC-HPLC鉴定纯度大于95％，经LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到PD-L1/TGF-β trap。

以下用生化测试方法验证本公开中PD-L1抗体/TGF-β融合蛋白性能及有益效果。

测试例(体内、外活性生物学评价)

测试例1.ELISA检测PD-L1/TGF-β trap体外结合TGF-β1实验

检测流程描述如下：

a.以1μg/ml浓度的人源TGF-β1(8915LC，CST)为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。

b.250μl 1×PBST洗涤3次，加入250μl 5％牛奶PBS，37℃封闭2小时。

c.250μl 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的PD-L1/TGF-β trap，TGF-β trap为阳性对照，37℃孵育1小时。

d.250μl 1×PBST洗涤3次。

e.每孔加入100μl抗-人FC抗体-HRP(1∶4000)，37℃孵育40分钟。

f.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H₂SO₄终止反应。

g.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。

融合蛋白体外结合人源TGF-β1的结果如图2、图3所示。ELISA显示表2中融合蛋白1未保留对人源TGF-β1的结合活性。质谱分析结果显示融合蛋白1(即TGF-βRII胞外区非截短形式(1-136))不稳定，容易在重链TGF-βRII部分断裂，阳性对照同样存在相同情况，而融合蛋白7、9、10、12-15等TGFβRII胞外区N端截短形式的融合蛋白对于结合至人源TGF-β1是具有特异性的。

测试例2.ELISA检测PD-L1/TGF-βtrap体外结合PD-L1实验

检测用抗原：PD-L1-His

检测流程描述如下：

a.以5μg/ml浓度的人源PD-L1-His(SEQ ID NO：18)为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。

b.250μl 1×PBST洗涤3次，加入250μl 5％牛奶PBS 37℃封闭2小时。

c.250μl 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的PD-L1/TGF-βtrap，PD-L1抗体为阳性对照，37℃孵育1小时。

d.250μl 1×PBST洗涤3次。

e.每孔加入100μl抗人FC抗体-HRP(1∶4000)，37℃孵育40分钟。

f.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止反应。

g.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。

本公开融合蛋白体外结合人源PD-L1的结果如图4所示。ELISA结果显示融合蛋白均保留了对人源PD-L1的结合活性。

测试例3.体外检测PD-1/PD-L1通路阻断实验

1.测试目的：

为了研究PD-L1/TGF-β trap对PD-1/PD-L1信号通路的阻断作用，采用来自Promaga公司构建的分别带有人源PD-1和PD-L1受体分子的细胞，进行基于细胞水平上的抗体阻断实验。

2.测试样品：

①PD-L1抗体：重链序列如SEQ ID NO：12所示，轻链序列如SEQ ID NO：13所示；

②对照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(20-136)与Fc的融合蛋白，序列如下：

③对照2(22T-Fc)：ECD(22-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(22-136)与Fc的融合蛋白，序列如下：

