CN112415204B

CN112415204B - 一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

Info

Publication number: CN112415204B
Application number: CN202011146123.8A
Authority: CN
Inventors: 王权; 蒋蔚; 辛思培; 李思; 顾惠明; 耿小玲; 刘琪
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2040-10-23
Also published as: CN112415204A

Abstract

本发明公开了一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将待测细菌和双特异性抗体标记的胶体金反应得到细菌‑双特异性抗体胶体金复合物；(2)纯化所述细菌‑双特异性抗体胶体金复合物并溶解于小分子半抗原‑载体偶联物标记的胶体金溶液，得到上样液；(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应。本发明检测细菌的方法可以在避免细菌聚集的同时提高检测灵敏度，最佳可达2.5×10⁴CFU/mL，且所述双特异性抗体的稳定性高。

Description

一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。

背景技术

近年来，由食源性致病菌引发的食物中毒事件已广为关注，引起这些中毒的细菌主要有：大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌以及单增李斯特菌等。这些菌会引起疾病的爆发和流行，给社会带来巨大损失，如肠出血性大肠杆菌O157：H7可产生志贺毒素，能引起出血性肠炎、血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症等疾病。该菌主要通过污染食品、水源进行粪口传播，而且其具有耐胃酸能力强、感染剂量低的特点，有报道称数十个活菌即可造成人畜感染发病。检测细菌的“金标准”需要通过平板计数分离和生理生化鉴定，操作复杂、耗时长。而胶体金免疫层析试纸条方法利用抗原抗体特异性结合反应，具有操作简便、耗时短等特点，因而在微生物、药物残留等多个检测领域被广泛运用。

现有的关于胶体金试纸条检测细菌的方法中，存在如下问题：

1、传统的检测细菌的免疫层析试纸条一般为利用双抗夹心原理的胶体金试纸条方法，由于两个抗体针对细菌的结合位点存在竞争；

2、作为检测探针胶体金标记抗体的Fab存在两个抗原结合片段，发生一个抗体可结合两个细菌从而导致胶体金标记抗体与细菌在金标垫结合反应过程中造成细菌凝聚(这一点已在普通显微镜及扫描电镜下得到验证)，细菌凝聚成较大的颗粒后会导致在试纸条上进行层析时发生堵塞，形成不规则条带，使迁移达到T线的胶体金标记抗体-细菌免疫复合物较少。

由于上述原因灵敏度仅能达到10⁶CFU/mL，但有些细菌如大肠杆菌O157:H7感染致病剂量低，因此传统的检测细菌的免疫层析试纸条的灵敏度亟需改进和提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为解决现有胶体金试纸条检测方法中细菌聚集从而导致试纸层析时发生堵塞、灵敏度不够高、检测所需时间较长等缺陷，提供了一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。

本发明的发明人通过构思和验证，发现了在胶体金试纸条检测中利用双特异性抗体可以避免细菌聚集并提高检测的灵敏度。其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物。在测试中完全避免细菌聚集，同时检测灵敏度可达2.5×10⁴CFU/mL。另外，本发明所用双特异性抗体的稳定性高，检测结果稳定可靠；灵敏度的提高也带来了检测效率的提升。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法，其包括以下步骤：

(1)将待测细菌和所述双特异性抗体标记的胶体金反应得到细菌-双特异性抗体胶体金复合物；

(2)纯化所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物并溶解于小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金溶液，得到上样液；

(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应；

其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物。

所述待测样品、所述双特异性抗体标记的胶体金和小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金溶液的用量本领域人员可以常规确定，例如可参照本领域中含有单克隆抗体的胶体金试纸条检测。

较佳地，所述双特异性抗体包括Fab¹-Fc-Fab²结构，前述结构中上标数字仅用于区分相同术语，不具有实际意义。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体进一步包括抗体恒定区，所述抗体恒定区的重链恒定区选自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述抗体恒定区的轻链恒定区选择人或鼠κ和λ链恒定区及其常规变体。

较佳地，所述待测细菌可为食品工业中常见的有害细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等；优选为革兰氏阴性菌。

和/或，所述小分子半抗原-载体偶联物中小分子半抗原为非天然存在的人工合成的小分子半抗原，本领域技术人员可以在此范围内常规选择，优选为呋喃唑酮代谢物4-CPAOZ。

较佳地，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli)；优选大肠杆菌O157，更优选大肠杆菌O157：H7。

较佳地，所述小分子半抗原-载体偶联物中载体为半抗原常用载体，例如牛血清蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)或者血蓝蛋白(KLH)等；优选为BSA。

在本发明一较佳实施例中，所述小分子半抗原-载体复合物为4-CPAOZ-BSA，且所述待测细菌为大肠杆菌O157：H7。

较佳地，所述双特异性抗体按下述方法制备：

以AOZ为原料，制备4-CPAOZ-BSA作为完全抗原，利用所述完全抗原制备分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫细胞；

制备灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原，利用灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原制备抗所述大肠杆菌O157:H7菌体抗原的免疫细胞，并利用所述免疫细胞制备抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞；

融合所述分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫细胞和所述抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞，得到分泌所述双特异性抗体的杂交瘤细胞，从所述分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞注射的小鼠腹腔液中提取所述双特异性抗体。

本发明所述免疫细胞优选为免疫脾细胞。

在本发明一较佳实施例中，所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示。

较佳地，本发明所述方法的具体步骤为：

从待测样品中分离出细菌，向分离出的细菌加入所述双特异性抗体标记的胶体金，反应后分离并纯化所得细菌-双特异性抗体胶体金复合物；

将所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物溶解于含所述小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金的PBST缓冲液中，得到所述胶体金试纸条的上样液；

