CN112368001A - 治疗用途和方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗受试对象肌营养不良症，或在患有肌营养不良症的受试对象中改善肌肉功能或延迟肌肉功能衰退的方法，包括向受试对象施用包括VLA‑4的反义寡核苷酸的药物组合物，用于在足够的时间和条件下，改善受试对象肌营养不良症或肌营养不良肌纤维的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症进展。在一个实施方案中，该方法使用低于约50mg/剂的低剂量反义寡核苷酸。在一个实施方案中，反义寡核苷酸治疗用作患有肌营养不良症例如DMD的受试对象的皮质类固醇治疗的辅助疗法。

Description

治疗用途和方法

技术领域

本说明书能够实现用于治疗肌肉病症如肌营养不良症的组合物和方法。

背景技术

本说明书中参考文献的著录细节也在说明书的末尾列出。

本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被认为是承认或任何形式的暗示该现有技术形成任何国家的公知常识的一部分。

肌营养不良症(MD)是一组以特定肌肉组织进行性衰弱和消瘦(肌坏死)为特征的疾病，骨骼肌被纤维、骨或脂肪组织取代。肌营养不良症有几种不同的形式，影响男性或男性和女性，其中许多出现在婴儿期和儿童期，直到中年或更晚。其形式和严重程度随着发病年龄的不同而不同，尤其是较年轻的受试对象经常经历急性进展性疾病。

最常见的MD形式有Duchene肌营养不良症(DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、Becker肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD，包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端型。几乎所有类型的MD都是由单基因突变引起的。

DMD和BMD涉及X染色体上的肌营养不良蛋白(dystrophin)基因缺陷。肌营养不良蛋白用于连接肌肉细胞(肌节)和细胞骨架的收缩机制(肌动蛋白丝)和细胞外基质(ECM)，胶原蛋白在细胞外基质中传递肌肉力量(Grounds MD，2008)。已知ECM在肌肉功能和肌肉再生中扮演着复杂的角色。营养不良的肌纤维与坏死、炎症和纤维化有关。由于肌营养不良蛋白缺乏导致进展性疾病的确切事件序列在分子水平上还不清楚。患有DMD的儿童有肌营养不良蛋白缺陷的肌肉，容易受到收缩引起的肌肉损伤，从而触发免疫系统，加剧肌肉损伤，FDA CDER的主任的出版物对此进行了总结(Rosen等人，2015)。肌肉力量的持续退化影响下肢，导致活动能力受损，并且还影响上肢，导致功能和自我护理能力的进一步丧失。虽然基因治疗和跳过外显子的方法将是理想的，但研究人员也专注于了解疾病的性质，以便开发能够减轻其严重性和延缓其进展的策略和药物。mdx小鼠模型被广泛用于临床前研究机制和干预措施。Grounds MD，2008，确定了在mdx小鼠中针对慢性期和急性期疾病的两级方法的必要性。

DMD是一种破坏性的疾病，主要影响男孩，发病率约为1:3,500活产。男孩在很小的时候就失去了行走的能力，在青春期之后就只能坐在轮椅上，而且常常是在生命的第三个十年中死于心肺功能衰竭。BMD与DMD相似但更温和。

目前使用皮质类固醇的治疗旨在通过减少炎症来减轻疾病的严重程度，从而在一段时间内保持肌肉质量和功能。皮质类固醇有急性抗炎效果，但可能是短期的，其作用机制尚不清楚。它们不是最理想的，因为副作用严重限制了它们的使用，而且它们还可能导致萎缩。泼尼松龙0.75mg/kg/天和地夫可特(Deflazacort)0.9mg/kg/天是能行走的DMD患者的标准治疗方法，但当男孩变得不能行走时，对于CS的益处没有达成共识，男孩可能会继续治疗，有时是他们失去行走能力时所用的固定剂量，即减少的mg/kg/天剂量，否则他们可能会停止CS治疗。Edasalonexent作为一种抗炎的NF-κB药物正在开发中，作为一种单一疗法用于患有DMD的年轻能行走的男孩。有几种药物正在进行临床试验，针对营养不良的不同方面。例如，针对纤维化的它莫西芬(Tamoxifen)、用于呼吸功能的艾地苯醌(Idebenone)和用于跳过终止密码子的Ataluren正在进行MD的临床试验。通过诱导肌营养不良蛋白基因外显子的定向跳跃来治疗DMD的寡核苷酸治疗已经被评估，结果好坏参半。Eteplirsen，一种吗啉代寡核苷酸，已经在13％的在第51外显子发生遗传终止密码子突变的DMD儿童中进行了验证性研究，可跳过外显子51，而Drispersen，一种用于第51外显子跳过的2'-O-甲基硫代磷酸寡核苷酸，未能获得活性和FDA批准。

目前治疗中的这些缺陷表明需要另外的治疗方法。

发明内容

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数方面，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种组合物”包括单一组合物，以及两种或更多种组合物；提及“一种试剂”包括一种试剂，以及两种或更多种试剂；提及“本发明”包括本发明的单个和多个方面等。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试对象的肌营养不良症的方法，其包括向人CD49d(VLA-4的α4链)施用抑制性寡核苷酸。

在一个实施方案中，示例性抑制性寡核苷酸包括分离的或合成的反义RNA或DNA、siRNA或siDNA、miRNA、miRNA模拟物、shRNA或DNA和反义DNA或RNA或DNA:RNA杂合体。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的受试对象的肌营养不良症的方法，该方法包括周期性地向受试对象施用药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体(carrier)和治疗有效量的包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，给药的时间和条件足以改善受试对象的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试对象的肌营养不良症的进展。

在一个实施方案中，给药与标准皮质类固醇治疗组合。

在一个实施方案中，皮质类固醇以低剂量施用。低剂量皮质类固醇包括标准剂量的2/3、1/2、1/4和1/3。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在标准或低剂量皮质类固醇存在下是治疗有效的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的，并且其中受试对象是能行走的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的，并且其中受试对象是不能行走的。

在另一个实施方案中，本说明书实现了用于在患有肌营养不良症的受试对象中改善肌肉功能或延迟肌肉功能衰退的方法，该方法包括周期性地向受试者施用药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体(carrier)和治疗有效量的包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体，持续时间和条件足以在受试对象中改善营养不良肌纤维的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症的进展。

在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA-DNA杂合体。

在一个实施方案中，受试对象由于MD而不能行走。

在一个实施方案中，受试对象是青春期后的。

在一个实施方案中，方法包括监测CD4+和/或CD8+T细胞水平。在一个实施方案中，方法包括监测降低的CD4+和/或CD8+T细胞水平。在一个实施方案中，方法包括监测M1巨噬细胞或HLADR⁺单核细胞。在一个实施方案中，方法包括监测减少的M1巨噬细胞或HLADR⁺单核细胞。

在一个实施方案中，方法包括测定MD或营养不良的肌纤维的一种或多种标志物的水平或存在，包括免疫细胞或免疫调节因子的水平或数量、炎性标志物的水平或纤维化标志物的水平或肌肉状态标志物的水平。

在一个实施方案中，MD或MD进展或营养不良肌纤维的一种或多种标志物包括免疫细胞或免疫调节因子的水平或数量、炎性标志物的水平或纤维化标志物的水平或肌肉状态标志物的水平。

肌肉状态的标志物包括但不限于运动肌功能的标志物、指示肌肉纤维化或其不存在的标志物、指示肌肉退化或再生的标志物、心脏功能的标志物和肺功能的标志物。

在一个实施方案中，改善MD或营养不良的肌纤维的一种或多种体征包括改善肢体功能、身体肌肉功能、心脏和/或肺功能。

在一个实施方案中，方法包括测定MD或营养不良肌纤维的一种或多种体征的水平或存在。说明性的体征包括肢体功能、身体肌肉功能、心脏和肺功能。

在一个实施方案中，MD或营养不良肌纤维的一个或多个症状包括生活质量因素，诸如能量水平、幸福感、感觉到的步行舒适性、上肢功能活动等。

在一个实施方案中，有需要的受试对象包括有MD的遗传和/或临床诊断以及相对低水平的营养不良肌纤维和炎性标志物的受试对象。

在一个实施方案中，受试对象显示炎性细胞水平正常或仅稍微升高。炎性细胞包括T细胞(CD4、CD8)、B细胞(CD-19)、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。

在一个实施方案中，受试对象显示正常或仅稍微升高水平的CD49d细胞。

在一个实施方案中，受试对象显示CD49d T细胞水平正常或仅稍微升高。

在一个实施方案中，受试对象表现出免疫细胞标志物如CD3、CD4、CD8、CD49d、CD29和HLA-DR的水平正常或仅稍微升高。

标志物的合适方法包括细胞或蛋白质/核酸或脂质分析是本领域已知的，并且包括但不限于流式细胞术、微珠技术和基于ELISA的方法、层析和/或MS方法、基于杂交或测序的方法。

