CN112500454A - 一种依色格南的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽依色格南的制备方法，包括：以Fmoc‑Linker‑氨基树脂为起始原料，采用Fmoc/tBu固相合成方法，利用偶联剂按照依色格南的氨基酸序列依次将Fmoc‑氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上，得到全保护十七肽的肽树脂；裂解液切割并脱除肽树脂保护基，得到依色格南线性粗肽；液相一步空气氧化，控制多肽溶液的浓度在0.5～5g/L范围内，调节其pH值至8‑10，使第5位与第14位、第7位与第12位间分别形成分子内二硫键，获得依色格南粗品溶液；将依色格南粗品溶液过滤、分离纯化、转盐和冷冻干燥，获得依色格南三氟醋酸盐或依色格南醋酸盐。本发明采用固相与液相相结合的方式，将两个二硫键的氧化简化为一步反应，提高了产品的纯度，粗肽产率大，有利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子多肽化合物的制备，具体涉及依色格南(包括依色格南醋酸盐、三氟醋酸盐及游离肽)的制备方法。
背景技术
依色格南(Iseganan)是猪中性粒细胞肽-1的类似物，能与细菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等相结合，引起细菌膨胀、破裂，通过破坏细胞膜杀死细菌。其对革兰氏阳性、阴性细菌及真菌、酵母菌等均有抑制作用。依色格南分子式为C78H126N30O18S4，分子量为1900.2852，氨基酸序列如下：
依色格南是一类广泛存在于动物、植物、昆虫及人体内，由基因编码并具有特定空间结构的小分子多肽，这种多肽是机体天然免疫的组成部分。抗菌肽具有广谱高效的抗微生物学活性、水溶性好、热稳定等优点。作为新型药物，抗菌肽在人类治疗和预防疾病过程中具有广阔的开发应用前景。
现有技术中，已报道过多种依色格南的合成方法，例如专利CN102336813A报道了固相合成线性肽，然后在液相中成环的方法。该方法在固相中合成线性肽，切除固相上保护线性肽时脱除5和14位的半胱氨酸上的巯基保护基Trt，后用双氧水氧化形成第一对二硫键(Cys5-14)；再在碘的甲醇溶液中脱除7和12位的半胱氨酸的巯基保护基Acm，同时氧化形成第二对二硫键。王小青等2016年报道了另一种固相合成线性肽后经过两次液相环化制备依色格南的方法，其两次环化也使用了过氧化氢和碘氧化法。这类方法在第二对二硫键形成时需要用到大量的碘，导致很难进行后处理、产生废液多，在产品中容易造成碘残留、超标，且难以运用于大生产中。专利文献CN103012563A报道了一种依色格南的固相合成方法，先按照固相合成的方法合成线性的十七肽氨基树脂，然后采用固相成环方式，先脱除一种保护基并氧化生成第一对二硫键，再脱除另一种保护基并氧化生成第二对二硫键，最后脱除N端保护基，从氨基树脂上裂解并去除侧链保护基，纯化得到依色格南。以上现有技术中不论是液相环化还是固相环化，都需要经过两次脱保护基并氧化的过程，不仅工艺复杂，而且使用的氧化剂种类多、剂量大，生产成本高，也为后续处理造成困难，不适合工业化生产。
发明内容
本发明针对背景技术中涉及的这些问题(例如用碘氧化会产生大量废液，且很难清除干净等)，提供一种成本低廉、步骤精简，收率大且纯度高的依色格南的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种依色格南的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)以Fmoc-Linker-氨基树脂为起始原料，采用Fmoc/tBu固相合成方法，利用偶联剂按照依色格南的氨基酸序列依次将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上，得到全保护十七肽的肽树脂；
(2)将步骤(1)得到的肽树脂以裂解液切割，同时脱去所有侧链保护基，再以冰乙醚沉淀切割液而获得依色格南线性粗肽；
(3)将步骤(2)得到的线性粗肽依色格南溶于水中得到多肽溶液，控制所述的多肽溶液中线性粗肽依色格南的浓度在0.5～5g/L范围内，并调节所述多肽溶液的pH值至8-10；然后放置经自然空气氧化，使在第5位与第14位、第7位与第12位间分别形成分子内二硫键，获得依色格南粗品溶液；
(4)将步骤(3)得到的依色格南粗品溶液过滤、分离纯化、转盐和冷冻干燥，获得依色格南三氟醋酸盐或依色格南醋酸盐。
本发明的方案中，步骤(1)所述的氨基树脂可以选自以下几种中的任意一种：RinkAmide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PAL Amide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或Rink Amide-MBHA树脂；优选的方案中，树脂的取代值为0.1～1.5mmol/g，树脂的颗粒大小为100～400目。
本发明优选的方案中，步骤(1)所述的连接至溶胀后的氨基树脂上的Fmoc-氨基酸依次为：Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH；即步骤(1)得到的所述全保护十七肽树脂是H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-氨基树脂。
本发明的方案中，步骤(1)所述的偶联剂可以选自含有HOBt(1-羟基苯并三氮唑)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑)的多种复合偶联剂；优选的所述复合偶联剂进一步含有DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)；更优选的所述复合偶联剂选自以下八种混合物中的任意一种：
X试剂、HATU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HCTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂与Y试剂DIC按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂与EDC·HCl按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂、PyAOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、PyBOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、TBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
其中，所述的X试剂为HOBt(1-羟基苯并三氮唑)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑)，Y试剂为DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)。
