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CN112292143A - 溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途 - Google Patents

溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途 Download PDF

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CN112292143A
CN112292143A CN201980036016.9A CN201980036016A CN112292143A CN 112292143 A CN112292143 A CN 112292143A CN 201980036016 A CN201980036016 A CN 201980036016A CN 112292143 A CN112292143 A CN 112292143A
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activity
gram
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CN201980036016.9A
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R·舒赫
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Original Assignee
Contrafect Corp
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Abstract

本公开涉及溶素‑AMP多肽构建体、分离的溶素多肽以及包含所述分离的多肽和/或溶素‑AMP多肽构建体的药物组合物。本文还提供了使用所述溶素‑AMP多肽构建体、分离的溶素多肽和药物组合物的方法，包括治疗其中存在肺表面活性剂的器官或组织的细菌感染或与生物膜相关的革兰氏阴性细菌感染的方法。另外，本文公开了编码所述溶素‑AMP多肽构建体和分离的溶素多肽的分离的多核苷酸。

Description

溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核 苷酸及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月29日提交的PCT申请号PCT/US2019/024912的优先权，并且依赖于其申请日，所述PCT申请号PCT/US2019/024912要求2018年8月24日提交的美国临时申请号62/722,793、2018年3月29日提交的美国临时申请号62/650,235和2018年8月23日提交的美国临时申请号62/721,969的优先权，并且还依赖于2019年5月17日提交的美国临时申请号62/849,320和2019年6月13日提交的美国临时申请号62/860,836(其各自通过引用以其整体并入本文)的申请日。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本，在2019年8月22日创建，命名为0341_0021-00-304_ST25.txt，且大小为249,856字节。
公开领域
本公开涉及抗细菌剂的领域，并且更具体地涉及具有针对革兰氏阴性细菌的溶素活性的多肽，以及这些药剂在杀死革兰氏阴性细菌和对抗细菌感染和污染中的用途。
背景
革兰氏阴性细菌，特别是假单胞菌属的成员和新出现的多药抗性病原体鲍氏不动杆菌，是严重且可能威胁生命的侵入性感染的重要原因。假单胞菌感染在烧伤伤口、慢性伤口、慢性阻塞性肺病症(COPD)、囊性纤维化、植入的生物材料上以及医院表面和供水系统(在此处其对脆弱患者构成许多威胁)内的表面生长中构成主要问题。
一旦在患者中建立，铜绿假单胞菌可能特别难以治疗。该基因组编码许多抗性基因，包括赋予对β-内酰胺和氨基糖苷抗生素的抗性的多药外排泵和酶，由于缺乏新型抗微生物治疗剂，这使针对该革兰氏阴性病原体的疗法特别有挑战性。铜绿假单胞菌在生物膜中生长的能力使该挑战复杂化，所述能力可以通过保护细菌免于宿主防御和化学疗法来增强其引起感染的能力。
在健康护理环境中，铜绿假单胞菌的药物抗性菌株的发生率正在增加。在社区医院中的健康护理相关的血流感染(BSI)的一项观察性研究中，铜绿假单胞菌是前四种多药抗性(MDR)病原体之一，占18%的总体医院死亡率。此外，充分记录了MDR铜绿假单胞菌的暴发。结果不佳与经常需要用最后使用的药物(诸如粘菌素)进行治疗的铜绿假单胞菌的MDR菌株相关。
此外，由于感染环境中的因素(诸如肺表面活性剂)，而不是抗生素抗性发展，而观察到某些抗生素在抗击感染中的有效性降低。某些抗生素，诸如达托霉素，例如在严重的社区获得性肺炎的临床试验中未能符合标准。已经显示这种缺陷是由于达托霉素和肺表面活性剂之间的相互作用，所述肺表面活性剂抑制该抗生素的活性，特别是在肺部环境中，且更通常在其中存在肺部表面活性剂的气道环境中。Silverman, J.A. 等人, “SurfactantInhibition of Daptomycin,” JID, 191: 2149-2152 (2005)。因此，达托霉素未指示用于治疗肺部感染和更通常气道(特别是下呼吸道)感染，并且本领域技术人员将不采用包括达托霉素的治疗方案来治疗此类感染。达托霉素在肺表面活性剂存在的情况下不能抗击感染，已经引人注目地显示于例如Koplowicz, Y.B.等人, “Development of daptomycin-susceptible methicillin-resistant Staphylococcus aureus Pneumonia duringhigh-dose daptomycin therapy”, Clin Infect Dis. 49(8):1286-7 (2009)。近来的研究已经集中于通过测试和评估结构相关的脂肽A54145的杂合分子的抗细菌活性来克服达托霉素在表面活性剂存在的情况下的无活性。Nguyen, K.T. 等人, “Geneticallyengineered lipopeptide antibiotics related to A54145 and daptomycin withimproved properties”, Antimicrob. Agents Chemother. 2010 Apr; 54(4):1404-1413。
肺表面活性剂(上皮内衬液的主要组分)，是一种复杂的脂质-和-蛋白混合物，其覆盖气道的内表面，降低肺泡内的表面张力。表面活性剂主要由二棕榈酰磷脂酰胆碱(在所有哺乳动物物种中的~80%)连同显著量的磷脂酰甘油(PG)和较小量的次要磷脂、中性脂质和胆固醇构成。存在4种蛋白组分：亲水性蛋白SP-A和SP-D和疏水性蛋白SP-B和SP-C。Goerke, J., “Pulmonary Surfactant: functions and molecular composition”,Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1408:79-89。将达托霉素插入由磷脂酰胆碱(PC)和PC/PG构成的人工膜囊泡中。Lakey J.H. 等人, “Fluorescence indicates a calcium-dependent interaction between the lipopeptide antibiotic LY146032 andphospholipid membranes,” Biochemistry 1988; 27:4639-45; Jung, D. 等人,“Structural transitions as determinants of the action of the calcium-dependent antibiotic daptomycin”, Chem. Biol. 2004; 11:949-57。
因此，在其他方面有效的抗生素被存在于作为感染部位的器官或组织中的因子(诸如在肺部感染或其他气道感染和更通常呼吸道感染的情况下，肺表面活性剂)抑制的程度上，会恢复且甚至加强此类抗生素的活性的治疗方案会具有商业和公共健康价值。
除了上面讨论的达托霉素以外，已知被肺表面活性剂抑制的其他抗生素包括但不限于：妥布霉素，一种用于治疗由革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(肺炎的常见原因)引起的感染的氨基糖苷((van ’t Veen, A. 等人, “Influence of pulmonary surfactant onin vitro bactericidal activities of amoxicillin, ceftazidime, andtobramycin”, Antimicrob. Agents Chemother. 39:329-333 (1995))，以及粘菌素，一种针对革兰氏阴性细菌(包括铜绿假单胞菌)具有广泛活性的环状脂肽(多粘菌素)。Schwameis, R. 等人, “Effect of Pulmonary surfactant on antimicrobial activityin vitro”, Antimicrob. Agents Chemother. 57(10):5151-54 (2013)。
为了解决对具有新型机制的新的抗微生物剂的需求，研究人员正在研究各种药物和生物制剂。一类这样的抗微生物剂包括溶素。溶素是细胞壁肽聚糖水解酶，其充当“分子剪刀”以降解用于维持细胞形状且用于承受内部渗透压的肽聚糖网状结构。肽聚糖的降解导致渗透裂解。然而，至少部分地由于存在在革兰氏阳性细菌中不存在且限制对次相邻的肽聚糖的接近的外膜(OM)，溶素通常针对革兰氏阴性细菌不是有效的。还已经开发了修饰的溶素(“artylysins”)。包含与具有聚阳离子、两亲性和疏水性特征的特定α-螺旋结构域融合的溶素的这些药剂能够跨OM易位。然而，artylysins通常表现出低体内活性。
尽管近来的出版物已经描述了可以在体内以不同水平的效力针对革兰氏阴性细菌使用的新型溶素，但仍然存在对于用于治疗侵入性感染的，在人血液基质或肺表面活性剂中保留靶向MDR铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性细菌的活性的额外抗细菌剂的连续医疗需求。
概述