④本公开实施例1制备的TGF-β受体融合蛋白：融合蛋白9、融合蛋白15：

融合蛋白9中融合PD-L1抗体重链-(G₄S)₄G-TGF-βRII ECD(20-136)的融合肽序列如下：

备注：正体字为PD-L1抗体重链序列，斜体为连接序列，下划线为TGF-βRII胞外区截短片段ECD(20-136)序列。

融合蛋白9中的PD-L1抗体轻链序列如下：

融合蛋白15中的融合PD-L1抗体重链-(G₄S)₅G-TGF-β RII ECD(22-136)的融合肽序列如下：

备注：正体字为PD-L1抗体重链序列，斜体为连接序列，下划线为TGF-βRII胞外区截短片段ECD(22-136)序列；

融合蛋白15中的PD-L1抗体轻链序列如下：

⑤人IgG：空白对照，从混合的正常人血清中，利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白；

⑥阳性对照(FP17022)：PD-L1抗体2/TGF-βRII胞外区融合蛋白

FP17022融合蛋白中的PD-L1抗体2轻链的氨基酸序列

FP17022融合蛋白中的PD-L1抗体2重链/TGF-βRII胞外区(1-136)的融合肽的氨基酸序列：

3.测试过程

取CHO/PD-L1细胞(CS187108，Promega)，消化并用F-12 Nutrient Mixture(Ham)完全培养基重悬细胞。根据细胞计数结果使用完全培养基调整细胞密度至4×10⁵/mL，将细胞悬液转移至加样槽中，使用多道移液器以100μL/孔加入到96孔板中，放置于37℃，5％CO₂培养箱培养20～24h；第二天制备Jurkat/PD-1(CS187102，Promega)细胞悬液，根据细胞计数结果使用分析培养基重悬细胞，并调整细胞密度至1.25×10⁶/mL；将加入CHO/PD-L1细胞的细胞培养板从培养箱中取出，使用多道移液器每孔取出95μL培养液，按照40μL/孔加入梯度稀释的融合蛋白，以PD-L1抗体及阳性对照(FP17022)，然后将Jurkat/PD-1细胞悬液转移至加样槽中，以40μL/孔加入到细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养5～6h。在蛋白孵育期间，将Bio-Glo^TM Reagent取出使其温度恢复至室温。取出细胞培养板，置于室温放置5～10min，然后每孔加入40μL Bio-Glo^TM Reagent，置于安全柜中孵育5～10min，使用多功能酶标仪读取化学发光信号值。

4.结果

如图5所示，本公开融合蛋白9同阳性分子一样均能够有效地阻断表达有PD-1分子的Jurkat细胞同CHO/PD-L1细胞结合，并且有药物浓度剂量依赖效应。融合蛋白15与融合蛋白9有相同水平的阻断能力。

测试例4.Biacore检测体外结合亲和力和动力学实验

通过Biacore T200(GE)测定待测分子与人或鼠源TGF-β1或人源PD-L1蛋白的亲和力，实验过程描述如下：

用Protein A芯片亲和捕获一定量的PD-L1/TGF-β trap，然后于芯片表面流经人或鼠源TGF-β1(8915LC，CST)或人源PD-L1(Sino Biological)，利用Biacore实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线，然后用甘氨酸-盐酸(pH 1.5，GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲溶液为HBS-EP Buffer(GE)。实验得到的数据用BIAevaluation version4.1软件(GE)以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，得出如表3所示的亲和力数值。

表3.本公开融合蛋白与TGF-β1或人源PD-L1的体外亲和力

*对应序号的融合蛋白形式见表2。

融合蛋白结合活性见表3，结果表明，本公开融合蛋白9和融合蛋白15均对人、小鼠TGF-β1以及人PD-L1具极高的亲和力。

测试例5.SMAD3报告基因抑制实验

1、测试目的

该实验通过HepG2细胞表达带荧光素酶报告基因的Smad3结合原件(SBE)来研究PD-L1/TGF-β trap对TGF-β1诱导Smad3活化的抑制作用，根据IC50大小评价PD-L1/TGF-βtrap的体外活性。

2、测试样品：融合蛋白9、阳性对照(FP17022)

3、测试过程

HepG2细胞使用含有10％FBS的MEM完全培养基(GE，SH30243.01)培养，每3天传代一次。实验第一天以每孔25,000个细胞的密度接种于96孔板(Corning，3903)，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。第二天，弃去细胞培养板中的培养基，每孔转染100ng 3TP-Lux质粒。细胞在37℃、5％CO₂条件下继续培养24小时。加入待测样品前6小时，弃去96孔板中完全培养基，每孔加入80μL不完全培养基(MEM+0.5％FBS)。6小时后再加入10μL使用不完全培养基配制的人TGF-β1(R&D，240-B-010)溶液，终浓度为2ng/mL和10μL待测样品，终浓度为500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005和0nM，以人TGF-β1溶剂为对照，细胞在37℃、5％CO₂条件下继续培养18h。然后每孔加入100μL配制好的萤光素酶底物ONE-GloTM Luciferase Assaysystem(promega，E6110)，室温避光放置10分钟，然后使用Victor3多功能酶标仪(PerkinElmer)读取发光信号值。待测样品的IC50值使用数据处理软件Graphpad Prism5.0计算得到。

