CN112322615B - 核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法。该核酸保存液包括抗凝剂和保护剂，保护剂由咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、聚乙二醇和丙三醇组成。本发明核酸保存液能延长血液样本的离体保存时间，在6‑35℃可稳定保存血液样本中cfDNA长达1个月，适用于常温长距离运输。同时能够避免血液样本出现溶血问题，且不需要繁琐的两步法分离血浆，能方便快速获得高质量的核酸。

Description

核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法。

背景技术

为了保证采集到真空采血管内血液样本能够满足预定的临床检验要求，需要在采血管内添加适于血液保存或能与血样反应的试剂，按添加剂的类别划分，主要分为促凝剂和抗凝剂两大类。随着核酸检测技术的飞速发展，血液样本中游离DNA\RNA、基因组DNA\RNA及单细胞的保存、分离、检测和分析，在遗传性及原发性疾病筛查与辅助诊断中是一个新兴且可靠的领域。基于临床对以上检验用途血液样本的特殊保存需要(不同保存时间及异地分离检测)，现有惯用的采血管添加剂(如促凝剂及抗凝剂)已不能满足需要，额外加入不同功能的血液样本保存液，能实现血液样本的离体长期保存及异地高质量血浆样本的分离与检测。

具备血浆cfDNA提取、下游基因扩增及测序分析检测资质的医院，会使用常规抗凝管进行血样采集与血浆分离，但抗凝管采集的血样要即刻进入后续分析以防cfDNA降解及天然样本状态的改变。常规抗凝管采集的血液样本必须在2-8℃环境温度下保存、6小时内完成血浆的分离，以保证血浆质量。而对于大样本量地区和多数不具备以上检测资质的医院，常规抗凝管已不能满足血液保存需要。而且，使用常规抗凝管进行血液样本采集，经常会出现溶血，血浆颜色由黄色变为橙色或红色，溶血的出现严重影响了样本的正常检测，需要重新采血，对于与采血时间密切相关的血液样本往往因为样本不合格而错过了最佳检测时间。现有技术虽然能稳定外周血有核细胞，但未对无核红细胞进行有效的保护，不能避免血样溶血的发生。另外，现有技术中，从采血管分离血浆需要经过两步离心操作，即使用高速冷冻离心机以4℃、1600g、离心10min后小心吸取上层血浆，再次将上层血浆以4℃、16000g、离心10min去除血细胞，获得的血浆才能满足下游提取cfDNA的要求。实验人员由于离心效果的控制不同、血浆抽吸操作的差异，现有技术不能保证获得高质量的血浆和cfDNA，进而直接影响下游检测。

多数医院开始使用添加cfDNA保存液的cfDNA保存管进行血液样本的采集与运输，专利CN106244535B通过在采血管内部添加cfDNA保存液，来实现孕妇外周血中胎儿cfDNA的稳定保存，所述保存液配方如下：EDTA钾盐或EDTA钠盐作为抗凝剂，重氮咪唑烷基脲、NaF或40％的甲醛作为细胞稳定剂，分子生物级糖原作为代谢抑制剂，二硫苏糖醇(DTT)作为DNA酶抑制剂，同时添加Tris-Cl缓冲液。通过以上添加剂与血液混合后，能稳定保存cfDNA 7天。

专利CN108823286A使用保护剂组合物咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸三钾二水合物及甘氨酸，在常温条件下能稳定储存游离DNA 7天，该专利保护剂组合物与已公开的保护剂(加拿大专利CA2690651C；欧洲专利EP2228453B1及EP2814981A2；美国专利US20140080112A1；)组成完全相同。

专利CN103789202A公开了保存核酸的添加剂，组成为抗凝剂及缓冲液(EDTAK2/EDTAK3)、防腐固定剂(双咪唑烷基脲/二羟甲基脲)、核酸酶抑制剂(金精三羧酸)、代谢抑制剂(甘油醛)及细胞膜稳定剂(甘氨酸/天冬氨酸)的五组分组合物，可在常温条件下保存血液样本7天。

专利CN109321523A公开了一种血液添加剂，其组分为抗凝剂(乙二胺四乙酸二钾)、核酸酶抑制剂(尿素)、细胞稳定剂(聚乙烯醇1788)、嘌呤、代谢抑制剂(甘油醛)、凋亡抑制剂(Q-VD-OPh)、核酸保护剂(甘氨酸/精胺)、非Cl^-缓冲液(MOPS缓冲液/磷酸盐缓冲液)的八组分组合物，可在常温条件下保存血液样本14天。