本发明优选的一个实施方式中，步骤(1)所述的按照依色格南的氨基酸序列依次将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上包括以下步骤：
(1.1)按照1:(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)的摩尔比分别称取所述溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC；
(1.2)将所述Fmoc-氨基酸和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸；
(1.3)用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液对步骤(1.2)处理后的氨基树脂脱Fmoc保护基1～10次，每次1～100min；
(1.4)使用相应的Fmoc-氨基酸重复步骤(1.1)到步骤(1.3)的偶联过程，最后得到全保护十七肽树脂，即
H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-氨基树脂。
本发明更优选的方案中步骤(1.3)所述的脱Fmoc保护基1～10次后再用DMF洗涤树脂1～20次。
本发明优选的方案中，步骤(1)所述的将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上，每次连接的反应温度为0～50℃，反应时间为0.1～10.0h。
本发明优选的方案中，步骤(2)所述的切割肽树脂所用的裂解液是三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇和水按照90:5:3:2的体积比混合得到的复合裂解液；步骤(2)所述的切割是以1g肽树脂加入1～100mL裂解液的比例，将上述裂解液加入所述全保护十七肽的肽树脂中，0～50℃机械搅拌反应1～24h；然后将反应液过滤至-50～0℃的冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀1～20次，0～50℃减压干燥至恒重，得到依色格南线性肽粗肽。
本发明优选的方案中，步骤(3)所述的多肽溶液中线性粗肽依色格南的浓度优选控制在0.5～1g/L范围内，最优选控制在1g/L，且优选调节所述多肽溶液的pH值至8-9。
本发明优选的方案中，步骤(4)所述的过滤是将得到的依色格南粗品溶液以0.1～10.0μm的微孔滤膜过滤；所述的分离纯化是用反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为纯乙腈或甲醇，B相为0.01～10％v/v的三氟醋酸的水溶液或磷酸的水溶液；检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果选择目标产物，将目标产物经合并和冷冻干燥之后，就可以获得依色格南三氟醋酸盐或依色格南醋酸盐。
与现有技术相比，本发明制备依色格南的方法具有以下有益效果：
①本发明方法中，固相合成过程选用的氨基酸，均为保护基可一次性脱除的带保护氨基酸，使得后续的切割过程能够采用同一种裂解液一次性脱除所有氨基酸的保护基，并在氧化成环过程中在第5和14位、第7和12位间一次性形成两对分子内二硫键，如此可以获得更高的收率。同时本发明的方法因为减少了反应步骤，可以显著降低多步骤处理引起的副反应的发生，从而减少损失。
②现有技术中，为了提高依色格南的两对分子内二硫键的选择性，通常需要进行分步脱保护基和分步定向环化的处理，不仅工艺复杂，而且使用的氧化剂种类多、剂量大，生产成本高，也为后续处理造成困难，不适合工业化生产。本发明方法从整体上改换思路，不仅将所有氨基酸的保护基一步脱除，而且将脱除保护基后的依色格南线性粗肽在液相中经一次性空气氧化获得两对分子内二硫键(即Cys7-12和Cys5-14)，从而大大降低了整个制备工艺的难度和成本。为了减少脱保护基的次数并降低成本，本发明选择了容易脱除且廉价的带Fmoc保护基的氨基酸，使固相合成的线性多肽侧链保护基能够在切割过程中全部脱除，为后续的一步氧化打下良好基础。为了在一步空气氧化过程中保证二硫键生成的选择性，本发明对空气氧化时多肽水溶液的pH值和浓度都进行了调控，使线性多肽在弱碱性和稀溶液的液相环境中自然地发生了高选择性地环化，形成分子内二硫键(即Cys7-12和Cys5 -14)，从而获得理想的产品纯度。经过实验发现，本发明经一次性空气氧化得到的依色格南粗品，其分子内二硫键的选择性和粗品的纯度与现有技术的分步环化工艺相当，但整体工艺成本和稳定性显著高于现有的分步环化工艺，此外，本发明的方法可以避免在氧化中使用碘氧化剂，因此避免了大量废水的产生。
总之，本发明的工艺简单稳定，条件温和，易于控制，对人体和环境影响小，产品的收率和纯度均很高，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1是实施例1、2制备依色格南的工艺流程图。
图2是实施例1方法制备的依色格南的高效液相色谱图。
图3是实施例1方法制备的依色格南的质谱谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明的方法及其核心思想。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做出的若干简单推演或者替换，在具体实施方式及应用范围上所做的改变之处，比如氨基酸缩合时更换缩合剂，调整缩合剂的比例，调整反应的时间或温度，都应当视为本发明的保护范围。
说明书或权利要就书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc：9-芴甲氧羰基
Linker：链接子
DCM：二氯甲烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Piperidine：六氢吡啶/哌啶
HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
NMM：N-甲基吗啉
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
PyAOP：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)
tBu：叔丁基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Arg：精氨酸
Gly：甘氨酸
Val：缬氨酸
Cys：半胱氨酸
Phe：苯丙氨酸
Tyr：酪氨酸
Leu：亮氨酸
MeOH：甲醇
TFA：三氟醋酸
EDT：乙二硫醇
Thioanisole：苯甲硫醚
NH3·H2O：氨水
CH3COOH：醋酸
RP-HPLC：反相-高效液相色谱
实施例1
一种制备抗菌肽依色格南的方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂的制备