图6显示融合蛋白9以剂量依赖性形式抑制TGFβ诱导的pSMAD3报告物活性，且与阳性对照FP17022具有相当的功效和IC₅₀(抑制最大活性的50％所需的浓度)。PD-L1抗体的测试结果显示其不具有抑制作用(IC₅₀＞500nM)。

测试例6.体外检测结核杆菌素(TB)刺激PBMC释放IFNγ实验

1、测试目的

为了研究PD-L1/TGF-β trap对T淋巴细胞的激活作用，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，采用结核杆菌素(TB)体外刺激5天，检测IFNγ细胞因子的分泌水平。

2、测试样品：

①人IgG；

②PD-L1抗体；

③融合蛋白9；

④对照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc；

⑤PD-L1抗体+对照1(20T-Fc)。

3、测试过程

新鲜分离纯化的PBMC，15mL约3×10⁷个，加入20μL结核菌素，37℃、5％CO₂培养箱培养5天。第6天，收集上述培养的细胞离心，用PBS洗一次，重悬至新鲜的培养基中，调整密度为1×10⁶个每毫升，接种至96孔细胞培养板，每孔90μL。将不同浓度的抗体分别加入上述96孔细胞培养板的对应孔中，每孔10μL，对照组和空白组分别加入10μL PBS。细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(4000rpm，10min)每孔取上清，10倍稀释后，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒，欣博盛，EHC102g.96)检测IFN-γ的水平。具体操作参考试剂说明书。结果如下表4所示，PD-L1/TGF-β trap融合蛋白样品均能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且有药物浓度剂量效应。

表4.细胞因子IFN-γ的分泌结果

4、结果

如图7、表4所示，融合蛋白9能够剂量依赖地增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且具有比PD-L1抗体，20T-FC更强的激活作用。

测试例7.药代动力学评价

实验用SD大鼠3只，雌性，12/12小时光/暗调节，温度24±3℃恒温，湿度50-60％，自由进食饮水。购自杰思捷实验动物有限公司。实验当天对SD大鼠分别尾静脉注射融合蛋白，给药剂量为6mg/kg，注射体积为5ml/kg。

取血时间点为：第1天给药后15min、7h、24h(第2天)，第3天，第4天，第6天，第8天，第10天，第15天，于大鼠眼底静脉取血，每次200μl(相当于取血清100μl)；收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下10000 x g离心10分钟。收集上清，立即放置-80℃贮存。用ELISA检测血清中的融合蛋白浓度。

检测流程描述如下：

a.以2μg/ml浓度的人源PD-L1-His为抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。

b.250μl 1×PBST洗涤4次，加入250μl 5％牛奶PBS，37℃封闭3小时。

c.250μl 1×PBST洗涤4次，加入100μl梯度稀释的待测血清，以融合蛋白9为阳性对照，37℃孵育1小时。

d.250μl 1×PBST洗涤5次。

e.每孔加入100μl生物素化的抗人源TGF-βRII的抗体(R&D)，37℃孵育1小时。

f.250μl 1×PBST洗涤5次。

g.每孔加入100μl TMB，室温孵育10分钟后加入100μl 1M H₂SO₄终止反应。

h.酶标仪上检测450nm测吸收值，Graphpad Prism5分析数据。

表5.融合蛋白在SD大鼠中的T1/2

参见表5，PK分析结果表明，本公开的融合蛋白9在大鼠体内的半衰期约为236h(9.8天)。

测试例8.PD-L1/TGF-β trap对人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的疗效

本实验应用的小鼠品系为NOD/SCID雌性小鼠(卡文斯)，实验使用的人外周血单个核细胞从新鲜采集的血液中提取获得，提取方法如下：将肝素抗凝处理的静脉血与同体积含2％FBS的PBS混合，混匀后将25ml稀释后的血液缓慢加入到含15ml淋巴细胞分离液的离心管中，室温下1200g离心10分钟，吸取淋巴细胞层转移到另一个离心管，加入PBS清洗细胞，室温下300g离心8分钟，重复一次后，用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，将细胞加入到事先包被好CD3抗体(OKT3，40ng/ml)的6孔板中，每孔2×10⁶个细胞(2ml)，置于37℃培养箱中培养4天。