本申请涉及包含溶素和抗微生物肽(AMP)的新型多肽构建体，其可用于例如治疗细菌感染，包括由革兰氏阴性细菌、特别是多药抗性的革兰氏阴性细菌(包括但不限于铜绿假单胞菌)引起的感染。还提供了新鉴定的溶素及其变体，以及其他溶素的变体。如本文所述，所述溶素-AMP多肽构建体、新获得的溶素和变体溶素可以包含在药物组合物中，所述药物组合物可以用于例如治疗细菌感染。本文还尤其提供了使用所述溶素-AMP多肽构建体、新鉴定的溶素和变体溶素用于治疗细菌感染、加强抗生素的效力并通常抑制革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌的生长、减少革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌的种群或杀死革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌的方法。还提供了溶素变体多肽和编码所述构建体和溶素变体的多核苷酸。在某些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体、新获得的溶素和变体溶素可用于治疗其中存在肺表面活性剂的器官或组织中的细菌感染，诸如例如肺炎(包括医院获得性肺炎)和囊性纤维化。在其他实施方案中，可以使用所述溶素-AMP多肽构建体、新获得的溶素和变体溶素来治疗与生物膜相关的革兰氏阴性细菌感染。
在一个方面，本公开涉及溶素-AMP多肽构建体，其包含：(a)包含以下多肽序列的第一组分：(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQID NO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ IDNO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333(SEQ ID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或(iii)所述溶素的活性片段；和
b)包含以下多肽序列的第二组分：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1(SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ IDNO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1(SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915(SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ IDNO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ IDNO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，其中所述溶素-AMP多肽构建体包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
在另一个方面，本公开涉及分离的多肽，其包含选自GN121 (SEQ ID NO:175)、GN217溶素(SEQ ID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)、GN428 (SEQ ID NO:60)和GN486 (SEQID NO:66)的溶素或其活性片段，其中所述溶素或其活性片段在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
本公开还涉及分离的多核苷酸，其包含编码溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的核酸分子，所述核酸分子包含：
(a)编码第一组分的第一核酸分子，所述第一组分包含：(i)选自以下的溶素：GN76(SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316(SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485 (SEQ IDNO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个具有至少80%同一性；或(iii)所述溶素的活性片段；和
(b)编码第二组分的第二核酸分子，所述第二组分包含：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ IDNO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11(SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ IDNO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1(SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ IDNO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2(SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ IDNO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ IDNO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，其中所述溶素-AMP多肽构建体包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
在又另一个方面，本公开涉及分离的多核苷酸序列，其包含编码选自GN121 (SEQID NO:175)、GN217溶素(SEQ ID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ IDNO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)、GN428 (SEQ ID NO:60)和GN486 (SEQ ID NO:66)的溶素或其活性片段的核酸分子，其中所述溶素或其活性片段在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
在一个方面，本公开涉及药物组合物，其包含分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体和药学上可接受的载体，
其中所述分离的溶素包括以下中的至少一种：(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123(SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ IDNO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，(ii)其活性片段，或(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：(a)包含以下多肽序列的第一组分：(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ IDNO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485(SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或(iii)所述溶素的活性片段；和b)包含以下多肽序列的第二组分：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ IDNO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ IDNO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1(SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915(SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ IDNO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ IDNO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，其中所述药物组合物包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
在另一个方面，本公开涉及治疗由革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的方法，其中所述革兰氏阴性细菌包括铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种，所述方法包括：向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用如本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，所述细菌感染在其中存在肺表面活性剂的器官或组织中，诸如在肺或气道中。
在又另一个方面，本公开涉及预防或治疗细菌感染的方法，其包括：向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一有效量的如本文所述的药物组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的组合。
在一个方面，本公开涉及用于加强适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的效力的方法，其包括：共同施用所述抗生素与含有有效量的分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的组合物，
