CN112342018A

CN112342018A - 一种化合物aps5-cqd及其制备方法、化学发光底物液

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Publication number: CN112342018A
Application number: CN202011162362.2A
Authority: CN
Inventors: 王铎; 来祥兵; 李重阳; 舒芹; 张雪娇
Original assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Current assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-10-27
Also published as: CN112342018B

Abstract

本发明公开了一种化合物APS5‑CQD及其制备方法、化学发光底物液，所述化合物APS5‑CQD的结构通式如下式I：式中，n＝3～5，R基团为碳量子点。所述制备方法包括：获得如式II所示的化合物IV；将所述化合物IV与羧基荧光碳量子点在缩合剂作用下进行接枝反应，获得化合物APS5‑CQD；所述化学发光底物液的配方为：Tris 10～300mM，SDS 0.01～1.0％，APS5‑CQD 20～1000mg/L，Tween20 0.01％～0.1％，pH 8.5～10；本发明将APS‑5接枝到碳量子点上形成增强型化学发光底物APS5‑CQD，增强了底物的发光性能及长期稳定性、简化了配置过程。

Description

一种化合物APS5-CQD及其制备方法、化学发光底物液

技术领域

本发明涉及化学发光免疫技术领域，特别涉及一种化合物APS5-CQD及其制备方法、化学发光底物液。

背景技术

化学发光免疫分析技术作为一种非放射性免疫分析技术，在酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析和荧光免疫分析技术之后在世界范围内得到了迅速发展。

发光底物是化学发光免疫系统重要基础试剂之一，底物性能直接影响检测系统的分析灵敏度、精密度和稳定性等指标，是决定分析系统质量高低的重要因素。目前，在化学发光免疫测定中被用作发光物质的有鲁米洛、异鲁米诺、吖啶酯、1.2-二氧杂环类和吖啶酮类。其中吖啶酮类是具有高灵敏度的碱性磷酸酶(ALP)底物。当它们在适当的缓冲区中与ALP 接触时会被水解并提供强大的光学信号。目前吖啶酮类代表性的化合物为APS-5((4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)。APS-5是一种本底低的一种化学底物。但由于该有机化学物质本身发光效率低，水溶液中稳定性差，因此在配置化学底物工作液的过程中需要各种的抗氧化剂、稳定剂、发光增强剂等组分，配置过程复杂。

因此，如何开发一种发光效率低，水溶液中稳定性好，发光底物工作液配制简单的化合物APS5-CQD及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种化合物APS5-CQD及其制备方法、化学发光底物液，本发明将 APS-5接枝到碳量子点上，形成一种增强型化学发光底物APS5-CQD，增强了底物的发光性能及长期稳定性、优化了化学发光底物工作液、简化了配置过程。

在本发明的第一方面，提供一种化合物APS5-CQD，所述化合物APS5-CQD的结构通式如下：

式中，n＝3～5，R基团为碳量子点。

在本发明的第二方面，提供一种所述化合物APS5-CQD的制备方法，所述方法包括：

获得化合物IV；

将所述化合物IV与羧基荧光碳量子点在缩合剂作用下进行接枝反应，获得化合物APS5-CQD；

其中，所述化合物IV的结构式如下所示：

进一步地，所述缩合剂为DCC。

进一步地，所述接枝反应前，先将所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点溶解于THF 溶液中，后加入缩合剂进行接枝反应。

进一步地，所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点的质量比为(0.5～1)：(3～4)。

进一步地，所述获得化合物IV，所述n＝4时，具体包括：

获得化合物I；

将所述化合物I与4-溴丁腈在有机溶剂A和催化剂A下进行第一反应，获得化合物II；

将所述化合物II与3-羟基丙腈、POCl₃在有机溶剂B和催化剂B下进行第二反应，后于碱性且无氧条件下搅拌，获得化合物III；

将所述化合物III与NaBH₄在有机溶剂C和催化剂C下进行第三反应，获得化合物IV；所述化合物I、所述化合物II、所述化合物III的结构式和反应式如下：

进一步地，所述获得化合物I，包括：

将4-氯苯硫溶解于CH₂Cl₂溶液中，将9-吖啶甲酰氯溶解于吡啶溶液中，在室温下氩气保护中搅拌，后固液分离和洗涤，获得微褐黄色固体；

将所述微褐黄色固体溶解于CH₂Cl₂溶液中，在室温氩气的保护下加入锌粉和醋酸反应，后固液分离和洗涤，获得化合物I。

进一步地，所述有机溶剂A为氢氧化钠溶液，所述催化剂A为四丁基溴化铵；所述有机溶剂B为四氢呋喃溶液，所述催化剂B为LDA和吡啶；所述有机溶剂C为四氢呋喃溶液，所述催化剂C为InCl₃溶液。