在另一个实施方案中，诊断为患有MD的受试对象表现出严重营养不良肌纤维的显著升高或急性水平，伴有严重肌肉坏死和炎症。

在一个实施方案中，受试对象显示相对于正常健康对照显著升高的CD49d T细胞水平。

在一个实施方案中，受试对象中MD的形式选自由以下组成的组：杜兴型肌营养不良症(Duchene muscular dystrophy，DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、贝克型肌营养不良症(Becker muscular dystrophy，BMD)、先天性肌营养不良症(CMD)，包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端肌营养不良。

在一个实施方案中，受试对象有DMD或BMD并且是不能行走的。

在一个实施方案中，受试对象具有DMD或BMD并且是青春期后的。

在本发明的另一种形式中，考虑了涉及的实施方案；当药物组合物用于目前描述的方法或用途时，本文描述的组合物在制备用于治疗或预防受试对象肌营养不良症的药物中的用途，用于目前描述的方法的药物组合物。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包括以下结构的寡核苷酸的用途：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防受试对象的肌营养不良症或延迟受试对象的肌营养不良症的进展的药物中的用途。

在另一个实施方案中，本说明书能够实现包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体，用于治疗或预防受试对象的肌营养不良症或延迟受试对象的肌营养不良症的进展。

在一个实施方案中，本发明能够实现治疗有需要的受试对象的肌营养不良症的方法，该方法包括周期性地向受试对象施用治疗有效量的人CD49d抑制性寡核苷酸以改善受试对象的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟其进展。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸给药与标准或低剂量皮质类固醇治疗相结合或作为辅助治疗。

在一个实施方案中，皮质类固醇以低剂量施用。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在没有皮质类固醇治疗的情况下是有效的。

在另一个实施方案中，公开了人CD49d的抑制性寡核苷酸在制备用于在患有肌营养不良症的受试对象中改善肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症进展的药物中的用途。

在一个实施方案中，提供了包括针对人CD49d的抑制性寡核苷酸的药物组合物，其用于治疗受试对象的肌营养不良症或延迟受试对象的肌营养不良症的进展。

以上概述并非且不应以任何方式视为对本发明的所有实施例的详尽列举。

在不脱离本发明的范围的情况下，许多修改对于本领域技术人员将是显而易见的。

本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的广义范围的情况下，可以对上述实施方案行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

序列表的关键字

SEQ ID NO：1人α4整合蛋白反义复合物(ATL1102)

SEQ ID NO：2鼠α4整合蛋白反义复合物(ISIS348574)

具体实施方式

本发明不限于用于药剂的特定筛选程序、药剂的特定制剂和各种医学方法，因为这些可以变化。除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。类似于或等同于本文描述的那些的任何材料和方法可用于实践或测试本发明。对于本领域的定义和术语以及本领域人员已知的其他方法，从业者特别涉及Ausubel等人，《分子生物学的最新方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，增刊47，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)，纽约，1999；Colowick和Kaplan编，《酶学方法》(Methods In Enzymology)，Academic Press，Inc.；Weir和Blackwell编，《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷，布莱克韦尔科学出版公司(Blackwell Scientific Publications)，1986；《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第18版，宾夕法尼亚州麦克伊斯顿，(1990))。

术语“受试对象”包括被诊断患有MD人类受试对象或个体或临床研究模型动物。

例如，当婴儿运动里程碑在18个月延迟时，通常在临床上诊断出DMD。肌肉无力的早期特征包括步态宽阔、脚趾行走、脊柱前凸过度、经常摔倒、肌肉肥大、如腓肠肌、三角肌、股四头肌、舌头咬肌、站起困难、手臂无力。DMD患者的行走能力丧失通常发生在7-13岁之间，而之后还能行走则是BMD的特征。心肺缺陷也可能是明显的。疲劳和言语发展也可能延迟。然而，没有观察到上部运动神经元信号或肌肉肌束震颤。

DMD的诊断可以通过肌营养不良蛋白免疫荧光检测和/或免疫印迹显示肌营养不良蛋白缺乏，并且临床表现与典型的DMD一致。或者，肌营养不良蛋白基因的基因缺失检测阳性(缺失一个或多个外显子)，其中阅读框可预测为“框架外”，与典型DMD一致的临床表现是指示性的。在一个实施方案中，完整的肌营养不良蛋白基因测序可以表现为点突变、重复或其他突变，其导致终止密码子突变可以明确地与DMD相关。在兄弟姐妹或舅父身上，由上述标准之一证实的DMD阳性家族史也是有用的。也被用于评估DMD的特征性临床症状或体征(例如，近端肌肉无力、Gowers征(Gowers'manoeuvre)、血清肌酸激酶水平升高)。

MD或营养不良肌纤维/改善的肌肉功能的合适的改善的标志物、体征和症状是本领域技术人员已知的。

合适的测试包括在治疗期间随时间增加的运动、肌肉、心脏、血流、肺功能的测试。

在患有临床前心肌病的受试对象中，可以基于血清生物标志物应答确定心脏疗效。这可以通过测定一个或多个标志物的水平来实现，如肌肉生长抑制素(myostatin)比率、心肌肌钙蛋白、心肌BNP等。也可以监测eGFR的变化。其他心脏功能可以通过遥测来评估，或者通过持续的移动遥测监测来评估节律异常。

进一步的测试包括测试肌肉氧合参数和线粒体表型。

减少的纤维化可以通过MRI评估。减少肌肉脂肪、减少心脏纤维化、增加收缩力、握力、改善心脏和肺功能测试。其他评估试图减慢上述功能的衰退速率。

生活质量调查表对于确定治疗效果非常有用。

临床结果可能包括，例如，确定标准化上肢可达表面积的百分比变化，通过MRI评估心脏周向应变的百分比变化，心脏侧壁和后壁应变的百分比变化。另一个有用的测试是测量用力肺活量、呼吸功能的延迟性丧失，例如通过肺活量测量从基线开始的FVC 5p的变化。

运动功能测试包括测定治疗前后4个标准爬楼梯试验的平均变化、从地面上升的时间、股外侧肌的脂肪部分的磁共振磁波谱均值变化、股四头肌肌能测试、膝伸肌峰力矩测量、前臂超声肌肉微血管供血。

重要的临床评估包括行走/跑步6或10米的时间、爬4层楼的时间、下4层楼的时间、从仰卧姿势站立的时间。还可以评估体重、身高、BMI的变化。

替代地或另外地，评估来自肌肉活检评估的生物标志物、通过ELISA或蛋白质组学测量的血浆生物标志物组中药效学标志物测量变化、或循环免疫细胞标志物的变化。

如本文所用，术语“反义化合物”是指与编码VLA-4的α4整合蛋白链(α4β1)和/或α4β7整合蛋白的核酸分子杂交的寡聚化合物。人的α4整合蛋白链是CD49d。反义化合物可干扰CD49d，β1整合蛋白和/或β7整合蛋白的表达。

如本文所用，术语“编码α4整合蛋白的核酸分子”包括编码VLA-4的α4整合蛋白链或α4β7整合蛋白的DNA，从这样的DNA转录的RNA(包括前体mRNA和mRNA或其部分)，以及进一步地，衍生自这样的RNA的cDNA。

如本文所用，术语“VLA-4”是指α4整合蛋白和β1整合蛋白的异源二聚体。VLA-4在正常外周血B和T细胞、胸腺细胞、单核细胞和其他细胞以及造血干细胞和祖细胞上以显著水平表达。VLA-4在间充质和内皮祖细胞、间充质干细胞和潜在的内皮干细胞上也有表达。VLA-4的配体包括血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和CS-1，纤连蛋白的Hep II区内的交替剪接结构域。

如本文所用的术语“α4β7整合蛋白”是指α4整合蛋白和β7整合蛋白的异源二聚体。α4β7整合蛋白鉴定了对肠道具有靶向性的记忆T细胞亚群。α4β7整合蛋白也在肥大细胞、淋巴细胞和NK祖细胞的亚群上表达。α4β7整合蛋白在一些干细胞和祖细胞上表达。α4β7整合蛋白的配体包括MAdCam-1和VCAM-1。

核酸

本发明涵盖也称为核酸的各种寡核苷酸的用途。示例性核酸包括DNA(例如，互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA))、RNA(例如，信使RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短抑制RNA(SiRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA、微小RNA、DNA或RNA类似物(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂交物和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些都可以是单链或双链形式。在一个实例中，分离核酸。如本文所用，术语“分离的核酸”是指通过人为干预从天然状态改变或除去的核酸。

