CN112301066B

CN112301066B - 发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112301066B
Application number: CN201910703517.XA
Authority: CN
Inventors: 周豪宏; 徐敏; 刘修才; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN112301066A

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用，本发明提供血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中应用，本发明还提供长链二元酸生产菌株，其具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性。通过导入血红蛋白基因，长链二元酸生产菌株的发酵生产性能显著提高，菌株的发酵液中羟基脂肪酸和脂肪酸等发酵副产物的含量显著下降，极大地提高了长链二元酸的提取纯化效率，降低了生产成本，为制备高纯度的长链二元酸产品及提高下游产品的质量提供了新方法。

Description

发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为单体原料，具有广泛的用途，如用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、润滑剂、塑化剂防腐剂以及香料等。长期以来，长链二元酸通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法自身具有诸多限制，例如得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，需要复杂的提取纯化步骤、且对环境不友好等。而微生物发酵法生产长链二元酸具有低污染、能够合成化学合成方法难以合成的产物(如12碳以上的长链二元酸)且纯度高等特点，因此，近年来化学合成法生产长链二元酸逐渐被微生物发酵法取代。

长链二元酸的微生物发酵法生产主要通过烷烃经ω-氧化生成，继而又可以经过β-氧化途径降解。尽管较传统的化学合成法产生的二元酸纯度高，但发酵过程中由于不完全氧化导致产品中残留有羟基脂肪酸、脂肪酸等杂质，这些杂质的存在会严重影响下游产品的质量，如产品的色泽以及其它物理、化学性质等。杂质的存在为长链二元酸的提取纯化带来不小的挑战。因此，降低发酵产生的杂酸的含量成为生物合成法面临的重要问题，在一定程度上影响了生物法生产长链二元酸产业的发展。

现有技术中关于长链二元酸生产菌株的遗传改造多集中于通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径，提高长链二元酸的产率。如原Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,1991，11(9),4333-4339)研究发现，敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率，而在此基础上过量表达P450及氧化还原酶CPR-a基因，可以使产量得到有效提升。赖小勤等(中国发明专利CN103992959B)的研究表明向二元酸生产菌株中引入CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。清华大学曹竹安等人(Biotechnol.J.,2006，1,68-74)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体的运输过程中的关键基因CAT的一个拷贝，部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，也可以有效降低二元酸的降解，从而使二元酸产量得到显著提高。

目前，长链二元酸发酵过程中产生的杂酸仍然是长链二元酸生产过程中面临的关键问题，因此，亟需开发能够有效降低杂酸含量的菌株和发酵生产方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用。

长链二元酸发酵过程中杂酸等副产物的产生是影响长链二元酸提取纯化和收率的关键因素，发明人长期致力于长链二元酸发酵生产的研究，在发酵实践中发现，在发酵后期，由于产物积累导致发酵液粘度急剧升高，可能使得发酵菌株面临氧气供应不足的问题，进而导致ω-氧化反应不完全，造成羟基酸和脂肪酸等副产物的积累。发明人尝试采用传统的增加溶氧的方式，如增加通气量、用纯氧替代空气、提高搅拌速度或者添加表面活性剂等，但发现这些方式并不能有效解决溶氧的问题，同时还会降低细胞活力而导致菌株的发酵性能受到影响，而且纯氧的使用还会极大地增加生产成本。

由于长链二元酸合成的代谢途径的特性，氧化过程在长链二元酸的合成中具有高度的复杂性，在菌株细胞内存在复杂的调控网络和机制。长链二元酸的合成过程中，生产菌株对于氧气的摄取、利用以及氧气利用率对于菌株生长、长链二元酸合成相关的ω-氧化、β-氧化和三羧酸循环等途径代谢流量分布等多个代谢模块之间相互作用，相互制约。发明人发现，将血红蛋白基因导入长链二元酸的生产菌株中，能够显著提高菌株的底物ω-氧化过程，使得ω-氧化更加完全，进而促进烷烃等底物充分氧化，显著降低了羟基脂肪酸和脂肪酸等副产物的合成。

首先，本发明提供血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中应用。

具体地，所述应用为将血红蛋白基因导入出发菌株中构建长链二元酸的生产菌株。

本发明中，所述血红蛋白基因来源于微生物、植物或动物。

优选地，本发明所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)、大麦(Hordeum vulgare)、蚕豆(Vicia faba)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)或抹香鲸(Physeter microcephalus)。更优选地，所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)或四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)。

更优选地，本发明所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌的血红蛋白vgb基因或四棱豆的血红蛋白lhb基因，或者是与所述vgb基因或lhb基因编码相同蛋白的基因。

具体地，所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白vgb基因或vgb基因的片段；血红蛋白vgb具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述血红蛋白vgb基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

或者，所述血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因(SEQ ID NO.49)或lhb基因的片段。四棱豆的血红蛋白lhb的氨基酸序列见SEQ ID NO.50。

所述血红蛋白还可以是上述来源的血红蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。

本发明中，将基因导入菌株可以采用常规的基因工程方法，包括但不限于电转化、化学转化等转化方法以及转导、转染、接合等方法。

本发明中，所述出发菌株为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的菌株。

本发明中，所述底物优选为C9～C22的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。

更优选为C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。

最优选为C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。

本发明中，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸中的一种或多种。

优选为C9～C18的长链二元酸中的一种或多种。

更优选为癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

另一方面，本发明提供一种长链二元酸的生产菌株，所述生产菌株具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性，所述提高的血红蛋白的活性通过如下方式中的一种或多种实现：

(1)增加所述出发菌株中血红蛋白基因或其同源基因的拷贝数；

(2)将所述出发菌株或所述生产菌株中血红蛋白基因或其同源基因的转录或翻译调控元件替换为高活性的调控元件。

所述血红蛋白基因来源于微生物、植物或动物。

优选地，所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)、大麦(Hordeumvulgare)、蚕豆(Vicia faba)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)或抹香鲸(Physeter microcephalus)。

作为本发明的优选实施方式，为优化所述血红蛋白基因在出发菌株中的表达，本发明所述的血红蛋白基因为经密码子优化的血红蛋白基因。

具体为根据所述出发菌株的密码子偏好性规则进行密码子的优化，将氨基酸的低频率密码子替换为出发菌株中相同氨基酸的高频率密码子。

本发明中，增加血红蛋白基因的拷贝数可以通过采用导入携带血红蛋白基因的表达质粒的方式或通过将血红蛋白基因整合至染色体上的方式实现。

所述整合至染色体的位置可以为菌株常用的染色体插入位置，如染色体上常用的非编码区位置或其它基因缺失的位置等。

本发明中，所述转录或翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点(RBS)、增强子、弱化子、衰减子、5’-UTR、3’-UTR等调控基因表达水平的元件。

本发明中，所述高活性的调控元件为与原始的调控元件相比，调控活性增强的元件，如强启动子、具有更高翻译起始效率的RBS等。

发明人进一步发现，当在提高菌株的血红蛋白活性的同时，降低乙酰辅酶A氧化酶的活性，即将血红蛋白活性和乙酰辅酶A氧化酶的活性进行联合调控，对于减少羟基脂肪酸和脂肪酸等副产物的合成的作用效果更显著。

因此，进一步地，所述菌株还具有与出发菌株相比降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性，所述降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性通过如下方式中的一种或多种实现：

(1)失活所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因；

(2)将所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件；

(3)采用血红蛋白基因或其同源基因替换所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因，

优选地，将一个拷贝的血红蛋白基因或其同源基因替换所述出发菌株内的一个拷贝的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因。

本发明中，所述失活乙酰辅酶A氧化酶基因可以采用本领域常规的方法实现，如全部或部分缺失所述基因，或插入核苷酸序列使基因失活，或替换所述基因的部分序列使其失活等。

本发明中，所述低活性的调控元件为与原始的调控元件相比，调控活性降低的元件，如弱启动子、具有更低翻译起始效率的RBS等。

本发明中，所述出发菌株为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的菌株

具体地，所述出发菌株选自细菌、酵母或霉菌。

优选为选自棒杆菌属(Corynebacterium)、白地霉菌属(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)的微生物。更优选为选自假丝酵母属(Candida)的微生物。

作为本发明的优选实施方式，所述出发菌株为热带假丝酵母(Candidatropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

作为本发明的优选实施方式，所述的乙酰辅酶A氧化酶基因为POX2、POX4和POX5中的一种或多种。POX4基因(GenBank登录号：M12160)编码乙酰辅酶A氧化酶(EC1.3.3.6)，参与β-氧化途径中脂肪酸及其衍生物的氧化过程。已知热带假丝酵母中存在三个POX基因，POX2、POX4和POX5，其可能以八聚体的形式共同参与β-氧化途径。

另一方面，本发明提供所述的生产菌株的构建方法，包括构建含有所述血红蛋白基因的重组DNA片段或载体，将所述重组DNA片段或载体导入所述出发菌株中。

优选地，所述血红蛋白为具有如下任一种核苷酸序列的蛋白：

(1)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选地，所述同源性为至少95％。

其中，所述质粒载体可以为用于同源重组的质粒载体或表达质粒载体。

进一步地，所述构建方法还包括构建含有所述乙酰辅酶A氧化酶基因或所述乙酰辅酶A氧化酶基因的上下游同源臂的重组DNA片段或载体；将所述重组DNA片段或载体导入所述出发菌株中。

其中，所述质粒载体为用于同源重组的质粒载体。

优选地，所述的乙酰辅酶A氧化酶基因为POX2、POX4和POX5中的一种或多种。

更优选地，所述乙酰辅酶A氧化酶基因具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选地，所述同源性为至少95％。

另一方面，本发明还提供所述的生产菌株或所述的构建方法构建得到的生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

另一方面，本发明还提供一种长链二元酸生产菌株的改造方法，包括用血红蛋白基因或其同源基因替换所述长链二元酸生产菌株的基因组乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因的步骤。

所述替换优选采用同源重组的方式进行。

优选地，利用所述改造方法得到的长链二元酸生产菌株的发酵产物中杂酸含量相对于乙酰辅酶A氧化酶基因未被血红蛋白基因替换的生产菌株显著降低。

更优选地，所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌的血红蛋白vgb基因或四棱豆的血红蛋白lhb基因，或者是与所述vgb基因或lhb基因编码相同蛋白的基因。所述乙酰辅酶A氧化酶基因为POX2、POX4和POX5中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供一种长链二元酸的生产方法，包括发酵所述长链二元酸生产菌株或所述的构建或所述改造方法得到的生产菌株，得到长链二元酸。

本发明中，所述发酵的温度为28～32℃。

所述发酵的pH为5.0～7.8。发酵过程中，可以用1N HCl或1N NaOH调节pH值。

本发明中，所述发酵采用的发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐。

可选地，所述碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或，所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

可选地，所述氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或，所述氮源的总添加量为0.1％～4％(w/v)，如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％、2.9％、3.5％。

可选地，所述无机盐包括但不限于硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或，所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

在本发明的一些优选实施方式中，种子培养基可以包括以下成分:蔗糖1.0％～3.0％、尿素0.1％～0.5％、酵母膏0.1％～1.0％、玉米浆0.2％～1.0％及磷酸二氢钾0.4％～1.2％。优选当种子液菌体光密度(OD620)达到0.5(稀释30倍)以上时，将种子液接入发酵培养基中进行发酵转化，接种量可以为10％～30％(v/v)。

在本发明的一些优选实施方式中，所述接种量可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。

在本发明的一些优选实施方式中，发酵培养基可以包括以下成分：葡萄糖2.0％～5.0％、酵母膏0.1％～1.0％、玉米浆0.2％～1.0％、硝酸钾0.1％～1％、磷酸二氢钾0.1％～1.0％及硫酸铵0.1％～0.5％(w/v)。

在本发明的一些优选实施方式中，可以在种子培养基和发酵培养基中先加入所述发酵底物，也可以在发酵过程中再加入所述发酵底物。优选地，在发酵过程中，当菌体光密度(OD620)达到0.5～0.9(稀释30倍)以上时，加入发酵底物。如无其他说明，本发明OD620值均为稀释30倍时检测。