进一步地，所述第一反应、所述第二反应、所述第三反应均在室温氩气的保护下进行。

在本发明的第三方面，提供了一种化学发光底物液，所述化学发光底物液的配方为： Tris 10～300mM，SDS 0.01～1.0％，APS5-CQD 20～1000mg/L，Tween20 0.01％～0.1％，pH 8.5～10。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一种化合物APS5-CQD及其制备方法，将APS-5接枝到碳量子点上，形成一种增强型化学发光底物APS5-CQD，增强了底物的发光性能及长期稳定性、优化了化学发光底物工作液、简化了配置过程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种化合物APS5-CQD的制备方法的流程图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种化合物APS5-CQD，所述化合物APS5-CQD 的结构通式如下：

式中，n＝3～5，R基团为碳量子点。

作为优选的实施方式，n＝4，具体地，所述化合物APS5-CQD的结构通式如下：

式中，R基团为烷基。

碳量子点是一种新型发光物质，具有较高的荧光量子产率，可与化学发光底物形成共振能量转移而增强化学发光底物的发光效率，同时，碳量子点有丰富官能团，可对化学发光底物起保护作用，增强化学发光底物的稳定性。本发明提供的一种化合物APS5-CQD及其制备方法，将APS-5接枝到碳量子点上，形成一种增强型化学发光底物APS5-CQD，增强了底物的发光性能及长期稳定性、优化了化学发光底物工作液、简化了配置过程。

APS-5的结构式如下所示：

APS-5中N连接的是CH₃，结构式比对可看出本发明的化合物IV中N连接的是C₄H₈NH₂

本发明的化合物APS5-CQD由化合物IV中氨基-NH₂与羧基荧光碳量子点上的羧基-COOH发生缩合反应而得，之所以采用化合物IV(化合物IV中N连接的是C₄H₈NH₂)而没有采用APS-5上的碳链CH₃直接与羧基荧光碳量子点相连接，是因为：

本发明申请人发现：选用本发明的N连接的3～5个碳的化合物IV与羧基荧光碳量子点连接，可使得副反应少；所以，所述式中，n＝3～5；当n＝4时连接效果最好。若碳链过长即n大于5，副反应会增多；若碳链过短，即n小于3，在与碳量子点连接的过程中受空间位阻的影响，大大降低了连接效率。

根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种化合物APS5-CQD的制备方法，如图1所示，所述方法包括：

S1、获得化合物IV；

S2、将所述化合物IV与羧基荧光碳量子点在缩合剂作用下进行接枝反应，获得化合物 APS5-CQD；

其中，所述化合物IV的结构式如下所示：

作为优选的实施方式，

所述步骤S1中，所述获得化合物IV，所述n＝4时，具体包括：

S101、获得化合物I；

S102、将所述化合物I与4-溴丁腈在有机溶剂A和催化剂A下进行第一反应，获得化合物II；

S103、将所述化合物II与3-羟基丙腈、POCl₃在有机溶剂B和催化剂B下进行第二反应，后于碱性且无氧条件下搅拌，获得化合物III；

S104、将所述化合物III与NaBH₄在有机溶剂C和催化剂C下进行第三反应，获得化合物IV；

所述化合物I、所述化合物II、所述化合物III的结构式和反应式如下：

所述步骤S101中，所述获得化合物I，包括：

在其他实施方式中，所述步骤S101中，化合物I反应得到化合物II中间的试剂可以用 3-溴丙腈、4-溴丁腈、5-溴戊腈；

所述步骤S102-S104中，所述有机溶剂A为氢氧化钠溶液，所述催化剂A为四丁基溴化铵；所述有机溶剂B为四氢呋喃溶液，所述催化剂B为LDA和吡啶；所述有机溶剂C 为四氢呋喃溶液，所述催化剂C为InCl₃溶液。