将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应。

较佳地，所述分离的方法为离心；优选地，重复所述纯化的步骤。

和/或，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线包被抗所述双特异性抗体的抗体，所述质控线包被抗所述小分子半抗原的抗体。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ IDNO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：如技术方案之二所述的双特异性抗体在制备用于检测细菌的胶体金试纸条中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1.利用改造Fab片段的新型抗体，只用单个的抗原结合片段特异性的结合细菌，降低了细菌的凝聚度，避免了因细菌凝聚形成较大颗粒堵塞层析试纸条，使得能到达T线的细菌量增加；

2.结合间接法研制的试纸条避免了双抗夹心方法因两种抗体存在相同竞争位点导致灵敏度降低，使得T线上二抗捕获更多金标抗体结合的细菌，相较于双抗夹心试纸条方法，灵敏度获得提高。

3.金标4-CPAOZ-BSA又可与该抗体另一抗原结合片段结合，增强T线的显色，进一步提高灵敏度，最终使得试纸条灵敏度可达2.5×10⁴CFU/mL，过量的金标4-CPAOZ-BSA物质还能实现C线显色，确保试纸条的有效性，为读取T/C比值提供可靠参考。

4.本发明所用双特异性抗体由于具有完整的天然Y型抗体的构架，其在常规环境中更加稳定，保证了胶体金试纸条检测实验的稳定性。

5.因为本发明检测方法的灵敏度提高，样品增菌处理时间相对缩短，常规金标试纸条方法样品增菌处理时间需12h以上，而本发明样品所需的增菌处理时间约10h，总共可节省1.5h以上，故本发明所述检测方法更加快速。

附图说明

图1为试纸条组装示意图。

图2为分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞株。

图3为改造后杂交瘤细胞染色体。

图4为最佳反应pH值优化试验结果。

图5为最佳抗体标记量优化试验结果。

图6为光学显微镜观察结果。

图7为扫描电子显微镜观察结果。其中a:金标改造抗体与大肠杆菌O157:H7反应；b:金标普通抗体与大肠杆菌O157:H7反应结果；c:单个大肠杆菌O157:H7与多个金标改造抗体结合；d:金标改造抗体。

图8为最佳缓冲液的选择试验。a:0.01M PBS缓冲液；b:0.01M PBST缓冲液；c:含1％BSA的0.01M PBST缓冲液；d：含5％FBS的0.01M PBST缓冲液。

图9为检测线(T线)包被浓度优化。

图10为质控线(C线)包被浓度优化。

图11为金标4-CPAOZ-BSA用量优化。

图12为验证金标4-CPAOZ-BSA对增强T线显色。A：未添加金标4-CPAOZ-BSA；B添加金标4-CPAOZ-BSA；A’：未添加金标4-CPAOZ-BSA试纸条补充添加后。

图13为试纸条灵敏度试验结果。A：改造抗体制备试纸条灵敏度试验；B：普通抗体制备试纸条灵敏度试验。

图14为重复验证试纸条的最低检测限。

图15为试纸条特异性试验结果。A：大肠杆菌O157:H7 ATCC31350；B：大肠杆菌O111CVCC1450；C：大肠杆菌O26 CVCC1540；D：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；E：猪霍乱沙门氏菌BNCC186354；F：金黄色葡萄球菌ATCC29523；G：副溶血弧菌ATCC33847；H：单增李斯特菌CICC21662；I：阪崎肠杆菌CICC21550；J：无菌PBST缓冲液。

图16为牛奶模拟样本检测结果。

图17为4-CPAOZ质谱图。

图18为4-CPAOZ-BSA的MALDI-TOF-MS测试图。

双特异性抗体的cDNA序列

SEQ ID NO:1：抗4-CPAOZ的抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

TATGGCCGAGGTCAAACTGCAGGAGTCTGGAGATGATCTGGTAAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATTAACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATAGGACGTATTTCTCCTGGAAGTGGTAGTACTTACTACAATGAAATGTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTGTCATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAATCCTCTATGATGGTTACTACGTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGT

SEQ ID NO:2：抗大肠杆菌O157：H7的抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

TACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTTCCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCATAGTCCACGTAGTAACCATCATAGAGGATTGCACAGAAATAGACAGCAGAGTCCTCAGATGACAGGCTGCTGAGCTGAATGTAGGCTGTGCTGGAGGATGTGTCTACAGTCAGTGTTGCCTTGCCCTTGAACATTTCATTGTAGTAAGTACTACCACTTCCAGGAGAAATACGTCCTATCCACTCAAGGCCCAGTCCAGGCCTCTGTTTTATCCAGTTAATCCAGTAGCTGGTGAAGGTGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGACAGCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTTACCAGATCATCTCCAGACTGCTGCAGTTGCACCTCGGCCAT

SEQ ID NO:3：抗4-CPAOZ的抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

GTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCACGTTCGGTGCTGGCACAAAGCTGGAGATCAAACGG

SEQ ID NO:4：抗大肠杆菌O157：H7的抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

TCCGTTTGATTTCCAACTTTGTGCCCCCTCCGAACGTGTAAGCTCCCTAATGTGCTGACAGTAATAGGTTGCAGCATCCTCCTCCTCCACAGGATGGATGTTGAGGGTGAAGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTGAACCTGGCAGGGACCCCAGATTCTAGGTTGGATACAAGATAGATGAGGAGTCTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTTCCAGTGCATATAACTATAGCCAGATGTACTGACACTTTTGCTGGCCCTGTATGAGATGGTGGCCCTCTGCCCCAGAGATACAGCTAAGGAAGCAGGAGACTGAGTGAGCTCAATGTCCGATCCGCCACC