实验样品：

①空白对照：PBS；

②融合蛋白9：4.8mpk；

③融合蛋白9：24mpk；

④PD-L1抗体：4mpk；

⑤PD-L1抗体：20mpk；

⑥PD-L1抗体4mpk+对照1(20T-Fc)2.14mpk；

⑦对照1(20T-Fc)：2.14mpk。

将MDA-MB-231细胞重悬于无血清RPMI-1640培养基中，与等体积基质胶混合后100μl(2.3×10⁶)接种于NOD/SCID小鼠右肋部皮下，11天后去除肿瘤体积过大过小动物后，将小鼠随机分组，每组9只。将5×10⁵个刺激后的PBMC(60μl)注射到肿瘤组织中，剩余的PBMC停止刺激并继续培养，1周后将5×10⁶个PBMC(100μl)腹腔注射到荷瘤小鼠体内，视为第1轮注射。整个实验周期，进行2轮半、共5次PBMC注射。首次瘤内注射当日开始腹腔给药，一周三次，共给药14次，给药方式见表6。每周2次测量瘤体积，称体重。实验结果见表7。实验结束后将荷瘤小鼠安乐死并剥瘤称重。

表6.试验分组及给药情况

表7.融合蛋白9对MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的疗效

第0天：第一次给药时间；*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001通过student t检验与PBS对比。

实验结果如图8显示，抗体融合蛋白9(4.8mg/kg、24mg/kg)能明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的生长，高低剂量间呈现剂量依赖关系，且优于各自等同摩尔剂量的参比药物PD-L1抗体(4mg/kg、20mg/kg)、TGF-βRII对照分子20T-FC(2.14mg/kg)和联用组(PD-L1抗体-4mg/kg+20T-FC-2.14mg/kg)。各剂量的融合蛋白9从给药后14天开始，就一直保持理想的抑瘤效果，且其高剂量与PD-L1抗体-20mpk相比，优势非常明显(p＜0.05)；给药后25天，各抗体抑瘤效果最好，融合蛋白9和PDL-1抗体低、高剂量与联用组的抑瘤率分别为37.24％、52.38％、30.24％、28.01％、31.38％；给药后32天，融合蛋白9的抑瘤作用仍十分明显，低高剂量组％TGI分别为36.68％和50.76％，且瘤体积与对照组相比都存在统计学差异(p＜0.05)。

测试例9.PD-L1/TGF-β trap的物理稳定性

本测试例用于检测融合蛋白融合蛋白9和融合蛋白15的稳定性。

利用DSC(Differential scanning calorimetry，差示扫描量热法)检测不同抗体的热稳定性，比较了不同的缓冲体系下的稳定性情况，不同缓冲体系如10mM醋酸盐/135mMNaCl(pH 5.5)和10mM醋酸盐/9％海藻糖(pH 5.5)。

将样品置换到对应缓冲液中，控制样品浓度在50mg/ml左右，利用MicroCal*VP-Capillary DSC(Malvern)进行检测。检测前，将各个样品及空白缓冲液用真空脱气器脱气1～2min。样品板每个孔加入400μl样品或空白缓冲液(仪器上样量为300μl)。最后两对孔板分别加入14％Decon 90和ddH₂O，以备清洗用，样品板加样完毕后，套上塑料软盖板。扫描温度从25℃开始到100℃结束，扫描速率60℃/h。具体结果如下表8所示，在两个测试体系中融合蛋白9、融合蛋白15均表现了良好的热稳定性。

表8.热稳定性测试

通过SEC-HPLC监测样品纯度考察一定浓度条件下周期性稳定性，示例性的条件比如将样品浓度控制在约50mg/ml，在10mM醋酸盐/135mMNaCl(pH 5.5)比较在比如-80℃反复冻融5次及40℃保存一个月的稳定性情况。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC柱子检测。检测结果如下表9所示，两个融合蛋白均表现出良好的稳定性。