其中所述分离的溶素包含以下中的至少一种：(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123(SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ IDNO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，或(ii)其活性片段，或(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：(a)包含以下多肽序列的第一组分：(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ IDNO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485(SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或(iii)所述溶素的活性片段；和b)包含以下多肽序列的第二组分：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ IDNO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4(SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12(SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ IDNO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915(SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ IDNO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ IDNO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，其中所述组合物包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌，且其中在人血清存在或不存在或存在和不存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，与单独施用所述抗生素或所述溶素或溶素-AMP多肽构建体相比，所述组合的施用更有效地抑制革兰氏阴性细菌的生长，或减少革兰氏阴性细菌的种群，或杀死革兰氏阴性细菌。
在另一个方面，本公开涉及抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，其中所述革兰氏阴性细菌的至少一种物种是铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种，所述方法包括：使所述细菌与含有有效量的分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的组合物接触，
其中所述分离的溶素包含以下中的至少一种：(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123(SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ IDNO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，或(ii)其活性片段，或(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：(a)包含以下多肽序列的第一组分：(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ IDNO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485(SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或(iii)所述溶素的活性片段；和b)包含以下多肽序列的第二组分：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ IDNO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ IDNO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1(SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915(SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ IDNO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ IDNO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，且其中所述组合物包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
附图简述
图1描绘由I-Tasser预测的衣原体噬菌体肽(Chp)家族成员Chp1、Chp 2、Chp4、Chp5、Chp6、Chp7、Ecp1、Ecp2和Osp1的结构的三维模型。包括人先天性免疫效应肽LL-37用于比较。α螺旋结构是明显的，并且顶部末端通常是N-末端。
图2A是显示如实施例6中所述，在N-苯基-1-萘胺(NPN)和缓冲液、GN121或GN351存在的情况下铜绿假单胞菌随时间的百分比相对荧光单位(RFU)的图。
图2B是显示如实施例6中所述，在NPN和缓冲液、GN428或GN370存在的情况下铜绿假单胞菌随时间的百分比RFU的图。
图3是一系列显微照片，其显示用100%人血清中的GN121 (10 µg/mL)或缓冲液对照(“未处理”)处理15分钟的铜绿假单胞菌菌株1292的显微镜分析(2000倍放大)。将样品使用活/死细胞活力试剂盒(ThermoFisher)染色，并通过微分干涉反差(DIC)和荧光显微镜两者进行检查。显微照片显示，在未处理的行中不存在死细菌，且在经处理的行中的活细菌减少，如实施例7中所述。
图4A-4E显示如实施例9中所述，在21天连续传代中达到铜绿假单胞菌(菌株WC-452)的最小抑制浓度(MIC)所需的GN溶素和环丙沙星的倍数变化：GN121 (图4A)、GN351(图4B)、GN370 (图4C)、GN428 (图4D)和环丙沙星(图4E)。
详述
定义
除非上下文另外明确指明，否则本文使用的以下术语及其同源词应具有以下含义：
“载体”是指与活性化合物一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。此类载体可以是无菌液体，诸如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
“药学上可接受的载体”是指生理上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。载体必须是在通常用于药物中的量下不对待治疗的受试者有害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其他成分相容，而不使组合物不适合于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适用于本文所提供的受试者，而没有不适当的不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)。当其风险超过组合物所提供的益处时，副作用是“不适当的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂、诸如油/水乳剂和微乳剂。合适的药物载体描述于例如E.W. Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版。所述药学上可接受的载体可以是自然界中不存在的载体。
“杀细菌的”或“杀细菌活性”是指在18-24小时时段内在初始细菌种群中至少减少3-log10 (99.9%)或更好的减少的程度上具有细菌死亡或能够杀死细菌的特性。
“抑细菌的”或“抑细菌活性”是指抑制细菌生长(包括抑制细菌细胞的生长)，因此在18-24小时时间段内在初始细菌种群中引起2-log10 (99%)或更好且最多达仅略低于3-log减少的特性。
“抗细菌剂”是指抑细菌剂和杀细菌剂两者。
“抗生素”是指具有对细菌具有负面影响的特性(诸如致死性或生长减少)的化合物。抗生素可以对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两者具有负面影响。通过实例的方式，抗生素可以影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性或DNA或蛋白合成。针对革兰氏阴性细菌有活性的抗生素的非限制性实例包括头孢菌素类，诸如头孢曲松-头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮和头孢吡普；氟喹诺酮类，诸如环丙沙星和左氧氟沙星；氨基糖苷类，诸如庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星；哌拉西林、替卡西林、亚胺培南、美罗培南、多利培南、有或没有β-内酰胺酶抑制剂的广谱青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素。
“药物抗性的”通常是指对药物的抗细菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时，药物抗性可以具体地是指抗生素抗性。在一些情况下，通常对特定抗生素敏感的细菌可对抗生素发展抗性，由此成为药物抗性的微生物或菌株。“多药抗性的” (“MDR”)病原体是已经对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物发展抗性的病原体。例如，已经发现金黄色葡萄球菌的某些菌株对几种抗生素(包括甲氧西林和/或万古霉素)具有抗性(Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department ofHealth and Services, Centers for Disease Control and Prevention)。本领域技术人员可使用确定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术，容易地确定细菌是否是药物抗性的。
“有效量”是指当以适当的频率或给药方案应用或施用时足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或预防、减少或改善被治疗的病症(例如，革兰氏阴性细菌病原体生长或感染)的发作、严重程度、持续时间或进展，预防所治疗的病症的发展，引起所治疗的病症的消退、或者增强或改善另外的疗法(诸如抗生素或抑细菌疗法)的预防或治疗效果的量。
“共同施用”是指以依次的方式施用两种药剂、诸如溶素或溶素-AMP多肽和抗生素或任何其他抗细菌剂，以及以基本上同时的方式施用这些药剂，诸如在单一混合物/组合物中或以分开给予的剂量，但仍基本上同时施用于受试者，例如在同一天或24小时时段中的不同时间。两种药剂、诸如溶素或溶素-AMP多肽与一种或多种额外的抗细菌剂的这种共同施用可作为持续最多达数天、数周或数月的持续治疗而提供。另外，取决于用途，共同施用不需要是连续的或共同延伸的(coextensive)。例如，如果用途是作为局部抗细菌剂以治疗例如细菌性溃疡或感染的糖尿病性溃疡，则可以仅在额外抗生素的24小时内开始施用溶素或溶素-AMP多肽，且然后额外抗生素使用可以继续而不进一步施用溶素或溶素-AMP多肽。
