CN112442491A - 一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域，构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorion peroxidase全长编码序列，将含有pET28a‑Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀；确定蛋白在上清中表达后，过Ni‑NTA凝胶柱。本发明克隆表达了chorion peroxidase基因，并深入研究了它在卵巢发育中的功能，结果表明干扰该基因后，雌蛾产卵减少，滤泡细胞发育异常。

Description

一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及 其应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，涉及一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用。

背景技术

桑蚕又称家蚕，简称蚕，是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一。桑蚕属鳞翅目，蚕蛾科，学名为Bombyx mori Linnaeus。桑蚕起源于中国，由古代栖息于桑树的原始蚕驯化而来，与中国现今食害桑树的野桑蚕同源，染色体都是28对。蚕蛾幼虫，吃桑叶，在化蛹前吐出作茧用的大量蚕丝是重要的纺织原料。桑蚕是完全变态昆虫，一生经过卵、幼虫、蛹、成虫等四个形态上和生理机能上完全不同的发育阶段。卵是胚胎发生、发育形成幼虫的阶段，幼虫是摄取食物营养的生长阶段，蛹是从幼虫向成虫过渡的变态阶段，成虫是交配产卵繁殖后代的生殖阶段。整个世代只幼虫期摄食，并为蛹和成虫期的生命活动积贮营养。

家蚕是中国古代最主要的经济昆虫之一。在家蚕养殖过程中，产卵量是一个关键的因素。现有技术中研究结果表明，家蚕产卵的快慢，既与品种有关，也与环境有关。如雌蛾的成熟程度，交配时间的长短，产卵时的温度，产卵时的光照，交配前的短时低温处理，斜面产卵等都影响产卵的速度。后来研究中发现家蚕的chorion peroxidase基因，目前为止，该基因在家蚕中的功能未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用，该方法克隆表达了chorion peroxidase基因，并深入研究了它在卵巢发育中的功能，结果表明干扰该基因后，雌蛾产卵减少，滤泡细胞发育异常。

其技术方案如下：

一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法，包括以下步骤：

步骤1、构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorionperoxidase全长编码序列(氨基酸残基1-780)，引物序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：2所示。上游引物包含BamH I酶切位点，下游引物包含Sac I酶切位点，将含有酶切位点的全长与含有终止密码子的pET28a载体连接，防止移码突变。用双酶切筛选克隆并测序，分析测序结果，确认无氨基酸突变之后保存含有转基因质粒的菌液。提取转基因质粒并转入E.coliBL21感受态细胞获得可以表达Cp蛋白的菌株。

步骤2、将含有pET28a-Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1∶100将过夜的菌液接种到新鲜的含有Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM后继续震荡培养诱导蛋白表达6h。

步骤3、分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀。加入80μl PBS和20μl 5×SDS上样缓冲液后100℃煮沸10分钟。将样品与蛋白marker一起上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓度为12％的蛋白胶)。通过考马斯亮蓝染色确定蛋白是否诱导表达成功并判断蛋白分子量的大小。确定蛋白表达成功后，将诱导的菌液进行超声波破碎分别获得上清和沉淀，再进行SDS-PAGE确定蛋白表达在上清还是沉淀。

步骤4、确定蛋白在上清中表达后，过Ni-NTA凝胶柱。过柱后的洗脱液用SDS-PAGE进行检测并检测重组蛋白的浓度。-80度保存重组蛋白样品。

本发明所述方法得到的家蚕chorion peroxidase基因在调节雌蛾产卵量试剂制备过程中的应用。

本发明的有益效果：

本发明克隆表达了chorion peroxidase基因，并深入研究了它在卵巢发育中的功能，结果表明干扰该基因后，雌蛾产卵减少，滤泡细胞发育异常。本发明的研究结果显示该基因干扰之后，产卵量减少，说明该基因对家蚕的产卵有影响，从而影响到了后代的个体数。因此，如果将该基因过表达到家蚕体内，则可以增加家蚕的产卵量，从而提高后代的个体数，最终可以提高家蚕的经济性状，获得更多的蚕茧，提高农民收益。

