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CN112430565A - 批量生产3d细胞球的培养基底的制备方法 - Google Patents

批量生产3d细胞球的培养基底的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法。所述方法先采用微流控技术制备直径均一的明胶微球，通过表面皿获得明胶微球的单层排列模板，加热使其紧密排列后灌注PDMS，固化后采用水浴法除去明胶模板，获得PDMS孔状微阵列基底，最后将基底浸泡在F127溶液中，获得3D细胞球的培养基底。本发明通过改变明胶微球的直径，可获得不同孔径的PDMS孔状微阵列基底，进而获得不同尺寸的3D细胞球。本发明方法简便易行，尺寸可控，成本低廉，适用于批量生产3D细胞球。

Description

批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法
技术领域
本发明涉及一种批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法，属于生物医用材料的制备技术领域。
背景技术
传统的2D单层细胞培养很难恰当地反映出细胞的体内生长环境，进而可能造成细胞结构和组织功能的失真。相比之下，3D立体培养的细胞的形态和功能更加接近动物体内的真实生长状况。另外，在肿瘤药物筛选过程中，传统的2D肿瘤细胞培养难以反映体内的真实状况，导致体外测试有效的药物在进行体内测试时失效。因此，体外培养3D肿瘤细胞球来模拟体内肿瘤情况至关重要。
现有的3D细胞球的制备方法包括光刻多孔板、强制浮动、搅动法、U底多孔板、GravityPlus 3D细胞悬滴系和GravityTrap ULA板等。但这些方法存在一定的局限性，例如两侧与管壁接触不利细胞球形生长、产生的细胞球大小差异大、大规模制备受限、细胞球收集困难，或者需要较先进的设备等。而且市场上生产的3D细胞球培养基底价格昂贵，因此研制一种实用且价格低廉的批量培养3D细胞球的基底具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便易行、尺寸可控、可批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法。
实现本发明目的的技术方案如下：
批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法，先通过微流控装置制备直径均一的明胶微球，通过表面皿排列获得单层明胶支架，加热使其紧密粘结获得明胶微球单层模板，后灌注PDMS溶液并固化，水浴法溶解去除明胶微球，最后用F127修饰基底，获得3D细胞球的培养基底，具体步骤如下：
步骤1，采用微流控技术制备明胶微球；
步骤2，将明胶微球逐滴从边缘加入表面皿中，轻微震动表面皿使明胶微球单层排列，并使其浸没于甲醇中，然后置于70℃～85℃加热45～60分钟使微球排列粘结成型，去除残余的甲醇，获得整齐排列的单层明胶微球模板；
步骤3，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)的A液(预聚物，聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷))和B液(交联剂，聚(二甲基甲基氢硅氧烷))按10:1的质量比配制，搅拌均匀，排空气泡后滴加于单层明胶微球模板上，将PDMS-明胶复合物加热至PDMS固化成型；
步骤4，将固化成型的PDMS-明胶复合物水浴加热至明胶微球彻底溶解，获得PDMS孔状微阵列基底；
步骤5，将PDMS孔状微阵列基底浸泡在聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(F127)溶液中，最终获得3D细胞球的培养基底。
步骤1中，微流控技术制备明胶微球采用本领域常规使用的方法。具体地，在本发明具体实施方式中，明胶溶液的浓度为8％(wt/v，g/mL)，用微流控装置收集明胶微球，控制水相溶液流速为3～5mL/h，有机相流速为40mL/h，有机相通道的内径为0.85～1.2mm，水相通道的内径为0.3～0.45mm，收集溶液为甲醇溶液。更具体地，在本发明具体实施方式中，采用含3wt％Span80的甲苯为有机相。
作为优选，步骤2中，加热温度为80℃，加热时间为50分钟。
在本发明具体实施方式中，步骤3中，加热温度为37℃，加热时间为4小时。
在本发明具体实施方式中，步骤4中，水浴温度为45℃，加热时间为8小时。作为优选，采用边加热边搅拌的形式使明胶微球彻底溶解。
在本发明具体实施方式中，步骤5中，F127溶液的浓度为10％(wt/v，g/mL)，浸泡时间为0.5～2小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明通过调控明胶溶液浓度、水相和有机相的流速及毛细管道内径，可有效调节所获明胶微球的直径，进而调控PDMS的基底微球阵列的直径以及肿瘤3D细胞球的大小。
(2)本发明制得的PDMS基底微球阵列直径大小和结构均一，且可以使用医用酒精或者高压灭菌，因此基底可以重复使用，有效地提高细胞培养实验的准确度和可重复性。
(3)本发明无需特别的处理和培养过程，按照常规的细胞培养方法将细胞悬液直接接种到孔里，即可培养出3D细胞球。
(4)本发明具有独特设计的超低吸附表面，非常适合肿瘤细胞、干细胞、神经细胞等自发形成3D细胞球，孔的底部为U型，每一个孔仅形成一个细胞球。