所述第一反应、所述第二反应、所述第三反应均在室温氩气的保护下进行。

所述步骤S1中，所述获得化合物IV，所述n＝3或5时，可参照上述n＝4时的方法，不同的是，具体参数反应条件略有不同，可根据需要进行探索。

作为优选的实施方式，所述步骤S2中，

所述缩合剂为DCC。

所述接枝反应前，先将所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点溶解于THF溶液中，后加入缩合剂进行接枝反应。

所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点的质量比为(0.5～1)：(3～4)。所述比值碳量子点接上的化合物IV趋于饱和，导致化合物IV的浪费。过小会导致单位质量发光物质含有可被碱性磷酸酶催化的基团少，化学发光效率低。

根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种化学发光底物液，所述化学发光底物液的配方为：Tris 10～300mM，SDS 0.01～1.0％，APS5-CQD 20～1000mg/L，Tween200.01％～0.1％，pH 8.5～10。

表1-化学发光底物液APS5-CQD工作液配置表

该化学发光底物工作液配制简单，容易操作。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种化合物APS5-CQD进行详细说明。

本发明实施例和对比例中所用的实验材料包括：

关键化学试剂：4-氯苯硫酚(CAS:106-54-7)；9-吖啶甲酰氯(CAS:66074-67-7)；4-溴丁腈(CAS:5332-06-9)；二异丙基氨基锂(LDA，CAS：4111-54-0)；3-羟基丙腈(CAS： 109-78-4)。

实施例1

1、本发明实施例提供的化合物APS5-CQD，所述化合物APS5-CQD的制备方法包括如下步骤：

(1)将4-氯苯硫酚(7.43g)和9-吖啶甲酰氯(10.85g)分别溶于100mL CH₂Cl₂和12.1mL 吡啶中。在室温下氩气保护中搅拌过夜，待溶剂蒸发后，用100mL的己烷对固体洗涤，过滤，重复2次，然后用50mL的超纯水洗涤并过滤，重复3次，风干。得到13.41g微褐黄色固体。

(2)将(1)得到的产物(5.0g)溶于100mL的CH₂Cl₂中。在室温氩气的保护下加入9.3g锌粉，0.9mL醋酸。搅拌反应20分钟，过滤，用100mL的己烷对固体洗涤，过滤，重复2 次，然后用50mL的超纯水洗涤并过滤，重复3次，风干。

(3)将(2)得到的产物(4.0g)溶解于60mL 50％氢氧化钠溶液中，在室温氩气的保护下加入4-溴丁腈5.14g，0.8g四丁基溴化铵。再加入20mL甲苯，将混合物加热回流12h，用60mL乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和氯化钠洗涤后，以无水Na₂SO₄干燥。接着以二氯甲烷作为洗脱剂进行硅胶色谱柱纯化，得到纯产物(2.4g)。

(4)将(3)得到的产物(2.0g)溶解于30mL无水四氢呋喃中，在室温氩气的保护下缓慢滴加到1.8mL LDA到溶液中，在干冰浴搅拌60min。向其中缓慢滴加以12mL THF稀释，含1.55g POCl₃和4.56mL吡啶的预稀释液。在干冰浴搅拌30min。接着向其中加入3- 羟基丙腈(2.67g)和3.0mL吡啶。室温氩氛搅拌过夜，用四氢呋喃洗涤沉淀。将得到的滤液真空蒸发，得到的物质溶解于乙酸乙酯中，用25mL水洗涤4次。然后对乙酸乙酯溶液进行干燥浓缩。采用柱层析法纯化。

(5)将(4)的产物(1.2g)加入到10mL丙酮中。加入1mL 2M NaOH。氩氛保护室温搅拌过夜。所形成的沉淀物经抽吸过滤并风干。

(6)将(5)产物(1.0g)加入到20mL THF中，在室温氩气的保护下向其中缓慢滴加以10mL THF稀释，含0.3g NaBH4和0.65g InCl₃的预稀释液。30min后。采用柱层析法纯化。

(7)将带羧基的碳量子点(3.5g)和(6)得到的产物(0.7g)加入到25mL THF，向其中加入5mL 0.2g DCC(THF溶)，室温搅拌反应1h，以10mLTHF洗涤沉淀，风干。得到 APS5-CQD化合物4.0g。