附图说明

图1信号肽分析图。

图2系统进化树图。

图3产卵量图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.chorion peroxidase(cp)基因的克隆表达和纯化

构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorionperoxidase全长编码序列(氨基酸残基1-780)，引物序列为：上游引物cp-BamH I：5’-GGATTCATGAATTTCAAAAGCTTCATTTTG-3’，下游引物cp-Sac I：5’-GAGCTCGTCTAAATTCCGCGAGTTTTGA-3’。上游引物包含BamH I酶切位点，下游引物包含Sac I酶切位点，将含有酶切位点的全长与含有终止密码子的pET28a载体连接，防止移码突变。用双酶切筛选克隆并测序，分析测序结果，确认无氨基酸突变之后保存含有转基因质粒的菌液。提取转基因质粒并转入E.coli BL21感受态细胞获得可以表达Cp蛋白的菌株。

将含有pET28a-Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1∶100将过夜的菌液接种到新鲜的含有Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM后继续震荡培养诱导蛋白表达6h。

分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀。加入80μlPBS和20μl 5×SDS上样缓冲液后100℃煮沸10分钟。将样品与蛋白marker一起上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓度为12％的蛋白胶)。通过考马斯亮蓝染色确定蛋白是否诱导表达成功并判断蛋白分子量的大小。确定蛋白表达成功后，将诱导的菌液进行超声波破碎分别获得上清和沉淀，再进行SDS-PAGE确定蛋白表达在上清还是沉淀。

确定蛋白在上清中表达后，过Ni-NTA凝胶柱。过柱后的洗脱液用SDS-PAGE进行检测并检测重组蛋白的浓度。-80度保存重组蛋白样品。

2.chorion peroxidase的功能研究

将cDNA序列翻译成蛋白序列后，通过Blast比对获得相似度比较高的其他物种中的序列，通过MEGA7构建系统进化树。

设计含有dsBm-cp和dsEGFP的引物，dsBm-cp上游引物序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAATTTCAAAAGCTTCATTTTG’-3，下游引物序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATCAGCAGAAGCTTGTAGA’-3，dsEGFP上游引物为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGTGAGCAAGGGCGAG’-3，下游引物为5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC’-3。获得引物后，通过试剂盒合成dsRNA。将蛹期第8天的家蚕置于冰上5-10min，用微量注射器注射入蛹腹部中间位置，每个蛹注射20μg的Bm-cp dsRNA。以EGFP的dsRNA作为对照。每个处理组合对照组虫子的数量为80头，并在24h、48h、72h和96h后进行注射实验组和对照组(Mock)材料的收集。观察dsRNA注射后家蚕蛹的表型及生殖发育相关过程变化情况，该实验重复3次。