术语“寡核苷酸”广泛地指短核酸分子。寡核苷酸容易以序列特异性方式与它们各自的互补寡核苷酸、DNA或RNA结合形成双链体。在一个实施方案中，寡核苷酸长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更长。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸是抑制性寡核苷酸。在一个实例中，术语“抑制性寡核苷酸”是指降低一种或多种蛋白质的产生、表达或生物活性的任何寡核苷酸。例如，抑制性寡核苷酸可干扰mRNA在核糖体中翻译为蛋白质。在另一个实例中，抑制性寡核苷酸可以与编码一种或多种蛋白的基因或mRNA充分互补，以结合(杂交)靶基因或mRNA，从而降低靶蛋白的表达或生物活性。在另一个实例中，抑制性寡核苷酸抑制不编码蛋白质的细胞内核酸的生物活性。例如，抑制性寡核苷酸可抑制非编码RNA的生物活性。

如本文所用，术语“反义”意指与编码序列互补并因此能够结合编码序列的核苷酸序列，编码序列可以是经历转录的DNA双螺旋链的核苷酸序列，或信使RNA分子的核苷酸序列。反义DNA是与双链DNA中的编码链互补的非编码链。

术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指具有双链体区和环区的RNA结构。

术语小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类长度为约19-25个碱基对的双链或单链RNA分子。抑制或阻止翻译为特定蛋白质的siRNA由与术语siRNA偶联的蛋白质名称表示。通常，在各种实施方案中，siRNA是具有约19至约28个核苷酸(即，约19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)的双链或单链核酸分子。

术语“微小RNA”(缩写为miRNA)是在植物、动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。前缀“miR”后面跟有破折号和数字，后者通常指示命名顺序。除一个或两个核苷酸外具有几乎相同序列的不同miRNA用附加小写字母标注。许多miRNA是本领域已知的(miRBase V.21命名；参见Kozomara等人2013；Griffiths-Jones，S.2004)。这些miRNA的序列是本领域熟知的，并且可以在例如万维网mirbase.org上找到。

在一个实施方案中，“抑制性寡核苷酸”模拟一种或多种miRNA的活性。如本文所用，术语“miRNA模拟物”是指当引入细胞中时被设计成模拟内源性成熟miRNA分子的小的双链RNA分子。miRNA模拟物可以从各种供应商获得，例如Sigma Aldrich和Thermo FisherScientific。

在实施方案中，“抑制性寡核苷酸”抑制一种或多种miRNA的活性。各种miRNA种类适于此目的。实例包括但不限于拮抗剂、干扰RNA、核酶、miRNA海绵(miRNA sponge)和miR-屏障(miR-mask)。术语“拮抗剂”在本发明的上下文中用于指化学修饰的反义寡核苷酸，其结合靶miRNA并通过阻止miRNA与其同源基因靶标结合来抑制miRNA功能。拮抗剂可以包括本领域已知的任何碱基修饰。在一个实例中，以上引用的miRNA种类的长度是约10至50个核苷酸。例如，拮抗剂可具有长度为分10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的反义部分。

在一个实施方案中，miRNA种类是含两个或更多个化学上不同的区域的嵌合寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通常含有至少一个修饰核苷酸的区域和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物的区域，修饰核苷酸赋予一种或多种有益性质(例如，核酸酶抗性增加、细胞摄取增加、对靶标的结合亲和力增加)。

在一个实施方案中，本发明所涵盖的核酸是合成的。术语“合成核酸”意指核酸不具有天然存在的核酸的化学结构或序列。合成的核苷酸包括工程化的核酸分子。在另一个实例中，也可以将核酸结构修饰成锁核酸(LNA)，其在2'氧和4'碳之间具有亚甲基桥，以将核糖锁定在核酸的A-型构象中的3'-内(N)构象(Lennox等人2011；Bader等人2011)。在miRNA的情况下，这种修饰可以显著增加分子的靶特异性和杂交性质。

可根据需要使用常规方法设计用于本文公开的方法的核酸。例如，在抑制性寡核苷酸的上下文中，长度为5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的靶标片段被认为适于靶向基因，靶片段包括种子序列内或与其紧邻的至少五(5)个连续核苷酸的一段序列。示例性的靶片段可以包括包括至少5个连续核苷酸的序列，5个连续核苷酸来自种子序列之一的5'末端(剩余的核苷酸是同一RNA的连续片段，从紧邻种子序列的5'末端的上游开始，并持续至核酸含有约5至约30个核苷酸)。在另一个实例中，靶片段由RNA序列表示，RNA序列包括从种子序列之一的3'末端开始的至少5个连续核苷酸(剩余的核苷酸是同一RNA的连续片段，从紧邻靶片段的3'末端的下游开始，并且持续至核酸含有约5个至约30个核苷酸)。术语“种子序列”在本发明的上下文中用于指miRNA(即，种子序列)的5-端的第一个8nt内的6-8个核苷酸(nt)长的子串，其是靶标特异性的重要决定因素。一旦鉴定了一个或多个靶区域、片段或位点，选择与靶标充分互补的抑制性核酸化合物，即充分良好杂交并具有充分特异性的抑制性核酸化合物(即基本上不与其他非靶核酸序列结合)，以产生所需效果。

α4整合蛋白的反义化合物

在一个实施方案中，本发明的方法依赖于使用α4整合蛋白的反义化合物。这样的反义化合物靶向编码VLA-4的α4整合蛋白链(α4β1)或α4β7整合蛋白的核酸。在一个实施方案中，反义化合物是寡核苷酸。然而，考虑了其他寡聚反义化合物，包括但不限于寡核苷酸模拟物。

反义化合物与其靶核酸的杂交通常称为“反义”。反义化合物与其靶核酸的杂交抑制靶核酸的功能。这样的“反义抑制”通常基于反义化合物与靶核酸的基于氢键键合的杂交，使得靶核酸被切割、降解或以其他方式变得不可操作。被干扰的靶DNA的功能可以包括复制和转录。例如，复制和转录可以来自内源细胞模板、载体(vector)、质粒构建体或其他。被干扰的RNA的功能可以包括以下功能，如将RNA易位到蛋白质翻译的位点，将RNA易位到细胞内远离RNA合成位点的位点，从RNA翻译蛋白质，剪接RNA以产生一种或多种RNA种类，以及RNA参与或促进的与RNA有关的催化活性或复合物的形成。

如本文所用，“杂交”是指寡核苷酸和靶核酸的互补碱基的配对。碱基配对通常涉及互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡格斯汀(Hoogsteen)或反向胡格斯汀(Hoogsteen)氢键。鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)是通过形成3个氢键配对的互补核碱基的实例。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)是通过形成2个氢键配对的互补核碱基的实例。杂交可在各种情况下发生。

“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这类杂环碱基的两个最常见类别是嘌呤和嘧啶。“核苷酸”是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接至糖的2'羟基部分、3'羟基部分或5'羟基部分。

“可特异性杂交的”和“互补的”是用于指示足够程度的互补性使得在反义化合物和靶核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。应理解反义化合物不必与其待特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶分子的正常功能以引起活性丧失时，反义化合物是可特异性杂交的，并且在需要特异性结合的条件下，例如在治疗性处理的生理条件下，存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合。

如本文所用，“互补”是指反义化合物的核碱基与靶核酸之间精确配对的能力。例如，如果反义化合物的某个位置的核碱基能够与靶核酸的某个位置的核碱基氢键键合，则认为反义化合物与靶核酸之间的氢键键合的位置是互补位置。反义化合物可以在一个或多个片段上杂交，使得插入或相邻片段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。在一个实施方案中，反义化合物包括与靶核酸内的靶区域至少70％的序列互补性。

例如，其中20个核碱基中的18个与靶核酸内的靶区域互补，并且因此将特异性杂交的反义化合物将代表90％互补性。在该实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长度为18个核碱基，具有4个非互补核碱基，侧接与靶核酸完全互补的2个区域的反义化合物将与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此将落入本发明的范围内。可以使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定反义化合物与靶核酸区域的互补性百分比(Altschul等人，1990；Zhang和Madden，1997)。

反义寡核苷酸

本发明提供了用于抑制α4整合蛋白和/或VLA-4和/或α4β7整合蛋白表达的反义寡核苷酸。这样的反义寡核苷酸靶向编码VLA-4的α4整合蛋白链或α4β7整合蛋白的核酸。

如本文所用，术语“抑制”是指VLA-4或α4β7整合蛋白表达的任何可测量的降低(例如，10％、20％、50％、90％或100％)。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指RNA或DNA或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷(骨架)键组成的寡核苷酸，以及具有类似功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种修饰的或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为其具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。

寡核苷酸可以含有手性(不对称)中心，或者分子作为整体可以是手性的。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)和这些的混合物在本发明的范围内。关于包含手性硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸的公开，可参考Wan等人，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)42(22：13456-13468，2014)。