称取5.0g(3.1mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.62mmol/g)，置于带夹套的250mL多肽固相合成器中，加入50mL DMF溶胀30min。树脂溶胀完全后用泵抽去DMF，用40mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用40mL DMF洗涤5次，抽去DMF。用40mL DMF溶解6.034g(9.3mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH和1.508g(11.16mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入1.725mL(11.16mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应2h，以恒温循环水控制反应温度为30℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色的时候，以泵抽去反应液，用40mL DMF洗涤4次，抽干DMF即得Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂。
(2)H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂脱除Fmoc保护基之后，用40mL DMF溶解2.765g(9.3mmol)Fmoc-Gly-OH和1.508g(11.16mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入1.725mL(11.16mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应2h，以恒温循环水控制反应温度为30℃。茚三酮检验呈阴性，用泵抽去反应液，再用40mLDMF洗涤树脂，抽干DMF，即得Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-AM-树脂。按照依色格南氨基酸序列重复上述操作，依据表1的量称取氨基酸和缩合剂，加入40mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴10min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH，最后以40mL MeOH洗涤三次，再分别用40mL DCM和MeOH交替洗涤2次，再以40mL MeOH洗涤2次，用泵抽干MeOH，30℃减压干燥至树脂恒重，即得H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-AM-树脂。脱Fmoc和DMF洗涤的操作同(1)。
表1 每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-OH的制备。
配制180mL切割用裂解液(三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇和水按照90:5:3:2的体积比混合)加至上述制备的H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-AM-树脂中，30℃水浴加热，机械搅拌反应2h。然后将反应液过滤至1800mL的-20℃冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，乙醚洗涤沉淀3次，30℃减压干燥至恒重，得到依色格南粗肽5.763g，产率为97.8％。
(4)
称取0.312g步骤(3)中的依色格南线性肽置于一个500ml的玻璃烧杯，用312mL纯化水溶解(1mg/ml)，用1％稀氨水调pH至8-9，敞口过夜搅拌，HPLC分析直至反应完全，待反应完全后用1％稀醋酸调pH至5-6，反应液用0.45μm的微孔滤膜过滤，待纯化。
(5)HPLC法制备依色格南纯品
通过泵进样，HPLC纯化条件如下：柱子：Unips 10-300：30×250mm；流动相A：100％甲醇；流动相B：0.1％(v/v)TFA/H2O；流速：40mL/min；检测波长：220nm；洗脱梯度：40％-55％；时间：30min。收集HPLC纯度为99.0％以上的样品，合并后冻干得到0.143g的纯品，收率为45.8％。
制得产品的高效液相色谱图如图2所示，质谱图如图3所示。
实施例2
一种制备抗菌肽依色格南的方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂的制备
称取50.0g(31mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.62mmol/g)，置于带夹套的1000mL多肽固相合成器中，加入500mL DMF溶胀30min。树脂溶胀完全后用泵抽去DMF，用400mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用400mL DMF洗涤5次，抽去DMF。用400mL DMF溶解60.336g(93.0mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH和15.077g(111.6mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入17.253mL(111.6mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应2h，以恒温循环水控制反应温度为30℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色的时候，以泵抽去反应液，用400mL DMF洗涤4次，抽干DMF即得Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂。
(2)H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-Arg(Pbf)-AM-树脂脱除Fmoc保护基之后，用400mL DMF溶解27.650g(93.0mmol)Fmoc-Gly-OH和15.077g(111.6mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入17.253mL(111.6mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应2h，以恒温循环水控制反应温度为30℃。茚三酮检验呈阴性，用泵抽去反应液，再用400mL DMF洗涤树脂，抽干DMF，即得Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-AM-树脂。按照依色格南氨基酸序列重复上述操作，依据表2的量称取氨基酸和缩合剂，加入400mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴10min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH，最后以400mL MeOH洗涤三次，再分别用400mL DCM和MeOH交替洗涤2次，再以400mL MeOH洗涤2次，用泵抽干MeOH，30℃减压干燥至树脂恒重，即得