在本发明的一些优选实施方式中，所述具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性的产长链二元酸的生产菌株通过发酵生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有的羟基脂肪酸和脂肪酸等副产物的含量相对于出发菌株降低至少10％，优选至少20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

一般情况下，发酵结束后获得的长链二元酸发酵液中可能包含水分、长链二元酸盐、菌体和其它杂质。发酵过程中产生的发酵处理液可以是对发酵液进行加碱调节、脱色、分离等步骤处理后获得的混合溶液，如膜清液。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。

在本发明的一些优选实施方式中，将长链二元酸从发酵液或发酵处理液中分离提纯，具体可以采用中国发明专利公开号CN1292072C和CN104418725B中记载的发酵液预处理、精制等方法。

本发明中，所述脂肪酸是指碳链长度≥9的脂肪酸，所述羟基脂肪酸为ω-羟基脂肪酸，其化学式为CH2OH-(CH)n-COOH，其中n≥7。

例如：当发酵生产十二碳长链二元酸时，羟基脂肪酸主要为十二碳ω-羟基脂肪酸，脂肪酸为月桂酸；当发酵生产十碳长链二元酸时，羟基脂肪酸主要为十碳ω-羟基脂肪酸，脂肪酸为癸酸；当发酵生产十六碳长链二元酸时，十六碳羟基脂肪酸主要为十六碳ω-羟基脂肪酸，脂肪酸为棕榈酸。

本发明的有益效果在于，本发明通过构建导入血红蛋白基因的长链二元酸的生产菌株，使得菌株的氧气利用能力和长链二元酸的发酵生产性能显著提高。利用本发明提供的长链二元酸生产菌株进行发酵得到的发酵液中羟基脂肪酸和脂肪酸等副产物的含量显著降低。例如，发酵产物十二碳二元酸、十碳二元酸、十六碳二元酸中羟基脂肪酸与脂肪酸杂质的含量均显著降低，与出发菌株相比，杂质含量降低可达30％以上，显著提高了发酵产物长链二元酸产品的纯度，极大地降低了后期的提取纯化工艺的难度和成本，经提取纯化后的长链二元酸产品的纯度较出发菌株显著提高，进而有利于提高长链二元酸下游产品的质量和性能。

附图说明

图1为实施例1中血红蛋白vgb基因整合至染色体的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中采用的培养基配方如下：

YPD培养基(w/v)：蛋白胨2％，葡萄糖2％和酵母提取物(总氮含量8wt％)1％。

种子培养基(w/v)：蔗糖2.0％、尿素0.3％、酵母膏(总氮含量10wt％)0.5％、玉米浆(总氮含量3.0wt％)0.4％、磷酸二氢钾0.8％及。

发酵培养基(w/v)：葡萄糖3.0％、酵母膏(总氮含量7wt％)0.8％、玉米浆(总氮含量3.0wt％)0.6％、硝酸钾0.5％、磷酸二氢钾0.5％及硫酸铵0.3％。发酵底物正十二烷、正十烷、正十六烷添加量各为300mL/L。

以下实施例中长链二元酸、羟基脂肪酸和脂肪酸的检测采用气相色谱法(GC)，具体方法如下：

(1)发酵液中产物及杂质含量检测：发酵液经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(内标法)，色谱条件如下：

色谱柱：Supelco SPB-50；30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行二元酸产量计算，根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。

(2)固体产品纯度及杂质含量检测：固体样品经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(归一法)，

色谱条件：色谱柱：Supelco SPB-50；30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

分别根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。

实施例1长链二元酸生产菌株的构建

本实施例提供的长链二元酸生产菌株的制备方法包括步骤：(1)制备同源重组模板，包括靶位点上下游重组模板、vgb基因，CYP52A18基因的终止子和抗性筛选标记基因HYG(潮霉素抗性基因)，之后通过重叠延伸PCR方法得到完整的重组模板；(2)将完整的重组模板转化至感受态细胞；(3)在含有潮霉素的抗性培养基上筛选得到含有抗性标记的菌株，并进一步通过测序验证vgb基因整合到POX4位点，即将POX4位点经同源重组替换为vgb基因的生产菌株。

其中，POX4基因编码乙酰辅酶A氧化酶，参与β-氧化途径中脂肪酸及其衍生物的氧化过程。

vgb基因为透明颤菌的血红蛋白基因，其编码含有146个氨基酸的VHb血红素(血红蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，VHb在体内以同源二聚体的形式存在。

1、同源重组模板的制备

(1)vgb基因的合成

对透明颤菌的血红蛋白基因vgb基因进行密码子优化，密码子优化依据热带假丝酵母的密码子使用偏好进行优化(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。密码子优化的vgb基因的合成采用基于PCR的基因合成的方法(具体方法参见https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)，所用的引物序列如表1所示。

表1 vgb基因合成所用引物

引物标号	引物名称	引物序列5’-3’
			SEQ ID NO.4	VGB-1	ATGTTGGATCAACAAACCATTAAC
SEQ ID NO.5	VGB-2	CCTTCAAAACTGGAACGGTAGCCTTAATGATGTTAATGGTTTGTTGATCCAACAT
			SEQ ID NO.6	VGB-3	CTACCGTTCCAGTTTTGAAGGAACACGGTGTTACAATTACCACCACCTTCTACAA
SEQ ID NO.7	VGB-4	GTCTAACTTCTGGATGCTTAGCGAACAAGTTCTTGTAGAAGGTGGTGGTAATTGT
			SEQ ID NO.8	VGB-5	GCTAAGCATCCAGAAGTTAGACCATTGTTCGATATGGGTAGACAAGAATCCTTGG
SEQ ID NO.9	VGB-6	GCCAAAACGGTCATAGCCAAAGCCTTTGGTTGTTCCAAGGATTCTTGTCTACCCA
			SEQ ID NO.10	VGB-7	TGGCTATGACCGTTTTGGCTGCTGCTCAGAACATTGAAAACTTGCCTGCTATTTT
SEQ ID NO.11	VGB-8	GTGCTTAACAGCAATCTTCTTAACGGCTGGCAAAATAGCAGGCAAGTTTTCAATG
			SEQ ID NO.12	VGB-9	GTTAAGAAGATTGCTGTTAAGCACTGTCAAGCTGGTGTTGCTGCCGCCCATTACC
SEQ ID NO.13	VGB-10	CTTCCTTAATAGCACCCAATAATTCTTGACCAACAATTGGGTAATGGGCGGCAGC
			SEQ ID NO.14	VGB-11	GAATTATTGGGTGCTATTAAGGAAGTTTTGGGTGATGCTGCTACCGATGATATTT
SEQ ID NO.15	VGB-12	CAATGACACCGTAAGCCTTACCCCAGGCATCCAAAATATCATCGGTAGCAGCATC
			SEQ ID NO.16	VGB-13	GTAAGGCTTACGGTGTCATTGCTGATGTTTTCATTCAAGTTGAAGCTGATTTGTA
SEQ ID NO.17	VGB-14	TTCGACGGCTTGAGCGTACAAATCAGCTTCAACTTGAATGA

合成vgb基因的PCR反应体系中上述引物浓度为0.2ng/μL，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s；

步骤2:98℃10s,58℃10s,72℃1min,25个循环；

步骤3:72℃10min。

反应结束后取1μL反应液作为模板，再采用相同的PCR反应条件，使用引物VGB-1和VGB-14(终浓度为0.5μM)进行PCR扩增。

获得的PCR产物经回收纯化后，末端加A(TaqDNA聚合酶，Takara公司，)并克隆至pMD19-T(Takara)载体后转化至DH5α化学感受态细胞。采用Takara公司的TaqDNA聚合酶，进行菌落PCR筛选阳性克隆，引物为VGB-1和VGB-14，PCR反应条件如下：

步骤1:94℃5min；

步骤2:94℃30s,55℃30s,72℃45s,30个循环；

步骤3:72℃5min。

鉴定得到的阳性克隆经测序证实序列正确，vgb基因序列如SEQ ID NO.2所示。

以测序证实序列正确的上述质粒为模板，进行PCR扩增，获得在vgb基因两端添加重叠延伸所需的互补序列的Ppox4_vgb_T52a18片段，所需引物序列及PCR反应条件如下：

Ppox4-vgb(SEQ ID NO.18)：5’-TGTTCAAATCTTCACGACATAATGTTGGATCAACAAACCATTAAC-3’；

T52a18_vgb(SEQ ID NO.19)：5’-ATCAAACGCACTCATACGTATTATTCGACGGCTTGAGCGTACA AAT-3’。

PCR反应程序如下：

步骤1:98℃30s；

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃25s，5个循环；

步骤3:98℃10s，72℃25s，25个循环；

步骤4:72℃5min。

PCR扩增片段经测序证实正确，得到的Ppox4_vgb_T52a18命名为vgb片段，序列如SEQ ID NO.20所示。

(2)终止子序列扩增

出发菌株热带假丝酵母CAT N145(公开于中国专利CN102839133A，菌种保藏号为CCTCC NO:M2011192，)的基因组DNA提取采用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(上海生工，货号518257)，并辅以液氮研磨的方法提高破壁效率。

每50μL的PCR反应体系加入0.1μg基因组作为模板进行PCR扩增。所用的引物如下：

T52a18-F：5’-TACGTATGAGTGCGTTTGAT-3’(SEQ ID NO.21)

T52a18-R：5’-AAACGAAAGTTTTCCCCAAC-3’(SEQ ID NO.22)

PCR反应程序如下：

步骤1:98℃30s；

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃20s，30个循环；

步骤3:72℃5min。

经测序证实序列正确，所得的序列为终止子T52a18(序列如SEQ ID NO.23所示)。

(3)抗性筛选标记(HYG，潮霉素抗性基因)的扩增

扩增模板为载体pCIB2(序列如SEQ ID NO.4所示)，引物序列如下：

T52a18_HYG-F(SEQ ID NO.24)：5’-GTTGGGGAAAACTTTCGTTTGCATGCGAACCCGAAAATGG-3’；

POX4_HYG-R(SEQ ID NO.25)：5’-CGTACAACTTACCGAGGGTGGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’。

PCR反应程序如下：

步骤1:98℃30s；

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃20s，30个循环；

步骤3:72℃5min。

获得的扩增产物为HYG，经测序证实序列正确，其序列如SEQ ID NO.26所示。

(4)上下游同源重组片段的扩增

扩增模板为步骤(2)中酵母的基因组DNA，扩增引物序列如下：

POX4_Up-F：5’-AAAATAAGGCGACGGAGTTA-3’(SEQ ID NO.27)

POX4_Up-R：5’-TATGTCGTGAAGATTTGAACA-3’(SEQ ID NO.28)

POX4_Down-F：5’-CACCCTCGGTAAGTTGTACG-3’(SEQ ID NO.29)

POX4_Down-R：5’-CCGGCCTTGAGTTATGAGAC-3’(SEQ ID NO.30)。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s；

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃30s，5个循环；

步骤3:72℃，5min。

获得的产物分别称为POX4_Up和POX4_Down，PCR产物凝胶电泳后用

DNA凝胶回收试剂盒(Axygen，货号AP-GX-250G)回收，经测序验证无误，其序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示。

(5)重叠延伸PCR构建完整的同源重组模板

将上述vgb片段、终止子T52a18、HYG、POX4_Up和POX4_Down(序列分别如SEQ IDNO.20、23、26、31和32所示)共5个回收纯化的PCR片段进行重叠延伸PCR，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的上述片段作为模板，引物为POX4_Up-F和POX4_Down-R，用

HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃，30s；

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃2min，25个循环；

步骤3:72℃，8min。

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为3.7Kb的用于vgb基因染色体整合的同源重组片段，其序列如SEQ ID NO.33所示。