4-CPAOZ单克隆抗体的cDNA序列

SEQ ID NO:5：抗4-CPAOZ的单克隆抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

TATGGCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGATGATCTGGTAAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATTAACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATAGGACGTATTTCTCCTGGAAGTGGTAGTACTTACTACAATGAAATGTTCAAGGGCAAGGCAATACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTGTCATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAATCCTCTATGATGGTTACTACGTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGT

SEQ ID NO:6：抗4-CPAOZ的单克隆抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

TCCGTTTGAGCTCCAACTTGGTGCCCCCTCCGAACGTGTAAGCTCCCTAATGTGCTGACAGTAATAGGTTGCAGCATCCTCCTCCTCCACAGGATGGATGTTGAGGGTGAAGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTGAACCTGGCAGGGACCCCAGATTCTAGGTTGGATACAAGATAGATGAGGAGTCTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTTCCAGTGCATATAACTATAGCCAGATGTACTGACACTTTTGCTGGCCCTGTATGAGATGGTGGCCCTCTGCCCCAGAGATACAGCTAAGGAAGCAGGAGACTGAGTGAGCTCAATGTCCGATCCGCCAC

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

试验动物

清洁级的8周龄Balb/c雌鼠以及8周龄昆明雌鼠皆购买于上海杰思捷生物有限公司。

试验细胞株

抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞株由本实验制备。

试验材料和试剂

3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司

对醛基苯甲酸，含量93％韶远化学科技(上海)有限公司

弗氏完全佐剂美国Sigma公司

弗氏不完全佐剂美国Sigma公司

聚乙二醇6000 美国Sigma公司

次黄嘌呤美国Sigma公司

胸腺嘧啶脱氧核苷美国Sigma公司

氨基喋呤美国Sigma公司

谷氨酸美国Sigma公司

青链霉素合剂美国Sigma公司

牛血清白蛋白(BSA) 美国Sigma公司

鸡卵清蛋白(OVA) 美国Sigma公司

8-氮鸟嘌呤(8-AG) 美国Sigma公司

秋水仙素美国Sigma公司

4-甲基吗啉国药集团化学试剂有限公司

氯甲酸异丁酯国药集团化学试剂有限公司

二甲亚砜国药集团化学试剂有限公司

98％浓硫酸国药集团化学试剂有限公司

氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司

30％双氧水国药集团化学试剂有限公司

N，N-二环己基碳二亚胺(DCC) 国药集团化学试剂有限公司

明胶国药集团化学试剂有限公司

N，N-二甲基甲酰胺(NHS) 国药集团化学试剂有限公司

Gibco胎牛血清购于美国Invitrogen公司

Gibco DMEM高糖培养基购于美国Invitrogen公司

96孔细胞培养板美国Costar公司

24孔细胞培养板美国Costar公司

6孔细胞培养板美国Costar公司

96孔酶标板美国Costar公司

25mL²细胞培养瓶美国Corning公司

HiTrap^TM Protein G抗体纯化柱 GE公司

大肠杆菌O157：H7 ATCC31350

改良EC肉汤培养基青岛高科园海博生物技术有限公司；

抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体实验室制备；

氯金酸国药集团化学试剂有限公司；

柠檬酸钠国药集团化学试剂有限公司；

玻璃纤维垫上海捷宁生物科技有限科技公司；

吸水垫上海捷宁生物科技有限科技公司；

NC膜上海捷宁生物科技有限科技公司；

PVC背板上海捷宁生物科技有限科技公司；

试验仪器

台式低温高速离心机赛默飞世尔(Thermo Fisher)科技有限公司

AL104电子分析天平美国METTLER TOLEDO公司

干式恒温器(MK-20) 杭州奥盛仪器有限公司

4℃冰箱和-80℃超低温冰箱中国海尔公司

THZ-D台式恒温振荡器苏州培英试验设备有限公司

恒温恒湿生化培养箱美国Queue公司

Lab Dancer漩涡混匀器德国IKA公司

Direct-Pure 15Plus超纯水一体机上海瑞枫生物科技有限公司

CO₂细胞培养箱美国Thermo Scientific公司

本发明中，小分子半抗原即为4-CPAOZ。

实施例1：呋喃唑酮代谢物抗原(4-CPAOZ-BSA)合成及其单克隆抗体制备

1.1呋喃唑酮代谢物(AOZ)衍生成半抗原4-CPAOZ

50ml单口烧瓶中，加入0.6456g对醛基苯甲酸、6ml去离子水，搅拌中缓慢滴加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，对醛基苯甲酸完全溶解后，加入0.306g AOZ，室温反应2小时，溶液变混，有浅黄色沉淀，过滤，水洗3次得浅黄色固体，即4-CPAOZ.