“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物或细胞培养物。例如，术语“受试者”意欲包括易感或患有细菌感染、例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者是人，例如患有革兰氏阴性细菌感染、处于患有革兰氏阴性细菌的风险中、或易于被革兰氏阴性细菌感染的人，无论这种感染是全身性的、局部的还是以其他方式集中或局限于特定的器官或组织。
“多肽”在本文中与术语“肽”或“蛋白”可互换使用，并且是指由氨基酸残基构成且通常具有至少约30个氨基酸残基的聚合物。该术语不仅包括分离形式的多肽，而且还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖包含如本文所述的溶素或AMP并维持例如裂解功能的融合蛋白或融合多肽。取决于背景，多肽可以是天然存在的多肽或者重组、工程改造或合成产生的多肽。特定的溶素多肽例如可以例如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或移取，或者可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(诸如Sambrook, J.等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, N.Y. (1989)中公开的那些)制备，或者可策略性地将其截短或分段，产生维持例如针对相同或至少一种常见靶标细菌的裂解活性的活性片段。
“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段的融合产生的表达产物，导致通常具有两个或更多个通常具有不同特性或功能的结构域或区段的融合表达产物。在更具体的意义上，术语“融合多肽”还可以指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常被C-末端至N-末端连接，尽管它们也可以被C-末端至C-末端、N-末端至N-末端或N-末端至C-末端连接。术语“融合多肽”与术语“融合蛋白”可互换使用。开放式表述“包含”某种结构的“多肽”包括比所记载的结构、诸如融合多肽更大的分子。
“异源的”是指非天然连续的核苷酸、肽或多肽序列。例如，在本公开的上下文中，术语“异源的”可以用于描述两个或更多个肽和/或多肽的组合或融合，其中该融合肽或多肽通常在自然界中未发现，诸如例如溶素或其活性片段和抗微生物肽，包括阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等人，Cell Mol Life Sci.，65(7-8)：1202-19(2008))、防卫素肽(Ganz，T. Nature Reviews Immunology 3，710-720(2003))、疏水性肽，其可具有增强的裂解活性。
“活性片段”是指多肽的一部分，其保留从其中获取片段的分离多肽的一种或多种功能或生物活性，例如针对一种或多种革兰氏阴性细菌的杀细菌活性。
“两亲性肽”是指具有亲水和疏水性官能团两者的肽。在某些实施方案中，二级结构可以将疏水和亲水性氨基酸残基置于两亲性肽的对侧(例如，当所述肽在溶剂、诸如水中时，内侧相对于外侧)。在某些实施方案中，这些肽可以采用螺旋二级结构，诸如α-螺旋二级结构。
“阳离子肽”是指具有高百分比的带正电荷的氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，阳离子肽具有8.0或更高的pKa-值。在本公开的上下文中，术语“阳离子肽”还涵盖聚阳离子肽，其为由主要带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸(Lys)和/或精氨酸(Arg)残基)构成的合成产生的肽。不带正电荷的氨基酸残基可以是带中性电荷的氨基酸残基、带负电荷的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。
“疏水性基团”是指对水分子具有低亲和力或不具有亲和力、但对油分子具有更高亲和力的化学基团，诸如氨基酸侧链。疏水性物质倾向于在水或水相中具有低溶解度或不具有溶解度，并且通常是非极性的，但倾向于在油相中具有更高的溶解度。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。
“加强”是指药剂的活性、诸如抗微生物活性的程度高于除此以外的情况。“加强”涵盖加性以及协同(超加性)作用。
“协同”或“超加性”是指由两种物质组合产生的有益作用，其超过两种药剂独立起作用的作用的总和。在某些实施方案中，协同或超加性作用显著、即统计学显著超过两种药剂独立起作用的作用的总和。一种活性成分或活性成分两者可以在亚阈值水平(即，如果活性物质单独使用则不产生或产生非常有限的效果的水平)下使用。可通过测定、诸如此处所述的棋盘测定来测量效果。
“治疗”是指任何过程、作用、应用、疗法等，其中使受试者(诸如人类)经受医疗救助，目的是直接或间接地治愈病症、根除病原体、或改善受试者的状况。治疗还指降低发病率、减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病、降低发病的风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可以进一步涵盖减少受试者中细菌的种群、生长速率或毒力，且由此控制或减少受试者中的细菌感染或者器官、组织或环境的细菌污染。因此，降低发病率的“治疗”可以例如有效抑制至少一种革兰氏阴性细菌在特定环境(无论它是受试者还是环境)中的生长。另一方面，已经确定的感染的“治疗”是指抑制造成感染或污染的革兰氏阴性细菌的生长，减少造成感染或污染的革兰氏阴性细菌的种群，杀死造成感染或污染的革兰氏阴性细菌，包括根除造成感染或污染的革兰氏阴性细菌。
术语“预防”是指预防病症、诸如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或确立。无意于将本公开限制为感染的完全预防或感染的确立的预防。在一些实施方案中，发作被延迟，或者随后感染的疾病的严重程度或感染疾病的机会被降低，并且这样构成了预防的实例。
“感染的疾病”是指表现出临床或亚临床症状的疾病，诸如发烧、败血症或菌血症的检测，以及当尚未表现出与这种病理学相关的症状时，可以通过细菌病原体(例如培养物中)的生长检测的疾病。
肽或多肽或其活性片段的上下文中的术语“衍生物”意欲涵盖例如经修饰以含有除氨基酸以外的基本上不会不利地影响或破坏多肽的活性(例如，裂解活性)的一个或多个化学部分的多肽。化学部分可以与肽共价连接，例如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基，或在内部氨基酸残基处。此类修饰可以是天然或非天然的。在某些实施方案中，非天然修饰可以包括在反应性部分上添加保护或加帽基团、添加可检测标记物、诸如抗体和/或荧光标记物、添加或改变糖基化、或添加大体积基团(bulking group)、诸如PEG(聚乙二醇化)和本领域技术人员已知的其他变化。在某些实施方案中，非天然修饰可以是加帽修饰，诸如N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。可以添加至溶素多肽或AMP的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记物蛋白诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry，是可以共价或非共价结合至多肽或融合至多肽而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧凑蛋白。在某些实施方案中，编码荧光蛋白的多核苷酸可以被插入溶素或AMP多核苷酸序列的上游或下游。这将产生不干扰与其附接的多肽的细胞功能或功能的融合蛋白(例如，溶素多肽:: GFP)。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药物蛋白的循环半衰期的方法。因此，在多肽衍生物、诸如溶素多肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”涵盖通过共价附接一个或多个PEG分子而化学修饰的多肽、诸如溶素多肽。预期溶素多肽、诸如聚乙二醇化溶素与未聚乙二醇化多肽相比将表现出延长的循环半衰期，同时保留生物学和治疗活性。
“百分比氨基酸序列同一性”是指在比对序列和(如果必要的话)引入缺口以获得最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列、诸如溶素多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的软件、诸如BLAST或可例如自DNASTAR商业获得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%同一性的任何一处，或其之间的任何整数值。在本公开的上下文中，当至少80%的氨基酸残基(诸如至少约85%、至少约90%、至少约92.5%、至少约95%、至少约98%或至少约99%)相同时，两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”也适用于肽。因此，术语“基本上相同的”将涵盖本文所述的分离的溶素多肽和肽和AMP的突变、截短、融合或在其他方面的序列修饰的变体及其活性片段，以及相比于参考(野生型或其他完整)多肽具有基本上的序列同一性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%同、至少98%或至少99%同一性，如通过例如上文提到的一种或多种方法所测量)的多肽。
如本文所用，当至少约80%的氨基酸残基(诸如至少约85%、至少约90%、至少约92.5%、至少约95%、至少约98%或至少约99%)相同或代表保守取代时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽、诸如本文所述的溶素、AMP和/或融合多肽的一个或多个、诸如最多达10%、最多达15%或最多达20%的氨基酸被相似或保守的氨基酸取代进行取代时，并且其中所得肽具有参考多肽、诸如本文所述的溶素、AMP和/或融合多肽的至少一种活性(例如，抗细菌作用)和/或细菌特异性，本公开的多肽的序列是基本上同源的。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的取代。具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“可吸入组合物”是指被配制用于在常规或辅助呼吸期间或与常规或辅助呼吸相结合而直接递送至呼吸道(例如通过气管内支气管、肺、和/或鼻腔施用)的本公开的药物组合物，包括但不限于雾化、喷洒、干粉和/或气雾化制剂。