2、长链二元酸生产菌株的构建

(1)酵母重组转化子的转化与筛选

热带假丝酵母CAT N145制备电转化感受态细胞，加入1μg的如SEQ ID NO.33所述同源重组模板点击转化酵母感受态细胞，30℃培养3天后，挑取单克隆接种于YPD培养基(含潮霉素B)中，摇床转速220rpm，30℃培养16h。进行菌落PCR鉴定，所用引物序列如下：

vgbHR-F:5’-GTGGTGGTAAGCCGACAGAA-3’(SEQ ID NO.34)

vgbHR-R:5’-CAACACCAGCTTGACAGTGC-3’(SEQ ID NO.35)

菌落PCR鉴定筛选得到的阳性菌株，用vgbHR-F和vgbHR-R引物使用

HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)进行扩增，得到的PCR片段经进一步测序证明包含vgb片段、终止子T52a18和HYG基因的DNA片段插入POX4位点，该菌株命名为497。通过同源重组的方式将vgb基因整合至POX4位点的示意图如图1所示。

实施例2重组菌株497发酵生产十二碳长碳链二元酸

1、发酵培养：挑取菌株497的单菌落接种于含有1mL YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2mL离心管中，30℃下，250rpm摇床培养24小时。取上述菌液接入含有30mL种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的500mL摇瓶中，接种量为3％，pH自然，在30℃、250rpm培养36～48h至OD620达到0.8时，将种子液接入装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，且发酵培养基中添加300mL/L底物正十二烷。在30℃、250rpm摇床培养至发酵结束，培养过程中控制pH为7.5～7.6。以菌株CAT N145作为对照组，培养和发酵方法均与菌株497相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，进行GC检测，计算十二碳二元酸含量以及羟基脂肪酸和月桂酸的杂质质量比率(杂质质量比率为发酵液中羟基脂肪酸或月桂酸杂质占十二碳长链二元酸的质量百分比)，结果如下表2所示。

表2 菌株497发酵生产十二碳二元酸的产物分析

菌株	CAT N145	497
			十二碳二元酸产量(mg/g)	148.1	149.3
十二碳羟基脂肪酸质量比(％)	1.37	0.83
			月桂酸质量比(％)	0.97	0.61

由表2可知，采用菌株497进行十二碳二元酸的发酵生产，发酵液中杂质十二碳羟基脂肪酸和月桂酸的质量百分比分别下降了39.4％和37.1％。

实施例3菌株497发酵生产十碳长链二元酸

挑取菌株497的单菌落接种于含有1mL YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250rpm摇床培养24小时。取上述菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，pH自然，在30℃、250rpm培养36～48h至OD₆₂₀达到0.8时，将种子液接入装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，且发酵培养基中添加300mL/L底物正十烷。在30℃、250rpm摇床培养至发酵结束，培养过程中控制pH为7.5～7.6。

以菌株CAT N145作为对照组，培养和发酵方法均与菌株497相同。

采用GC方法测定十碳二元酸产量以及十碳羟基脂肪酸与癸酸杂质的含量(杂质质量比为发酵液中羟基脂肪酸或癸酸杂质占十碳长链二元酸的质量百分比)，结果如表3所示，结果表明，采用菌株497进行十碳二元酸的发酵生产，发酵液中杂质十碳羟基脂肪酸的含量降低了36.4％，癸酸的质量比率下降40.3％。

表3 菌株497发酵生产十碳二元酸的产物分析

菌株	CAT N145	497
			十碳二元酸产量(mg/g)	120.4	121.5
十碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	0.88	0.56
			癸酸质量比率(％)	0.72	0.43

实施例4菌株497发酵生产十六碳长链二元酸

挑取菌株497的单菌落接种于含有1mL YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250rpm摇床培养24小时。取上述菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，pH自然，在30℃、250rpm培养36～48h至OD₆₂₀达到0.8时，将种子液接入装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，且发酵培养基中添加300mL/L底物正十六烷。在30℃、250rpm摇床培养至发酵结束，培养过程中控制pH为7.5～7.6。

采用GC方法测定发酵液中十六碳二元酸产量及十六碳一元酸杂质的质量比率(杂质质量比为发酵液中羟基脂肪酸或棕榈酸杂质占十六碳长链二元酸的质量百分比)，结果如表4所示，结果表明，采用菌株497进行十六碳二元酸的发酵生产，发酵液中杂质十六碳羟基脂肪酸杂质的含量降低了40.1％，棕榈酸杂志的含量降低了38.3％。

表4 菌株497发酵生产十六碳二元酸的产物分析

菌株	CAT N145	497
			十六碳二元酸产量(mg/g)	125.1	126.6
十六碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	3.14	1.88
			棕榈酸杂质质量比率(％)	1.96	1.21

实施例5菌株498发酵生产十二碳长链二元酸

将vgb基因重组在热带假丝酵母CAT N145菌株的基因组上任意选择的位点。同源重组模板制备方法参照实施例1。用

HS高保真DNA聚合酶扩增如下片段，所需引物如下：

UP-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCGGTACCTTAGACCGCCAGAGAAGGGA-3’(SEQ ID NO:36)；

UP-R：5’-TGTCATTGCGTAACGTGGGA-3’(SEQ ID NO:37)；

DOWN-F：5’-GTGGTGGGTTCCCAGCTTAT-3’(SEQ ID NO:38)；

DOWN-R：5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGGAGGTACCAACAATCCCCG-3’(SEQ ID NO:39)。

模板为实施例1所述出发菌株热带假丝酵母CAT N145的基因组DNA，

PCR扩增后所得PCR产物分别为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。

Prom-F：5’-TCCCACGTTACGCAATGACATCGGCAACCAACTTTTTACT-3’(SEQ ID NO:42)；

Prom-R：5’-CTCTAGGCACTGGAACTAA-3’(SEQ ID NO:43)。

模板为实施例1所述出发菌株热带假丝酵母CAT N145的基因组DNA，以上述Prom-F和Prom-R引物进行PCR扩增，所得PCR产物经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO:44所示。

Prom-VGB-F：5’-TTAGTTCCAGTGCCTAGAGATGTTGGATCAACAAACCATTAAC-3’(SEQ IDNO:45)；

Down_HYG-F：5’-ATAAGCTGGGAACCCACCACGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’(SEQ ID NO:46)。

模板为稀释后的实施例1所述SEQ ID NO:33，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃ 30s

步骤2:98℃ 10s,55℃ 10s,72℃ 4min,5个循环

步骤3:98℃ 10s,72℃ 4min,25个循环

步骤4:72℃ 5min。

所得产物为SEQ ID NO:47。

使用

MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme Biotech)将上述回收纯化后的片段SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44与SEQ ID NO:47组装入载体pUC57(Genbank登录号：Y14837.1)，方法如下：

pUC57经KpnI和HindIII(FastDigest，ThermoFisher)酶切并回收纯化。

分别加入0.03pmol的上述回收纯化后的SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:47与经EcoRI和HindIII酶切后的pUC57载体骨架，4μL 5x CE MultiSbuffer，2μL Exnase MultiS，补dd H₂O至20μL。37℃孵育30min后，迅速冷却至4℃。取10μL转化至DH5α化学感受态细胞中。

挑取单克隆经测序验证无误，序列如SEQ ID NO:48所示，即为包含有同源重组片段的质粒。

将1μg上述质粒(SEQ ID NO:48)转入菌株CAT N145过程、重组子筛选参照实施例1，重组子筛选所用引物及PCR反应条件为：

HR-F：5’-CAGGTTCGTCAGGAGCACAT-3’(SEQ ID NO:49)；

HR-R：5’-CAACTCTTCCGCCAACTTGC-3’(SEQ ID NO:50)。

步骤1:94℃ 5min

步骤2:94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min 35s,30个循环

步骤3:72℃ 5min。

将PCR所筛选到的阳性菌株(与未转化株相比，能够扩增出大小约为1.55Kb的目的片段)命名为498。

发酵方法同实施例2，所用菌株为CAT N145和498。发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品进行GC检测，计算十二碳二元酸产量及杂质质量比率，如表5所示，结果说明十二碳杂酸杂质的含量相对于没有过量表达vgb基因的亲代菌株显著下降。

表5菌株498发酵生产十二碳二元酸的产物分析

十二碳二元酸产量(mg/g)	147.7	148.8
			十二碳羟基脂肪酸质量比(％)	1.32	0.87
月桂酸质量比(％)	0.97	0.65

实施例6重组菌株499发酵生产十二碳长链二元酸

将实施例1所述DNA片段SEQ ID NO.33同源重组入热带假丝酵母ES9-66(公开于中国专利CN1285766C，菌种保藏号为CCTCC NO:M203052)，获得POX4基因被vgb基因替换的重组菌株的方法同实施例1，筛选得到的阳性株菌命名为499。

发酵方法同实施例2所用菌株为ES9-66和499，发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品，计算十二碳二元酸产量与杂质含量，如表6所示。结果表明，与亲代菌株ES9-66相比，两种杂质含量均有显著下降。

表6菌株499发酵生产十二碳二元酸的产物分析

菌株	ES9-66	499
			十二碳二元酸产量(mg/g)	131.9	134.5
十二碳羟基脂肪酸质量比(％)	1.18	0.43
			月桂酸质量比(％)	1.11	0.52

实施例7菌株500发酵生产十二碳长链二元酸

依据热带假丝酵母的密码子使用偏好优化并合成来自豆科植物四棱豆的血红蛋白LHb(Leghemoglobin)基因，基因合成由生工生物工程(上海)有限公司完成，并将其克隆至pUC57载体(Genbank登录号：Y14837.1)。

1、制备LHb基因的同源重组模板

以上述pUC57质粒载体质粒为模板，扩增LHb基因序列，并在其两端添加重叠延伸所需的片段，引物如下：

Ppox4-LHb-F:5’-TGTTCAAATCTTCACGACATAAATGGGCGGCTTCACCG-3’(SEQ ID NO:51)

T52a18-LHb-R:5’-ATCAAACGCACTCATACGTATTAGAATGCCTTCTTCAATGCAGC-3’(SEQID NO:52)

凝胶电泳后回收纯化大小约480bp的DNA片段为LHb，经测序证实无误，其序列如SEQ ID.NO:53所示。

2、PCR重叠延伸制备同源重组模板

以等摩尔量的POX4_Up、LHb、T52a18、HYG以及POX4_Down(序列分别如SEQ ID NO:31、53、23、26、和32所示)共5个回收纯化的PCR片段进行重叠延伸PCR，得到同源重组模板，并回收纯化。回收纯化后的产物经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO:54所示。

3、构建过表达LHb基因的长链二元酸生产菌株

除菌落PCR鉴定所用引物不同外，将本实施例步骤1所得的同源重组模板SEQ IDNO.52同源重组至热带假丝酵母CAT N145并筛选重组转化子的方法均与实施例1步骤2所述方法相同。菌落PCR鉴定重组子所用引物如下：

LHbHR-1F:5’-TTGTCCACCGATACACGCTT-3’(SEQ ID NO:55)

LHbHR-1R:5’-CCCTTTTGTGCGTGCAATGA-3’(SEQ ID NO:56)

菌落PCR筛选到的电泳产物约为500bp的DNA片段经回收纯化后测序验证无误的菌株即为阳性菌株，将其中一株命名为500。

4、重组菌株500发酵生产十二碳长链二元酸

菌株CAT N145和重组菌株500的发酵方法同实施例2，发酵结束后分别取0.5g发酵液样品进行GC检测，计算十二碳二元酸的产量及杂志质量比率，如表7所示。由结果可见，过表达LHb的菌株中十二碳二元酸杂质的含量与亲代菌株相比显著下降。

表7菌株500发酵生产十二碳二元酸的产物分析

菌株	CAT N145	500
			十二碳二元酸产量(mg/g)	145.0	145.4
十二碳羟基脂肪酸质量比(％)	1.33	0.94
			月桂酸质量比(％)	1.02	0.71

实施例8菌株501发酵生产十二碳长链二元酸

将LHb基因重组至热带假丝酵母CAT N145菌株基因组上任意选择的位点。同源重组模板的制备方法参照实施例5。

以实施例7所述稀释后的SEQ ID NO.52为模板，用Prime

HS高保真DNA聚合酶扩增如下片段，所需引物如下：

Prom-LHb-F：5’-TTCCAGTGCCTAGAGATGTTCAAATCTTCACGACATA-3’(SEQ ID NO:57)