1.通过克隆测序，获得了chorion peroxidase的cDNA序列如下：

ATGAATTTCAAAAGCTTCATTTTGCTCTTAATTAATGTGTTCTTATTGAGTGTCATTGAGGATAGTTCTTGTCACGTTTACGAAGGCAGCGCACGTGAGGCCTCAGAACACATTCACGTACAAGAGCGACCATGCGCCGTCTGCCCCAGAGGCGGGAAGTGTGTCCCGAAGGTCAAATGTCCGGCCCACGTCAGACCGGGATCGTTGAATCCGACCTGCCACTTGGTCCTTGGACATATCGGTATCTGCTGCTTCACCGGGCAAAAGCATTCAGCCCAATTAGAATCTACTCAGCGTTCTGGCGCCATCAGTATAGAAGACATTAAAAGCAGCCATGACGTATCAAGGCAGAAAATGGTCCAGTGGATAGCGAACGAGAAAGTTCTAGAACGTTCTGCTGATACAATCGTCAGTAGTTCGGCACCTAGTTACGGGCATCATTTGTCCATGGTTACGTACGACAAGAGAGTTGAGGGTCTTGGACGTGGTGGACTGTTGAACGTCTTCGCTGCTCTGGAACTGAAGTCTCGGCAGGCGGTCTCTGATGATGAGCTGGAGTTGGGAGCAACAGGACATACTGATGGTCCCTTTTGCCCTAAGCCCCCGCAGTGCCCGGATACCCAAAGCCGGTACAGATCTATAGATGGGGAGTGCAACAATCTGGCCAACCCAACGTGGGGAGCTGTCAATACTGGCTTCGAGAGGCTTCTACCACCAGATTATAGTGACGGCGTGTGGGCAATGAGAGTCTCCGCAGCAGGTAATCCCCTTCCGAGCGCGAGGGTGGTCAGCAGCGTTCTCCTGCCAGAAGGAAACCATCCAAGTCCCACACACAACCTCATGTTCATGCAGTTTGGACAGTTTATAGCACACGACACCAGCGCTGGAGTTATGTTCGCATCGGGTAACAACACTGGAATATCCTGTTGCGCTGAAGACGGTGTGGACCAGCTGCATCCGAAGCAGCAGCACTGGGCCTGTGCTCCAATCACCGCAGTTCCCGATGACCCTTTCTATGGTTTCTTTGGTCAGAAATGCCTCAATTTCGTGCGCACACAACTCGCACCAGCCAGCGATTGTTCCGTTGGCTATGCCAAGCAAATGAATGGCGCCACGCATTACCCTGATTTGTCTCACTTATACGGCACCTTTCCCGAAAAACTCTCATTGGTGCGCGGCGAGGGAGGGTTTCTGAAGACATTCAATGACTTTGGCAGAGCCCTCCCACCTTTGACTAAGAGAAGAGAATGCGTTAATATGGATGGTGGTAGCCCTTGCTTTGAATCAGGAGACAGTCACGGGAATCAGTTCATCTCACTGACAGCATTCCACACGTTATGGTCGAGGGAGCACAACCGAGTCGCGCAAGCCCTGTCGAGGTTGAACCCTCATTGGGACGAAGACACAGTCTTTATGGAGACCAGAAGGATACTGCAGGCAGAATTCCAGCATATCATTTATAATGAGTGGCTTCCTCTATTGATAGGTCACCAAATGATGCAGCTCTTCAATTTATCTCCATCTTCAGAGTATTCCTCGTCGTACGATCCAACAGTCAATCCGTCTATTACAGCAGAATTCGCGACCGCAGCCATGAGATTTGGCCACTCCATTGTTGATGGAAGAATTGTAATTCCCAACACGAAAACAGGAGAAGTTCACGAGACCATATCGATACCGGAAGTGATGTTTCAGCCGTCGAGAATGCGGCTACGTCACTTCTTGGATCGGCTGCTGATTGGCCTGACGCTGCAACCGATGCAGAGTGTCGATCCGTTTATCTCTGAAGGGCTTACGTCCTACATGTTCCGTGGCACCAACCCCTATGGCCTGGATCTAGCGTCAATAAACATTCAACGCGGCAGAGACTACGGAGTCAGATCCTACAATAGCTACCGGCGCTTGTGTGGGCTTCAGCCATTTGAAAGCTTCGAGCAATTTCCACAAAGTGCTGCAAAGCGTCTAGCGTCTGTCTACGAGAGTCCGGAATACATAGACCTTTGGGTTGGAGGTCTGCTGGAGGCGCCGATGGAAGAGGCAGTTATCGGGCCAACTTTCGCTCATATCATAGCCGACCAATTCTACAGGCTCAAGGCTGGAGATAGATACTTCTACGATAATGGTCCTGATATAAATCCCGGCGCTTTTACTCCAAGCCAACTGACAGAAATAAAGAAGGTTAAACTATCAAGACTGATTTGTGACAATAGCGATGGTATAGAACTTGTAACCCAGCCAGTTGAAGCCTTTTATAGAGCAGACCTACCAGGAAATGAATTAGTGGCTTGCAACAGTGGACGCATACCTTTTATGGATTTGAGCAGATTTAAGGCGCTCAAAACTTAA