因此，现有技术中仍然存在保存cfDNA时间短、获得的cfDNA浓度低、无法避免采集的血样发生溶血、操作繁琐、配方多组分功能重复而保存效果不理想等技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法。该核酸保存液能延长血液样本的离体保存时间，血液样本不会出现溶血，不需要繁琐的两步法分离血浆，能方便快速获得高浓度、高纯度的核酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种核酸保存液，包括抗凝剂和保护剂，保护剂由咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、聚乙二醇和丙三醇组成；以重量份计，各组分用量为：

作为优选，以重量份计，各组分用量为：

优选地，以重量份计，各组分用量为：

作为优选，抗凝剂为EDTA钾盐、EDTA钠盐或枸橼酸钠盐中的一种或几种。

优选地，抗凝剂为EDTA钾盐。

本发明还提供了一种核酸提取保存液，包括核酸吸附材料和上述核酸保存液。

作为优选，核酸吸附材料为聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物。

作为优选，聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物中，磁珠与聚乙二醇水凝胶的比表面积比为(3～8)：(7～25)。

优选地，聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物中，磁珠与聚乙二醇水凝胶的比表面积比为7：23。

作为优选，聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物在核酸提取保存液中的体积百分含量为66.7％～75.8％。

优选地，聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物在核酸提取保存液中的体积百分含量为69％。

本发明还提供了一种采血管，包括安全帽、胶塞、管体及管内的添加物，添加物为上述核酸保存液或上述核酸提取保存液。

作为优选，采血管内为真空。

本发明还提供了一种提取核酸的方法，包括如下步骤：

将磁棒置于保存有核酸的核酸提取保存液内静置15～25s，得到吸附有水凝胶/纳米粒子复合物的磁棒；核酸提取保存液为上述核酸提取保存液；

随后将水凝胶/纳米粒子复合物转移至容器内，在37℃条件下，采用胶原蛋白水解酶处理水凝胶/纳米粒子复合物5～10min，得到粗提液；

对粗提掖进行纯化、洗脱，得到核酸。

在本发明中，核酸为游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)、核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)、循环游离RNA(circulating cell-free RNA，cfRNA)中的一种。

本发明提供了核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法。该核酸保存液包括抗凝剂和保护剂，保护剂由咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、聚乙二醇和丙三醇组成；以重量份计，各组分用量为：抗凝剂5～20份，咪唑烷基脲30～50份，对羟基苯甲酸甲酯1～10份，聚乙二醇10～40份，丙三醇10～30份。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明采血管内添加的核酸保存液能延长血液样本的离体保存时间，在6-35℃可稳定保存血液样本中cfDNA长达1个月，适用于常温长距离运输。对于大样本量和不具备血浆分离条件的地区具有重要的意义。

2、本发明的采血管内添加的核酸保存液为多组分构成的组合物，能抑制血细胞破裂释放血红蛋白，相比普通抗凝采血管，采集到本发明采血管内的血液样本不出现溶血，极大的提高了血液样本的合格率，能减少反复采血造成的患者心理负担并能有效避免错过最佳采血时间。

3、本发明采血管内添加的核酸吸附材料能特异性结合cfDNA，不需要繁琐的两步法分离血浆，能方便快速获得高浓度、高纯度、高质量的cfDNA。

附图说明

图1对照组及优选组游离核酸保存效果。

具体实施方式

本发明公开了核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)或循环游离核酸(circulating cell freenucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA，即释放到血浆中的降解的DNA片段。

磁珠法核酸提取原理：

运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。

以下具体实施方式，仅为本发明用于cfDNA保存的具体实施方式，并不用于限定本发明的保护范围，对于除血液外其它体液样本、附着体液的组织样本以及各类型样本中核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)、循环游离RNA(circulating cell-free RNA，cfRNA)的保存，都为本发明的应用范围。

本发明提供的核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法中所用材料、试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例提供了一种核酸保存液、核酸吸附材料及其构成的真空采血管，所述的真空采血管包括安全帽、胶塞、管体及管内的核酸保存液和吸附材料。

其中，对于核酸保存液的配方，本实施例仅列出部分对照组及优选组，其具体配方详见表1。

表1部分对照组及优选组制备方法

优选组制备方法：定量称取7重量份EDTA-2K完全溶解于70mL无酶水中至溶液澄清，再依次加入36重量份咪唑烷基脲、18重量份聚乙二醇匀速搅拌溶解，随后将12重量份丙三醇按20～30滴/分的速度缓慢滴加入上述混合液中，最后加入6重量份对羟基苯甲酸甲酯、匀速搅拌5-15分钟，直至溶液无目视可见的溶质颗粒或液滴，用无酶水定容至100mL即为核酸保存液。将上述保存液160μL加注到采血管内，使用真空加胶机将占保存液体积百分含量为69％的水凝胶/纳米粒子复合物(磁珠与聚乙二醇水凝胶的比表面积比为7：23)加入到采血管内，胶塞安全帽组装、抽真空、包装、灭菌即得。