Down-HYG-F：5’-CTGGGAACCCACCACGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’。(SEQ ID NO:58)

扩增得到的DNA片段，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO:59所示。

将上述回收纯化后的片段SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44与SEQ IDNO:57组装入载体pUC57的方法参照实施例5，得到包含有LHb的同源重组片段的质粒，经测序证实无误，序列如SEQ ID NO.60所示。

LHbHR-2F:5’-TCCCACGTTACGCAATGACA-3’(SEQ ID NO:61)

LHbHR-2R:5’-CCCTTTTGTGCGTGCAATGA-3’(SEQ ID NO:62)

将PCR所筛选到的阳性菌株(与未转化株相比，能够扩增出大小约为1.3Kb的目的片段)命名为501。

菌株为CAT N145和501的发酵方法同实施例2，发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品进行GC检测，计算十二碳二元酸产量及杂质质量比率，如表8所示，结果说明十二碳杂酸杂质的含量相对于没有过量表达LHb基因的亲代菌株显著下降。

表8菌株501发酵生产十二碳二元酸的产物分析

菌株	CAT N145	501
			十二碳二元酸产量(mg/g)	143.9	144.2
十二碳羟基脂肪酸质量比(％)	1.30	0.89
			月桂酸质量比(％)	1.02	0.73

综上所述，采用本发明方法获得的重组菌株发酵生产不同碳链长度的长链二元酸，发酵产物十二碳二元酸、十碳二元酸、十六碳二元酸中羟基脂肪酸与脂肪酸杂质的含量均显著降低，极大地降低了后期的提取纯化工艺的难度和成本，为长链二元酸下游产品的质量提供了有力保障。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

CIBT美国公司

<120> 发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用

<130> KHP181116621.7

<160> 62

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttggatc aacaaaccat taacatcatt aaggctaccg ttccagtttt gaaggaacac 60

ggtgttacaa ttaccaccac cttctacaag aacttgttcg ctaagcatcc agaagttaga 120

ccattgttcg atatgggtag acaagaatcc ttggaacaac caaaggcttt ggctatgacc 180

gttttggctg ctgctcagaa cattgaaaac ttgcctgcta ttttgccagc cgttaagaag 240

attgctgtta agcactgtca agctggtgtt gctgccgccc attacccaat tgttggtcaa 300

gaattattgg gtgctattaa ggaagttttg ggtgatgctg ctaccgatga tattttggat 360

gcctggggta aggcttacgg tgtcattgct gatgttttca ttcaagttga agctgatttg 420

tacgctcaag ccgtcgaata a 441

<210> 3

<211> 2955

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaataaggc gacggagtta gtgtccgtta tgtgacacat ttttcattgg cggagattat 60

accgagctcc aattgtaata tttcgggaga aatatcgttg gggtaaaaca acagagagag 120

agagggagag atggttctgg tagaattata atctggttgt tgcaaatgct actgatcgac 180

tctggcaatg tctgtagctc gctagttgta tgcaacttag gtgttatgca tacacacggt 240

tattcggttg aattgtggag taaaaattgt ctgagttgtg tcttagctac tggctggccc 300

cccgcgaaag ataatcaaaa ttacacttgt gaatttttgc acacacaccg attaacattt 360

cccttttttg tccaccgata cacgcttgcc tcttcttttt tttctctgtg cttccccctc 420

ctgtgacttt ttccaccatt gatataaaat caactccatt tccctaaaat ctccccagat 480

tctaaaaaca acttcttctc ttctgctttt cctttttttt tgttatattt atttaccatc 540

cctttttttt gaatagttat tccccactaa cattgttcaa atcttcacga cataatgact 600

tttacaaaga aaaacgttag tgtatcacaa ggtcctgacc ctagatcatc catccaaaag 660

gaaagagaca gctccaaatg gaaccctcaa caaatgaact acttcttgga aggctccgtc 720

gaaagaagtg agttgatgaa ggctttggcc caacaaatgg aaagagaccc aatcttgttc 780

acagacggct cctactacga cttgaccaag gaccaacaaa gagaattgac cgccgtcaag 840

atcaacagaa tcgccagata cagagaacaa gaatccatcg acactttcaa caagagattg 900

tccttgattg gtatctttga cccacaggtc ggtaccagaa ttggtgtcaa cctcggtttg 960

ttcctttctt gtatcagagg taacggtacc acttcccaat tgaactactg ggctaacgaa 1020

aaggaaaccg ctgacgttaa aggtatctac ggttgtttcg gtatgaccga attggcccac 1080

ggttccaacg ttgctggttt ggaaaccacc gccacatttg acaaggaatc tgacgagttt 1140

gtcatcaaca ccccacacat tggtgccacc aagtggtgga ttggtggtgc tgctcactcc 1200

gccacccact gttctgtcta cgccagattg attgttgacg gtcaagatta cggtgtcaag 1260

acttttgttg tcccattgag agactccaac cacgacctca tgccaggtgt cactgttggt 1320

gacattggtg ccaagatggg tagagatggt atcgataacg gttggatcca attctccaac 1380

gtcagaatcc caagattctt tatgttgcaa aagttctgta aggtttctgc tgaaggtgaa 1440

gtcaccttgc cacctttgga acaattgtct tactccgcct tgttgggtgg tagagtcatg 1500

atggttttgg actcctacag aatgttggct agaatgtcca ccattgcctt gagatacgcc 1560

attggtagaa gacaattcaa gggtgacaat gtcgatccaa aagatccaaa cgctttggaa 1620

acccaattga tagattaccc attgcaccaa aagagattgt tcccatactt ggctgctgcc 1680

tacgtcatct ccgctggtgc cctcaaggtt gaagacacca tccataacac cttggctgaa 1740

ttggacgctg ccgttgaaaa gaacgacacc aaggctatct ttaagtctat tgacgacatg 1800

aagtcattgt ttgttgactc tggttccttg aagtccactg ccacttggtt gggtgctgaa 1860

gccattgacc aatgtagaca agcctgtggt ggtcacggtt actcgtccta caacggcttc 1920

ggtaaagcct acaacgattg ggttgtccaa tgtacttggg aaggtgacaa caatgtcttg 1980

gccatgagtg ttggtaagcc aattgtcaag caagttatca gcattgaaga tgccggcaag 2040

accgtcagag gttccaccgc tttcttgaac caattgaagg actacactgg ttccaacagc 2100

tccaaggttg ttttgaacac tgttgctgac ttggacgaca tcaagactgt catcaaggct 2160

attgaagttg ccatcatcag attgtcccaa gaagctgctt ctattgtcaa gaaggaatct 2220

ttcgactatg tcggcgctga attggttcaa ctctccaagt tgaaggctca ccactacttg 2280

ttgactgaat acatcagaag aattgacacc tttgaccaaa aggacttggt tccatacttg 2340

atcaccctcg gtaagttgta cgctgccact attgtcttgg acagatttgc cggtgtcttc 2400

ttgactttca acgttgcctc caccgaagcc atcactgctt tggcctctgt gcaaattcca 2460

aagttgtgtg ctgaagtcag accaaacgtt gttgcttaca ccgactcctt ccaacaatcc 2520

gacatgattg tcaattctgc tattggtaga tacgatggtg acatctatga gaactacttt 2580

gacttggtca agttgcagaa cccaccatcc aagaccaagg ctccttactc tgatgctttg 2640

gaagccatgt tgaacagacc aaccttggac gaaagagaaa gatttgaaaa gtctgatgaa 2700

accgctgcta tcttgtccaa gtaagaatag aagagagtga ctcttttgat aagagtcgca 2760

aatttgattt cataagtata tattcattat gtaaagtagt aaatggaaaa ttcattaaaa 2820

aaaaagcaaa tttccgttgt atgcatactc cgaacacaaa actagccccg gaaaaaccct 2880

tagttgatag ttgcgaattt aggtcgacct ctcatgattt caaccttacc cccacgtctc 2940

ataactcaag gccgg 2955

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttggatc aacaaaccat taac 24

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccttcaaaac tggaacggta gccttaatga tgttaatggt ttgttgatcc aacat 55

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaccgttcc agttttgaag gaacacggtg ttacaattac caccaccttc tacaa 55

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtctaacttc tggatgctta gcgaacaagt tcttgtagaa ggtggtggta attgt 55

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctaagcatc cagaagttag accattgttc gatatgggta gacaagaatc cttgg 55

<210> 9

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccaaaacgg tcatagccaa agcctttggt tgttccaagg attcttgtct accca 55

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggctatgac cgttttggct gctgctcaga acattgaaaa cttgcctgct atttt 55

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgcttaaca gcaatcttct taacggctgg caaaatagca ggcaagtttt caatg 55

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gttaagaaga ttgctgttaa gcactgtcaa gctggtgttg ctgccgccca ttacc 55

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttccttaat agcacccaat aattcttgac caacaattgg gtaatgggcg gcagc 55

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattattgg gtgctattaa ggaagttttg ggtgatgctg ctaccgatga tattt 55

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caatgacacc gtaagcctta ccccaggcat ccaaaatatc atcggtagca gcatc 55

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtaaggctta cggtgtcatt gctgatgttt tcattcaagt tgaagctgat ttgta 55

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcgacggct tgagcgtaca aatcagcttc aacttgaatg a 41

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgttcaaatc ttcacgacat aatgttggat caacaaacca ttaac 45

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atcaaacgca ctcatacgta ttattcgacg gcttgagcgt acaaat 46

<210> 20

<211> 482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgttcaaatc ttcacgacat aatgttggat caacaaacca ttaacatcat taaggctacc 60

gttccagttt tgaaggaaca cggtgttaca attaccacca ccttctacaa gaacttgttc 120

gctaagcatc cagaagttag accattgttc gatatgggta gacaagaatc cttggaacaa 180

ccaaaggctt tggctatgac cgttttggct gctgctcaga acattgaaaa cttgcctgct 240

attttgccag ccgttaagaa gattgctgtt aagcactgtc aagctggtgt tgctgccgcc 300

cattacccaa ttgttggtca agaattattg ggtgctatta aggaagtttt gggtgatgct 360

gctaccgatg atattttgga tgcctggggt aaggcttacg gtgtcattgc tgatgttttc 420

attcaagttg aagctgattt gtacgctcaa gccgtcgaat aatacgtatg agtgcgtttg 480

at 482

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tacgtatgag tgcgtttgat 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aaacgaaagt tttccccaac 20

<210> 23

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tacgtatgag tgcgtttgat tttgtagttt ctgtttgcag taatgagata actattcaga 60

taaggcgggt ggatgtacgt tttgtaagag tttccttaca accctggtgg gtgtgtgagg 120

ttgcatctta gggagagata gcaccttttg cagctctccg tatacagttt tactctttgt 180

aacctatgcc aatcatgtgg ggattcattg tttgcccatg gtggtgcatg caaaatcccc 240

ccaactaccc aatctcacat gaaactcaag cacactagaa aaaaaagatg ttgcgtgggt 300

tcttttgatg ttggggaaaa ctttcgttt 329

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gttggggaaa actttcgttt gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgtacaactt accgagggtg gctagcagct ggatttcact 40

<210> 26

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttggggaaa actttcgttt gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagagaaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agggttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

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gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagccacc ctcggtaagt tgtacg 1776

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaaataaggc gacggagtta 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tatgtcgtga agatttgaac a 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caccctcggt aagttgtacg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccggccttga gttatgagac 20