2.Chorion peroxidase蛋白序列

MNFKSFILLLINVFLLSVIEDSSCHVYEGSAREASEHIHVQERPCAVCPRGGKCVPKVKCPAHVRPGSLNPTCHLVLGHIGICCFTGQKHSAQLESTQRSGAISIEDIKSSHDVSRQKMVQWIANEKVLERSADTIVSSSAPSYGHHLSMVTYDKRVEGLGRGGLLNVFAALELKSRQAVSDDELELGATGHTDGPFCPKPPQCPDTQSRYRSIDGECNNLANPTWGAVNTGFERLLPPDYSDGVWAMRVSAAGNPLPSARVVSSVLLPEGNHPSPTHNLMFMQFGQFIAHDTSAGVMFASGNNTGISCCAEDGVDQLHPKQQHWACAPITAVPDDPFYGFFGQKCLNFVRTQLAPASDCSVGYAKQMNGATHYPDLSHLYGTFPEKLSLVRGEGGFLKTFNDFGRALPPLTKRRECVNMDGGSPCFESGDSHGNQFISLTAFHTLWSREHNRVAQALSRLNPHWDEDTVFMETRRILQAEFQHIIYNEWLPLLIGHQMMQLFNLSPSSEYSSSYDPTVNPSITAEFATAAMRFGHSIVDGRIVIPNTKTGEVHETISIPEVMFQPSRMRLRHFLDRLLIGLTLQPMQSVDPFISEGLTSYMFRGTNPYGLDLASINIQRGRDYGVRSYNSYRRLCGLQPFESFEQFPQSAAKRLASVYESPEYIDLWVGGLLEAPMEEAVIGPTFAHIIADQFYRLKAGDRYFYDNGPDINPGAFTPSQLTEIKKVKLSRLICDNSDGIELVTQPVEAFYRADLPGNELVACNSGRIPFMDLSRFKALKT

该蛋白含有一个信号肽，切割位点在24-25之间。如图1所示。

4.Chorion peroxidase进化树分析

家蚕的Chorion peroxidase蛋白单独聚为一枝。如图2所示。

5.干扰chorion peroxidase后，家蚕产卵量减少。如图3所示。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所

<120> 一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggattcatga atttcaaaag cttcattttg 30

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagctcgtct aaattccgcg agttttga 28

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatacgactc actataggga gaatgaattt caaaagcttc attttg 46

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg agagtatcag cagaagcttg taga 44

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg agaatggtga gcaagggcga g 41

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg agattacttg tacagctcgt ccatgc 46

<210> 7

<211> 2346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaatttca aaagcttcat tttgctctta attaatgtgt tcttattgag tgtcattgag 60