在形成寡核苷酸时，磷酸基团彼此共价连接相邻的核苷以形成线性聚合化合物。依次地，该线性聚合化合物的相应末端可以进一步接合以形成环状化合物；然而，通常优选直链化合物。此外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并且因此可以以产生完全或部分双链的化合物的方式折叠。对于寡核苷酸，磷酸基团通常指的是形成寡核苷酸的核苷间骨架。RNA和DNA的正常键或骨架是3'至5'磷酸二酯键。

本发明的反义寡核苷酸包括例如核酶、siRNA、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、替代剪接器、引物、探针、以及与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸可以以单链、双链、环状或发夹的形式施用，并且可以含有结构元件，例如内部或末端隆起或环。一旦施用，反义寡核苷酸可以引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的修饰。

这种酶的一个非限制性实例是RNAse H，一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物引起RNAse H。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的切割，从而大大提高了寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。对于其他核糖核酸酶，例如RNase III和核糖核酸酶L家族的酶，已经假设了类似的作用。

双链RNA(dsRNA)分子的引入，已经被证明可以诱导基因或其相关基因产物的功能的有效和特异性的反义介导的降低。这种现象发生在植物和动物中，并被认为与病毒防御和转座子沉默具有进化关系。dsRNA可以在动物中导致基因沉默的第一个证据来自1995年在线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的工作中(Guo和Kempheus，1995)。Montgomery等人(1998)已经显示dsRNA的主要干扰作用是转录后的。在秀丽隐杆线虫中定义的由暴露于双链RNA(dsRNA)引起的转录后反义机制自此被称为RNA干扰(RNAi)。该术语已经被概括为意指反义介导的基因沉默，其涉及dsRNA的引入，导致内源靶mRNA水平的序列特异性降低(Fire等人，1998)。最近，已经显示事实上是dsRNA的反义极性的单链RNA寡聚物，它是RNAi的有效诱导剂(Tijsterman等人，2002)。

本领域普通技术人员无需过多实验即可鉴定可用于本发明方法的反义寡核苷酸。

修饰的核苷间键(骨架)

本发明的反义化合物包括具有修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。

其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸盐、氨基磷酸酯，包括3'-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代膦酸酯、具有正常3'-5'键硼代膦酸酯、2'-5'键类似物的硼代膦酸酯以及具有反转极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'键、5'至5'或2'至2'键。具有反转极性的寡核苷酸在最靠近3'端的核苷酸间键包括单一的3'至3'键，即单个反转的核苷残基，其可能是碱性的(核碱基缺失或在其位置具有羟基)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于US 3,687,808、US 4,469,863、US 4,476,301、US 5,023,243、US 5,177,196、US 5,188,897、US 5,264,423、US 5,276,019、US 5,278,302、US 5,286,717、US 5,321,131、US 5,399,676、US 5,405,939、US5,453,496、US 5,455,233、US 5,466,677、US 5,476,925、US 5,519,126、US 5,536,821、US5,541,306、US 5,550,111、US 5,563,253、US 5,571,799、US 5,587,361、US 5,194,599、US5,565,555、US 5,527,899、US 5,721,218、US 5,672,697和US 5,625,050。

其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括例如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；核糖乙酰基骨架；含骨架的烯烃；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。

教导上述寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于US 5,034,506、US 5,166,315、US 5,185,444、US 5,214,134、US 5,216,141、US 5,235,033、US 5,264,562、US5,264,564、US 5,405,938、US 5,434,257、US 5,466,677、US 5,470,967、US 5,489,677、US5,541,307、US 5,561,225、US 5,596,086、US 5,602,240、US 5,610,289、US 5,602,240、US5,608,046、US 5,610,289、US 5,618,704、US 5,623,070、US 5,663,312、US 5,633,360、US5,677,437、US 5,792,608、US 5,646,269和US 5,677,439。

修饰的糖和核苷间键

本发明的反义化合物包括寡核苷酸模拟物，其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)均被新基团取代。保持核碱基单元用于与靶核酸杂交。

已显示具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核碱基被保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于US 5,539,082、US 5,714,331和US 5,719,262。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsen等人，1991。

本发明的反义化合物还包括具有硫代磷酸骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，例如US5,489,677的-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架]，-CH2-O-N(CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中，天然磷酸二酯骨架表示为-O-P-O-CH2-]以及US 5,602,240的酰胺骨架。

本发明的反义化合物还包括具有US 5,034,506的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。

改性糖

本发明的反义化合物包括具有一个或多个取代的糖部分的寡核苷酸。

实例包括在2'位置包括以下之一的寡核苷酸：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。

在一个实施方案中，寡核苷酸在2'位置包括以下之一：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。

修饰的寡核苷酸的进一步实例包括在2'位置包括以下之一的寡核苷酸：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团、和具有类似性质的其他取代基。

在一个实施方案中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3(也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，1995)，即烷氧基烷氧基。在另一个实施方案中，修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团(也称为2'-DMAOE)，或2'-二甲基氨基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。

其他修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH2-CH＝CH2)和2'-氟(2'-F)。2'修饰可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在一个实施方案中，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。

也可以在寡核苷酸上的其他位置进行类似的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置或在2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。

寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如环丁基部分代替呋喃戊糖。

教导制备这种修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于US 4,981,957、US5,118,800、US5,319,080、US 5,359,044、US 5,393,878、US 5,446,137、US 5,466,786、US5,514,785、US 5,519,134、US 5,567,811、US 5,576,427、US 5,591,722、US 5,597,909、US5,610,300、US 5,627,053、US 5,639,873、US 5,646,265、US 5,658,873、US 5,670,633、US5,792,747和US 5,700,920。

糖的进一步修饰包括锁核酸(Locked Nucleic Acids，LNA)，其中2'-羟基与糖环的3'或4'碳原子连接，从而形成双环糖部分。在一个实施方案中，键是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。

天然和修饰的核碱基

本发明的反义化合物包括具有核碱基修饰或取代的寡核苷酸。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-CC-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶、嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如吩恶嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G型夹(G-clamps)，例如：取代的吩恶嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括US 3,687,808中公开的那些，J.I.Kroschwitz(编)，《聚合物科学和工程的简要百科全书》(The ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering)，858-859页，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1990)中公开的那些，Englisch等人(1991)公开的那些，以及Y.S.Sanghvi，第15章：反义研究与应用(Antisense Research and Applications)，289-302页，S.T.Crooke,B.Lebleu(编)，CRC出版社，1993公开的那些。

这些核碱基中的某些对于增加寡核苷酸的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃。在一个实施方案中，这些核碱基取代与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合。

教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于US3,687,808、US 4,845,205、US 5,130,302、US 5,134,066、US 5,175,273、US 5,367,066、US 5,432,272、US 5,457,187、US 5,459,255、US 5,484,908、US 5,502,177、US5,525,711、US 5,552,540、US 5,587,469、US 5,594,121、US 5,596,091、US 5,614,617、US5,645,985、US 5,830,653、US 5,763,588、US 6,005,096、US 5,681,941和US 5,750,692。

缀合物

本发明的反义化合物可以缀合至增强反义化合物的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或基团。

这些部分或基团可以共价键合至官能团如伯羟基或仲羟基。

示例性的部分或基团包括嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团和增强低聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。

增强药效学性质的部分或基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的那些。

增强药代动力学性质的部分或基团包括改善本发明的化合物的吸收、分布、代谢或排泄的那些。代表性的部分或基团公开于PCT/US92/09196和US 6,287,860中。部分或基团包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。

嵌合化合物

如本领域技术人员将理解的，不必对给定化合物中的所有位置均一地修饰，并且实际上，可将上述修饰中的多于一种掺入单个寡核苷酸中或甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷处。

本发明的反义化合物包括嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”含有两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，即在寡核苷酸化合物的情况下是核苷酸。这些寡核苷酸通常含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰以增强对核酸酶降解的抵抗力、增加细胞摄取、增加稳定性和/或增加与靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区域可用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。例如，RNAse H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的切割，从而大大提高了寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。RNA:RNA杂合体的切割可以以类似的方式通过内切核糖核酸酶如切割细胞和病毒RNA的RNAseL的作用完成。RNA靶标的切割可通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关的核酸杂交技术常规检测。

本发明的嵌合反义化合物可以形成为两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这样的化合物在本领域中也被称为杂合体或gapmer。教导制备这种杂化结构的代表性美国专利包括但不限于US 5,013,830、US 5,149,797、US 5,220,007、US 5,256,775、US 5,366,878、US 5,403,711、US 5,491,133、US 5,565,350、US5,623,065、US 5,652,355、US 5,652,356和US 5,700,922。