(5)本发明与现行的3D细胞球制备方法相比，步骤简便，操作简单，实验成本大大降低。
附图说明
图1A为单层排列的明胶微球；B为烘干后的明胶微球模板；C为去除模板后的PDMS孔状微阵列基底；D、E为生长在F127修饰的PDMS孔状微阵列基底的人结肠癌细胞(HCT116)形成的细胞球。
图2A、B为F127修饰的PDMS平面膜表面HCT116细胞团聚生长情况图；C、D为未修饰F127的PDMS孔状微阵列基底HCT116细胞贴壁生长情况图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
明胶浓度的影响
1.明胶微球的获得：明胶颗粒在60℃水浴环境下溶解于超纯水中，分别配制浓度为5％、8％、10％(wt/v，g/mL)的明胶溶液。用微流控装置收集明胶微球，通过控制水相溶液(明胶溶液)流速为5ml/h，有机相(甲苯为主，加入3wt％的Span80作为表面活性剂)流速为40ml/h，毛细管内径为0.85mm作为有机相通道，毛细管内部采用注射器针头(内径为0.45mm)作为水相溶液通道，获得明胶微球，收集于甲醇溶液中备用；
2.明胶模板制备：将明胶微球从边缘滴入表面皿，轻微震动表面皿使明胶微球单层排列，放入80℃烘箱中50分钟，使微球排列粘结成型后取出恢复至室温备用；
3.明胶/PDMS复合物获得：将PDMS组分中的A液和B液按照质量比10:1的比例混合，搅拌均匀，静置1h或置于真空干燥箱抽真空排空气泡，获得无色透明的PDMS溶液，将配制好的PDMS溶液滴加到排列整齐的明胶模板上，PDMS覆盖整个模板后置于37℃恒温箱中加热4小时至PDMS固化成型；
4.PDMS 3D细胞基底制备：取出PDMS-明胶复合物，置于45℃水浴中磁力搅拌8小时，溶解去除明胶微球，获得PDMS孔状微阵列基底。
5.F127溶液修饰PDMS 3D细胞基底：以10％浓度(wt/v，g/mL)配制F127溶液，将PDMS孔状微阵列基底浸泡于其中2小时。
6.细胞接种及培养：将HCT116细胞悬液逐滴加入PDMS基底中，轻轻摇动使细胞均匀进入微孔中，正常培养4天后即可收获大量尺寸均一的3D细胞球。
三种浓度的明胶溶液均可以获得明胶微球，但是10％明胶溶液获得的微球在制备明胶模板时较为分散，不易粘结，很难形成大尺寸的明胶模板，且易碎不易进行后续操作；5％浓度明胶溶液获得的明胶微球直径过小，对后续3D细胞球培养不利。而8％浓度的明胶溶液制备的明胶微球直径约500μm，适宜后续3D细胞球培养。
实施例2
水相溶液通道直径的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，分别控制水相溶液通道直径为0.3mm、0.45mm。
水相溶液通道直径为0.3mm和0.45mm制得的明胶微球的平均直径分别为300μm和500μm。两种流速下均可以获得直径均匀的明胶微球，直径大小略有差距，基于后续3D细胞球培养的需求，选用0.45mm的水相通道直径。
实施例3
有机相通道直径的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，分别控制有机相通道直径为0.85mm和1.2mm。
有机相通道直径为0.85mm和1.2mm制得的明胶微球的平均直径分别为500μm和900μm。可见增加有机相通道直径可以获得尺寸更大的明胶微球，说明本发明可以通过改变有机相和水相通道的内径从而调节获得明胶微球的大小，进一步影响后续3D细胞球的大小。
实施例4
明胶模板制备过程中烘箱温度的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，分别控制明胶模板制备过程中烘箱温度为60℃、70℃、80℃、85℃和90℃。
明胶微球在烘箱中，在温度(70℃～85℃)和时间(45～60分钟)条件下，均可获得单层紧密排列的明胶模板，但是反应温度的改变会影响微球间粘结程度，进而影响后续PDMS膜的制备。80℃和50分钟反应条件可以获得适合操作的明胶模板。在小于70℃时，不足以粘结成型，不能操作。高于85℃，粘结过度，明胶模板间隙过小，不利于PDMS溶液渗透，影响后续基底制备。
实施例5
明胶模板制备过程中烘烤时间的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，分别控制明胶模板制备过程中烘烤时间分别为30、45、60和75分钟。
明胶微球在烘箱中，在温度(70℃-85℃)和时间(45-60分钟)条件下，均可以获得单层紧密排列的明胶模板，但是时间的改变会影响微球间粘结程度，30分钟的反应时间过短，不能形成模板，75分钟时间过长，导致明胶微球后期不能很好的水浴溶解。80℃和50分钟反应条件可以获得合适的明胶模板。
对比例1
F127修饰的影响
本对比例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，PDMS孔状微阵列基底未经F127修饰。
与F127修饰的PDMS孔状微阵列基底(图1D、E)相比，未经修饰的PDMS基底上细胞贴壁生长，不能形成3D细胞球(图2C、D)。
对比例2
本对比例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为8％，用PDMS平面膜基底进行细胞培养。
与PDMS孔状微阵列基底相比(图1D、E)，PDMS平面膜上细胞形成不规则的团聚，尺寸随机(图2A、B)。