表9.稳定性

	融合蛋白9(Δ％)	融合蛋白15(Δ％)
			40℃	3.39％	1.8％
-80℃冻融	1.44％	1.39％

注：Δ％表示变化率。

测试例10.融合蛋白的化学稳定性

脱酰胺修饰是抗体中可能影响后期稳定性的一种常见的化学修饰，尤其是CDR区域的部分氨基酸高度脱酰胺修饰一般选择尽量避免或者突变降低。取1600μg待测抗体溶于200μl 10mM醋酸盐/135mM NaCl(pH 5.5)中，40℃恒温箱存放；分别于0、14、28天取样，用于酶解实验。将100μg不同时间点取样的样品溶于100μl 0.2M His-HCl，8M Gμa-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小时，后用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超滤两次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶，37℃水浴酶解过夜。Agilent 6530 Q-TOF进行LC-MS检测脱酰胺修饰情况，结果如下表10所示。

表10.脱酰胺修饰

备注：N代表检测到修饰的天冬酰胺，数字代表所处轻链或者重链N端开始计数所处的位置。百分含量代表LC-MS检测到的脱酰胺修饰占该位点所处全部肽段信号的比例。

质谱检测结果显示两个融合蛋白都没有明显的脱酰胺修饰位点，提示其后期化学稳定性良好。

制备例

示例性融合蛋白药物组合物(制剂)制备工艺

第一步：取一定量的纯化的TGF-β受体融合蛋白原液，用不含蛋白的缓冲液(如10mM，pH 6.2枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液)进行溶剂置换(优选超滤)，经超滤膜至少6倍体积置换，蛋白浓缩到约70mg/mL。加入一定体积的蔗糖母液，混匀，使最终蔗糖浓度为80mg/mL。加入一定体积的吐温-80母液，混匀，使最终吐温-80浓度为0.4mg/mL。加10mM pH 6.2枸橼酸盐缓冲液定容，使蛋白浓度为50mg/mL(其他待测试制剂或稳定性制剂参照相似步骤进行配制)。

产品经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。

第二步：调节装量至6.3ml，将滤液灌装于6ml西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。

第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。

第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。

制备例1.TGF-β受体融合蛋白制剂缓冲体系pH值的筛选

用下列缓冲液，配制蛋白浓度为50mg/ml的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)制剂：

1)10mM组氨酸-醋酸，pH 5.0

2)10mM组氨酸-醋酸，pH 6.0

3)10mM组氨酸-醋酸，pH 6.5

4)10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 7.0

5)10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 7.5

过滤每种制剂并以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。取样品分别进行40℃高温和振摇实验，实验结果如表11所示，结果表明TGF-β受体融合蛋白在pH 6.0-6.5时稳定性较好。

表11.强制降解实验筛选结果

注：振摇条件为：D1：130rpm，D2：200rpm，D3-D7：300rpm；D表示天，T表示时间，M表示月。

制备例2.TGF-β受体融合蛋白制剂缓冲体系的筛选

1)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH 6.0

2)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 6.0

3)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 6.5

4)10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH 6.5

5)10mM组氨酸-盐酸盐，pH 6.5

过滤每种制剂并以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。取样品进行振摇(25℃，300rpm)实验，实验结果见表12，结果表明，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组在振摇第6天见大量小颗粒，SEC检测聚体达1.8％，而其它组仅偶见小颗粒，可见TGF-β受体融合蛋白在枸橼酸、组氨酸和琥珀酸盐缓冲体系中的稳定性优于磷酸盐缓冲体系。

表12.缓冲体系及pH值筛选实验结果

注：D表示天。

制备例3.TGF-β受体融合蛋白制剂缓冲体系的进一步筛选

用pH 6.2的含10mM组氨酸-盐酸盐或10mM枸橼酸-枸橼酸钠的缓冲液制备含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)浓度为50mg/ml的制剂。

过滤每种制剂并以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。将样品保存于25℃，进行稳定性分析，6个月的SEC或非还原CE-SDS检测。