示例性寡核苷酸

本领域已知的示例性反义平台包括但不限于吗啉代、第1基因寡核苷酸(1^st genoligos)、第2基因寡核苷酸(2^nd gen oligo’s)、gapmer、siRNA、LNA、BNA或寡核苷酸模拟物样肽核酸。寡核苷酸可以是裸露的或配制在脂质体中。寡核苷酸可以连接到细胞的传递方式，也可以不连接。寡核苷酸可以使用或不使用核内体释放剂。

在一个实施方案中，反义化合物是第二代硫代磷酸骨架2'-MOE修饰的嵌合寡核苷酸gapmer，其设计用于与VLA-4mRNA的3'-非翻译区杂交。在一个实施方案中，寡核苷酸通过与编码CD49的RNA杂交选择性地抑制原代人细胞和几种人细胞系中的VLA-4表达，其是VLA-4的α4整合蛋白亚单位和α4β7整合蛋白。

在一个实施方案中，寡核苷酸是3'→5'硫代磷酸酯寡核苷酸20mer的19-钠盐，也称为3-9-8 MOE gapmer，分子量为7230道尔顿，其中位于5'端1-3位的核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)(2'MOE)修饰的核糖核苷(2'-O-(2-甲氧乙基核糖)；5'端4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷，所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶；自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷。

在一个实施方案中，寡核苷酸的序列是(SEQ ID NO：1)：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'。

寡核苷酸的经验式为：

C₂₃₃H₃₂₇N₆₀O₁₂₉P₁₉S₁₉Na₁₉。

先前已显示反义寡核苷酸ATL1102在中枢神经系统病症，MS中有效且剂量显著高于本文所提出的剂量(Limmroth等人)。针对VLA-4的CD49dα链的反义寡核苷酸选择性抑制免疫细胞中的VLA-4的能力防止了显著的安全性事件，例如PML，其特征在于施用了VLA-4的抗体和小分子抑制剂，是影响表达VLA-4的所有细胞的泛性VLA-4抑制剂。

在一个实施方案中，所有尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶(MeU)。通常，使用2-甲氧基乙基修饰的胸苷而不是5-甲基尿嘧啶来合成寡核苷酸。

在一个实施方案中，所有嘧啶都是C5甲基化的(即，U、T、C是C5甲基化的)。

在一个实施方案中，寡核苷酸的序列可以通过接受的寡核苷酸命名法命名，显示每个O-O连接的硫代磷酸酯核苷酸间键：

2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-脱氧腺苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-脱氧鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-腺苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞嘧啶(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-19钠盐。

寡核苷酸可以通过多步法合成，多步法可以分为两个不同的操作：固相合成和下游处理。在第一操作中，通过计算机控制的固相合成器组装寡核苷酸的核苷酸序列。随后的下游处理包括脱保护步骤，制备反相色谱纯化、分离和干燥以得到寡核苷酸药物物质。寡核苷酸的化学合成利用亚磷酰胺偶联化学，随后氧化硫化，并且涉及活化的单体与延伸的低聚物的顺序偶联，延伸的低聚物的3'-末端共价连接至固相支持体。

脱三苯甲基化(反应a)

固相合成的每个循环开始于除去支持物结合的寡核苷酸的5'末端核苷的酸不稳定的5'-O-4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基。这通过用酸溶液(例如在甲苯中的二氯乙酸(DCA))处理来完成。在脱三苯甲基化之后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

偶联(反应b)

链延长是通过在活化剂(例如，1H-四唑)存在下，载体结合的寡核苷酸的5'-羟基与对应于该特定碱基位置的亚磷酰胺溶液(例如，对于碱基2：MOE-MeC酰胺)反应来实现的。这导致在引入的核苷酸合成子和载体结合的寡核苷酸链之间形成亚磷酸三酯键。偶联反应后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

硫化(反应c)

通过硫转移试剂(例如苯乙酰二硫化物)的溶液处理，将新形成的亚磷酸三酯键转化为相应的[O,O,O)-三烷基硫代磷酸三酯。硫化后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

戴帽(反应d)

在任何给定的循环中可获得的小比例的5'-羟基未能延伸。这些基团在任何后续循环中的偶联将导致形成难以与所需产物分离的与过程相关的杂质(“有DMT(n-l)-单体单元(DMT-on(n-l)-mers)”)。为了防止这些杂质的形成并且为了促进纯化，将“戴帽剂”(例如，乙酸酐和N-甲基咪唑/乙腈/吡啶)引入反应器容器中以得到戴帽序列。通过反相HPLC纯化从所需产物中分离得到的故障序列(“无DMT短单体单元(DMT-off shortmers)”)。戴帽反应后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

使用适当的被保护的核苷亚磷酰胺重复这个基本的四步循环可以组装整个被保护的寡核苷酸序列。

骨架脱保护(反应e)

在该过程的装配部分完成后，通过用三乙胺(TEA)在乙腈中的溶液处理除去保护(O,O)-三烷基硫代磷酸三酯核苷酸间键的氰乙基。通过用乙腈洗涤柱除去在该步骤过程中产生的试剂和丙烯腈。

从载体上切割和碱脱保护(反应f)

通过与氢氧化铵水溶液孵育实现环外氨基的脱保护和粗产物从载体上的切割(反应f)。通过反相HPLC纯化粗产物，得到5'-O-DMT保护的产物。反相HPLC步骤除去DMT-off故障序列。通过UV吸收光谱监测洗脱曲线。收集并分析含有DMT-on寡核苷酸产物的级分。

酸性脱保护(反应g)

收集含有5'-O-DMT保护的寡核苷酸的反相HPLC级分并转移至沉淀槽。在该过程的该阶段将从几种合成的纯化获得的产物合并。用酸(例如，乙酸)处理纯化的DMT-on寡核苷酸以除去连接在5'末端的DMT基团。在酸暴露规定时间和中和后，分离并干燥寡核苷酸药物物质。

在最后的酸性脱保护步骤之后，通过加入氢氧化钠水溶液中和溶液，并通过加入乙醇从溶液中沉淀寡核苷酸药物物质。使沉淀的物质沉降在反应容器底部，倾析乙醇上清液。将沉淀的物质再溶解在纯水中，并将溶液pH调节至pH 7.2-7.3。重复沉淀步骤。将沉淀的物质溶于水中并将溶液通过0.45微米过滤器过滤并转移到一次性聚丙烯盘中，然后将其装入冻干器中。将溶液冷却至-50℃。一次干燥在25℃下进行37小时。将温度升至30℃，进行二次干燥步骤5.5小时。冻干过程完成后，将药物转移到高密度聚乙烯瓶中并储存在-200℃。

靶核酸

“靶向”反义化合物至特定核酸可以是多步骤过程。该过程通常从鉴定将要调节其功能的靶核酸开始。在本发明内容中，靶核酸编码VLA-4或α4β7整合蛋白的α4整合蛋白链。

靶向过程通常还包括确定靶核酸内的至少一个靶区域、片段或位点，以发生反义相互作用，从而产生所需效果，例如抑制表达。如本文所用，术语“区域”定义为具有至少一种可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸的区域内是片段。“片段”定义为靶核酸内的区域的较小或亚部分。如本文所用，“位点”是指靶核酸内的位置。

由于“翻译起始密码子”通常是5'-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中的5'-ATG)，翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、”起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有翻译起始密码子，该密码子的RNA序列为5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG、和5'-AUA，5'-ACG和5'-CUG已显示在体内发挥作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可涵盖许多密码子序列，即使在每种情况下起始氨基酸通常是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。本领域还已知真核和原核基因可以具有两个或更多个可选起始密码子，其中任一个都可以优先用于在特定细胞类型或组织中或在特定组的条件下的翻译起始。如本文所用，术语“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于起始mRNA翻译的一个或多个密码子，该mRNA转录自编码例如VLA-4的α4整合蛋白链或α4β7整合蛋白的基因，而不管这些密码子的序列。

也称为“终止密码子”的“翻译终止密码子”可具有三种RNA序列之一：5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA(5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA，分别在相应的DNA分子中)。如本文所用，术语“翻译终止密码子”和“终止密码子”是指在体内用于终止mRNA翻译的一个或多个密码子，该mRNA转录自编码VLA-4的α4整合蛋白链或α4β7整合蛋白的基因，而不管这些密码子的序列。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包括从翻译起始密码子起始的沿任一方向(即，5'或3')的约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包括从翻译起始密码子终止的沿任一方向(即，5'或3')的约25至约50个连续核苷酸。因此，“起始密码子区”或“翻译起始密码子区”和“终止密码子区”或“翻译终止密码子区”都是可以用本发明的反义化合物有效靶向的区域。

本领域已知“开放阅读框”(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可以有效靶向的区域。在一个实施方案中，靶向包括基因ORF的翻译起始或终止密码子的基因内区。