H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-AM-树脂。脱Fmoc和DMF洗涤的操作同(1)。
表2 每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-OH的制备。
取一个2000mL圆底烧瓶，将肽树脂置于圆底烧瓶中，配制1800mL切割用裂解液(三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇和水按照90:5:3:2的体积比混合)加至上述反应瓶中，30℃水浴加热，机械搅拌反应2h。然后将反应液过滤至18000mL的-20℃冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，乙醚洗涤沉淀3次，30℃减压干燥至恒重，得到依色格南粗肽58.4g，产率为99.2％。
(4)
称取0.301g步骤(3)中的依色格南线性肽置于一个500ml的玻璃烧杯，用300mL纯化水溶解(1mg/ml)，用1％稀氨水调pH至8-9，敞口过夜搅拌，HPLC分析直至反应完全，待反应完全后用1％稀醋酸调pH至5-6，反应液用0.45μm的微孔滤膜过滤，待纯化。
(5)HPLC法制备依色格南纯品
通过泵进样，HPLC纯化条件如下：柱子：Unips 10-300：30×250mm；流动相A：100％甲醇；流动相B：0.1％(v/v)TFA/H2O；流速：40mL/min；检测波长：220nm；洗脱梯度：40％-55％；时间：30min。收集HPLC纯度为99.0％以上的样品，合并后冻干得到0.137g的纯品，收率为45.5％。
实施例3.依色格南线性肽在不同条件下环化的对比研究
分别称取5组0.300g的实施例2的步骤(3)制备的依色格南线性肽，置于2000ml、1000ml、500ml、100ml、50ml的玻璃烧杯，各烧杯中分别加入1500ml、600ml、300ml、60ml、30ml纯化水溶解依色格南线性肽，用1％稀氨水调pH至8-9，敞口搅拌反应，HPLC分析直至原料反应完全，各组的环化反应结果见表3。
通过表3所示的反应结果可知，在氧化成环的过程中，若依色格南线性肽的浓度太低，则成环的反应时间太长且纯度较低；但如果依色格南线性肽的浓度太高时，产物的纯度也会显著降低，二硫键生成的选择性明显下降，二聚体及多聚体增多。
因此，在氧化成环的过程中，依色格南线性肽的浓度控制在本发明所述的0.5～5g/L时，可以获得理想的二硫键选择性，从而可保证产物纯度；尤其是将依色格南线性肽的浓度控制在0.5～1g/L时，可以获得最佳综合效果。
| 序号 | 依色格南线形肽浓度/(mg/ml) | 反应时间/h | 产物纯度/％ |
| 1 | 0.2 | 78 | 72 |
| 2 | 0.5 | 29 | 83 |
| 3 | 1 | 20 | 86 |
| 4 | 5 | 15 | 69 |
| 5 | 10 | 12 | 51 |
Claims (10)
1.一种依色格南的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)以Fmoc-Linker-氨基树脂为起始原料，采用Fmoc/tBu固相合成方法，利用偶联剂按照依色格南的氨基酸序列依次将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上，得到全保护十七肽的肽树脂；
所述的连接至溶胀后的氨基树脂上的Fmoc-氨基酸依次为：Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH；即得到的所述全保护十七肽树脂是H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-氨基树脂；
(2)将步骤(1)得到的肽树脂以裂解液切割，同时脱去所有侧链保护基，再以冰乙醚沉淀切割液而获得依色格南线性粗肽；
(3)将步骤(2)得到的线性粗肽依色格南溶于水中得到多肽溶液，控制所述的多肽溶液中线性粗肽依色格南的浓度在0.5～5g/L范围内，并调节所述多肽溶液的pH值至8-10；然后放置经自然空气氧化，使线性粗肽依色格南在第5位与第14位、第7位与第12位间分别形成分子内二硫键，获得依色格南粗品溶液；
(4)将步骤(3)得到的依色格南粗品溶液过滤、分离纯化、转盐和冷冻干燥，获得依色格南三氟醋酸盐或依色格南醋酸盐。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的氨基树脂选自以下几种中的任意一种：Rink Amide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PAL Amide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或Rink Amide-MBHA树脂；优选的方案中，树脂的取代值为0.1～1.5mmol/g，树脂的颗粒大小为100～400目。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的偶联剂选自含有HOBt或HOAt的多种复合偶联剂；优选的所述复偶联剂含有DIC。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的复合偶联剂选自以下八种混合物中的任意一种：
X试剂、HATU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HCTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂与Y试剂DIC按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂与EDC·HCl按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂、PyAOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、PyBOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、TBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
其中，所述的X试剂为HOBt或HOAt，Y试剂为DIC。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的按照依色格南的氨基酸序列依次将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上包括以下步骤：
(1.1)按照1:(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)的摩尔比分别称取所述溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC；