“生物膜”是指附着至表面并聚集在水合聚合物基质中的细菌，该基质可以由细菌和/或宿主来源的组分构成。生物膜为微生物的聚集体，其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞通常被嵌入包含(但不限于)胞外聚合物质(EPS)的基质内。生物膜EPS也称为粘液(尽管并非所有描述为粘液的东西均为生物膜)或菌斑，为一种通常由胞外DNA、蛋白和多糖构成的聚合物团聚物。
“预防生物膜形成”是指预防生物膜的发生、复发、扩散、开始或建立。并不意欲将本公开限于完全预防或防止生物膜的建立。在一些实施方案中，延迟生物膜的开始，或减少生物膜的建立被或减少新生物膜的形成的机会，并且这构成预防生物膜的实例。进一步，生物膜的预防可能是由于任何机制，包括：1)有效地杀死浮游细菌；2)杀死悬浮液中的“持久(persister)”细菌细胞，即在代谢上无活性、对抗生素耐受并且与生物膜形成高度相关的细菌；和/或3)预防“聚集”，即细菌经由蛋白或多糖彼此附着的能力。
关于生物膜的“根除”包括1)有效地杀死生物膜中的细菌，包括生物膜中的持久细菌细胞，和，任选地2)有效地破坏和/或损坏生物膜基质。
关于生物膜的“破坏”是指落在预防和根除之间的机制。被破坏的生物膜可以被“打开”，或以其他方式被损坏，因此允许例如抗生素更容易渗透生物膜并杀死细菌。
在适合于针对某些细菌的抗生素使用的上下文中，“适合”是指被发现针对那些细菌有效的抗生素，即使随后发展出抗性。
“外膜”或“OM”是指革兰氏阴性细菌的特征。外膜由脂质双层构成，所述脂质双层具有内部的磷脂小叶和外部的主要由脂多糖(LPS)组成的两亲小叶。LPS具有三个主要部分：称为脂质A的六酰化的基于葡萄糖胺的磷脂，多糖核和称为O-抗原的延伸的外部多糖链。所述OM呈现通过三种主要相互作用稳定的非流体连续体，所述三种主要相互作用包括：i) LPS分子与彼此的亲合(avid)结合，特别是如果存在阳离子以中和磷酸酯基团；ii)大大饱和的酰基链的紧密堆积；iii)脂质A部分的疏水堆叠。所得结构是疏水和亲水分子两者的屏障。在OM下，肽聚糖形成薄层，其对水解裂解非常敏感 – 不同于革兰氏阴性细菌的肽聚糖，其厚30-100纳米(nm)，且由最多达40层组成，革兰氏阴性细菌的肽聚糖仅为2-3 nm厚，且仅由1-3层组成。
多肽
溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物
本公开涉及分离的多肽，其包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物。在一些实施方案中，将包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽与抗微生物肽(“AMP”)组合以形成溶素-AMP多肽构建体，其中所述溶素-AMP多肽构建体具有溶素活性。如本文所用，“溶素活性”涵盖溶素杀死细菌(例如，铜绿假单胞菌)、减少细菌的种群或抑制细菌生长(例如，通过渗透革兰氏阴性细菌的外膜)(任选地在人血清或肺表面活性剂存在的情况下)的能力。溶素活性还涵盖除去或减少生物膜的能力和/或减少抗生素的最小抑制浓度(MIC)(任选地在人血清或肺表面活性剂存在的情况下)的能力。
在一些实施方案中，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或其衍生物的分离的多肽能够穿透革兰氏阴性细菌的外膜。不受理论的限制，在穿透外膜之后，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或其衍生物的分离的多肽可以降解肽聚糖，细菌细胞壁的主要结构组分，导致例如细胞裂解或抑制细菌生长的非致命性损伤。在一些实施方案中，本发明的包含本文公开的溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽含有带正电荷的(和两亲性的)N-和/或C-末端α-螺旋结构域，其促进与革兰氏阴性细菌的阴离子外膜的结合，以实现向次相邻肽聚糖的易位。
可以通过本领域中已知的任何方法，诸如WO 2017/049233(其通过引用以其整体并入本文)中描述，来评价溶素穿透革兰氏阴性细菌的外膜的能力。例如，可以将所述溶素与革兰氏阴性细菌和疏水性化合物一起孵育。由于存在外膜，大多数革兰氏阴性细菌对疏水性化合物强烈抵抗，且因此不允许摄取疏水剂、诸如1-N-苯基萘胺(NPN)、结晶紫或8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)。NPN，例如，在疏水条件下强烈发荧光，且在水性条件下微弱发荧光。因此，NPN荧光可以用作外膜渗透性的测量值。
更具体地，可以通过在待测试活性的溶素存在的情况下，将例如NPN与革兰氏阴性细菌、例如铜绿假单胞菌菌株PA01一起孵育来评价溶素穿透外壁的能力。与在溶素不存在的情况下(阴性对照)发出的荧光相比，较高的荧光诱导表明外膜渗透。此外，可以将荧光诱导与建立的透化剂、诸如EDTA(乙二胺四乙酸酯)或抗生素、诸如用于治疗铜绿假单胞菌的最后使用的抗生素、即多粘菌素B(PMB))进行比较，以评价外膜渗透性的水平。
在一些实施方案中，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽在人血清存在和/或不存在的情况下表现出溶素活性。用于评价人血清中的溶素的活性的合适方法是本领域中已知的，并且描述于实施例中。简而言之，可以测定溶素的MIC值(即，与对照相比足以抑制至少80%的细菌生长的肽的最小浓度)，并且与例如亲本溶素或人血清中无活性的化合物、例如T4噬菌体溶菌酶或artilysin GN126进行比较。T4噬菌体溶菌酶是商业可得的，例如来自Sigma-Aldrich, Inc。GN126对应于Art-175，其描述于文献中，并通过将AMP SMAP-29与GN溶素KZ144融合而获得。参见Briers等人2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784，其通过引用以其整体并入本文。
更具体地，可以针对例如实验室铜绿假单胞菌菌株PA01，在例如Mueller-Hinton培养液，补充有人血清的Mueller-Hinton培养液、如本文所述的CAA (其包括生理盐浓度)和补充有人血清的CAA中，测定溶素的MIC值。PA01的使用使得能够在升高血清浓度存在的情况下进行测试，因为不同于大多数临床分离株，PA01对人血液基质的抗细菌活性不敏感。
在一些实施方案中，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽能够减少生物膜。用于评价溶素或AMP的最小生物膜根除浓度(MBEC)的方法可以使用具有修改的培养液微量稀释MIC方法的变式来测定(参见Ceri等人 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776，其通过引用以其整体并入本文，和Schuch等人, 2017,Antimicrob. Agents Chemother. 61,第1-18页，其通过引用以其整体并入本文)。在该方法中，将例如铜绿假单胞菌菌株、诸如ATCC 17647的新鲜菌落悬浮于培养基、例如以例如1:100在TSBg (补充有0.2%葡萄糖的胰蛋白酶大豆培养液)中稀释的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，作为例如0.15 ml等分试样添加至Calgary生物膜装置(具有携带96个聚碳酸酯塞的盖的96孔板；lnnovotech Inc.)中，并在37℃下孵育例如24小时。然后洗涤生物膜，并用例如溶素在TSBg中的2倍稀释系列在例如37℃下处理24小时。处理后，将孔洗涤，在例如37℃下风干，并用例如0.05%结晶紫染色10分钟。染色后，将生物膜在例如33%乙酸中脱色，并测定例如提取的结晶紫的OD600。每份样品的MBEC是通过结晶紫定量评价的除去>95%的生物膜生物量所需的最小溶素浓度。
在一些实施方案中，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽降低抗生素在人血清存在和/或不存在或在肺表面活性剂存在的情况下抑制细菌所需的最小抑制浓度(MIC)。可以使用任何已知的评价MIC的方法。在一些实施方案中，棋盘测定法用于测定溶素对抗生素浓度的作用。棋盘测定法基于通过培养液微量稀释测定MIC的CLSI方法的修改(参见临床和实验室标准协会(CLSI), CLSI. 2015. Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That GrowAerobically; Approved Standard-第10版. Clinical and Laboratory StandardsInstitute, Wayne, PA, 其通过引用以其整体并入本文，以及Ceri等人1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776，其也通过引用以其整体并入本文)。
通过首先准备例如96-孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘，其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在分开的板中，准备可比较的行，其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释例如2倍的溶素。然后将溶素和抗生素稀释液合并，使得每列具有恒定量的抗生素和溶素的两倍稀释液，而每行具有恒定量的溶素和抗生素的两倍稀释液。因此，每个孔具有溶素和抗生素的独特组合。将细菌以CAA中1 x 105 CFU/ml的浓度，例如在有或没有人血清或肺表面活性剂(诸如Survanta®)的情况下添加至药物组合中。然后，例如在37℃在环境空气中16小时后，记录单独和组合的每种药物的MIC。计算每种药物的分数抑制浓度总和(∑FICs)，并使用最小∑FIC值(∑FICmin)来测定溶素/抗生素组合的作用。