gatagttctt gtcacgttta cgaaggcagc gcacgtgagg cctcagaaca cattcacgta 120

caagagcgac catgcgccgt ctgccccaga ggcgggaagt gtgtcccgaa ggtcaaatgt 180

ccggcccacg tcagaccggg atcgttgaat ccgacctgcc acttggtcct tggacatatc 240

ggtatctgct gcttcaccgg gcaaaagcat tcagcccaat tagaatctac tcagcgttct 300

ggcgccatca gtatagaaga cattaaaagc agccatgacg tatcaaggca gaaaatggtc 360

cagtggatag cgaacgagaa agttctagaa cgttctgctg atacaatcgt cagtagttcg 420

gcacctagtt acgggcatca tttgtccatg gttacgtacg acaagagagt tgagggtctt 480

ggacgtggtg gactgttgaa cgtcttcgct gctctggaac tgaagtctcg gcaggcggtc 540

tctgatgatg agctggagtt gggagcaaca ggacatactg atggtccctt ttgccctaag 600

cccccgcagt gcccggatac ccaaagccgg tacagatcta tagatgggga gtgcaacaat 660

ctggccaacc caacgtgggg agctgtcaat actggcttcg agaggcttct accaccagat 720

tatagtgacg gcgtgtgggc aatgagagtc tccgcagcag gtaatcccct tccgagcgcg 780

agggtggtca gcagcgttct cctgccagaa ggaaaccatc caagtcccac acacaacctc 840

atgttcatgc agtttggaca gtttatagca cacgacacca gcgctggagt tatgttcgca 900

tcgggtaaca acactggaat atcctgttgc gctgaagacg gtgtggacca gctgcatccg 960

aagcagcagc actgggcctg tgctccaatc accgcagttc ccgatgaccc tttctatggt 1020

ttctttggtc agaaatgcct caatttcgtg cgcacacaac tcgcaccagc cagcgattgt 1080

tccgttggct atgccaagca aatgaatggc gccacgcatt accctgattt gtctcactta 1140

tacggcacct ttcccgaaaa actctcattg gtgcgcggcg agggagggtt tctgaagaca 1200

ttcaatgact ttggcagagc cctcccacct ttgactaaga gaagagaatg cgttaatatg 1260

gatggtggta gcccttgctt tgaatcagga gacagtcacg ggaatcagtt catctcactg 1320

acagcattcc acacgttatg gtcgagggag cacaaccgag tcgcgcaagc cctgtcgagg 1380

ttgaaccctc attgggacga agacacagtc tttatggaga ccagaaggat actgcaggca 1440

gaattccagc atatcattta taatgagtgg cttcctctat tgataggtca ccaaatgatg 1500

cagctcttca atttatctcc atcttcagag tattcctcgt cgtacgatcc aacagtcaat 1560

ccgtctatta cagcagaatt cgcgaccgca gccatgagat ttggccactc cattgttgat 1620

ggaagaattg taattcccaa cacgaaaaca ggagaagttc acgagaccat atcgataccg 1680

gaagtgatgt ttcagccgtc gagaatgcgg ctacgtcact tcttggatcg gctgctgatt 1740

ggcctgacgc tgcaaccgat gcagagtgtc gatccgttta tctctgaagg gcttacgtcc 1800

tacatgttcc gtggcaccaa cccctatggc ctggatctag cgtcaataaa cattcaacgc 1860

ggcagagact acggagtcag atcctacaat agctaccggc gcttgtgtgg gcttcagcca 1920

tttgaaagct tcgagcaatt tccacaaagt gctgcaaagc gtctagcgtc tgtctacgag 1980

agtccggaat acatagacct ttgggttgga ggtctgctgg aggcgccgat ggaagaggca 2040

gttatcgggc caactttcgc tcatatcata gccgaccaat tctacaggct caaggctgga 2100

gatagatact tctacgataa tggtcctgat ataaatcccg gcgcttttac tccaagccaa 2160

ctgacagaaa taaagaaggt taaactatca agactgattt gtgacaatag cgatggtata 2220

gaacttgtaa cccagccagt tgaagccttt tatagagcag acctaccagg aaatgaatta 2280

gtggcttgca acagtggacg catacctttt atggatttga gcagatttaa ggcgctcaaa 2340

acttaa 2346

<210> 8

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Asn Phe Lys Ser Phe Ile Leu Leu Leu Ile Asn Val Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Ile Glu Asp Ser Ser Cys His Val Tyr Glu Gly Ser Ala Arg

20 25 30

Glu Ala Ser Glu His Ile His Val Gln Glu Arg Pro Cys Ala Val Cys

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Lys Cys Val Pro Lys Val Lys Cys Pro Ala His Val