<210> 31

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaaataaggc gacggagtta gtgtccgtta tgtgacacat ttttcattgg cggagattat 60

accgagctcc aattgtaata tttcgggaga aatatcgttg gggtaaaaca acagagagag 120

agagggagag atggttctgg tagaattata atctggttgt tgcaaatgct actgatcgac 180

tctggcaatg tctgtagctc gctagttgta tgcaacttag gtgttatgca tacacacggt 240

tattcggttg aattgtggag taaaaattgt ctgagttgtg tcttagctac tggctggccc 300

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cccttttttg tccaccgata cacgcttgcc tcttcttttt tttctctgtg cttccccctc 420

ctgtgacttt ttccaccatt gatataaaat caactccatt tccctaaaat ctccccagat 480

tctaaaaaca acttcttctc ttctgctttt cctttttttt tgttatattt atttaccatc 540

cctttttttt gaatagttat tccccactaa cattgttcaa atcttcacga cata 594

<210> 32

<211> 613

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caccctcggt aagttgtacg ctgccactat tgtcttggac agatttgccg gtgtcttctt 60

gactttcaac gttgcctcca ccgaagccat cactgctttg gcctctgtgc aaattccaaa 120

gttgtgtgct gaagtcagac caaacgttgt tgcttacacc gactccttcc aacaatccga 180

catgattgtc aattctgcta ttggtagata cgatggtgac atctatgaga actactttga 240

cttggtcaag ttgcagaacc caccatccaa gaccaaggct ccttactctg atgctttgga 300

agccatgttg aacagaccaa ccttggacga aagagaaaga tttgaaaagt ctgatgaaac 360

cgctgctatc ttgtccaagt aagaatagaa gagagtgact cttttgataa gagtcgcaaa 420

tttgatttca taagtatata ttcattatgt aaagtagtaa atggaaaatt cattaaaaaa 480

aaagcaaatt tccgttgtat gcatactccg aacacaaaac tagccccgga aaaaccctta 540

gttgatagtt gcgaatttag gtcgacctct catgatttca accttacccc cacgtctcat 600

aactcaaggc cgg 613

<210> 33

<211> 3713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaaataaggc gacggagtta gtgtccgtta tgtgacacat ttttcattgg cggagattat 60

accgagctcc aattgtaata tttcgggaga aatatcgttg gggtaaaaca acagagagag 120

agagggagag atggttctgg tagaattata atctggttgt tgcaaatgct actgatcgac 180

tctggcaatg tctgtagctc gctagttgta tgcaacttag gtgttatgca tacacacggt 240

tattcggttg aattgtggag taaaaattgt ctgagttgtg tcttagctac tggctggccc 300

cccgcgaaag ataatcaaaa ttacacttgt gaatttttgc acacacaccg attaacattt 360

cccttttttg tccaccgata cacgcttgcc tcttcttttt tttctctgtg cttccccctc 420

ctgtgacttt ttccaccatt gatataaaat caactccatt tccctaaaat ctccccagat 480

tctaaaaaca acttcttctc ttctgctttt cctttttttt tgttatattt atttaccatc 540

cctttttttt gaatagttat tccccactaa cattgttcaa atcttcacga cataatgttg 600

gatcaacaaa ccattaacat cattaaggct accgttccag ttttgaagga acacggtgtt 660

acaattacca ccaccttcta caagaacttg ttcgctaagc atccagaagt tagaccattg 720

ttcgatatgg gtagacaaga atccttggaa caaccaaagg ctttggctat gaccgttttg 780

gctgctgctc agaacattga aaacttgcct gctattttgc cagccgttaa gaagattgct 840

gttaagcact gtcaagctgg tgttgctgcc gcccattacc caattgttgg tcaagaatta 900

ttgggtgcta ttaaggaagt tttgggtgat gctgctaccg atgatatttt ggatgcctgg 960

ggtaaggctt acggtgtcat tgctgatgtt ttcattcaag ttgaagctga tttgtacgct 1020

caagccgtcg aataatacgt atgagtgcgt ttgattttgt agtttctgtt tgcagtaatg 1080

agataactat tcagataagg cgggtggatg tacgttttgt aagagtttcc ttacaaccct 1140

ggtgggtgtg tgaggttgca tcttagggag agatagcacc ttttgcagct ctccgtatac 1200

agttttactc tttgtaacct atgccaatca tgtggggatt cattgtttgc ccatggtggt 1260

gcatgcaaaa tccccccaac tacccaatct cacatgaaac tcaagcacac tagaaaaaaa 1320

agatgttgcg tgggttcttt tgatgttggg gaaaactttc gtttgcatgc gaacccgaaa 1380

atggagcaat cttccccggg gcctccaaat accaactcac ccgagagaga gaaagagaca 1440

ccacccacca cgagacggag tatatccacc aaggtaagta actcagggtt aatgatacag 1500

gtgtacacag ctccttccct agccattgag tgggtatcac atgacactgg taggttacaa 1560

ccacgtttag tagttatttt gtgcaattcc atggggatca ggaagtttgg tttggtgggt 1620

gcgtctactg attccccttt gtctctgaaa atcttttccc tagtggaaca ctttggctga 1680

atgatataaa ttcaccttga ttcccaccct cccttctttc tctctctctc tgttacaccc 1740

aattgaattt tctttttttt tttactttcc ctccttcttt atcatcaaag ataagtaagt 1800

ttatcaattg cctattcaga atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt 1860

ttctcatcga aaagttcgac agcgtctccg acctcatgca gctctcggag ggcgaagaat 1920

ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctccgggta aatagctgcg 1980

ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga 2040

ttccggaagt gcttgacatt ggggaattca gcgagagcct cacctattgc atctcccgcc 2100

gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctcc ctgaaaccga actccccgct gttctccagc 2160

cggtcgcgga ggccatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg 2220

gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga 2280

ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg 2340

tcgcgcaggc tctcgatgag ctcatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc 2400

tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctcacgga caatggccgc ataacagcgg 2460

tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct 2520

tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc 2580

cggagcttgc aggatcgccg cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac 2640

tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg 2700

acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg 2760

cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca 2820

gcactcgtcc gagggcaaag gaatagtgtg ctacccacgc ttactccacc agagctatta 2880

acatcagaaa tatttattct aataaatagg atgcaaaaaa aaaacccccc ttaataaaaa 2940

aaaaagaaac gattttttat ctaatgaagt ctatgtatct aacaaatgta tgtatcaatg 3000

tttattccgt taaacaaaaa tcagtctgta aaaaaggttc taaataaata ttctgtctag 3060

tgtacacatt ctcccaaaat agtgaaatcc agctgctagc caccctcggt aagttgtacg 3120

ctgccactat tgtcttggac agatttgccg gtgtcttctt gactttcaac gttgcctcca 3180

ccgaagccat cactgctttg gcctctgtgc aaattccaaa gttgtgtgct gaagtcagac 3240

caaacgttgt tgcttacacc gactccttcc aacaatccga catgattgtc aattctgcta 3300

ttggtagata cgatggtgac atctatgaga actactttga cttggtcaag ttgcagaacc 3360

caccatccaa gaccaaggct ccttactctg atgctttgga agccatgttg aacagaccaa 3420

ccttggacga aagagaaaga tttgaaaagt ctgatgaaac cgctgctatc ttgtccaagt 3480

aagaatagaa gagagtgact cttttgataa gagtcgcaaa tttgatttca taagtatata 3540

ttcattatgt aaagtagtaa atggaaaatt cattaaaaaa aaagcaaatt tccgttgtat 3600

gcatactccg aacacaaaac tagccccgga aaaaccctta gttgatagtt gcgaatttag 3660

gtcgacctct catgatttca accttacccc cacgtctcat aactcaaggc cgg 3713

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtggtggtaa gccgacagaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caacaccagc ttgacagtgc 20

<210> 36

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

agtgaattcg agctcggtac cttagaccgc cagagaaggg a 41

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgtcattgcg taacgtggga 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtggtgggtt cccagcttat 20

<210> 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaccatgatt acgccaagct tggaggtacc aacaatcccc g 41

<210> 40

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agtgaattcg agctcggtac cttagaccgc cagagaaggg agtgggaagg cagaaaaata 60

gtccggtatt ttatgtatgg cataaaggag tgtgtataga gacagaagaa taaaaatttc 120

aggtttggtt tatgtgtcgt ttcggttgta gactaatgga cgttgatgat ctctcatcat 180

gatagccatc ggccacctca aatgatcgtg agacgcaaag gctgaaatag ggttgagggt 240

tgcttgatta gacgagcatt ctgagctgtt gtattctgtc gttgatccct ggggctatct 300

ctgctgatcg tcaaacaaga cagccaaaaa aaacatccac ccactggtca gtggggctgt 360

atgcaggcgt acgggtaaat aatttgtacg ttttaggaaa ccattgtgca caaaaagcta 420

aagaaatctt aacgagtggt taacctgtgt aacagaggag ggagggaaaa aatttggcca 480

caaacacaca gacagaatta ttttacaagc tagacaacca agtcaaccct agcccaactt 540

aatttcatag aaaaatcaac caatcctatt gtttgccaaa ataatttata gcccatgtaa 600

tagaatctct tgtctgtcca atttaaatac tttttgtact tatctcaaag ttaacatcac 660

ctgcttagcc ataatccagg gttaacattc tcatccccac caccaccctc ataactgtgg 720

gtcgcctgag atttttcaca taaatttttc acagatttcc cttgaaccaa tttttttttt 780

cccctttgat tttctggatt tttttttttt acaaccactg ctttagacga tctctagctg 840

gttttctttc tatttcattg cctgggtagt cgccgtaacc atttcccacc ttcccattct 900

aaacagtcac agggtcctcc tcaaacaaca gcggtatgac ttggattaga acagaattct 960

tgatcaaagg gaagatcatc aaaccctttt tgcccaacga taagcatccc acgttacgca 1020

atgaca 1026

<210> 41

<211> 1088

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gtggtgggtt cccagcttat ttgaccaaca tcagtcaaat ctttgaaggt caggcattcg 60

aacacttgac gtcgttccat cagagaatct tgaaaatata cccaggtgct aaaatcatca 120

ctgatgacga cgaagctaag caattgagtg aaagcagaac gaatggtaga ttcttgcaca 180

tcaagactgt tgaaccagtg tatgaattct ccgacaaatt gctttacact tctgttggtg 240

tcagaaagta tgctagagac aaggatcttc gttcgtttgt gtccaccaaa gtcattcctg 300

gatcaacttc tgttttggat atgtggactc agcaaactac gtaccattct tggttgtcat 360

tcccaacact tatgaacaga tcattcatta aggaagtcaa gtctgtcaag ttgtctccgt 420

tggagaatgg tatcagaatc attgccgaca agaacaatgc tttgattgag ttggaagctg 480

ctgtcgtcaa aaagtctact gaaaagagtg actacactga gcagttgaat gacttgtcaa 540

ggcagttggc tggaactgtc gattcccctg tcaatggtgg cgttggtcag taccgtgcat 600

tctttacgga tgccaagtac ggaatcaagg aagaagacat caagaaggtt gctttattgc 660

gcgatgcctt caacgacctt gccatgattt tgtaccgttg tttgaatttg catggaagat 720

tcattggtcc aactatgaag gtgtcgcaca atgcattggt tgaattgttc aacaagaact 780

ttaaggagga aattgttgcc ttgagattgg gcgaagaagc tcctaaacct gtgccatcga 840

gccgtgtttc aatcttccag gacagacgtt atgctggaag tcagttgaac gagcgtggtt 900

cgatctcgaa catgtctagc tcgaactatt ctgggtcgag attagcaaga tcaccaacca 960

atgcctccac caattcatca aactcatcga tgaaccgatc aggaagatct tcgggatacc 1020

catcaagcaa catccagcct ggttattcgg ggattgttgg tacctccaag cttggcgtaa 1080

tcatggtc 1088

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcccacgtta cgcaatgaca tcggcaacca actttttact 40