实验结果见表13，结果表明，枸橼酸-枸橼酸钠体系优于组氨酸-盐酸盐体系(M6的SEC聚体：1.8％V 2.2％；非还原CE-SDS：94.5％V 92.2％)，因此可选择枸橼酸体系作为TGF-β受体融合蛋白的缓冲体系。

表13.缓冲体系筛选25℃加速稳定性实验结果

注：T表示时间；D表示天；M表示月。

制备例4.TGF-β受体融合蛋白制剂中稳定剂的筛选

用下列不同糖种类的缓冲液，制备蛋白浓度为50mg/ml的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)制剂：

1)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，80mg/ml蔗糖，pH 6.2

2)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，80mg/ml α，α-二水合海藻糖，pH 6.2

过滤每种制剂并以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。取样品分别进行25℃常温和2-8℃低温长期保存实验。

实验结果见表14，结果表明蔗糖与海藻糖对TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)的稳定性作用相似，选择蔗糖作为TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)的稳定剂。当蔗糖浓度为80mg/ml时，渗透压约为300mosm/kg，接近等渗，因此可选蔗糖浓度为80mg/ml。

表14.糖种类筛选实验结果

注：T表示时间，M表示月。

制备例5.TGF-β受体融合蛋白制剂中表面活性剂的筛选

用下列不同浓度及种类表面活性剂的缓冲液，制备蛋白浓度为50mg/ml的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)制剂：

1)10mM组氨酸-盐酸盐，0.1mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

2)10mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

3)10mM组氨酸-盐酸盐，0.4mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

4)10mM组氨酸-盐酸盐，0.6mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

5)10mM组氨酸-盐酸盐，0.8mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

6)10mM组氨酸-盐酸盐，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

7)10mM组氨酸-盐酸盐，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

8)10mM组氨酸-盐酸盐，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

9)10mM组氨酸-盐酸盐，0.6mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

10)10mM组氨酸-盐酸盐，0.8mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

过滤每种制剂并取0.5mL注射入50mL生理盐水注射液或5％葡萄糖注射液，使稀释后蛋白浓度为0.5mg/mL。观察样品的稀释稳定性。实验结果见表15，结果表明，处方中聚山梨酯20浓度达到0.2mg/ml以上时，稀释后不溶性微粒有显著下降；聚山梨酯80，氯化钠稀释产生的不溶性微粒随着其浓度增加而减少，当达到0.4mg/ml以上时，10μm以上颗粒可降低到10个/ml以内。

表15.聚山梨酯筛选-稀释振摇实验结果

制备例6.TGF-β受体融合蛋白制剂中表面活性剂的进一步筛选

用下列不同种类表面活性剂的缓冲液，制备蛋白浓度为50mg/ml的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)：

1)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

2)10mM枸橼酸-枸橼酸钠，0.6mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

过滤每种制剂并以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，水针压塞轧盖封口。取样品进行2-8℃低温长期保存实验。

实验结果见表16，结果表明聚山梨醇酯80对TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)的稳定性作用更好，因此选择聚山梨醇酯80作为TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)的表明活性剂。

表16.聚山梨酯筛选2-8℃长期稳定性实验结果

注：T表示时间，D表示天，M表示月。

制备例7.TGF-β受体融合蛋白制剂滤膜相容性实验

TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)以50mg/ml配制在10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2中。将制剂分别过0.22μm PES滤膜和PVDF滤膜并于开始、中间和最后取样检测。

实验结果见表17，蛋白含量、外观和纯度分析表明，TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)在与滤膜接触的时间内是稳定的，该制剂与PES和PVDF滤膜均可以相容。

表17.滤膜相容性实验结果

注：T表示时间。

制备例8.TGF-β受体融合蛋白制剂的冻干

用pH6.2的含10mM枸橼酸-枸橼酸钠的缓冲剂，制备TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)浓度为50mg/ml，含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)制剂。将抗体以6.3mL/瓶填充入20mL西林瓶中，装入冻干箱中，冻干。

冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥。冻干程序结束后，真空加塞。复溶样品进行冻干前后对比。结果表明，复溶溶液可保持液体制剂良好的性能。

表18.制剂的冻干步骤

制备例9.其它可选择制剂组成

此外，本公开还提供其它制剂配方的TGF-β受体融合蛋白(融合蛋白9)药物制剂：

(1)70mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.4；

(2)80mg/ml融合蛋白9，85mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.2；

(3)60mg/ml融合蛋白9，90mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和5mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.2；

(4)30mg/ml融合蛋白9，60mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.3；

(5)90mg/ml融合蛋白9，95mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.0；

(6)100mg/ml融合蛋白9，70mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和25mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.5；

(7)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为7.0；

(8)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为7.5；

(9)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为5.0；

(10)60mg/ml融合蛋白9，70mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为5.5；

(11)40mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.2；

(12)55mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和5mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为6.0；

(13)65mg/ml融合蛋白9，90mg/ml蔗糖，0.7mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为7.5；

(14)70mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为7.0；

(15)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终pH为7.0。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

<120> 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途

<150> 201980050112.9

<151> 2019-11-08

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR1

<400> 1

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2

<220>

<221> DOMAIN

<222> (3)..(3)

<223> Xaa选自His或Gly

<220>

<221> DOMAIN

<222> (8)..(8)

<223> Xaa选自Gly或Phe

<400> 2

Arg Ile Xaa Pro Asn Ser Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR3

<400> 3

Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 5

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源化PD-L1抗体重链可变区

<220>

<221> DOMAIN

<222> (52)..(52)

<223> Xaa选自His或Gly

<220>

<221> DOMAIN

<222> (57)..(57)

<223> Xaa选自Gly或Phe

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Xaa Pro Asn Ser Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 人源化PD-L1抗体轻链可变区

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> PD-L1抗体重链可变区

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2

<400> 10

Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 11

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> PD-L1抗体轻链可变区

<400> 11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> PD-L1抗体重链序列：Ig G4(AA) (S228P)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala

435 440 445

<210> 13

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> PD-L1抗体轻链序列

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 14

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> TGF-βRII胞外结构域序列：ECD (1-136)

<400> 14

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> TGF-βRII胞外结构域序列在N端有19个氨基酸的截短或缺失：ECD (20-136)

<400> 15

Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe

1 5 10 15

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

20 25 30

Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

35 40 45

Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

50 55 60

Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile

65 70 75 80

Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys

85 90 95

Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn

100 105 110

Thr Ser Asn Pro Asp

115

<210> 16

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> TGF-βRII胞外结构域序列在N端有21个氨基酸的截短或缺失：ECD (22-136)

<400> 16

Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr

1 5 10 15

Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile

20 25 30

Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp

35 40 45

Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr

50 55 60

His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys

65 70 75 80

Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser

85 90 95

Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser

100 105 110

Asn Pro Asp

115

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> TGF-βRII胞外结构域序列在N端有14个氨基酸的截短或缺失：ECD (15-136)

<400> 17

Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

20 25 30

Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val

35 40 45

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

50 55 60

His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

115 120

<210> 18

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 检测用抗原：PD-L1-His

<400> 18

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Glu Gln Lys Leu

210 215 220

Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His

225 230 235

<210> 19

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 对照1（20T-Fc）：ECD(20-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(20-136)与Fc的融合蛋白

<400> 19

Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe

1 5 10 15

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

20 25 30

Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

35 40 45

Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

50 55 60

Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile

65 70 75 80

Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys

85 90 95

Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn

100 105 110

Thr Ser Asn Pro Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

115 120 125

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

130 135 140

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

145 150 155 160

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

165 170 175

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

180 185 190

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

195 200 205

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

210 215 220

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

225 230 235 240

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

245 250 255

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

260 265 270

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

275 280 285

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

290 295 300

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

305 310 315 320

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

325 330 335

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

340 345

<210> 20

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 对照2（22T-Fc）：ECD(22-136)-Fc，TGF-βRII胞外区截短片段ECD(22-136)与Fc的融合蛋白