50 55 60

Arg Pro Gly Ser Leu Asn Pro Thr Cys His Leu Val Leu Gly His Ile

65 70 75 80

Gly Ile Cys Cys Phe Thr Gly Gln Lys His Ser Ala Gln Leu Glu Ser

85 90 95

Thr Gln Arg Ser Gly Ala Ile Ser Ile Glu Asp Ile Lys Ser Ser His

100 105 110

Asp Val Ser Arg Gln Lys Met Val Gln Trp Ile Ala Asn Glu Lys Val

115 120 125

Leu Glu Arg Ser Ala Asp Thr Ile Val Ser Ser Ser Ala Pro Ser Tyr

130 135 140

Gly His His Leu Ser Met Val Thr Tyr Asp Lys Arg Val Glu Gly Leu

145 150 155 160

Gly Arg Gly Gly Leu Leu Asn Val Phe Ala Ala Leu Glu Leu Lys Ser

165 170 175

Arg Gln Ala Val Ser Asp Asp Glu Leu Glu Leu Gly Ala Thr Gly His

180 185 190

Thr Asp Gly Pro Phe Cys Pro Lys Pro Pro Gln Cys Pro Asp Thr Gln

195 200 205

Ser Arg Tyr Arg Ser Ile Asp Gly Glu Cys Asn Asn Leu Ala Asn Pro

210 215 220

Thr Trp Gly Ala Val Asn Thr Gly Phe Glu Arg Leu Leu Pro Pro Asp

225 230 235 240

Tyr Ser Asp Gly Val Trp Ala Met Arg Val Ser Ala Ala Gly Asn Pro

245 250 255

Leu Pro Ser Ala Arg Val Val Ser Ser Val Leu Leu Pro Glu Gly Asn

260 265 270

His Pro Ser Pro Thr His Asn Leu Met Phe Met Gln Phe Gly Gln Phe

275 280 285

Ile Ala His Asp Thr Ser Ala Gly Val Met Phe Ala Ser Gly Asn Asn

290 295 300

Thr Gly Ile Ser Cys Cys Ala Glu Asp Gly Val Asp Gln Leu His Pro

305 310 315 320

Lys Gln Gln His Trp Ala Cys Ala Pro Ile Thr Ala Val Pro Asp Asp

325 330 335

Pro Phe Tyr Gly Phe Phe Gly Gln Lys Cys Leu Asn Phe Val Arg Thr

340 345 350

Gln Leu Ala Pro Ala Ser Asp Cys Ser Val Gly Tyr Ala Lys Gln Met

355 360 365

Asn Gly Ala Thr His Tyr Pro Asp Leu Ser His Leu Tyr Gly Thr Phe

370 375 380

Pro Glu Lys Leu Ser Leu Val Arg Gly Glu Gly Gly Phe Leu Lys Thr

385 390 395 400

Phe Asn Asp Phe Gly Arg Ala Leu Pro Pro Leu Thr Lys Arg Arg Glu

405 410 415

Cys Val Asn Met Asp Gly Gly Ser Pro Cys Phe Glu Ser Gly Asp Ser

420 425 430

His Gly Asn Gln Phe Ile Ser Leu Thr Ala Phe His Thr Leu Trp Ser

435 440 445

Arg Glu His Asn Arg Val Ala Gln Ala Leu Ser Arg Leu Asn Pro His

450 455 460

Trp Asp Glu Asp Thr Val Phe Met Glu Thr Arg Arg Ile Leu Gln Ala

465 470 475 480

Glu Phe Gln His Ile Ile Tyr Asn Glu Trp Leu Pro Leu Leu Ile Gly

485 490 495

His Gln Met Met Gln Leu Phe Asn Leu Ser Pro Ser Ser Glu Tyr Ser

500 505 510

Ser Ser Tyr Asp Pro Thr Val Asn Pro Ser Ile Thr Ala Glu Phe Ala

515 520 525

Thr Ala Ala Met Arg Phe Gly His Ser Ile Val Asp Gly Arg Ile Val