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ctctaggcac tggaactaa 19

<210> 44

<211> 1037

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tcccacgtta cgcaatgaca tcggcaacca actttttact ttttgcaaca ctttctcttc 60

accactctca gaaccaatgc caccgaagaa gggtctcagc caggaggaaa agctctcggc 120

actcctcacc tggttccaag ccagtcattg cttctacaca ctcaaggagg ttgaacagaa 180

ggcgagcaaa gcgtgcaaga tctcgtctat gcagatcaag gacttggttg caagcttagt 240

caacgaaggt ttggtagaac aggaaaagtg tgggaccaca aacttgtact ggtcgttcca 300

gtactcggaa ttcaaacgga agctacagag atacgggcag ctaagacaat cagccgccaa 360

acttcaagcg gataaaggca agttggcgga agagttgcga aacgcatgtg gtgaacggga 420

catggacaac aataggcaag accggatgca acaatacgat caccttgtta acgaggcggc 480

acgtctccag gaggaactaa aactgtcaag gcagatagat accattgacg agttagttca 540

ggccattgat ttcttcaacg agctgataga gaccgtcctc agctacatca gccatcagtc 600

agggaccagc gtgtcgatat tgaaaacgga gtttgagata cccgcagaac tagaagaggc 660

cccccagata agcaatgccg gagttagtgc gtaaatcgag caggcataca ttgccccttt 720

gtattttttc acaggatgct caccccacca cgcccaacat ttccccccac attttattac 780

ccacattgag ccgtcaaatg cattttttta tccgtcgcta gctaaaccaa aattccacat 840

gcgttgcctc agagtatata aacaacgggg caaaaaacat gggattaata gcttatttgt 900

ggattgatat ttttatattt tagttcgccc cttctacgac caagctcaat tggactattt 960

gtcagtggtg tataagctag agattactag actgcttttc tgattcttga tcatcccctt 1020

agttccagtg cctagag 1037

<210> 45

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ttagttccag tgcctagaga tgttggatca acaaaccatt aac 43

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ataagctggg aacccaccac gctagcagct ggatttcact 40

<210> 47

<211> 2545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ttagttccag tgcctagaga tgttggatca acaaaccatt aacatcatta aggctaccgt 60

tccagttttg aaggaacacg gtgttacaat taccaccacc ttctacaaga acttgttcgc 120

taagcatcca gaagttagac cattgttcga tatgggtaga caagaatcct tggaacaacc 180

aaaggctttg gctatgaccg ttttggctgc tgctcagaac attgaaaact tgcctgctat 240

tttgccagcc gttaagaaga ttgctgttaa gcactgtcaa gctggtgttg ctgccgccca 300

ttacccaatt gttggtcaag aattattggg tgctattaag gaagttttgg gtgatgctgc 360

taccgatgat attttggatg cctggggtaa ggcttacggt gtcattgctg atgttttcat 420

tcaagttgaa gctgatttgt acgctcaagc cgtcgaataa tacgtatgag tgcgtttgat 480

tttgtagttt ctgtttgcag taatgagata actattcaga taaggcgggt ggatgtacgt 540

tttgtaagag tttccttaca accctggtgg gtgtgtgagg ttgcatctta gggagagata 600

gcaccttttg cagctctccg tatacagttt tactctttgt aacctatgcc aatcatgtgg 660

ggattcattg tttgcccatg gtggtgcatg caaaatcccc ccaactaccc aatctcacat 720

gaaactcaag cacactagaa aaaaaagatg ttgcgtgggt tcttttgatg ttggggaaaa 780

ctttcgtttg catgcgaacc cgaaaatgga gcaatcttcc ccggggcctc caaataccaa 840

ctcacccgag agagagaaag agacaccacc caccacgaga cggagtatat ccaccaaggt 900

aagtaactca gggttaatga tacaggtgta cacagctcct tccctagcca ttgagtgggt 960

atcacatgac actggtaggt tacaaccacg tttagtagtt attttgtgca attccatggg 1020

gatcaggaag tttggtttgg tgggtgcgtc tactgattcc cctttgtctc tgaaaatctt 1080

ttccctagtg gaacactttg gctgaatgat ataaattcac cttgattccc accctccctt 1140

ctttctctct ctctctgtta cacccaattg aattttcttt ttttttttac tttccctcct 1200

tctttatcat caaagataag taagtttatc aattgcctat tcagaatgaa aaagcctgaa 1260

ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctc atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctc 1320

atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga 1380

tatgtcctcc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg 1440

cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga attcagcgag 1500

agcctcacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctccctgaa 1560

accgaactcc ccgctgttct ccagccggtc gcggaggcca tggatgcgat cgctgcggcc 1620

gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact 1680

acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg 1740

atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctcat gctttgggcc 1800

gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctc 1860

acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc 1920

caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag 1980

acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccgcggct ccgggcgtat 2040

atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat 2100

gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg 2160

cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc 2220

gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaata gtgtgctacc 2280

cacgcttact ccaccagagc tattaacatc agaaatattt attctaataa ataggatgca 2340

aaaaaaaaac cccccttaat aaaaaaaaaa gaaacgattt tttatctaat gaagtctatg 2400

tatctaacaa atgtatgtat caatgtttat tccgttaaac aaaaatcagt ctgtaaaaaa 2460

ggttctaaat aaatattctg tctagtgtac acattctccc aaaatagtga aatccagctg 2520

ctagcgtggt gggttcccag cttat 2545

<210> 48

<211> 8236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cttagaccgc cagagaaggg 420

agtgggaagg cagaaaaata gtccggtatt ttatgtatgg cataaaggag tgtgtataga 480

gacagaagaa taaaaatttc aggtttggtt tatgtgtcgt ttcggttgta gactaatgga 540

cgttgatgat ctctcatcat gatagccatc ggccacctca aatgatcgtg agacgcaaag 600

gctgaaatag ggttgagggt tgcttgatta gacgagcatt ctgagctgtt gtattctgtc 660

gttgatccct ggggctatct ctgctgatcg tcaaacaaga cagccaaaaa aaacatccac 720

ccactggtca gtggggctgt atgcaggcgt acgggtaaat aatttgtacg ttttaggaaa 780

ccattgtgca caaaaagcta aagaaatctt aacgagtggt taacctgtgt aacagaggag 840

ggagggaaaa aatttggcca caaacacaca gacagaatta ttttacaagc tagacaacca 900

agtcaaccct agcccaactt aatttcatag aaaaatcaac caatcctatt gtttgccaaa 960

ataatttata gcccatgtaa tagaatctct tgtctgtcca atttaaatac tttttgtact 1020

tatctcaaag ttaacatcac ctgcttagcc ataatccagg gttaacattc tcatccccac 1080

caccaccctc ataactgtgg gtcgcctgag atttttcaca taaatttttc acagatttcc 1140

cttgaaccaa tttttttttt cccctttgat tttctggatt tttttttttt acaaccactg 1200

ctttagacga tctctagctg gttttctttc tatttcattg cctgggtagt cgccgtaacc 1260

atttcccacc ttcccattct aaacagtcac agggtcctcc tcaaacaaca gcggtatgac 1320

ttggattaga acagaattct tgatcaaagg gaagatcatc aaaccctttt tgcccaacga 1380

taagcatccc acgttacgca atgacatcgg caaccaactt tttacttttt gcaacacttt 1440

ctcttcacca ctctcagaac caatgccacc gaagaagggt ctcagccagg aggaaaagct 1500

ctcggcactc ctcacctggt tccaagccag tcattgcttc tacacactca aggaggttga 1560

acagaaggcg agcaaagcgt gcaagatctc gtctatgcag atcaaggact tggttgcaag 1620

cttagtcaac gaaggtttgg tagaacagga aaagtgtggg accacaaact tgtactggtc 1680

gttccagtac tcggaattca aacggaagct acagagatac gggcagctaa gacaatcagc 1740

cgccaaactt caagcggata aaggcaagtt ggcggaagag ttgcgaaacg catgtggtga 1800

acgggacatg gacaacaata ggcaagaccg gatgcaacaa tacgatcacc ttgttaacga 1860

ggcggcacgt ctccaggagg aactaaaact gtcaaggcag atagatacca ttgacgagtt 1920

agttcaggcc attgatttct tcaacgagct gatagagacc gtcctcagct acatcagcca 1980

tcagtcaggg accagcgtgt cgatattgaa aacggagttt gagatacccg cagaactaga 2040

agaggccccc cagataagca atgccggagt tagtgcgtaa atcgagcagg catacattgc 2100

ccctttgtat tttttcacag gatgctcacc ccaccacgcc caacatttcc ccccacattt 2160

tattacccac attgagccgt caaatgcatt tttttatccg tcgctagcta aaccaaaatt 2220

ccacatgcgt tgcctcagag tatataaaca acggggcaaa aaacatggga ttaatagctt 2280

atttgtggat tgatattttt atattttagt tcgccccttc tacgaccaag ctcaattgga 2340

ctatttgtca gtggtgtata agctagagat tactagactg cttttctgat tcttgatcat 2400

ccccttagtt ccagtgccta gagatgttgg atcaacaaac cattaacatc attaaggcta 2460

ccgttccagt tttgaaggaa cacggtgtta caattaccac caccttctac aagaacttgt 2520

tcgctaagca tccagaagtt agaccattgt tcgatatggg tagacaagaa tccttggaac 2580

aaccaaaggc tttggctatg accgttttgg ctgctgctca gaacattgaa aacttgcctg 2640

ctattttgcc agccgttaag aagattgctg ttaagcactg tcaagctggt gttgctgccg 2700

cccattaccc aattgttggt caagaattat tgggtgctat taaggaagtt ttgggtgatg 2760

ctgctaccga tgatattttg gatgcctggg gtaaggctta cggtgtcatt gctgatgttt 2820

tcattcaagt tgaagctgat ttgtacgctc aagccgtcga ataatacgta tgagtgcgtt 2880

tgattttgta gtttctgttt gcagtaatga gataactatt cagataaggc gggtggatgt 2940

acgttttgta agagtttcct tacaaccctg gtgggtgtgt gaggttgcat cttagggaga 3000

gatagcacct tttgcagctc tccgtataca gttttactct ttgtaaccta tgccaatcat 3060

gtggggattc attgtttgcc catggtggtg catgcaaaat ccccccaact acccaatctc 3120

acatgaaact caagcacact agaaaaaaaa gatgttgcgt gggttctttt gatgttgggg 3180

aaaactttcg tttgcatgcg aacccgaaaa tggagcaatc ttccccgggg cctccaaata 3240

ccaactcacc cgagagagag aaagagacac cacccaccac gagacggagt atatccacca 3300

aggtaagtaa ctcagggtta atgatacagg tgtacacagc tccttcccta gccattgagt 3360

gggtatcaca tgacactggt aggttacaac cacgtttagt agttattttg tgcaattcca 3420

tggggatcag gaagtttggt ttggtgggtg cgtctactga ttcccctttg tctctgaaaa 3480

tcttttccct agtggaacac tttggctgaa tgatataaat tcaccttgat tcccaccctc 3540

ccttctttct ctctctctct gttacaccca attgaatttt cttttttttt ttactttccc 3600

tccttcttta tcatcaaaga taagtaagtt tatcaattgc ctattcagaa tgaaaaagcc 3660

tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctcatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 3720

cctcatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 3780

tggatatgtc ctccgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 3840

tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag 3900

cgagagcctc acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctccc 3960

tgaaaccgaa ctccccgctg ttctccagcc ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc 4020

ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata 4080

cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac 4140

tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tcatgctttg 4200

ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt 4260

cctcacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga 4320

ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca 4380

gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc 4440

gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga 4500

tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt 4560

cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt 4620

actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagtgtgc 4680

tacccacgct tactccacca gagctattaa catcagaaat atttattcta ataaatagga 4740

tgcaaaaaaa aaacccccct taataaaaaa aaaagaaacg attttttatc taatgaagtc 4800

tatgtatcta acaaatgtat gtatcaatgt ttattccgtt aaacaaaaat cagtctgtaa 4860

aaaaggttct aaataaatat tctgtctagt gtacacattc tcccaaaata gtgaaatcca 4920

gctgctagcg tggtgggttc ccagcttatt tgaccaacat cagtcaaatc tttgaaggtc 4980

aggcattcga acacttgacg tcgttccatc agagaatctt gaaaatatac ccaggtgcta 5040

aaatcatcac tgatgacgac gaagctaagc aattgagtga aagcagaacg aatggtagat 5100

tcttgcacat caagactgtt gaaccagtgt atgaattctc cgacaaattg ctttacactt 5160

ctgttggtgt cagaaagtat gctagagaca aggatcttcg ttcgtttgtg tccaccaaag 5220

tcattcctgg atcaacttct gttttggata tgtggactca gcaaactacg taccattctt 5280

ggttgtcatt cccaacactt atgaacagat cattcattaa ggaagtcaag tctgtcaagt 5340

tgtctccgtt ggagaatggt atcagaatca ttgccgacaa gaacaatgct ttgattgagt 5400

tggaagctgc tgtcgtcaaa aagtctactg aaaagagtga ctacactgag cagttgaatg 5460

acttgtcaag gcagttggct ggaactgtcg attcccctgt caatggtggc gttggtcagt 5520

accgtgcatt ctttacggat gccaagtacg gaatcaagga agaagacatc aagaaggttg 5580

ctttattgcg cgatgccttc aacgaccttg ccatgatttt gtaccgttgt ttgaatttgc 5640

atggaagatt cattggtcca actatgaagg tgtcgcacaa tgcattggtt gaattgttca 5700

acaagaactt taaggaggaa attgttgcct tgagattggg cgaagaagct cctaaacctg 5760

tgccatcgag ccgtgtttca atcttccagg acagacgtta tgctggaagt cagttgaacg 5820

agcgtggttc gatctcgaac atgtctagct cgaactattc tgggtcgaga ttagcaagat 5880

caccaaccaa tgcctccacc aattcatcaa actcatcgat gaaccgatca ggaagatctt 5940

cgggataccc atcaagcaac atccagcctg gttattcggg gattgttggt acctccaagc 6000

ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 6060

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 6120

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 6180

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 6240

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 6300

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 6360

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6420

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6480

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6540

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6600

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6660

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6720

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6780

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6840

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6900

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6960

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 7020

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 7080

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 7140

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 7200

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 7260

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 7320

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 7380

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7440

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 7500

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 7560

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7620

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7680

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7740

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 7800

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7860

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7920

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7980

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 8040

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 8100

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 8160

ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 8220

acgaggccct ttcgtc 8236

<210> 49

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

atgggtggtt tcaccgaaaa acaggaagcg ctggttaact cttcttacga agcgttcaaa 60

gcgaacgtac cgcagtactc tgttgttttc tacacctcta tcctggaaaa agcgcctgca 120

gcgaaagacc tgttcccgtt cctggcgaac ggtgttgacc cgacgaaccc gaaactgatc 180

ggtcacgcag aaaaactgtt cggtctggtt cacgactctg cggcgcaact gcgtgcgaaa 240

ggcgcggttg ttgcggacgc cgctctgggt tctctgcacg cgcagaaagg tgttaccgac 300

ccgcagttcg ttgtagttaa ggaagcactg ctgaaaaccg ttaaagaagc ggttggtgac 360

aaatggtctg acgagctgtc taacgcgtgg gaagttgcgt ataatgaact ggcggctgcc 420

ctcaagaaag cgttttaa 438

<210> 50

<211> 145

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Met Gly Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Val Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Pro Phe Leu

35 40 45

Ala Asn Gly Val Asp Pro Thr Asn Pro Lys Leu Ile Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val His Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Ala Lys

65 70 75 80

Gly Ala Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Leu His Ala Gln Lys

85 90 95

Gly Val Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Asn

115 120 125

Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Ala Leu Lys Lys Ala

130 135 140

Phe

145

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tgttcaaatc ttcacgacat aaatgggcgg cttcaccg 38

<210> 52

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

atcaaacgca ctcatacgta ttagaatgcc ttcttcaatg cagc 44

<210> 53

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tgttcaaatc ttcacgacat aatgggcggc ttcaccgaaa agcaagaagc tttggtcaac 60

tccagttacg aagcattcaa agccaacgtc ccacagtact ccgtcgtgtt ttacacatcc 120

attttggaaa aggctcctgc tgccaaggac ttgtttcctt tcttggcaaa tggagtggac 180

cctacaaacc ctaagttgat cggccacgcc gagaaattgt tcggcttggt tcacgactcc 240

gccgcacagt tgagagccaa aggcgctgtg gtcgccgatg ctgccttagg ctcattgcac 300

gcacaaaagg gcgtgactga ccctcagttc gtggtcgtta aggaggcctt gttgaaaact 360

gtcaaagagg ccgtcggtga taagtggtcc gatgagttgt caaacgcttg ggaggtcgcc 420

tacaacgaat tggctgctgc attgaagaag gcattctaat acgtatgagt gcgtttgat 479

<210> 54

<211> 3710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

aaaataaggc gacggagtta gtgtccgtta tgtgacacat ttttcattgg cggagattat 60

accgagctcc aattgtaata tttcgggaga aatatcgttg gggtaaaaca acagagagag 120

agagggagag atggttctgg tagaattata atctggttgt tgcaaatgct actgatcgac 180

tctggcaatg tctgtagctc gctagttgta tgcaacttag gtgttatgca tacacacggt 240

tattcggttg aattgtggag taaaaattgt ctgagttgtg tcttagctac tggctggccc 300

cccgcgaaag ataatcaaaa ttacacttgt gaatttttgc acacacaccg attaacattt 360

cccttttttg tccaccgata cacgcttgcc tcttcttttt tttctctgtg cttccccctc 420

ctgtgacttt ttccaccatt gatataaaat caactccatt tccctaaaat ctccccagat 480

tctaaaaaca acttcttctc ttctgctttt cctttttttt tgttatattt atttaccatc 540

cctttttttt gaatagttat tccccactaa cattgttcaa atcttcacga cataatgggc 600

ggcttcaccg aaaagcaaga agctttggtc aactccagtt acgaagcatt caaagccaac 660

gtcccacagt actccgtcgt gttttacaca tccattttgg aaaaggctcc tgctgccaag 720

gacttgtttc ctttcttggc aaatggagtg gaccctacaa accctaagtt gatcggccac 780

gccgagaaat tgttcggctt ggttcacgac tccgccgcac agttgagagc caaaggcgct 840

gtggtcgccg atgctgcctt aggctcattg cacgcacaaa agggcgtgac tgaccctcag 900

ttcgtggtcg ttaaggaggc cttgttgaaa actgtcaaag aggccgtcgg tgataagtgg 960

tccgatgagt tgtcaaacgc ttgggaggtc gcctacaacg aattggctgc tgcattgaag 1020

aaggcattct aatacgtatg agtgcgtttg attttgtagt ttctgtttgc agtaatgaga 1080

taactattca gataaggcgg gtggatgtac gttttgtaag agtttcctta caaccctggt 1140

gggtgtgtga ggttgcatct tagggagaga tagcaccttt tgcagctctc cgtatacagt 1200

tttactcttt gtaacctatg ccaatcatgt ggggattcat tgtttgccca tggtggtgca 1260

tgcaaaatcc ccccaactac ccaatctcac atgaaactca agcacactag aaaaaaaaga 1320

tgttgcgtgg gttcttttga tgttggggaa aactttcgtt tgcatgcgaa cccgaaaatg 1380

gagcaatctt ccccggggcc tccaaatacc aactcacccg agagagagaa agagacacca 1440

cccaccacga gacggagtat atccaccaag gtaagtaact cagggttaat gatacaggtg 1500

tacacagctc cttccctagc cattgagtgg gtatcacatg acactggtag gttacaacca 1560

cgtttagtag ttattttgtg caattccatg gggatcagga agtttggttt ggtgggtgcg 1620

tctactgatt cccctttgtc tctgaaaatc ttttccctag tggaacactt tggctgaatg 1680

atataaattc accttgattc ccaccctccc ttctttctct ctctctctgt tacacccaat 1740

tgaattttct tttttttttt actttccctc cttctttatc atcaaagata agtaagttta 1800

tcaattgcct attcagaatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 1860

tcatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tcatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 1920

gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct ccgggtaaat agctgcgccg 1980

atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 2040

cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctcac ctattgcatc tcccgccgtg 2100

cacagggtgt cacgttgcaa gacctccctg aaaccgaact ccccgctgtt ctccagccgg 2160

tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 2220

cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 2280

ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 2340

cgcaggctct cgatgagctc atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 2400

tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tcacggacaa tggccgcata acagcggtca 2460

ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 2520

ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 2580

agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 2640

atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 2700

caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 2760

ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 2820

ctcgtccgag ggcaaaggaa tagtgtgcta cccacgctta ctccaccaga gctattaaca 2880

tcagaaatat ttattctaat aaataggatg caaaaaaaaa acccccctta ataaaaaaaa 2940

aagaaacgat tttttatcta atgaagtcta tgtatctaac aaatgtatgt atcaatgttt 3000

attccgttaa acaaaaatca gtctgtaaaa aaggttctaa ataaatattc tgtctagtgt 3060

acacattctc ccaaaatagt gaaatccagc tgctagccac cctcggtaag ttgtacgctg 3120

ccactattgt cttggacaga tttgccggtg tcttcttgac tttcaacgtt gcctccaccg 3180

aagccatcac tgctttggcc tctgtgcaaa ttccaaagtt gtgtgctgaa gtcagaccaa 3240

acgttgttgc ttacaccgac tccttccaac aatccgacat gattgtcaat tctgctattg 3300

gtagatacga tggtgacatc tatgagaact actttgactt ggtcaagttg cagaacccac 3360

catccaagac caaggctcct tactctgatg ctttggaagc catgttgaac agaccaacct 3420

tggacgaaag agaaagattt gaaaagtctg atgaaaccgc tgctatcttg tccaagtaag 3480

aatagaagag agtgactctt ttgataagag tcgcaaattt gatttcataa gtatatattc 3540

attatgtaaa gtagtaaatg gaaaattcat taaaaaaaaa gcaaatttcc gttgtatgca 3600

tactccgaac acaaaactag ccccggaaaa acccttagtt gatagttgcg aatttaggtc 3660

gacctctcat gatttcaacc ttacccccac gtctcataac tcaaggccgg 3710

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ttgtccaccg atacacgctt 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

cccttttgtg cgtgcaatga 20

<210> 57

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

ttccagtgcc tagagatgtt caaatcttca cgacata 37

<210> 58

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ctgggaaccc accacgctag cagctggatt tcact 35

<210> 59

<211> 2538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ttccagtgcc tagagatggg cggcttcacc gaaaagcaag aagctttggt caactccagt 60

tacgaagcat tcaaagccaa cgtcccacag tactccgtcg tgttttacac atccattttg 120

gaaaaggctc ctgctgccaa ggacttgttt cctttcttgg caaatggagt ggaccctaca 180

aaccctaagt tgatcggcca cgccgagaaa ttgttcggct tggttcacga ctccgccgca 240

cagttgagag ccaaaggcgc tgtggtcgcc gatgctgcct taggctcatt gcacgcacaa 300

aagggcgtga ctgaccctca gttcgtggtc gttaaggagg ccttgttgaa aactgtcaaa 360

gaggccgtcg gtgataagtg gtccgatgag ttgtcaaacg cttgggaggt cgcctacaac 420

gaattggctg ctgcattgaa gaaggcattc taatacgtat gagtgcgttt gattttgtag 480

tttctgtttg cagtaatgag ataactattc agataaggcg ggtggatgta cgttttgtaa 540

gagtttcctt acaaccctgg tgggtgtgtg aggttgcatc ttagggagag atagcacctt 600

ttgcagctct ccgtatacag ttttactctt tgtaacctat gccaatcatg tggggattca 660

ttgtttgccc atggtggtgc atgcaaaatc cccccaacta cccaatctca catgaaactc 720

aagcacacta gaaaaaaaag atgttgcgtg ggttcttttg atgttgggga aaactttcgt 780

ttgcatgcga acccgaaaat ggagcaatct tccccggggc ctccaaatac caactcaccc 840

gagagagaga aagagacacc acccaccacg agacggagta tatccaccaa ggtaagtaac 900

tcagggttaa tgatacaggt gtacacagct ccttccctag ccattgagtg ggtatcacat 960

gacactggta ggttacaacc acgtttagta gttattttgt gcaattccat ggggatcagg 1020

aagtttggtt tggtgggtgc gtctactgat tcccctttgt ctctgaaaat cttttcccta 1080

gtggaacact ttggctgaat gatataaatt caccttgatt cccaccctcc cttctttctc 1140

tctctctctg ttacacccaa ttgaattttc tttttttttt tactttccct ccttctttat 1200

catcaaagat aagtaagttt atcaattgcc tattcagaat gaaaaagcct gaactcaccg 1260

cgacgtctgt cgagaagttt ctcatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctcatgcagc 1320

tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc 1380

tccgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg 1440

catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctca 1500

cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctccct gaaaccgaac 1560

tccccgctgt tctccagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta 1620

gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc 1680

gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg 1740

acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct catgctttgg gccgaggact 1800

gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctcacggaca 1860

atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg 1920

aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct 1980

acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc 2040

gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt 2100

gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac 2160

aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata 2220

gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga atagtgtgct acccacgctt 2280

actccaccag agctattaac atcagaaata tttattctaa taaataggat gcaaaaaaaa 2340

aacccccctt aataaaaaaa aaagaaacga ttttttatct aatgaagtct atgtatctaa 2400

caaatgtatg tatcaatgtt tattccgtta aacaaaaatc agtctgtaaa aaaggttcta 2460

aataaatatt ctgtctagtg tacacattct cccaaaatag tgaaatccag ctgctagcgt 2520

ggtgggttcc cagcttat 2538

<210> 60

<211> 8233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cttagaccgc cagagaaggg 420

agtgggaagg cagaaaaata gtccggtatt ttatgtatgg cataaaggag tgtgtataga 480

gacagaagaa taaaaatttc aggtttggtt tatgtgtcgt ttcggttgta gactaatgga 540

cgttgatgat ctctcatcat gatagccatc ggccacctca aatgatcgtg agacgcaaag 600

gctgaaatag ggttgagggt tgcttgatta gacgagcatt ctgagctgtt gtattctgtc 660

gttgatccct ggggctatct ctgctgatcg tcaaacaaga cagccaaaaa aaacatccac 720

ccactggtca gtggggctgt atgcaggcgt acgggtaaat aatttgtacg ttttaggaaa 780

ccattgtgca caaaaagcta aagaaatctt aacgagtggt taacctgtgt aacagaggag 840

ggagggaaaa aatttggcca caaacacaca gacagaatta ttttacaagc tagacaacca 900

agtcaaccct agcccaactt aatttcatag aaaaatcaac caatcctatt gtttgccaaa 960

ataatttata gcccatgtaa tagaatctct tgtctgtcca atttaaatac tttttgtact 1020

tatctcaaag ttaacatcac ctgcttagcc ataatccagg gttaacattc tcatccccac 1080

caccaccctc ataactgtgg gtcgcctgag atttttcaca taaatttttc acagatttcc 1140

cttgaaccaa tttttttttt cccctttgat tttctggatt tttttttttt acaaccactg 1200

ctttagacga tctctagctg gttttctttc tatttcattg cctgggtagt cgccgtaacc 1260

atttcccacc ttcccattct aaacagtcac agggtcctcc tcaaacaaca gcggtatgac 1320

ttggattaga acagaattct tgatcaaagg gaagatcatc aaaccctttt tgcccaacga 1380

taagcatccc acgttacgca atgacatcgg caaccaactt tttacttttt gcaacacttt 1440

ctcttcacca ctctcagaac caatgccacc gaagaagggt ctcagccagg aggaaaagct 1500

ctcggcactc ctcacctggt tccaagccag tcattgcttc tacacactca aggaggttga 1560

acagaaggcg agcaaagcgt gcaagatctc gtctatgcag atcaaggact tggttgcaag 1620

cttagtcaac gaaggtttgg tagaacagga aaagtgtggg accacaaact tgtactggtc 1680

gttccagtac tcggaattca aacggaagct acagagatac gggcagctaa gacaatcagc 1740

cgccaaactt caagcggata aaggcaagtt ggcggaagag ttgcgaaacg catgtggtga 1800

acgggacatg gacaacaata ggcaagaccg gatgcaacaa tacgatcacc ttgttaacga 1860

ggcggcacgt ctccaggagg aactaaaact gtcaaggcag atagatacca ttgacgagtt 1920

agttcaggcc attgatttct tcaacgagct gatagagacc gtcctcagct acatcagcca 1980

tcagtcaggg accagcgtgt cgatattgaa aacggagttt gagatacccg cagaactaga 2040

agaggccccc cagataagca atgccggagt tagtgcgtaa atcgagcagg catacattgc 2100

ccctttgtat tttttcacag gatgctcacc ccaccacgcc caacatttcc ccccacattt 2160

tattacccac attgagccgt caaatgcatt tttttatccg tcgctagcta aaccaaaatt 2220

ccacatgcgt tgcctcagag tatataaaca acggggcaaa aaacatggga ttaatagctt 2280

atttgtggat tgatattttt atattttagt tcgccccttc tacgaccaag ctcaattgga 2340

ctatttgtca gtggtgtata agctagagat tactagactg cttttctgat tcttgatcat 2400

ccccttagtt ccagtgccta gagatgggcg gcttcaccga aaagcaagaa gctttggtca 2460

actccagtta cgaagcattc aaagccaacg tcccacagta ctccgtcgtg ttttacacat 2520

ccattttgga aaaggctcct gctgccaagg acttgtttcc tttcttggca aatggagtgg 2580

accctacaaa ccctaagttg atcggccacg ccgagaaatt gttcggcttg gttcacgact 2640

ccgccgcaca gttgagagcc aaaggcgctg tggtcgccga tgctgcctta ggctcattgc 2700

acgcacaaaa gggcgtgact gaccctcagt tcgtggtcgt taaggaggcc ttgttgaaaa 2760

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cctacaacga attggctgct gcattgaaga aggcattcta atacgtatga gtgcgtttga 2880

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ttttgtaaga gtttccttac aaccctggtg ggtgtgtgag gttgcatctt agggagagat 3000

agcacctttt gcagctctcc gtatacagtt ttactctttg taacctatgc caatcatgtg 3060

gggattcatt gtttgcccat ggtggtgcat gcaaaatccc cccaactacc caatctcaca 3120

tgaaactcaa gcacactaga aaaaaaagat gttgcgtggg ttcttttgat gttggggaaa 3180

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actcacccga gagagagaaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata tccaccaagg 3300

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tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc aattccatgg 3420

ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct ctgaaaatct 3480

tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc caccctccct 3540

tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta ctttccctcc 3600

ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga aaaagcctga 3660

actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct 3720

catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg 3780

atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg 3840

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gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag acctccctga 3960

aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc 4020

cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac 4080

tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt 4140

gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca tgctttgggc 4200

cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct 4260

cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc 4320

ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca 4380

gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta 4440

tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca atttcgatga 4500

tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg 4560

gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact 4620

cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat agtgtgctac 4680

ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata aataggatgc 4740

aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa tgaagtctat 4800

gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag tctgtaaaaa 4860

aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg aaatccagct 4920

gctagcgtgg tgggttccca gcttatttga ccaacatcag tcaaatcttt gaaggtcagg 4980

cattcgaaca cttgacgtcg ttccatcaga gaatcttgaa aatataccca ggtgctaaaa 5040

tcatcactga tgacgacgaa gctaagcaat tgagtgaaag cagaacgaat ggtagattct 5100

tgcacatcaa gactgttgaa ccagtgtatg aattctccga caaattgctt tacacttctg 5160

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ttcctggatc aacttctgtt ttggatatgt ggactcagca aactacgtac cattcttggt 5280

tgtcattccc aacacttatg aacagatcat tcattaagga agtcaagtct gtcaagttgt 5340

ctccgttgga gaatggtatc agaatcattg ccgacaagaa caatgctttg attgagttgg 5400

aagctgctgt cgtcaaaaag tctactgaaa agagtgacta cactgagcag ttgaatgact 5460

tgtcaaggca gttggctgga actgtcgatt cccctgtcaa tggtggcgtt ggtcagtacc 5520

gtgcattctt tacggatgcc aagtacggaa tcaaggaaga agacatcaag aaggttgctt 5580

tattgcgcga tgccttcaac gaccttgcca tgattttgta ccgttgtttg aatttgcatg 5640

gaagattcat tggtccaact atgaaggtgt cgcacaatgc attggttgaa ttgttcaaca 5700

agaactttaa ggaggaaatt gttgccttga gattgggcga agaagctcct aaacctgtgc 5760

catcgagccg tgtttcaatc ttccaggaca gacgttatgc tggaagtcag ttgaacgagc 5820

gtggttcgat ctcgaacatg tctagctcga actattctgg gtcgagatta gcaagatcac 5880

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gatacccatc aagcaacatc cagcctggtt attcggggat tgttggtacc tccaagcttg 6000

gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 6060

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 6120

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 6180

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 6240

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 6300

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 6360

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 6420

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 6480

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 6540

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 6600

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 6660

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 6720

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6780

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 6840

ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 6900

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 6960

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 7020

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 7080

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 7140

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 7200

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 7260

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 7320

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 7380

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 7440

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 7500

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 7560

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 7620

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 7680

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 7740

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 7800

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 7860

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 7920

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 7980

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 8040

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 8100

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 8160

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 8220

aggccctttc gtc 8233

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

tcccacgtta cgcaatgaca 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

cccttttgtg cgtgcaatga 20

Claims

1.血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中的应用；

所述应用为将所述血红蛋白基因导入出发菌株中构建长链二元酸的生产菌株；

所述出发菌株为假丝酵母；

所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌（Vitreoscilla）的血红蛋白vgb基因或四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus）的血红蛋白lhb基因。

2.一种长链二元酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性，所述提高的血红蛋白的活性通过增加所述出发菌株中血红蛋白基因的拷贝数实现；

所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌（Vitreoscilla）的血红蛋白vgb基因或四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus）的血红蛋白lhb基因；

所述出发菌株为假丝酵母。

3.根据权利要求2所述的生产菌株，其特征在于，所述菌株还具有与出发菌株相比降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性，所述降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性通过如下方式中的一种或多种实现：

（1）失活所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因；

（2）将所述出发菌株中乙酰辅酶A氧化酶基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件；

（3）采用血红蛋白基因替换所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因。

4.根据权利要求3所述的生产菌株，其特征在于，以一个拷贝的血红蛋白基因替换所述出发菌株的一个拷贝的乙酰辅酶A氧化酶基因。

5.根据权利要求2~4任一项所述的生产菌株，其特征在于，所述出发菌株为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的假丝酵母。

6.权利要求2~5任一项所述的生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：构建含有所述血红蛋白基因的重组DNA片段或载体，将所述重组DNA片段或载体导入所述出发菌株中。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述血红蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.49所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括构建含有所述乙酰辅酶A氧化酶基因或所述乙酰辅酶A氧化酶基因的上下游同源臂的重组DNA片段或载体；将所述重组DNA片段或载体导入所述出发菌株中。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A氧化酶基因为POX2、POX4和POX5中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

11.权利要求2~5任一项所述的生产菌株或权利要求6~10任一项所述的构建方法构建得到的生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

12.一种长链二元酸生产菌株的改造方法，其特征在于，包括用血红蛋白基因替换所述长链二元酸生产菌株的基因组乙酰辅酶A氧化酶基因的步骤，

利用所述改造方法得到的长链二元酸生产菌株的发酵产物中杂酸含量相对于乙酰辅酶A氧化酶基因未被血红蛋白基因替换的生产菌株显著降低；

所述长链二元酸生产菌株为假丝酵母。

13.根据权利要求12所述的长链二元酸生产菌株的改造方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A氧化酶基因为POX2、POX4和POX5中的一种或多种。

14.根据权利要求13所述的长链二元酸生产菌株的改造方法，其特征在于，采用同源重组的方式进行替换。

15.一种长链二元酸的生产方法，其特征在于，发酵权利要求2~5任一项所述的生产菌株或权利要求6~10任一项所述的构建方法构建得到的生产菌株或权利要求12~14任一项所述的改造方法改造获得的生产菌株，得到长链二元酸。