其他靶区域包括5'非翻译区(5'UTR)，本领域已知是指mRNA从翻译起始密码子起5'方向的部分，因此包括mRNA的5'帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)，且本领域已知的3'非翻译区(3'UTR)指从翻译终止密码子起3'方向的mRNA部分，因此包括翻译终止密码子和mRNA的3'端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5'帽位点包括N7-甲基化鸟苷残基，N7-甲基化鸟苷残基通过5'-5'三磷酸酯键与mRNA的最靠近5'端的残基接合。认为mRNA的5'帽区域包括5'帽结构本身，以及邻近帽位点的前50个核苷酸。在一个实施方案中，靶向5'帽区域。

尽管一些真核mRNA转录物是直接翻译的，但许多真核mRNA转录物含有一个或多个称为“间隔子”的区域，这些区域在翻译前从转录物中切除。剩余的(因此翻译的)区称为“外显子”并剪接在一起形成连续的mRNA序列。通过剪接来自不同基因来源的两种(或更多种)mRNA的过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。在一个实施方案中，靶向内含子或剪接位点，即内含子-外显子连接区或外显子-内含子连接区，或由于重排或缺失引起的异常融合连接区。可替代的RNA转录物可以从DNA的相同基因组区域产生。这些可替代的转录物通常称为“变体”。

“前mRNA变体”是由相同的基因组DNA产生的转录物，其在起始或终止位置上不同于由相同的基因组DNA产生的其他转录物，并且含有内含子和外显子序列。在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分时，前mRNA变体产生较小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是加工前mRNA变体，并且每种独特的前mRNA变体必须总是由于剪接而产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可替代的剪接变体”。如果没有发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体相同。

可以通过使用交替信号来开始或停止转录，即通过使用交替的起始密码子或终止密码子来产生变体。起源于使用替代起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该前mRNA或mRNA的“替代起始变体”。使用替代终止密码子的那些转录物被称为前mRNA或mRNA的“替代终止变体”。一种特定类型的替代终止变体是“聚A变体(polyA variant)”，其中所产生的多个转录物是由转录机器对“聚A终止信号”之一的替代选择产生的，从而产生终止于独特聚A位点的转录物。在一个实施方案中，靶向前mRNA或mRNA变体。

与反义化合物杂交的靶核酸上的位置称为“靶片段”。如本文所用，术语“靶片段”定义为反义化合物所靶向的靶区域的至少8个核碱基部分。虽然不希望受理论的束缚，但目前认为这些靶片段代表可用于杂交的靶核酸的部分。

一旦鉴定了一个或多个靶区域、片段或位点，选择与靶片段充分互补的反义化合物，即充分良好杂交并具有充分特异性的反义化合物，以产生所需效果。

靶片段也可以与其相应的互补反义化合物组合以形成稳定的双链(双链的)寡核苷酸。这种双链寡核苷酸部分在本领域中已经显示通过反义机制调整靶表达和调节翻译以及RNA加工。此外，可以对双链部分进行化学修饰(Fire等人，1998；Timmons和Fire，1998；Timmons等人，2001；Tabara等人，1998；Montgomery等人，1998；Tuschl等人，1999；Elbashir等人，2001a；Elbashir等人，2001b)。例如，已经显示这样的双链部分通过双链体的反义链与靶标的经典杂交来抑制靶标，从而触发靶标的酶促降解(Tijsterman等人，2002)。

组合物

本发明的反义化合物可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合，从而产生例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类吸收、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于US 5,108,921、US 5,354,844、US 5,416,016、US 5,459,127、US 5,521,291、US 5,543,158、US 5,547,932、US 5,583,020、US 5,591,721、US 4,426,330、US4,534,899、US 5,013,556、US 5,108,921、US 5,213,804、US 5,227,170、US 5,264,221、US5,356,633、US 5,395,619、US 5,416,016、US 5,417,978、US 5,462,854、US 5,469,854、US5,512,295、US 5,527,528、US 5,534,259、US 5,543,152、US 5,556,948、US 5,580,575和US 5,595,756。

本发明的反义化合物可以在药学上可接受的载体(carrier)中施用。术语“药学上可接受的载体(carrier)”是指当给予受试对象(特别是哺乳动物，更特别是人)时不产生变应性、毒性或其他不良反应的分子实体。药学上可接受的载体(carrier)可以是固体或液体。药学上可接受的载体的有用实例包括但不限于不影响本发明的活性剂的活性的稀释剂、溶剂、表面活性剂、赋形剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、佐剂、媒介物、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣、稳定剂、保护胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、等渗剂和吸收延迟剂。

在一个实施方案中，药物载体(carrier)是注射用水(WFI)并且将药物组合物调节至pH 7.4、7.2-7.6。

在一个实施方案中，盐为钠盐或钾盐。

寡核苷酸可以含有手性(不对称)中心，或者分子作为整体可以是手性的。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)和这些的混合物在本发明的范围内。

本发明的反义化合物可以是药学上可接受的盐、酯或酯的盐，或在给药时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物的任何其他化合物。

如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指反义化合物的生理学上和药学上可接受的盐，其保留母体化合物的所需生物活性并且在给药时不赋予不期望的毒理学作用。药学上可接受的盐的实例及其用途进一步描述于US 6,287,860中。

本发明的反义化合物可以是前药或前药的药学上可接受的盐，或其他生物等效物。如本文所用的术语“前药”是指以非活性形式制备的治疗剂，其在给药时通过内源酶或其他化学品和/或条件的作用转化成活性形式(即药物)。特别地，根据WO 93/24510、WO 94/26764和US 5,770,713中公开的方法，将本发明的反义化合物的前药形式制备为SATE[(S乙酰基-2-硫乙基)磷酸酯]衍生物。

前药可例如在体内(例如在血液中水解)转化成具有医疗效果的其活性形式。药学上可接受的前药描述于T.Higuchi和V.Stella，前药作为新型给药系统(Prodrugs asNovel Delivery Systems),A.C.S.Symposium Series的第14卷(1976)；“前药设计”编，H.Bundgaard,Elsevier，1985；和在Edward B.Roche编，药物设计中的生物可逆性载体(Bioreversible Carriers in Drug Design，美国制药协会(American PharmaceuticalAssociation)和培格曼出版公司(Pergamon Press)，1987，其通过引用并入本文。有机化学领域的技术人员将理解，许多有机化合物可以与它们在其中反应或它们从其中沉淀或结晶的溶剂形成络合物。这些复合物称为“溶剂合物”。例如，与水的络合物称为“水合物”。

常规治疗

皮质类固醇治疗是门诊患者DMD治疗的主要手段。“皮质类固醇”是指几种合成的或天然存在的物质中的任一种，其具有模拟或增强天然存在的皮质类固醇的作用的类固醇的一般化学结构。合成皮质类固醇的实例包括泼尼松、泼尼松龙(包括泼尼松龙的前体泼尼松、甲泼尼龙)、地塞米松曲安奈德、布地奈德和倍他米松。

在一个实施方案中，本发明针对患有MD的人类受试对象的MD的治疗包括向受试对象施用有效量的治疗剂，例如CD49d(VLA-4的α链)的反义寡核苷酸，并且进一步包括向受试对象施用有效量的第二药物，即皮质类固醇。在一个实施方案中，皮质类固醇是泼尼松(或泼尼松等同物)、地夫可特(泼尼松龙衍生物)。如上，其他皮质类固醇是本领域已知的。

本文中的联合给药包括使用单独的制剂(或单独的药物制剂)联合给药和以任一顺序的连续给药，其中通常存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。

DMD患者在能走动时使用标准剂量的皮质类固醇治疗，因为这已被证明对某些患者的行走能力有一定效果。然而，以标准剂量(0.75mg/kg/天泼尼松或0.9mg/kg/天地夫可特)长期治疗可导致肌肉萎缩和/或具有其他副作用。对于继续使用CS的不能行走的DMD患者，没有护理标准，有时是他们失去行走能力时使用的固定剂量的CS，也就是减少了CS的mg/kg/天的剂量，或者他们可能因为副作用和/或缺乏益处而停止CS治疗。如本文所提出和示出的，CD49d的反义治疗与皮质类固醇治疗相结合，包括降低皮质类固醇治疗水平，在不能行走的受试对象中减少或延缓肌肉功能的进展。不清楚CS治疗是否在这样的受试对象中提供任何益处，因此这支持ATL1102单一疗法或组合的治疗。

如本文所用，在施用疗法的上下文中的术语“组合”是指使用多于一种疗法或治疗剂。术语“组合”的使用不限制向受试对象施用疗法或治疗剂的顺序。治疗或治疗剂可以在向受试对象施用第二治疗或治疗剂之前，与其同时或在其之后施用。

给药

在一个实施方案中，本发明的反义化合物全身施用。如本文所用，“全身给药”是经肠或肠胃外的给药途径。

如本文所用，“肠内”是指涉及胃肠道的任何部分的给药形式，并且包括例如片剂、胶囊或滴剂形式的反义寡核苷酸的口服给药；胃饲管、十二指肠饲管或胃造口术；和直肠给药例如以栓剂或灌肠剂形式的反义化合物。