530 535 540

Ile Pro Asn Thr Lys Thr Gly Glu Val His Glu Thr Ile Ser Ile Pro

545 550 555 560

Glu Val Met Phe Gln Pro Ser Arg Met Arg Leu Arg His Phe Leu Asp

565 570 575

Arg Leu Leu Ile Gly Leu Thr Leu Gln Pro Met Gln Ser Val Asp Pro

580 585 590

Phe Ile Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr Met Phe Arg Gly Thr Asn Pro

595 600 605

Tyr Gly Leu Asp Leu Ala Ser Ile Asn Ile Gln Arg Gly Arg Asp Tyr

610 615 620

Gly Val Arg Ser Tyr Asn Ser Tyr Arg Arg Leu Cys Gly Leu Gln Pro

625 630 635 640

Phe Glu Ser Phe Glu Gln Phe Pro Gln Ser Ala Ala Lys Arg Leu Ala

645 650 655

Ser Val Tyr Glu Ser Pro Glu Tyr Ile Asp Leu Trp Val Gly Gly Leu

660 665 670

Leu Glu Ala Pro Met Glu Glu Ala Val Ile Gly Pro Thr Phe Ala His

675 680 685

Ile Ile Ala Asp Gln Phe Tyr Arg Leu Lys Ala Gly Asp Arg Tyr Phe

690 695 700

Tyr Asp Asn Gly Pro Asp Ile Asn Pro Gly Ala Phe Thr Pro Ser Gln

705 710 715 720

Leu Thr Glu Ile Lys Lys Val Lys Leu Ser Arg Leu Ile Cys Asp Asn

725 730 735

Ser Asp Gly Ile Glu Leu Val Thr Gln Pro Val Glu Ala Phe Tyr Arg

740 745 750

Ala Asp Leu Pro Gly Asn Glu Leu Val Ala Cys Asn Ser Gly Arg Ile

755 760 765

Pro Phe Met Asp Leu Ser Arg Phe Lys Ala Leu Lys Thr

770 775 780

Claims (2)

1.一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorionperoxidase全长编码序列，引物序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：2所示；上游引物包含BamH I酶切位点，下游引物包含Sac I酶切位点，将含有酶切位点的全长与含有终止密码子的pET28a载体连接，防止移码突变；用双酶切筛选克隆并测序，分析测序结果，确认无氨基酸突变之后保存含有转基因质粒的菌液；提取转基因质粒并转入E.coli BL21感受态细胞获得能表达Cp蛋白的菌株；

步骤2、将含有pET28a-Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按1∶100将过夜的菌液接种到新鲜的含有Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，至OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM后继续震荡培养诱导蛋白表达6h；

步骤3、分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀；加入80μl PBS和20μl 5×SDS上样缓冲液后100℃煮沸10分钟；将样品与蛋白marker一起上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；通过考马斯亮蓝染色确定蛋白是否诱导表达成功并判断蛋白分子量的大小；确定蛋白表达成功后，将诱导的菌液进行超声波破碎分别获得上清和沉淀，再进行SDS-PAGE确定蛋白表达在上清还是沉淀；

步骤4、确定蛋白在上清中表达后，过Ni-NTA凝胶柱；过柱后的洗脱液用SDS-PAGE进行检测并检测重组蛋白的浓度；-80度保存重组蛋白样品；将浓度为1mg/ml的重组蛋白进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色后，将含有重组蛋白条带大小的胶条切下共12块SDS-PAGE胶条注射兔子获得抗体；获得的抗体通过Western Blot进行效价检测。

2.权利要求1所述方法得到的家蚕chorion peroxidase基因在调节雌蛾产卵量试剂制备过程中的应用。

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