Claims (8)

1.批量生产3D细胞球的培养基底的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，采用微流控技术制备明胶微球；
步骤2，将明胶微球逐滴从边缘加入表面皿中，轻微震动表面皿使明胶微球单层排列，并使其浸没于甲醇中，然后置于70℃～85℃加热45～60分钟使微球排列粘结成型，去除残余的甲醇，获得整齐排列的单层明胶微球模板；
步骤3，将PDMS的A液和B液按10:1的质量比配制，搅拌均匀，排空气泡后滴加于单层明胶微球模板上，将PDMS-明胶复合物加热至PDMS固化成型；
步骤4，将固化成型的PDMS-明胶复合物水浴加热至明胶微球彻底溶解，获得PDMS孔状微阵列基底；
步骤5，将PDMS孔状微阵列基底浸泡在F127溶液中，最终获得3D细胞球的培养基底。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，明胶溶液的浓度为8％(wt/v，g/mL)，用微流控装置收集明胶微球，控制水相溶液流速为3～5mL/h，有机相流速为40mL/h，有机相通道的内径为0.85～1.2mm，水相通道的内径为0.3～0.45mm，收集溶液为甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用含3wt％Span80的甲苯为有机相。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，加热温度为80℃，加热时间为50分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，加热温度为37℃，加热时间为4小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，水浴温度为45℃，加热时间为8小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，采用边加热边搅拌的形式使明胶微球彻底溶解。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，F127溶液的浓度为10％(wt/v，g/mL)，浸泡时间为0.5～2小时。
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