(1.2)将所述Fmoc-氨基酸和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸；
(1.3)用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液对步骤(1.2)处理后的氨基树脂脱Fmoc保护基1～10次，每次1～100min；
(1.4)使用相应的Fmoc-氨基酸重复步骤(1.2)到步骤(1.3)的偶联过程，最后得到全保护十七肽树脂，即H-Arg(pbf)-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Phe-Cys(Trt)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(pbf)-氨基树脂。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1.3)所述的脱Fmoc保护基1～10次后再用DMF洗涤树脂1～20次。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的将Fmoc-氨基酸连接至溶胀后的氨基树脂上，每次连接的反应温度为0～50℃，反应时间为0.1～10.0h。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的切割肽树脂所用的裂解液是三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇和水按照90:5:3:2的体积比混合得到的复合裂解液；步骤(2)所述的切割是以1g肽树脂加入1～100mL裂解液的比例，将上述裂解液加入所述全保护十七肽的肽树脂中，0～50℃机械搅拌反应1～24h；然后将反应液过滤至-50～0℃的冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀1～20次，0～50℃减压干燥至恒重，得到依色格南线性肽粗肽。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的多肽溶液中线性粗肽依色格南的浓度控制在0.5～1g/L范围内，优选控制在1g/L，且调节所述多肽溶液的pH值至8-9。
10.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的过滤是将得到的依色格南粗品溶液以0.1～10.0μm的微孔滤膜过滤；所述的分离纯化是用反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为纯乙腈或甲醇，B相为0.01～10％v/v的三氟醋酸的水溶液或磷酸的水溶液；检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果判断样品的纯度，合格的样品经合并和冷冻干燥之后，就可以获得依色格南三氟醋酸盐或依色格南醋酸盐。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1552728A (zh) * | 2003-05-29 | 2004-12-08 | 上海子能药物研究有限公司 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN101284863A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-10-15 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种固相合成西曲瑞克的制备方法 |
| CN102268082A (zh) * | 2011-05-27 | 2011-12-07 | 江苏江神药物化学有限公司 | 一种齐考诺肽的固相合成方法 |
| CN103012563A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-04-03 | 南京工业大学 | 抗菌肽依色格南的固相合成方法 |
| CN103145827A (zh) * | 2013-03-04 | 2013-06-12 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种乌拉力肽的固相合成方法 |
| CN104788546A (zh) * | 2015-03-12 | 2015-07-22 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法 |
| CN107216374A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-29 | 重庆莱美隆宇药业有限公司 | 一种齐考诺肽的合成方法 |
-
2020
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1552728A (zh) * | 2003-05-29 | 2004-12-08 | 上海子能药物研究有限公司 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN101284863A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-10-15 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种固相合成西曲瑞克的制备方法 |
| CN102268082A (zh) * | 2011-05-27 | 2011-12-07 | 江苏江神药物化学有限公司 | 一种齐考诺肽的固相合成方法 |
| CN103012563A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-04-03 | 南京工业大学 | 抗菌肽依色格南的固相合成方法 |
| CN103145827A (zh) * | 2013-03-04 | 2013-06-12 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种乌拉力肽的固相合成方法 |
| CN104788546A (zh) * | 2015-03-12 | 2015-07-22 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法 |
| CN107216374A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-29 | 重庆莱美隆宇药业有限公司 | 一种齐考诺肽的合成方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王小青等: "抗菌肽IB-367的固相合成与抑菌活性", 合成化学, vol. 24, no. 7, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 600 - 603 * |
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