如本文所用，“肠胃外”包括通过注射或输注给药。实例包括，静脉内(进入静脉内)、动脉内(进入动脉内)、肌内(进入肌肉内)、心内(进入心脏内)、皮下(在皮肤下)、骨内输注(进入骨髓内)、皮内(进入皮肤本身内)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射到腹膜内)、膀胱内(输注到膀胱内)、经皮(通过完整皮肤扩散)、透粘膜(通过粘膜扩散)、吸入。

在一个实施方案中，药物组合物的给药是皮下的。

反义化合物可以作为单次剂量或按周期重复给药，例如每天、每两天一次、每三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四天一次、每周一次、每周两次、每周三次、或每两周或每三周。

在一个实施方案中，每周1至3次、或每周一次、两周一次、三周一次、四周一次、或每两个月一次进行给药。

在一个实施方案中，给药是每周一次。

在一个实施方案中，低剂量施用3至6个月，例如约25-50mg/周，持续至少3至6个月，然后长达12个月和长期。

示例性的剂量在约10-300mg之间。示例性剂量包括25、50、100、150、200mg。示例性剂量包括1.5mg/kg(约50-100mg)和3mg/kg(100-200mg)和4.5mg/kg(150-300mg)。在一个实施方案中，剂量每周施用一次。因此，在一个实施方案中，可以将约10-30、或20-40、或20-28mg的低剂量给予通常体重在约25-65kg之间的受试对象。在一个实施方案中，反义寡核苷酸以每剂小于50mg、或小于30mg、或约25mg的剂量施用以产生治疗效果。在一个实施方案中，反义寡核苷酸ATL1102以每剂小于50mg、或小于30mg、或约25mg的剂量施用以产生治疗效果。

在一个实施方案中，在给药第一次服药之后的大约三个月内可以看到诸如进展延迟的治疗效果。如本文所用的术语“治疗有效量”是指在给药条件下足以例如改善受试对象的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试对象的肌营养不良症的进展，或改善受试对象的肌营养不良肌纤维的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试对象的肌营养不良症的进展的反义化合物的剂量。

在另一个实施方案中，给药有效提供人受试对象血浆中寡核苷酸的Cmax，为2890ng/mL以上，在一个实施方案中，为约10,000-11,000ng/mL。

在另一个实施方案中，施用有效提供人受试对象血浆中寡核苷酸的至少2.5ng/mL，在一个实施方案中至少20ng/mL，或至少45ng/mL的Cmin或Ctrough。

进行研究以证明用VLA-4整合蛋白的抑制性寡核苷酸治疗肌营养不良症，降低了人受试对象血液或肌肉中VLA-4的水平。可以在一个或多个器官(包括血液、肌肉或肺)的细胞亚群中检测到VLA-4水平的降低。在一个实施方案中，受试对象在给药前约24小时服用皮质类固醇。

这使得可以在没有皮质类固醇的情况下评估免疫细胞中VLA-4整合蛋白的CD49dα链的抑制性反义寡核苷酸的影响，皮质类固醇在给药24小时后在血流中没有显著水平，以对循环免疫细胞产生效果。

实施例1

在一个实施方案中，ATL1102每周以约1.5mg/kg(约50-100mg)和3mg/kg(100-200mg)和4.5mg/kg(150-300mg)给10岁或10岁以上患有DMD的不能行走的少年(或青春期)男孩施用长达12周。测量所施用的寡核苷酸例如对运动/肌肉功能和炎性标志物的作用。还评估了肌肉退化-再生和纤维化的标志物。标志物可以在原地或样本中检测，如血浆、尿液或肌肉活检。评估吸气和呼气压力、最大咳嗽流量、用力肺活量(FVC)以评估呼吸功能的变化。采用标准化上肢可达表面积变化百分比、上肢功能评估评分变化百分比、患者报告的结果测量上肢功能能力评分变化百分比(PROM-UL)来评估肌肉功能。生活质量调查表可用于确定治疗效果。

皮质类固醇可以每天给药，或以较低频率给药。泼尼松龙可以0.75mg/kg/天和0.9mg/kg/天的剂量作为用于能行走的DMD患者的标准疗法，以三分之二标准剂量、一半剂量或三分之一剂量给药。

实施例2

在一个实施方案中，将ATL1102每周以约1.5mg/kg(约10-100mg)和3mg/kg(约20-200mg)和4.5mg/kg(30-300mg)给4-11岁患有DMD的能行走的儿科男孩施用长达12周。确定所施用的寡核苷酸例如对运动/肌肉功能和炎性标志物的作用。能行走的儿科男孩可能是步行状况良好或差步行状况较差。保持或减少步行能力的损失可以通过本领域技术人员已知的方法来评估。

实施例3

在一个实施方案中，10名12至18岁的不能行走的DMD患者接受ATL1102，起始剂量为3mg/kg，每周一次，持续4周。前5名患者继续以3mg/kg/周继续服药4周，其余5名患者剂量增至4.5mg/kg/周(每周两次，每周2.25mg/kg)，共4周。治疗8周后，进行4周的监测。在治疗和监测期间，分别在基线、2周、4周、6周、8周、10周和12周进行评估。主要的活性结果是评估治疗4周和8周的循环淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞以及hi CD49d T细胞的数量和安全性，包括注射部位反应、血小板变化、肝酶GGT-胆红素、CRP和白蛋白、A/G比值的变化。次要终点临床评估是测量力量、上肢功能、功能能力、生活质量和呼吸标志物，MRI评估肌肉纤维化、脂肪炎症水肿和萎缩以及药代动力学。探索性结果指标将包括血清/血浆生物标志物反应，例如与肌肉炎症、肌肉纤维化、肌肉凋亡/退化和肌肉再生(包括细胞因子)以及蛋白质组学和单核细胞RNA阵列和外泌体RNA相关的那些。

实施例4

抑制性寡核苷酸的低剂量给药

在一个实施方案中，9名10-18岁，体重25-60kg的不能行走的DMD患者以每周一次25mg的起始剂量接受ATL1102，持续24周。治疗24周后，进行8周的监测。在治疗和监测期间，在基线、在治疗期间每2周和在治疗后监测期间每4周进行评估。主要的活性结果是评估治疗4周和8周的循环淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞以及hi CD49d T细胞的数量和安全性，包括注射部位反应、血小板变化、肝酶GGT-胆红素、CRP和白蛋白、A/G比值的变化。临床评估的次要终点是测量力量、由myoset测量的上肢功能、PUL-2(DMD2.0上肢模块的性能)测量的功能能力、生活质量、呼吸标志物以及MRI评估肌肉纤维化、脂肪炎症-水肿、萎缩和药代动力学。探索性结果指标将包括血清/血浆生物标志物反应，例如与肌肉炎症、肌肉纤维化、肌肉凋亡/退化和肌肉再生(包括细胞因子，其中一种或多种可能是肌肉损伤的标志物)以及蛋白质组学和单核细胞RNA阵列和潜在的外泌体RNA相关的那些。

实施例5

结果

对一名13岁，体重62kg的不能行走的受试对象施用低剂量25mg/周的ATL1102，施用30mg日剂量的皮质类固醇(CS)Deflazacort(0.48mg/kg/天)，持续12周。ATL1102有效地降低了患者每日服用CS前基线(第1周)每微升循环CD8+细胞和CD8+细胞高水平表达CD49d的细胞数，降低了生化探索性标志物测量的肌肉损伤标志物、myoset测量的肌力以及PUL-2测量的重要功能。该受试对象在大约2.5年前丧失行走能力，并且在能行走时使用约50％的标准护理，0.90mg/kg/天剂量的Deflazacort治疗患有DMD的受试对象。当能行走时，DMD中用作标准护理的等效泼尼松龙剂量是0.75mg/kg/天。

免疫细胞

通过流式细胞术和血液学测量ATL1102在基线(第1周)、第5周(ATL1103服药后3天)、第8周和第12周(第8周和第12周服药后7天)对免疫细胞的影响。ATL1102对CD8+细胞的影响与在多发性硬化(MS)中较高ATL1102的先前经验相比是相对选择性的(Limroth等人，2014)。这些效果也比之前在MS研究中测量的服药后3天更长，其中ATL1102服药后7天首次显示出效果。在此剂量下某些免疫细胞不受影响并且评估时间指示ATL1102效果在此低剂量下是相对更特异性的。例如，在MS研究中，使用ATL1102在较高剂量下观察到的中性粒细胞或血小板没有显着降低(Limmroth等人)。