4-CPAOZ合成反应方程如下：

对合成的产物进行质谱分析鉴定。4-CPAOZ的质谱测定结果见图17，可知4-CPAOZ的测定分子量为232.9(正离子)，符合理论值234。

1.2 4-CPAOZ与BSA偶联生成完全抗原

采用氯甲酸异丁酯法偶联4-CPAOZ-BSA，偶联路线如下：20.5mg 4-CPAOZ溶于DMF2ml中，搅拌下逐滴加入75μl 4-甲基吗啉，搅拌5分钟，逐滴加入50μl氯甲酸异丁酯，搅拌15min，成A液。将50mg BSA溶于5ml pH 7.2 1mM的PBS中，成B液。A液在搅拌下逐滴滴入B液中，室温反应2小时。4℃，pH 7.2 1mM PBS透析3天3夜，每天换液2次。冻干分装后储存于-20℃。产品经MALDI-TOF-MS鉴定，用OVA代替BSA同法偶联4-CPAOZ-OVA。

4-CPAOZ-BSA偶联路线如下：

抗原4-CPAOZ-BSA的鉴定

MALD-TOF-MS法：将4-CPAOZ-BSA冻干，送样鉴定。结果如图18，BSA的分子量为66479.5，偶联后的分子量为70693.06，分子量增加4213.56，偶联率为22.27～24.03，达到最佳偶联率值。

实施例2.抗大肠杆菌O157:H7及4-CPAOZ-BSA双特异性抗体的制备

2.1完全抗原的制备

取4-CPAOZ和BSA同上采用氯甲酸异丁酯法偶联生成4-CPAOZ-BSA，产物使用0.01M的PBS溶液透析3d。透析完成后，产物适当浓缩，并离心去沉淀，终产物即为4-CPAOZ免疫原，于-20℃保存。

用OVA代替BSA，进行同方法偶联反应，终产物即为4-CPAOZ包被原，于-20℃保存。

2.2小鼠的免疫

用制备的免疫原免疫8周龄清洁级健康雌性BALB/c小鼠，免疫程序如下表1：

表1小鼠免疫程序

2.3小鼠血清效价测定

小鼠第三次免疫后，以合成的包被原进行间接ELISA测定小鼠血清效价。

2.4抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞株的制备及诱导

2.4.1参照文献(龙梦瑶，肠出血性大肠杆菌O157:H7的IMS-RT-PCR和镧系荧光微球免疫层析检测方法的建立，(硕士学位论文)，南京农业大学，2016年)，应用热酚-水法提取EHEC O157:H7脂多糖(LPS)，将水相脂多糖和酚相脂多糖分离，应用酸解法制备O-特异性多糖(O-spectific polysaccharides,O-SP)。将浓度为2×10⁹CFU/mL的EHEC O157:H7甲醛灭活后制备全菌免疫原，常规方法免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞，按5-10:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，培养数天后，以EHEC O157:H7灭活菌体与O-SP分别作为包被原，用间接ELISA方法依次筛选分泌EHEC O157:H7 O-SP抗体的阳性细胞克隆，亚克隆建株，液氮冻存。

2.4.2杂交瘤细胞株用8-AG诱导培养

复苏实验室保存的抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞株，向培养基中添加的8-AG进行诱导培养，使杂交瘤细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT缺失，对该细胞株进行扩大培养并冻存备份。

2.5饲养细胞的培养

于融合前一天，取清洁级的8周龄昆明鼠，眼球放血处死后，于75％酒精浸泡后，固定于超净工作台内。用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜，向腹膜内注射空白DMEM培养基，用无菌镊子轻轻拍打小鼠腹腔后，抽取腹腔中的培养基于15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，用含有20％胎牛血清的HAT培养基重悬细胞，滴加于96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

2.6免疫脾细胞的制备及融合

取经间接ELISA测定血清效价较高的小鼠，眼球放血处死后，于75％酒精浸泡后，固定于超净工作台内。用无菌眼科剪依次剪开腹部皮肤、腹膜，取出脾脏放入6孔细胞培养板，用空白DMEM培养基清洗后转入另一孔，用注射器吸取空白DMEM培养基反复冲洗脾脏，将脾细胞洗脱，洗脱液转移入15mL离心管，1000r/min离心10min，弃去上清，用适量空白DMEM培养基重悬备用。

预先将空白DMEM培养基、含20％FBS HAT完全培养基和1mL PEG 6000(聚乙二醇)提前置于37℃、5％CO₂的培养箱中预热备用。

将生长状态良好的缺失HGPRT酶的抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞收集到15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清后用2-3mL空白DEME培养基重悬管底细胞。将缺失HGPRT酶的抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞与4-CPAOZ-BSA免疫脾细胞按1:10的比例混合加入融合管中，加入空白DEME培养基使终体积为30mL，1000r/min离心10min，弃上清并将管内培养基吸干，充分混匀两种细胞后，置于37℃水浴10min。在45s内加入1mL预热的PEG，作用90s后，按照30s内加入1mL空白DMEM培养基、30s内加入2mL空白DMEM培养基、2min内加入30mL空白DMEM培养基的次序终止PEG作用，最后将融合管置于37℃、5％CO₂培养箱静置10min，1000r/min离心10min，弃上清后用12mL的20％HAT完全培养基重悬细胞，稀释成不同浓度分别加入饲养细胞板中，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.7阳性克隆的筛选

采用间接ELISA方法，使用4-CPAOZ-OVA包被ELISA板，用1％明胶封闭后备用。待杂交瘤细胞生长到适当大小时，取各孔上清50μL加入包被好的ELISA板，以阴性小鼠血清作为阴性对照，HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗，测试各孔对4-CPAOZ-OVA是否呈阳性。