在一些实施方案中，本发明的溶素和溶素-AMP多肽构建体能够与抗生素、诸如亚胺培南和美罗培南协同作用，并且驱动革兰氏阴性细菌(包括MDR生物体，诸如碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌)的重新敏化。可以通过在如本文所述的棋盘测定中，将本发明的溶素或溶素-AMP多肽构建体与抗生素组合来确定这种重新敏化。将抗生素抗性的细菌、诸如碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌，添加至溶素或溶素-AMP多肽构建体组合中。通常，重新敏化在协同组合中发生，其中抗生素MIC值降至低于确立的断点，例如，对于抗生素敏感的细菌的<2的MIC值，对于中度敏感的细菌的4的MIC值，和对于抗生素抗性细菌(例如碳青霉烯抗性的分离株)的> 8的MIC值。参见Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne,PA，通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽显示针对红细胞的低毒性。可以使用本领域中已知的任何方法来评价本发明的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽的溶血活性的潜力。
本公开的合适的溶素的实例，特别是与本文所述的溶素-AMP多肽构建体一起使用，包括获得自克雷伯氏菌噬菌体0507-KN2-1的GN316溶素(NCBI参考序列：YP_008531963.1, SEQ ID NO:22)，获得自假单胞菌噬菌体的溶素PaP2_gp17(NCBI参考序列：YP_024745.1, SEQ ID NO:96)，获得自代尔夫特菌属物种的GN333 (NCBI参考序列：WP_016064791.1, SEQ ID NO:28)，获得自假多噬伯克霍尔德氏菌的GN424 (NCBI参考序列：WP_060250996.1, SEQ ID NO:56)，获得自柔韧假单胞菌的GN425溶素(NCBI参考序列：WP_039605935.1, SEQ ID NO:58)，获得自埃希氏杆菌属病毒CBA120的GN428 (NCBI参考序列：YP_004957781.1, SEQ ID NO:60)，获得自Dickeya噬菌体phiD3的GN431 (NCBI参考序列：AIM51349.1, SEQ ID NO:64)，获得自欧文氏菌属物种Leaf5的GN485 (NCBI参考序列：WP_056233282.1, SEQ ID NO:68)和获得自假单胞菌噬菌体PhiPA3的GN123 (NCBI参考序列：YP_009217242.1, SEQ ID NO:173)。
通过生物信息学技术鉴定了上述溶素。尽管鉴定的序列中的一些已被注释为推定的肽聚糖结合蛋白，但先前没有功能被确定地归因于具有这些序列的多肽。发明人已经令人惊讶地认识到，上面鉴定的序列适合用作抗细菌剂，特别是针对如实施例中所述的革兰氏阴性细菌的抗细菌剂。
本公开的合适的溶素的额外实例，特别是与本发明的溶素-AMP多肽构建体一起使用的那些溶素，包括获得自不动杆菌噬菌体vB_AbaP_CEB1的NC76溶素(NCBI参考序列ALC76575.1, SEQ ID NO:203 GenBank: ALC76575.1)，获得自假单胞菌噬菌体PAJU2的GN4溶素(NCBI参考序列YP 002284361.1, SEQ ID NO:74)，获得自假单胞菌噬菌体Lull的GN14溶素(NCBI参考序列YP 006382555.1, SEQ ID NO:124)和获得自Micavibrio aeruginosavorus 的GN37溶素(NCBI参考序列WP _014102102.1, SEQ ID NO:84)。前述溶素各自还公开于WO 2017/049233，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的分离的多肽包含溶素变体，例如与参考溶素多肽例如天然存在的溶素或亲本溶素(其本身是变体溶素)相比，含有一个或多个插入、缺失和/或氨基酸取代的溶素。在一些实施方案中，包含变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽序列与本文所述的参考溶素和/或其活性片段具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性。
本公开的溶素变体通常保留参考溶素的一种或多种功能或生物学活性。在一些实施方案中，所述修饰提高溶素的抗细菌活性。通常，与参考溶素相比，所述溶素变体具有提高的体外抗细菌活性(例如，在缓冲液和/或培养基中)。在其他实施方案中，所述溶素变体具有提高的体内抗细菌活性(例如，在动物感染模型中)。在一些实施方案中，所述修饰提高所述溶素在人血清不存在和/或存在的情况下的抗细菌活性。在一些实施方案中，所述修饰提高所述溶素在肺表面活性剂存在的情况下的抗细菌活性。
合适的变体溶素，特别是用于本发明的溶素-AMP多肽构建体中的那些，包括GN146溶素(SEQ ID NO:78)、GN156溶素(SEQ ID NO:126)、GN202溶素(SEQ ID NO:118)和GN121溶素(SEQ ID NO:175)。前述溶素各自也公开于2017年12月12日提交的美国临时申请号62,597,577和2018年8月23日提交的美国临时申请号62/721,969，其通过引用以其整体并入本文。通常，将美国临时申请号62/721,969中描述的溶素参考其天然存在的对应物进行修饰，以增强所述溶素在血清中的活性，例如，通过引入氨基酸取代和/或引入来自较大抗微生物肽的氨基酸片段。例如，将Daniels和Scepartz, 2007, J. Am. Chem. Soc. 129:14578-14579 (其通过引用以其整体并入本文)描述的氨基酸序列GPRRPRRPGRRAPV(SEQ ID NO:126的残基1-14)引入到例如GN4(SEQ ID NO:74)的N末端，以生成GN156 (SEQ ID NO:126)，非天然存在的溶素-AMP多肽构建体。
在一些实施方案中，所述变体溶素通过如下获得：通过例如将单个提高pI的突变(诸如单个点突变)并入参考溶素来修饰参考溶素以包括导致溶素的总体等电点(pI)(即具有净中性电荷的pH)的改变的修饰。合适的参考溶素多肽包括选自以下的溶素：GN76 (SEQID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、GN37(SEQ ID NO:84) GN316 (SEQ ID NO:22) 溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ IDNO:28) GN485 (SEQ ID NO:68) GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)。在某些实施方案中，所述溶素变体与具有选自SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173和175的氨基酸序列的参考溶素多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性。
例如，可以通过引入氨基酸取代R79H来修饰GN37溶素(SEQ ID NO:84)以提高pI，以生成GN217溶素(SEQ ID NO:8)。在该实施方案中，在人血清存在和不存在的情况下，与参考溶素GN37(SEQ ID NO:84)的功效相比，GN217溶素(SEQ ID NO:8)的功效均增加，如实施例中所述。
合适的改变pI突变的其他实例包括将氨基酸取代、诸如K218D、K228D、R85H和/或K22D引入参考溶素、诸如GN316(SEQ ID NO:22)，以分别生成例如GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)和GN418溶素(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，前述改变pI的突变提高所述溶素在人血清不存在和/或存在的情况下的抗细菌活性，如本文中所例示。
在一些实施方案中，通常设计本公开的溶素变体以保留α-螺旋结构域，所述α-螺旋结构域的存在或不存在可以使用各种软件程序、诸如Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred)、Helical Wheel (hael.net/helical.htm)、HeliQuest(zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)和PEP-FOLD 3 (bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3)容易地确定。
在一些实施方案中，所述α-螺旋结构域位于溶素的C末端。在其他实施方案中，α-螺旋结构域位于溶素的N-末端。更通常，α-螺旋结构域位于C末端。本公开的溶素的α-螺旋结构域的大小在约20和40个氨基酸残基之间，更通常在约15和33个氨基酸残基之间变化。例如，位于N末端的GN14 α-螺旋结构域含有15个氨基酸(SEQ ID NO:124的残基66至80)。位于C末端的GN37 α-螺旋结构域含有14个氨基酸(SEQ ID NO:84的残基113至126)。也位于C末端的GN4 α-螺旋结构域含有25个氨基酸(SEQ ID NO:74的残基116至140)。
在一些实施方案中，本文公开的变体溶素、其活性片段或其衍生物被修饰以包括纯化标签，例如，GSHHHHHHG (SEQ ID NO:100)。所述纯化标签可以插入溶素内的任何位置，通常在第一和第二氨基酸之间。例如，所述纯化标签可以插入GN316溶素(SEQ ID NO:22)的N末端的第一甲硫氨酸和第一丙氨酸之间，以获得变体GN316溶素(SEQ ID NO:24)，而没有不利地影响活性。在其他实施方案中，所述纯化标签可以插入GN156溶素(SEQ ID NO:126)的N末端的第一甲硫氨酸和第一甘氨酸之间，以获得变体GN486 (SEQ ID NO:66)。
溶素变体可以通过本领域中已知的和如WO WO 2017/049233(其通过引用以其整体并入本文)中所述的任何方法形成，例如，通过经由定点诱变或经由在产生保留如本文所述的一种或多种生物学功能的本发明的溶素的宿主中的突变，修饰本文所述的溶素、其活性片段和衍生物中的任一种。本发明的溶素变体可以是截短的，嵌合的，改组的或“天然的”，并且可以组合，如例如在美国专利号5,604,109(其通过引用以其整体并入本文)中所述。
例如，本领域技术人员可以合理地进行和测试对例如α-螺旋结构域或α-螺旋结构域之外的区域的取代或替换。可以用例如如本文所述的完整氨基酸序列进行与Genbank数据库的序列比较，例如以鉴定用于取代的氨基酸。
可以在氨基酸序列中或在编码多肽和溶素、活性片段或衍生物的核酸序列中进行突变，使得特定密码子被改变为编码不同氨基酸的密码子，即氨基酸取代为另一氨基酸，或缺失一个或多个氨基酸。