Myoset-肌力数据

这一受试对象1的Myoset初步数据表明，与基线相比，在服药12周后，他的主手的肌力有所下降，但拇指的力量没有下降(以myopinch测量)，12周后，与基线相比，当轻叩次数相同时，通过moviplate确定的手指力量也没有减少。另一方面的数据表明，与基线相比，在第12周，手或手指的力量没有损失，并且拇指的力量在数值上更高。Ricotti等人(2016)观察了15名患者(14名接受CS治疗)，CS和myoset治疗12周或更长时间，观察到与基线相比，myogrip平均趋势减少0.22kg，myopinch减少0.1kg，moviplate增加。

PUL-2-功能数据

DMD的PUL-2是用于测量上肢功能的PUL-1的更新版本。PUL-2测量较高水平的肩关节功能，最大评分为12，中度肘关节功能，最大评分为17，远端腕关节和手功能，最大评分为13。入组评分为3到6分意味着(6分为最高分，1分为最低分)，表示可以对受试对象的肩部功能进行评估。受试对象1的入组水平功能为5，记录的测量表明他已经服药超过12周，在基线和12周时评分为8，肩部功能没有受损。受试对象1在第12周获得了中位肘关节功能，评分为14分，而在基线时为13分；在第12周获得了远端手腕和手的功能，评分为12分，而在基线时为10分。与基线相比，服药12周时，PUL-2评分为34分，而基线为31分。患者入组评分也从基线水平5增加到与记录的PUL-2结果一致的水平6。

ATL1102附加疗法可以帮助保持myoset测量的肌肉力量，如果不能改善受试对象的功能，似乎可以维持PUL-2测量的功能。ATL1102疗法可因此减缓疾病进展。

结果验证了CD49d(VLA-4α链)反义核酸和ATL1102特异性治疗DMD患者的用途，以及单用或联合CS治疗延缓肌营养不良疾病进展。

肌肉损伤的探索性药效学结局指标

肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)是患有DMD的男孩的肌肉损伤的指标，主要与肌营养不良蛋白水平低或没有肌营养不良蛋白和收缩时对肌肉的损伤有关，其次与炎性和其他对肌肉的下游损伤有关。肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)是年轻的能行走的DMD患者的肌肉损伤的指标，他们与不能行走的患者相比具有更多的肌肉量和炎症。

尽管如此，还是收集了血液和血清样本，以调查受试对象1肌肉损伤标志物的变化。在受试对象1中，与基线和第5周相比，CK、ALT、AST、LDH在第8周和第12周降低。与4606/5358、265/250、116/134和564/498的第8/12周水平相比，CK、ALT、AST、LDH的基线/第5周水平(单位/升)分别在5860/6881、304/404、未测试/184和632/681。LDH水平从被认为高的水平下降到正常范围内。这表明与肌营养不良蛋白缺失或炎症或其他损伤相关的肌肉损伤迹象在该不能行走的患者中已经减少。

本领域技术人员已知包括许多修饰。

参考文献

Altschul等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)(1990)215:403-410

Ausubel等人，(编)《分子生物学最新方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，增刊47，John Wiley&Sons，New York，1999

Colowick和Kaplan，编，《酶学方法》(Methods In Enzymology)，Academic Press，Inc.

Elbashir等人，《自然》(Nature)(2001a)411:494-498

Elbashir等人，《基因与发育》(Genes Dev.)(2001b)15:188-200

Englisch等人，《应用化学》(Angewandte Chemie)，国际版(1991)30:613

Fire等人，《自然》(Nature)(1998)391:806-811

Grounds MD，《细胞和分子生命科学》(Cell.Mol.Life.Sci.)2008

Guo和Kempheus，《细胞》(Cell)(1995)81:611-620

Limmroth等人，美国神经学会(Americal Academy of Neurology)83 2014年11月11日

Montgomery等人，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)(1998)95:15502-15507

Nielsen等人，《科学》(Science)(1991)254，1497-1500

《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第18版，MackEaston，Pa.(1990)，

Ricotti V,等人，(2016)杜兴型肌营养不良症的上肢评估：MRI定量脂肪水，肌肉力量和功能定义临床试验的终点。(Upper Limb Evaluation in Duchenne MuscularDystrophy:Fat-Water Quantification by MRI，Muscle Force and Function DefineEndpoints for Clinical Trials.)《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)11(9):e0162542.doi:10.1371/journal.

Rosenberg AS，Puig M，Nagaraju K,等人，杜兴型肌营养不良症的免疫介导病理学(Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.)《科学转化医学》(Sci Transl Med)2015，7:299rv4.

Tabara等人，《科学》(Science)(1998)282:430-431

Tijsterman等人，《科学》(Science)(2002)295:694-697

Timmons和Fire，《自然》(Nature)(1998)395:854

Tuschl等人，《基因与发育》(Genes Dev.)(1999)13:3191-3197

Wan等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)42(22):13456-13468，2014

Weir和Blackwell，编，《实验免疫学手册》(Handbook of ExperimentalImmunology)，I-IV卷，Blackwell Scientific Publications，1986

Zhang和Madden，《基因组研究》(Genome Res.)(1997)7:649-656

J.I.Kroschwitz(编)，《高分子科学与工程学简明百科全书》(The ConciseEncyclopaedia of Polymer Science and Engineering)，858-859页，John Wiley andSons(1990)

S.Sanghvi，第15章：反义的研究与应用(Chapter 15:Antisense Research andApplications)，289-302页，S.T.Crooke，B.Lebleu(编)，CRC Press，1993。

序列表

<110> 反义治疗有限公司

<120> 治疗用途和方法

<130> 524449PCT

<150> AU2018901531

<151> 2015-05-04

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (1)..(1)

<220>

<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (1)..(3)

<220>

<221> 甲基尿嘧啶

<222> (2)..(2)

<220>

<221> 2'脱氧核糖核苷

<222> (4)..(13)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (7)..(7)

<220>

<221> 甲基尿嘧啶

<222> (13)..(13)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (14)..(14)

<220>

<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (14)..(20)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (15)..(15)

<220>

<221> 甲基尿嘧啶

<222> (17)..(17)

<220>

<221> 甲基尿嘧啶

<222> (18)..(18)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (19)..(19)

<220>

<221> 甲基尿嘧啶

<222> (20)..(20)

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<220>

<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (1)..(5)

<220>

<221> 2'脱氧核糖核苷

<222> (6)..(15)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (9)..(9)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (10)..(10)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (12)..(12)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (13)..(13)

<220>

<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (16)..(20)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (18)..(18)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (19)..(19)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (20)..(20)

<400> 2

atatttttcc acctgtgccc 20

Claims (17)

1.一种治疗有需要的受试对象的肌营养不良症的方法，所述方法包括周期性地向所述受试对象施用药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体(carrier)和治疗有效量的包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)所述寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自所述5'端起1-3位的所述核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自所述5'端起4-12位的所述核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自所述5'端起13-20位的所述核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐，持续时间和条件足以改善受试对象的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试对象的肌营养不良症的进展。

2.一种用于在患有肌营养不良症的受试对象中改善肌肉功能或延迟肌肉功能衰退的方法，所述方法包括周期性地向所述受试对象施用药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体(carrier)和治疗有效量的包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)所述寡核苷酸的19个核苷酸键中的每一个是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自所述5'端起1-3位的所述核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；

c)自所述5'端起4-12位的所述核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自所述5'端起13-20位的所述核苷酸为2'-O-(2-甲氧乙基)修饰的核糖核苷；并且

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体，持续时间和条件足以在受试对象中改善肌营养不良肌纤维的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症的进展。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述周期性给药是每周或每两周或每月一次或两次或三次。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述治疗有效量是10mg至300mg。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述治疗有效量是选自以下各项组成的组：25mg至50mg、50mg至100mg、100mg至200mg以及150mg至300mg。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸是钠盐或钾盐。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述药物载体(carrier)是WFI并且将所述组合物调节至pH 7.2-7.6。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述MD选自由以下各项组成的组：杜兴型肌营养不良症(DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症)、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端型肌营养不良。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述MD涉及所述肌营养不良蛋白基因中的突变。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述受试对象被诊断为患有MD并且是能行走的或不能行走的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述受试对象是10岁或更大的少年或青春期男孩。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述组合物经皮下施用。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，给药是与皮质类固醇治疗联用。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，皮质类固醇以低剂量施用。

15.一种治疗有需要的受试对象的肌营养不良症的方法，所述方法包括周期性地向所述受试对象施用治疗有效量的人CD49d的抑制性寡核苷酸，以改善受试对象的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症的进展。

16.人CD49d的抑制性寡核苷酸在所述制备用于在患有肌营养不良症的受试对象中改善肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟肌营养不良症进展的药物中的用途。

17.一种包括针对人CD49d的抑制性寡核苷酸的药物组合物，其用于治疗受试对象的杜兴型肌营养不良或延迟受试对象的杜兴型肌营养不良的进展。