针对上述筛选得到的阳性孔，同样利用间接ELISA方法测试各克隆孔对大肠杆菌O157:H7是否呈阳性。

某克隆孔对两种包被物质均呈现阳性，即为所需的分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞克隆孔，其分泌的抗体的2个Fab片段可分别与大肠杆菌O157:H7和4-CPAOZ特异性结合。

2.8阳性杂交瘤细胞的亚克隆及扩大培养

经筛选得到的双特异性抗体阳性分泌株细胞，经两次亚克隆后，用48孔细胞培养板、24细胞培养孔板、细胞培养瓶依次扩大培养并冻存备份。

分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞株见图2。

2.9腹水瘤法制备单克隆抗体及纯化

取清洁级8周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL灭菌石蜡油，每周1次，连续注射3次备用。

取扩大培养后的双特异性抗体杂交瘤细胞，1000r/min离心10min，弃上清后用生理盐水重悬细胞。先向小鼠腹腔注射0.5mL灭菌石蜡油，再将细胞悬液注入。注意观察小鼠变化，在注射细胞悬液后10-12天左右可见小鼠腹腔膨大，即可收集腹水。腹水离心去除上层石蜡油和下层沉淀后，即得粗制腹水抗体，保存于-80℃冰箱。

得到的粗制抗体先使用0.45μm滤器进行过滤，再采用HiTrap^TM Protein G纯化柱进行纯化。

对纯化后的双特异性抗体测序，其可变区序列如SEQ ID NO:1-4所示。

实施例3基于改造抗体的大肠杆菌O157H7胶体金试纸条检测

3.1杂交瘤细胞染色体染色鉴定

取双特异性抗体杂交瘤细胞，在培养基中加入0.4μg/mL秋水仙素，继续培养4-6h后收集细胞，1000r/min离心10min，弃去上清。用0.075M的KCl溶液将细胞沉淀重悬，于37℃水浴30min进行低渗处理。向细胞悬液中加入1mL新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，混匀后，1000r/min离心10min，弃去上清。向沉淀中加入5mL固定液重悬细胞，于室温静置30min，1000r/min离心10min，弃去上清，重复操作两次，加入5mL固定液，封闭管口，于4℃反应8h。反应产物离心弃去上清后，用适量固定液重悬，滴管吸取1-2滴滴加于在冰水中浸泡过的载玻片上，经火焰固定后，放置自然干燥。用新鲜配制的吉姆萨染色液染色，于显微镜下镜检，选取视野中染色体分散良好、无重叠、无失散的细胞染色体进行观察，计数100个左右完整的细胞，统计其染色体数目。抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞由SP2/0细胞(60-68条染色体)和小鼠脾细胞(40条染色体)融合得到，因此其染色体数目应为二者总和(100条左右)，而双特异性杂交瘤细胞株是以抗大肠杆菌O157:H7杂交瘤细胞与小鼠脾细胞融合得到，因此染色体数目应为140条左右，见图3。

3.2胶体金的制备

将100mL 0.01％氯金酸溶液加入洁净的锥形瓶中，置于磁力搅拌器上，加热至溶液沸腾，随后快速加入2mL 1％柠檬酸钠溶液，持续加热至溶液颜色变为酒红色且不再变化，用ddH₂O补至原体积，保存于4℃备用。

3.3胶体金标记抗体及条件优化

pH值选择将已纯化的抗体分别用PBS稀释为0.1mg/mL；分别向6个2mL EP管加入1mL胶体金溶液，再分别向各管中加入0.1mol/L K₂CO₃溶液0、5、10、15、20、25μL，混匀后再加入100μL抗体，混匀静置10min；再向各管内加入100μL、10％NaCl溶液，静置2h，观察各管内溶液颜色有无变化；将溶液颜色变为蓝色的EP管弃去，将仍保持红色的溶液的pH值作为最佳pH值。同时，将仍保持红色的溶液离心取上清，测OD₅₂₀值，确定抗体是否标记成功。当加入抗体量不变，各管溶液pH值不同时，如图4所示，从加入15μL K₂CO₃(经测定pH值为8.5)的EP管开始，溶液颜色呈现酒红色且不发生变化，故选择该条件下的pH值8.5作为最佳pH值。

抗体用量选择将已纯化的抗体分别用PBS稀释为0.1mg/mL；分别向6个2mL EP管加入1mL胶体金溶液，再分别向各管中加入15μL、0.1mol/L K₂CO₃溶液，混匀后分别加入0、20、40、60、80、100μL抗体，混匀静置10min；再向各管内加入100μL、10％NaCl溶液，静置2h，观察各管内溶液颜色有无变化；将溶液颜色变为蓝色的EP管弃去，将仍保持红色的溶液加入的抗体量作为最小标记量，最佳抗体标记量在此基础上增加30％。当反应的pH值不变时，调节各管加入抗体的量，如图5所示，从加入40μL抗体的EP管开始，溶液颜色呈现酒红色且不发生变化，为保证抗体标记的有效性，在此抗体加入量的基础上增加30％，即52μL作为最佳抗体标记量。

将已纯化的抗体分别用PBS稀释为0.1mg/mL；向15mL离心管加入10mL胶体金溶液，加适量0.1mol/L K₂CO₃分别调至标记代谢物抗体的最佳pH值，按照抗体最佳标记量加入抗体并混匀，室温反应0.5h；然后加入1mL 10％BSA溶液，使体系中BSA终浓度为1％，静置放置0.5h；反应完成后在4℃、12000r/min条件下离心30min，弃去上清，将流动沉淀用2mL的重悬液(含0.02％NaN3)重悬混匀，置于4℃保存备用。