这种突变通常通过进行尽可能最少的核苷酸改变来实现。可以进行这种取代突变，以便以非保守的方式(例如，通过将密码子从属于特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一分组的氨基酸)或以保守的方式(例如，将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于同一分组的氨基酸)改变所得蛋白中的氨基酸。这种保守的改变通常导致所得蛋白的结构和功能的改变较少。非保守的改变更可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。应认为本公开包括含有保守的改变的序列，所述保守的改变不显著改变所得蛋白的活性或结合特征。因此，基于对本文提供的溶素的序列的综述以及其知识和可用于其他溶素多肽的公共信息，本领域技术人员可以在溶素多肽序列中进行氨基酸改变或取代。可以进行氨基酸改变以替换或取代本文提供的溶素的序列中的一个或多个、一个或几个、一个或若干个、一个至五个、一个至十个或此类其他数目的氨基酸，以生成其突变体或变体。此类其突变体或变体可以针对功能进行预测，或针对如本文所述的针对例如铜绿假单胞菌的抗细菌活性的功能或能力和/或针对具有与所述和本文特别提供的溶素相当的活性进行测试。因此，可以使用本领域中已知和本文描述的测定和方法来测试对本文所述的溶素和突变体或变体的序列进行的改变。基于其溶素的结构域结构，本领域技术人员可以预测适合于取代或替换的一个或多个、一个或几个氨基酸和/或不适合于取代或替换(包括合理的保守或非保守取代)的一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的分离的多肽包含溶素或衍生物的活性片段。术语“活性片段”是指全长溶素的一部分，其保留参考溶素的一种或多种生物学活性。因此，如本文所用，在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下，或在肺表面活性剂存在的情况下，溶素或变体溶素的活性片段抑制如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，或杀死如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种。溶素的合适的活性片段包括但不限于WO2017/049233(其通过引用以其整体并入本文)中描述的那些。所述活性溶素片段通常保留α-螺旋结构域。活性溶素片段的实例包括SEQ ID NO:127-129中所示的GN4溶素(SEQ ID NO:74)的那些。
在一些实施方案中，本发明的分离的多肽中包括的溶素、溶素变体、其活性片段或衍生物选自GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24) GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ IDNO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、(SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ IDNO:58 )、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN485(SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96) GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQID NO:175)或其活性片段，其中所述溶素或其活性片段在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68、96、173或175中的至少一个，所述溶素或其活性片段含有至少一个氨基酸取代、缺失或插入。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开的溶素选自GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ IDNO:28)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431(SEQ ID NO:64)、GN485 (SEQ ID NO:68)和溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)或其活性片段，其中所述溶素或其活性片段在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:26、28、56、58、60、64、68或96，所述溶素、其衍生物或活性片段含有至少一个取代、缺失或插入修饰。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述分离的多肽序列包含选自GN217溶素(SEQ ID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)和GN486 (SEQ ID NO:66)的溶素或其活性片段，其中所述溶素或其活性片段在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:8、48、50、52、54或66，所述溶素或其活性片段含有至少一个取代、缺失或插入修饰。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
抗微生物肽
在一些实施方案中，本公开的多肽包含溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体。所述溶素-AMP多肽构建体含有如本文所述的包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的分离的多肽以及抗微生物肽或其片段。如本文所用的术语“抗微生物肽”(AMP)是指可以在事实上每种生物体中找到的广泛范围的短的(通常长度为3至50个氨基酸残基)基因编码的肽的成员，通常是抗生素。该术语涵盖螺旋肽、β-折叠肽以及展示很大程度无序的随机螺旋结构的那些。AMP包括防御素、cathelicidins、寿司肽(sushi peptide)、阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、疏水性肽和/或AMP-样肽，例如如本文所述的amurin肽。该术语还涵盖AMP的片段、AMP变体和AMP的衍生物。
如本文所用的术语“AMP活性”涵盖AMP或其片段在人血清存在和/或不存在的情况下例如通过穿透革兰氏阴性细菌的外膜杀死细菌、减少细菌的种群或抑制细菌生长的能力。通常，AMP的易位由如下驱动：与外膜的脂多糖部分的主要静电相互作用，随后为阳离子置换，膜解体和瞬时打开，以及在一些情况下AMP的内化。
AMP活性还涵盖AMP或其片段在人血清存在和/或不存在的情况下降低抗生素的最小抑制浓度(MIC)的能力。用于评价本发明的AMP及其片段穿透革兰氏阴性细菌的外膜的能力和确定在血清存在和不存在的情况下抗生素的MIC的降低的合适方法是本领域中已知的，并且包括上面针对本发明的溶素、其衍生物和活性片段描述的那些方法。
在一些实施方案中，本发明的AMP是与本文所述的任何AMP具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的变体AMP，其中其变体AMP保留AMP活性。
在一些实施方案中，本发明的AMP包含螺旋结构域，诸如α-螺旋结构域。在一些实施方案中，所述α-螺旋结构域跨越分子的大部分。参见，例如，图1的Chp1和Chp4。在其他实施方案中，所述α-螺旋结构域被中断(例如，Chp2)或被截短(例如，Chp6和Osp1)。本文所述的本发明的AMP、诸如Chps的α-螺旋结构域大小在约3至32个氨基酸残基之间，更通常在约10和25个氨基酸残基之间变化。通常，所述螺旋结构域是活性所需的，并且通常当与溶素的C-或N-末端融合时必须保留。
通常，螺旋肽展示两亲性特征并且含有显著部分(例如50%)的疏水性残基，经常以重复的模式出现。在形成α-螺旋结构后，所述亲水性残基通常终止于螺旋的同一侧，由此导致构象依赖性的两亲性。通常，这些肽在水性环境中是非结构化的，但在遇到脂质膜后采用螺旋构象。属于该组的肽通常展示范围为+2至+11的总体正电荷，并且通常通过产生膜缺陷，导致电解质梯度、信号物质和其他因子的损失，而杀死微生物、诸如革兰氏阴性细菌。
在一些实施方案中，本发明的AMP是“AMP样”肽，包括噬菌体裂解剂，在本文中被称为衣原体噬菌体(Chp)肽或amurin肽。本公开的amurin肽与amurin是可区分的。如本领域中已知，获得自ssDNA或ssRNA噬菌体(分别为微小噬菌体科和光滑噬菌体科)的amurin是具有推定的结构域结构的整合膜蛋白，所述结构域结构包括内部LS二肽，前面紧接10-17个疏水性残基的延伸段。amurin的实例包括来自噬菌体<pX174 (微小噬菌体科，Microvints属)的蛋白E amurin，其为91个氨基酸的膜蛋白，其通过抑制细菌的转位酶Mra Y (一种催化胞壁质前体脂质I的形成的重要的膜嵌入酶)引起裂解；噬菌体Q~(光滑噬菌体科，异光滑噬菌体属)的A2衣壳蛋白，其为420个氨基酸的结构蛋白，其通过干扰MurA活性并使肽聚糖生物合成的过程失调而引起裂解；噬菌体MS2(光滑噬菌体科，光滑噬菌体属)的蛋白L amurin，其为75个氨基酸的整合膜蛋白，其通过使用需要宿主伴侣蛋白DnaJ的活性的机制引起裂解。通常，amurin不能被纯化并且不适合用作抗细菌治疗剂。
与amurin相反，本公开的amurin肽是具有与获得自各种脊椎动物的先天免疫系统的AMP的α-螺旋结构相似的预测α-螺旋结构的小阳离子肽(但氨基酸序列与AMP不相似)。Amurin肽主要在衣原体微小噬菌体中发现，并且在较小程度上在蘑菇状噬菌体(Gokushovirinae)亚科的其他相关成员中发现。来自各种微小噬菌体科噬菌体的amurin肽表现出与彼此的30-100%同一性，并且与其他肽没有同源性。不同于微小噬菌体科的amurin(其具有在细胞壁生物合成装置中的细胞质靶标且因此可能不容易被外部应用的蛋白接近)，本发明的amurin肽可以以纯化形式使用以“从无到有(from without)”发挥杀细菌活性。