本实施例中的具体合成路线如下所示：

2、化学发光底物液的配置

按照表2配置得到1L化学发光底物液。

表2-化学发光底物液APS5-CQD工作液配置表

对比例1

1、本发明对比例的发光底物为化合物APS-5；

2、化学发光底物液的配置：按照表2配置得到1L化学发光底物液。

对比例2

1、本发明对比例的发光底物为化合物APS-5；

2、化学发光底物液的配置：按照表3配置得到1L化学发光底物液。

表3-化学发光底物液APS5工作液配置表

实验例1

对所述实施例和对比例得到的化学发光底物液进行评价：

1、发光强度与ALP的线性关系检测

(1)取一份50000pg/mL的ALP溶液，将该ALP溶液用酶稀释液(所述酶稀释液的配方乳表4所示)进行5倍稀释。稀释6次的到包含0浓度在内的8个浓度点。分别取不同浓度的ALP溶液10uL加入试管底部，然后加入300uL底物，涡旋混匀后，立即加载到 TURNERBIOSYSTEMS公司的MODULUS发光检测仪的发光检测器检测位，检测得到发光强度。分析不同实施例1、对比例1、对比例2底物的发光强度与ALP浓度的关系。

表4：酶稀释液配置表

(2)不同底物发光强度与ALP的线性关系的结果如表5所示。

表5：不同底物发光强度与ALP的线性关系

由表5的数据可知，对比例1与实施例1对比，ALP同浓度情况下，发光值远低于实施例1，这是由于APS5-CQD粒子中，已有QDS作为APS-5结构的荧光增强剂。同时，对比例2与实施例1对比，ALP同浓度情况下，实施例1发光值依然较对比例2高越1.6倍，这是由于，QDS是通过化学键与改性APS-5结构结合，使共振能量转移作用更强。且QDS 较光泽精荧光量子产率更高，更适合作为荧光增强剂。

2、底物稳定性检测

(1)将实施例1、对比例1、对比例2底物，分别以每瓶100mL分装，在25℃放置，分别在第1、3、7、14、30天测试。以2ng/mL的ALP检测不同底物发光值，每种重复检测3次，计算平均值。

(2)发光底物稳定性检测结果如表6所示：

表6：底物稳定性

由以上数据实施例1对比对比例1及对比例2可以看出，实施例1在30天降幅为 -5.90％；对比例1和对比例2在30天加速分别是-11.90％和-12.30％。

综上所述，本发明提供的一种化合物APS5-CQD及其制备方法，增强了底物的发光性能及稳定性、优化了化学发光底物工作液、简化了配置过程。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种化合物APS5-CQD，其特征在于，所述化合物APS5-CQD的结构通式如下：

式中，n＝3～5，R基团为碳量子点。

2.根据权利要求1所述的一种化合物APS5-CQD，其特征在于，所述n＝4。

3.一种权利要求1-2任一所述化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

获得化合物IV；

其中，所述化合物IV的结构式如下所示：

式中，n＝3～5。

4.根据权利要求3所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为DCC。

5.根据权利要求3所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述接枝反应前，先将所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点溶解于THF溶液中，后加入缩合剂进行接枝反应。

6.根据权利要求3所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述化合物IV与所述羧基荧光碳量子点的质量比为(0.5～1)：(3～4)。

7.根据权利要求3所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述获得化合物IV，所述n＝4时，具体包括：

获得化合物I；

将所述化合物III与NaBH₄在有机溶剂C和催化剂C下进行第三反应，获得化合物IV；

8.根据权利要求7所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述获得化合物I，包括：

9.根据权利要求7所述的一种化合物APS5-CQD的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂A为氢氧化钠溶液，所述催化剂A为四丁基溴化铵；所述有机溶剂B为四氢呋喃溶液，所述催化剂B为LDA和吡啶；所述有机溶剂C为四氢呋喃溶液，所述催化剂C为InCl₃溶液。

10.一种化学发光底物液，其特征在于，所述化学发光底物液的配方为：Tris 10～300mM，SDS 0.01～1.0％，APS5-CQD 20～1000mg/L，Tween20 0.01％～0.1％，pH 8.5～10。