实施例2

核酸提取方法为：

取出采用实施例1优选组保存液保存有cfDNA的采血管；

将磁棒移入采血管内静置15～25s，得到吸附有水凝胶/纳米粒子复合物的磁棒；

随后将水凝胶/纳米粒子复合物转移至离心管内，在37℃条件下，用胶原蛋白水解酶处理该水凝胶5～10min，使水凝胶壳分离，释放磁性纳米粒子；

将离心管放置于磁力架上，静置1min～2min，吸去废液；

向离心管内加入洗涤缓冲液10mL，混匀后放于磁力架上，静置1min～2min直至溶液澄清，吸去废液；

向离心管内加入75％乙醇10mL，混匀后放于磁力架上，静置1min～2min直至溶液澄清，吸去废液；

向离心管内加入75％乙醇1mL，混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，室温静置1min，然后放于磁力架上，静置1min～2min直至溶液澄清，吸去废液；

加入50μL、55℃预热的TE缓冲液，混匀后55℃金属浴10min(每30s颠倒混匀一次)，将离心管放于磁力架上，静置1min～2min直至溶液澄清，收集溶液至新的离心管中，即为得到的游离核酸。

常规采血管如EDTA-2K抗凝管需要经过繁琐的两步法离心分离血浆，首先使用高速冷冻离心机以4℃、1600g、离心10min后小心吸取上层血浆，再次将上层血浆以4℃、16000g、离心10min去除血细胞，获得血浆才能用于提取cfDNA，实验操作人员的技术水平和熟练程度也会影响血浆的质量，从开始分离血浆到cfDNA提取结束需要1～3h。

本发明在采血管内添加了水凝胶/纳米粒子复合物，可以省去繁琐的二步法离心分离血浆操作，能避免离心造成的血细胞破裂基因组DNA的释放，并能有效减少游离核酸在采血管内残留而带来的产量损失。使用本发明采血管只需将磁棒移入采血管内静置15～25s，即可将超顺磁性纳米粒子粒径为200nm的水凝胶/纳米粒子复合物快速吸附到磁棒上，此聚乙二醇水凝胶为多孔性结构，其孔隙允许小分子核酸进入而大分子核酸及蛋白质无法进入，其独特的选择透过作用最终使其内部磁性纳米粒子特异性的吸附cfDNA。随后将水凝胶/纳米粒子复合物转移至离心管内，37℃用胶原蛋白水解酶处理该凝胶5～10min使水凝胶发生胶状和液体状态的转变，即可开始后续的cfDNA纯化与洗脱。纳米粒子表面涂覆的水凝胶为一种可刺激响应的聚乙二醇水凝胶。这种水凝胶在酶作用下会发生胶状和液体状态的可逆转变，进而导致水凝胶壳的分离，释放磁性纳米粒子。

本发明采血管无需进行血浆分离，大大缩短了血液样本从分离血浆到cfDNA提取的时间，整个cfDNA提取过程仅需要30～40min。

实施例3

对实施例1中优选组及不同对照组分别在第0、1、2、3、5、7、10、14天进行游离核酸的保存效果对比试验，步骤如下：

以人基因组DNA定量标准物质为模板，使用国家推荐标准《GBT38165-2019人体外周血中循环游离DNA浓度检测基于Alu序列实时荧光PCR法》中特异性引物分别扩增Alu序列(Alu sequence，Alu序列)中长度为115bp和219bp的片段；

琼脂糖电泳、切胶回收上述115bp和219bp两个片段，调整浓度使其分别为8.2×10⁹copies/μL和8.6×10⁹copies/μL；

在500mL小牛血清中分别加入上述浓度的两个片段各50μL充分摇匀，将其作为待测样本；

在实施例1优选组及各对照组中加入1mL上述待测样本，分别在第0、1、2、3、5、7、10、14天，将各组采血管缓慢上下颠倒混匀10次，进行核酸提取，对比优选组及不同对照组核酸保存效果的差异。

表2用于扩增Alu序列的引物序列

图1数据显示，优选组具有最优的游离核酸保存效果。

实施例4

本实施例提供一种用于cfDNA保存及检测的真空采血管，选取志愿者30人，使用实施例1中优选组采血管、一种商业化品牌cfDNA保存管(K管)和EDTA-2K常规抗凝管分别采集每人外周血5mL，25℃储存血液样本，并于采血后第0、1、3、5、7、10、14、28、35天观察样本溶血情况、进行外周血cfDNA提取与浓度检测。

cfDNA浓度检测依据国家推荐标准《GBT 38165-2019人体外周血中循环游离DNA浓度检测基于Alu序列实时荧光PCR法》，采用实时荧光PCR技术，使用特异性引物分别扩增Alu序列中长度为115bp和219bp的片段，计算Alu序列拷贝数来表示外周血中cfDNA浓度。