3.4透射电子显微镜观察

将大肠杆菌O157：H7接种至LB培养基，37℃、180r/min振荡培养2h，再以3000r/min离心5min，弃上清，用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)重悬，并加入甲醛使终浓度为3％，固定2h后，再以3000r/min离心5min，弃上清，用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)重悬，即制得所需的大肠杆菌O157：H7观察样本。

取50μL胶体金标记的双特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体与100μL、10⁷CFU/mL大肠杆菌O157:H7混匀，于室温条件下反应15min。先使用光学显微镜观察，结果如图6所示，使用普通的金标抗体与细菌反应后，出现了细菌凝聚的现象，而使用金标改造后的抗体与细菌反应后，细菌仍能呈分散的状态。在扫描电镜下观察，制备的胶体金颗粒呈大小均匀的球形，直径在18nm左右(如图7d所示)。在透射电镜下分别观察大肠杆菌O157：H7、胶体金颗粒、两种金标抗体与大肠杆菌O157:H7结合状态以及大肠杆菌的分散状态。改造金标抗体与细菌反应后，也表明金标改造抗体降低了细菌的凝聚度，可观察到单个细菌周围结合了多个胶体金颗粒(如图7c所示)。

实施例4胶体金免疫层析试纸条的组装、优化

4.1胶体金免疫层析试纸的组装与使用

胶体金免疫层析试纸条由PVC背板、加样垫、NC膜、吸水垫按图1组装，其步骤如下：将NC膜固定在PVC背板中部，将加样垫和吸水垫分别裁剪后粘贴在NC上下两端，并使其与NC膜重合2mm，检测线(T线)包被羊抗鼠IgG，质控线(C线)包被抗4-CPAOZ单克隆抗体(重链可变区序列和轻链可变区分别如SEQ ID NO:5和6所示，轻重链恒定区为鼠轻重链恒定区)，包被浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL，置于25℃烘干1h，最后裁剪为宽3.8mm的试纸条，置于室温避光保存。如图1所示。

使用时，将待测样品按1:9加入改良EC肉汤培养基充分混合增菌培养，取1mL的菌液在4℃条件下以10000r/min离心5min，沉淀用含1％BSA或5％FBS的1×PBST缓冲液100μL重悬，加入50μL双特异性抗体标记的胶体金反应15min后，以2500r/min离心5min，使得与细菌结合的胶体金随细菌一同沉淀，弃上清，用1mL PBST缓冲液重悬洗涤沉淀，重复上述离心洗涤操作两次，最后取6.5μL金标4-CPAOZ-BSA溶液，用含1％BSA或5％FBS的PBST缓冲液补足100μL后重悬沉淀，滴加至加样垫上，反应15min后观察条带显色情况。若T线显色且C线显色则判断为阳性；若T线不显色且C线显色则判断为阴性；若C线不显色则该试纸条无效。

4.2胶体金免疫层析试纸条条件优化

NC膜的选择：准备了如下5种NC膜：mini PALL90、mini PALL170、AE99、SartoriusCN95、Sartorius CN140制备试纸条，T线和C线均采用相同浓度包被，取10⁷CFU/mL的大肠杆菌O157：H7作为样本，按照上述试纸条使用方法进行测试，根据层析及显色情况选择合适的NC膜。Sartorius CN95的爬速较快，孔径大小15μm，而大肠杆菌大小约为1.2×0.5μm，便于大肠杆菌进行层析。因此选择该NC膜制备用于检测O157：H7的试纸条。

缓冲液的选择：0.01M、pH7.2的PBS缓冲液、0.01M、pH7.2的PBST缓冲液、含1％BSA的0.01M、pH7.2的PBST缓冲液、含5％胎牛血清的0.01M、pH7.2的PBST缓冲液。取10⁷CFU/mL的大肠杆菌O157：H7作为样本，按照上述试纸条使用方法操作，用上述4种缓冲液分别重悬沉淀，进行试验，观察各试纸条层析及显色情况。

此外取10μL金标双特异性抗体溶液，分别用上述四种缓冲液各90μL进行稀释，以2500r/min离心5min，观察各管底部是否有沉淀，选择层析情况良好且经离心底部未出现沉淀的缓冲液作为最佳缓冲液。如图8所示，经离心后，0.01M的PBS缓冲液和0.01M的PBST缓冲液的管底出现了少量红色沉淀，而含1％BSA的0.01M的PBST缓冲液和含5％FBS的0.01M的PBST缓冲液管底部未观察到沉淀，说明这两种缓冲液能较好地分散悬浮胶体金颗粒，避免胶体金因低速离心而沉淀。最终选择含1％BSA的0.01M的PBST缓冲液或5％FBS的0.01M的PBST缓冲液作为最适缓冲液。

检测线(T线)包被浓度：将羊抗鼠IgG稀释为0.25、0.5、1、2mg/mL，以10⁷CFU/mL的大肠杆菌O157：H7按照上述操作步骤进行测试，根据显色情况选取合适的T线包被浓度。结果如图9所示，随着T线包被浓度的降低，T线显色逐渐变浅，在兼顾试纸条稳定性与经济成本的情况下，选择显色稳定且用量较少的1mg/mL的稀释度作为最佳T线包被浓度。