<400> 20

Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr

1 5 10 15

Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile

20 25 30

Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp

35 40 45

Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr

50 55 60

His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys

65 70 75 80

Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser

85 90 95

Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser

100 105 110

Asn Pro Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

145 150 155 160

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

165 170 175

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

180 185 190

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

195 200 205

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

210 215 220

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

225 230 235 240

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

245 250 255

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

260 265 270

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

290 295 300

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

305 310 315 320

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

325 330 335

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

340

<210> 21

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> FP17022融合蛋白中的PD-L1抗体2轻链的氨基酸序列

<400> 21

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 22

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> FP17022融合蛋白中的PD-L1抗体2重链/TGF-βRII胞外区（1-136）的融合肽序列

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

465 470 475 480

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

485 490 495

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

500 505 510

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

515 520 525

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

545 550 555 560

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

565 570 575

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

580 585 590

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 23

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 融合蛋白9中融合PD-L1抗体重链-（G4S）4G- TGF-βRII ECD（20-136）的融合肽序列

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

465 470 475 480

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

485 490 495

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

500 505 510

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

515 520 525

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

530 535 540

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

545 550 555 560

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

565 570 575

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

580

<210> 24

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 融合蛋白15中融合PD-L1抗体重链-（G4S）5G-TGF-βRII ECD（22-136）的融合肽序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys

465 470 475 480

Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met

485 490 495

Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys

500 505 510

Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val

515 520 525

Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala

530 535 540

Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr

545 550 555 560

Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile

565 570 575

Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

580 585

Claims

1.一种药物组合物，其包含：

(a)0.5mg/ml至100mg/ml TGF-β受体融合蛋白，以及

(b)5mM至30mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液；

(c)50mg/ml至100mg/ml糖，所述糖选自：海藻糖和蔗糖；

(d)0.4mg/ml至0.8mg/ml聚山梨醇酯80；

其中所述TGF-β受体融合蛋白包含：

PD-L1抗体重链和TGF-βRII ECD形成的融合肽，其序列如SEQ ID NO：23所示，和

PD-L1抗体轻链，其序列如SEQ ID NO：13所示；

所述药物组合物的pH为6.0至6.5。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的浓度为5mM至20mM。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的浓度为大约10mM。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述TGF-β受体融合蛋白的浓度为30mg/ml至70mg/ml。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述TGF-β受体融合蛋白的浓度为大约50mg/ml。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为大约6.2。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述糖为蔗糖。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述蔗糖的浓度为60mg/ml至90mg/ml。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述蔗糖的浓度为大约80mg/ml。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚山梨醇酯80的浓度为大约0.4mg/ml。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含：

所述药物组合物的pH为6.0至6.5。

12.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含：

所述药物组合物的pH为6.0至6.5。

13.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含：

所述药物组合物的pH为约6.2。

14.一种制备如权利要求1至13任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括：使TGF-β受体融合蛋白和缓冲液接触的步骤；其中，

所述缓冲液枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，

所述缓冲液的浓度为5mM至20mM，所述缓冲液的pH为6.0至6.5。

15.一种含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂，所述含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂通过将权利要求1至13任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。

16.一种含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂，所述含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂经复溶后可形成如权利要求1至13中任一项所述的药物组合物。

17.一种含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液，所述含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液是通过将权利要求15或16所述的冻干制剂经复溶获得。

18.一种制品，其包括容器，所述容器中包含：

如权利要求1至13任一项所述的药物组合物、或

如权利要求15或16所述的含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂、或

如权利要求17所述的含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液。

19.选自以下的任一项在制备药物中的用途：

如权利要求1至13任一项所述的药物组合物、或如权利要求15或16所述的含有TGF-β受体融合蛋白的冻干制剂、或如权利要求17所述的含有TGF-β受体融合蛋白的复溶溶液、或如权利要求18所述的制品；

所述药物用于治疗的疾病或病症选自：头部颈部癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、鼻咽癌、甲状腺癌、肺癌、骨髓瘤癌、神经内分泌癌、淋巴瘤、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、肉瘤、间皮瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌；所述肺癌选自：小细胞肺癌、非小细胞肺癌。