表3血液样本不同储存时间溶血情况

对比EDTA-2K常规抗凝管及K管，本发明优选组cfDNA保存管从采血当天到采血后第35天，所有血液样本均未发生溶血，表明本发明采血管能保护血细胞的完整性，防止血液样本溶血。

表4血液样本不同储存时间cfDNA浓度变化情况(ng/μL)

血液样本中cfDNA浓度随时间变化情况见表4，随着血液样本储存时间的延长，EDTA-2K抗凝管有核血细胞破裂基因组DNA释放，导致cfDNA浓度出现显著性升高；K管cfDNA浓度出现明显下降，cfDNA发生降解。

本发明优选组的血液样本在长达35天的储存期内，cfDNA浓度未发生明显变化。说明本发明采血管能长期稳定保护血液样本中cfDNA。

实施例5

本实施例提供一种用于孕妇外周血中胎儿cfDNA保存及检测的真空采血管，选取孕周在12～32周健康孕妇30人，使用实施例1优选组采血管和一种商业化品牌cfDNA保存管(K管)分别采集每人外周血各5mL，采血后常温异地运输5天，进行cfDNA提取与胎儿cfDNA浓度检测。结果如表5：

表5常温异地运输5天后孕妇外周血中胎儿cfDNA占母体总cfDNA浓度比

编号

1号

2号

3号

4号

5号

6号

7号

8号

9号

10号

优选组

12％

28％

15％

10％

26％

14％

16％

27％

16％

18％

K管

9％

25％

11％

7％

21％

10％

13％

22％

12％

15％

编号

11号

12号

13号

14号

15号

16号

17号

18号

19号

20号

优选组

11％

25％

20％

18％

14％

26％

22％

27％

17％

25％

K管

9％

21％

17％

15％

12％

22％

19％

23％

13％

21％

编号

21号

22号

23号

24号

25号

26号

27号

28号

29号

30号

优选组

21％

23％

16％

26％

21％

22％

19％

13％

28％

17％

K管

18％

18％

12％

21％

17％

18％

15％

9％

25％

15％

经过常温异地运输5天后，本发明采血管内孕妇外周血中胎儿cfDNA浓度均高于K管。可见，本发明采血管能稳定保存孕妇外周血中cfDNA，获得更高产率、高纯度的cfDNA。

实施例6

选取孕周在12～32周健康孕妇30人，使用实施例1优选组采血管和一种商业化品牌cfDNA保存管(K管)分别采集每人外周血各5mL，25℃放置35天，分别在采血后第0、7、14、28、35天QPCR检测胎儿SRY基因，比较K管与本发明优选组CT值变化情况。

表6用于扩增SRY基因的引物序列

表7孕妇外周血不同储存时间CT值变化情况

30名孕妇中，QPCR检测胎儿SRY基因，结果显示其中16名孕妇的胎儿为男胎，其有扩增曲线和CT值。

对比此16名孕妇35天及0天血液样本QPCR检测结果如表7所示，本发明优选组CT值变化在0.83～1.16之间，K管CT值变化在1.2～2.4之间，实验结果表明，本发明优选组具有优异的胎儿cfDNA保存效果，能延长血液样本的离体保存时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种核酸提取保存液，其特征在于，由核酸保存液和核酸吸附材料组成；所述核酸保存液由抗凝剂、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、聚乙二醇和丙三醇组成；以重量份计，所述核酸保存液中各组分用量为：

抗凝剂 7份

咪唑烷基脲 36份

对羟基苯甲酸甲酯 6份

聚乙二醇 18份

丙三醇 12份；

所述核酸吸附材料为聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物；

所述聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物中，磁珠与聚乙二醇水凝胶的比表面积比为7：23；

所述聚乙二醇水凝胶涂覆的磁性纳米粒子复合物在核酸提取保存液中的体积百分含量为69%；

所述抗凝剂为EDTA钾盐。

2.一种采血管，其特征在于，包括安全帽、胶塞、管体及管内的添加物，所述添加物为权利要求1所述核酸提取保存液。

3.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将磁棒置于保存有核酸的核酸提取保存液内静置15~25s，得到吸附有水凝胶/纳米粒子复合物的磁棒；所述核酸提取保存液为权利要求1所述核酸提取保存液；

随后将水凝胶/纳米粒子复合物转移至容器内，在37℃条件下，采用胶原蛋白水解酶处理水凝胶/纳米粒子复合物5~10min，得到粗提液；

对粗提液进行纯化、洗脱，得到核酸。

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