质控线(C线)包被浓度：将4-CPAOZ单克隆抗体(5mg/mL)以1:5、1:10、1:20、1:40进行稀释，按照上述操作步骤进行测试，根据显色情况选取合适的C线包被浓度。结果如图10所示，随着C线包被浓度的降低，C线显色逐渐变浅，在兼顾试纸条稳定性与经济成本的情况下，选择显色稳定且用量较少的1:10的稀释度作为最佳C线包被浓度。

金标4-CPAOZ-BSA添加量：分别取0、2.5、5、10、20μL的金标4-CPAOZ-BSA，用含1％BSA的PBST缓冲液补足至100μL，根据显色情况及背景深度选取效果较好的添加量，并在此基础上增加30％以保证其稳定性。结果如图11所示，随着金标4-CPAOZ-BSA的添加量逐渐增加，C线显色逐渐增强至不发生变化，然而试纸条背景深度也逐渐加深，添加10、20μL的试纸条背景偏红，出于C线显色稳定及金标4-CPAOZ-BSA物质用量的考虑，最终选择在5μL的基础上增加30％，即6.5μL作为金标4-CPAOZ-BSA最适添加量。

实施例5胶体金免疫层析试纸条的验证、测试

5.1验证金标4-CPAOZ-BSA对增强T线显色

各取1mL 10⁶CFU/mL大肠杆菌O157：H7菌液加入EP管，按照上述操作步骤与抗大肠杆菌O157：H7单抗标记的胶体金进行预先反应，完成离心洗涤步骤后，加入适量含1％BSA的PBST缓冲液重悬沉淀，其中一管加入6.5μL金标4-CPAOZ-BSA，另一管作空白对照，比较两试纸条T线显色情况并记录。稍后对空白对照的试纸条补加适量含有6.5μL金标4-CPAOZ-BSA的PBST缓冲液，比较该试纸条T线前后显色情况并记录。试验结果如图12所示，未添加金标4-CPAOZ-BSA的试纸条C线未出现条带，T线显色较添加金标4-CPAOZ-BSA的试纸条浅，验证了金标4-CPAOZ-BSA可以与金标改造抗体相结合，增强T线的显色。稍后对未添加金标4-CPAOZ-BSA的试纸条补充添加同样量的金标4-CPAOZ-BSA，可观察到该试纸条T线显色与之前相比有所增强，C线也显现出明显的条带，验证了金标4-CPAOZ-BSA可以与C线包被的抗4-CPAOZ-BSA抗体良好的结合。

5.2试纸条灵敏度试验

将大肠杆菌O157：H7稀释为10⁸—10¹CFU/mL等不同浓度，同时设置空白对照，每个浓度设置3个重复，按照上述试纸条使用方法操作，根据试纸条显色结果判断是否为阳性。试验结果如图13A所示，试纸条在10⁵CFU/mL浓度下T线有明显条带，在10⁴CFU/mL浓度下T线未出现明显条带。为探索最低检测限，将大肠杆菌O157:H7稀释为5×10⁴、2.5×10⁴、10⁴CFU/mL等不同浓度，每个浓度分别进行10次试验。结果如图14显示，在5×10⁴和2.5×10⁴CFU/mL条件下均呈现阳性，而10⁴CFU/mL条件下不完全呈现阳性，因此认定可靠的最低检测限为2.5×10⁴CFU/mL。而如图13B所示，利用普通抗体构建的试纸条方法检测限仅能达到10⁶CFU/mL，且在加样垫与NC膜上存在堵塞的现象。

5.3试纸条特异性试验

将A：大肠杆菌O157:H7 ATCC31350、B：大肠杆菌O111 CVCC1450、C：大肠杆菌O26CVCC1540、D：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、E：猪霍乱沙门氏菌BNCC186354、F：金黄色葡萄球菌ATCC29523、G：副溶血弧菌ATCC33847、H：单增李斯特菌CICC21662、I：阪崎肠杆菌CICC21550、J：无菌PBST缓冲液等9株食源性致病菌稀释为10⁷CFU/mL，用10⁶CFU/mL大肠杆菌O157:H7和无菌PBST缓冲液分别作为阳性对照和阴性对照，每组设置3个重复，按上述CLEIA步骤进行检测，同时采用ELISA方法进行比较。试验结果如图15所示，添加10⁶CFU/mL、大肠杆菌O157:H7的试纸条T线出现明显的条带，而添加10⁷CFU/mL其他细菌的试纸条T线均未出现明显条带，添加PBS的空白对照试纸条也未出现明显条带，说明该方法具有良好的特异性。

5.4模拟样本检测

无菌牛奶中加入大肠杆菌O157：H7使其浓度为1CFU/mL，取25mL上述牛奶加入225mL液体LB培养基充分混合，置于摇床以37℃、180r/min振荡培养。每间隔2h，取1mL的菌液在4℃条件下以10000r/min离心5min，弃去上清，沉淀用100μL含1％BSA的PBST缓冲液重悬，按照上述试纸条使用方法操作，验证该方法用于模拟样本检测所需的时间。试验结果如图16所示，当牛奶样本前增菌培养10小时，用该试纸条进行检测可观察到阳性条带。相比较于经典的平板分离与生理生化鉴定，其前增菌处理的时间大大缩短。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

<130> P19015414C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗4-CPAOZ的抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 1

tatggccgag gtcaaactgc aggagtctgg agatgatctg gtaaagcctg gggcctcagt 60

gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatta actggataaa 120

acagaggcct ggacagggcc ttgagtggat aggacgtatt tctcctggaa gtggtagtac 180

ttactacaat gaaatgttca agggcaaggc aacactgact gtagacacat cctccagcac 240

agcctacatt cagctcagca gcctgtcatc tgaggactct gctgtctatt tctgtgcaat 300

cctctatgat ggttactacg tggactatgc tatggactac tggggtcaag gaaccacggt 360

caccgtctcc tcaggtggag gcggt 385

<210> 2

<211> 385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗大肠杆菌O157：H7的抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 2

taccgcctcc acctgaggag acggtgaccg tggttccttg accccagtag tccatagcat 60

agtccacgta gtaaccatca tagaggattg cacagaaata gacagcagag tcctcagatg 120

acaggctgct gagctgaatg taggctgtgc tggaggatgt gtctacagtc agtgttgcct 180

tgcccttgaa catttcattg tagtaagtac taccacttcc aggagaaata cgtcctatcc 240

actcaaggcc cagtccaggc ctctgtttta tccagttaat ccagtagctg gtgaaggtgt 300

agccagaagc cttgcaggac agcttcactg aggccccagg ctttaccaga tcatctccag 360

actgctgcag ttgcacctcg gccat 385

<210> 3

<211> 327

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗4-CPAOZ的抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 3

gtggcggatc ggacatcgag ctcactcagt ctccagcaat catgtctgca tctctagggg 60

aggagatcac cctaacctgc agtgccagct cgagtgtaag ttacatgcac tggtaccagc 120

agaagtcagg cacctctccc aaactcttga tttatagcac atccaacctg gcttctggag 180

tcccttctcg cttcagtggc agtgggtctg ggacctttta ttctctcaca atcagcagtg 240

tggaggctga agatgctgcc gattattact gccatcagtg gagtagttat cacgttcggt 300

gctggcacaa agctggagat caaacgg 327

<210> 4

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗大肠杆菌O157：H7的抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 4

tccgtttgat ttccaacttt gtgccccctc cgaacgtgta agctccctaa tgtgctgaca 60

gtaataggtt gcagcatcct cctcctccac aggatggatg ttgagggtga agtctgtccc 120

agacccactg ccactgaacc tggcagggac cccagattct aggttggata caagatagat 180

gaggagtctg ggtggctgtc ctggtttctg ttggttccag tgcatataac tatagccaga 240

tgtactgaca cttttgctgg ccctgtatga gatggtggcc ctctgcccca gagatacagc 300

taaggaagca ggagactgag tgagctcaat gtccgatccg ccacc 345

<210> 5

<211> 385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗4-CPAOZ的单克隆抗体重链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 5

tatggccgag gtgcagctgc aggagtctgg agatgatctg gtaaagcctg gggcctcagt 60

gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatta actggataaa 120

acagaggcct ggacagggcc ttgagtggat aggacgtatt tctcctggaa gtggtagtac 180

ttactacaat gaaatgttca agggcaaggc aatactgact gtagacacat cctccagcac 240

agcctacatt cagctcagca gcctgtcatc tgaggactct gctgtctatt tctgtgcaat 300

cctctatgat ggttactacg tggactatgc tatggactac tggggtcaag gaaccacggt 360

caccgtctcc tcaggtggag gcggt 385

<210> 6

<211> 344

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗4-CPAOZ的单克隆抗体轻链可变区mRNA的cDNA序列

<400> 6

tccgtttgag ctccaacttg gtgccccctc cgaacgtgta agctccctaa tgtgctgaca 60

gtaataggtt gcagcatcct cctcctccac aggatggatg ttgagggtga agtctgtccc 120

agacccactg ccactgaacc tggcagggac cccagattct aggttggata caagatagat 180

gaggagtctg ggtggctgtc ctggtttctg ttggttccag tgcatataac tatagccaga 240

tgtactgaca cttttgctgg ccctgtatga gatggtggcc ctctgcccca gagatacagc 300

taaggaagca ggagactgag tgagctcaat gtccgatccg ccac 344

Claims

1.一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法，其包括以下步骤：

(2)纯化所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物并溶解于含有小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金和载体的溶液，得到上样液；

(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应；

其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物；

所述方法为非诊断目的的；

所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双特异性抗体包括Fab¹-Fc-Fab²结构。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测细菌为革兰氏阴性菌和/或所述小分子半抗原-载体偶联物中小分子半抗原为4-CPAOZ。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌O157。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌O157为大肠杆菌O157：H7。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-载体偶联物中载体为BSA或OVA。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-载体复合物为4-CPAOZ-BSA，所述待测细菌为大肠杆菌O157：H7。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双特异性抗体按下述方法制备：

以AOZ为原料，制备4-CPAOZ-BSA作为完全抗原，利用所述完全抗原制备分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫脾细胞；

制备灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原，利用灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原制备抗所述大肠杆菌O157:H7菌体抗原的免疫脾细胞，并利用所述免疫脾细胞制备抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞；

融合所述分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫脾细胞和所述抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞，得到分泌所述双特异性抗体的杂交瘤细胞，从所述分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞注射的小鼠腹腔液中提取所述双特异性抗体。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤具体为：

将所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物溶解于含所述小分子半抗原-载体偶联物的PBST缓冲液中，得到所述胶体金试纸条的上样液；

将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离的方法为离心。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，重复所述纯化的步骤；

13.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示。

14.如权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括Fab¹-Fc-Fab²结构。

15.如权利要求13或14所述的双特异性抗体在制备用于检测细菌的胶体金试纸条中的应用。