用于本发明的溶素-AMP多肽构建体中的合适的amurin肽包括在2018年3月29日提交且通过引用以其整体并入本文的美国临时申请号62/650,235中描述的肽。在一些实施方案中，可以使用amurin肽，诸如衣原体噬菌体(Chp)-来源的裂解剂。此类Chp-来源的裂解剂包括Chp1 (NCBI参考序列：NP_044319.1, SEQ ID NO:133)，Chp2 (NCBI参考序列：NP_0546521.1, SEQ ID NO:70)，CPAR39 (NCBI参考序列：NP_063898.1, SEQ ID NO:135)，Chp3 (NCBI参考序列：YP_022484.1, SEQ ID NO:137)，Chp4 (NCBI参考序列：YP_338243.1, SEQ ID NO:102)，Chp6 (NCBI参考序列：NP_510878.1, SEQ ID NO:106)，Chp7(NCBI参考序列：CRH73061.1, SEQ ID NO:139)，Chp8 (NCBI参考序列：CRH64983.1, SEQID NO:141)，Chp9 (NCBI参考序列：CRH84960.1, SEQ ID NO:143)，Chp10 (NCBI参考序列：CRH73061.1, SEQ ID NO:145)，Chp11 (NCBI参考序列：CRH59954.1, SEQ ID NO:147)和Chp12 (NCBI参考序列：CRH59965.1, SEQ ID NO:149)。
额外的合适的Chp家族成员包括Gkh1 (NCBI参考序列：YP_008798245.1, SEQ IDNO:151)，Gkh2 (NCBI参考序列：YP_009160382.1, SEQ ID NO:90)，Unp1 (NCBI参考序列：CDL66944.1, SEQ ID NO:153)，Ecp1 (NCBI参考序列：WP_100756432.1, SEQ ID NO:155)，Ecp2 (NCBI参考序列：OAC1404.1, SEQ ID NO:104)，Tma1 (NCBI参考序列：SHG47122.1,SEQ ID NO:157)，Osp1 (NCBI参考序列：SFP13761.1, SEQ ID NO:108)，Unp2 (NCBI参考序列：CDL65918.1, SEQ ID NO:159)，Unp3 (NCBI参考序列：CDL65808.1, SEQ ID NO:161)，Gkh3 (NCBI参考序列：AGT39941.1, SEQ ID NO:163)，Unp5 (NCBI参考序列：AGT39924.1,SEQ ID NO:165)，Unp6 (NCBI参考序列：AGT39915.1, SEQ ID NO:167)，Spi1 (NCBI参考序列：NP_598337.1, SEQ ID NO:169)和Spi2 (NCBI参考序列：NP_598336.1, SEQ ID NO:171)，Ecp3 (NCBI参考序列：WP_105269219.1, SEQ ID NO:177)，Ecp4 (NCBI参考序列：WP_105466506.1, SEQ ID NO:179)，ALCES1 (NCBI参考序列：AXB22573.1, SEQ ID NO:181)，AVQ206 (NCBI参考序列：AVQ10236.1, SEQ ID NO:183)，AVQ244 (NCBI参考序列：AVQ10244.1, SEQ ID NO:185)，CDL907 (NCBI参考序列：CDL65907.1, SEQ ID NO:187)，AGT915 (NCBI参考序列：AGT39915.1, SEQ ID NO:189)，HH3930 (NCBI参考序列：CCH66548.1, SEQ ID NO:191)，Fen7875 (NCBI参考序列：YP_009160399.1, SEQ ID NO:193)，SBR77 (NCBI参考序列：AOT25441, SEQ ID NO:195)，Bdp1 NCBI参考序列：NP_073546.1, SEQ ID NO:197)，LVP1 (NCBI参考序列：NP_042306.1, SEQ ID NO:199)和Lvp2(NCBI参考序列：NP_085469.1, SEQ ID NO:201)。
更通常，所述AMP选自以下amurin肽中的一种或多种：Chp2 (SEQ ID NO:70)、Gkh2(SEQ ID NO:90)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Chp6 (SEQ ID NO:106)和Osp1 (SEQ ID NO:108)。
在一些实施方案中，修饰所述amurin肽以产生变体amurin肽。如本文所述，amurin肽通常包含螺旋结构域，诸如α-螺旋结构域。通常，变体amurin肽保留α-螺旋结构域。通常使用各种软件程序，诸如Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred)、Helical Wheel(hael.net/helical.htm)、HeliQuest (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)和PEP-FOLD 3 (bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3)，准确地鉴定α-螺旋结构域在任何变体amurin肽中的保留。在一些实施方案中，通过将amurin肽内的(=)带电荷残基、诸如精氨酸和赖氨酸转化为“D”氨基酸形式来修饰amurin肽变体。转化为D形式的效用描述于文献中，例如，Manabe等人, Sci. Rep., 2017, 第1-10页，其通过引用以其整体并入本文。变体AMP可以根据本领域中已知的任何方法来制备，包括如上文针对溶素、其变体、活性片段和衍生物所述。
在一些实施方案中，用于本公开的溶素-AMP多肽构建体中的AMP包括保留抗细菌活性的较大AMP的片段。例如，在某些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体的AMP部分可以包括保留抗细菌活性的猪髓样抗微生物肽-36(“PMAP-36”，SEQ ID NO:204)的片段。PMAP-36是由在N-末端具有两亲性α-螺旋构象的从猪髓样cDNA推导的cathelicidin相关的AMP。因此，通常从N-末端选择合适的PMAP-36片段以获得保留抗细菌活性的片段。在一些实施方案中，本公开的PMAP-36片段在位置23处包含疏水性氨基酸(Trp)。在其他实施方案中，从PMAP-36片段省略无规卷曲的C-末端以减少或消除可能由PMAP-36引起的溶血。PMAP-36片段的进一步特征描述于例如Lyu等人, Scientific Reports, 2016, 6, 第1-12页，其通过引用以其整体并入本文。
特别期望的PMAP-36片段包括RI12 (SEQ ID NO:88)、RI18 (SEQ ID NO:92)和TI15 (SEQ ID NO:94)。其他合适的AMP片段包括来自Esculentin (NCBI参考序列：P40843.1)的那些，诸如SEQ ID NO:80中所示的片段和抗脂多糖因子同种型2 (NCBI参考序列：AFU61125.1)，诸如SEQ ID NO:76中所示的片段。
在一些实施方案中，本公开的AMP包括合成肽。在一些实施方案中，所述合成肽降低抗生素的最小抑制浓度(MIC)，其阻止细菌的可见生长，但自身不表现出抗细菌活性。用于与本公开的溶素-AMP多肽构建体一起使用的特别期望的合成肽包括FIRL肽模拟物(SEQID NO:114)。不受理论的限制，与参与外膜蛋白生物发生的蛋白BamD的序列相关的FIRL(SEQ ID NO:114)似乎增加外膜对抗生素的渗透性。关于提出的机制的进一步信息见于例如Mori等人, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012, 67: 2173-2181，其通过引用以其整体并入本文。
可用于使革兰氏阴性细菌对抗生素敏感的其他合成肽(其可以并入本公开的溶素-AMP多肽构建体中)包括在Vaara和Porro, Antimicrobial agents and Chemotherapy,1996, 1801-1805 (其通过引用以其整体并入本文)中描述的阳离子肽KFFKFFKFFK (SEQID NO:120)。
在一些实施方案中，所述合成肽对盐和血清失活是抗性的，如例如在Monhanram等人, Biopolymers, 2016, 106: 345-346(其通过引用以其整体并入本文)中所述。特别期望的盐和血清抗性合成肽包括RR12Whydro (SEQ ID NO:110)和RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)。
结构稳定组分
在一些实施方案中，本公开的溶素-AMP多肽构建体进一步包括至少一种结构稳定组分，以维持所述构建体中的所述第一和/或第二组分(例如，溶素和/或AMP)的结构的至少一部分与未缀合的溶素和/或AMP中实质上相同。在一些实施方案中，所述稳定组分是接头。通常，所述至少一种结构稳定成分，诸如接头，使得所述溶素和AMP能够实质上保留第一和/或第二蛋白部分的三维结构，使得所述溶素和/或AMP的至少一种生物活性被保留。
用于连接两个多肽的合适的接头是本领域中已知的。在某些实施方案中，所述接头是肽，诸如包含甘氨酸和丝氨酸残基的肽。特定的合适的接头包括但不限于TAGGTAGG接头(SEQ ID NO:72)、IGEM接头GGSGSGSGSGSP (BBa_K1485002) (SEQ ID NO:82)、GGGSGGGGSGGGS (BBA_K1486037, (SEQ ID NO:86)或如Briers等人, mBio, 2014, 5:e01379-14(其通过引用以其整体并入本文)中所述的接头，即AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQID NO:122)。
在一些实施方案中，所述结构稳定组分是肽部分，例如RPP或PP部分。此类肽部分可以包括在本发明的溶素-AMP多肽构建体中，以帮助维持所述溶素和/或AMP蛋白部分的结构。例如，可以将RPP或PP氨基酸插入接头的C末端或N末端，例如在BBA_K1486037接头的N末端(RPPGGGSGGGGSGGGS，SEQ ID NO:12的残基126至141)，在BBA_K1486037接头的N末端(PPGGGSGGGGSGGGS，SEQ ID NO:16的残基144-158)，在TAGGTAGG接头(SEQ ID NO:72)的N末端(诸如SEQ ID NO:18的残基137-144中所描绘)，或在BBA_K1486037接头的C末端(GGGSGGGGSGGGSPP，SEQ ID NO:20的残基135-149)。
在其他实施方案中，肽MIDR (SEQ ID NO:112)和/或NPTH (SEQ ID NO:116)被包括在构建体中，以帮助维持所述溶素和/或AMP蛋白部分的结构。例如，在一些实施方案中，通过添加MIDR (SEQ ID NO:112)和/或NPTH (SEQ ID NO:116)、诸如在SEQ ID NO:46的残基1-12 (MIDRFIRLNPTH)和SEQ ID NO:44的残基1-26所描绘，来维持AMP结构，诸如FIRL(SEQ ID NO:114)。
溶素-AMP多肽构建体的实例
在一些实施方案中，所述溶素-AMP构建体包含：(a)第一组分，其包含：(i)至少一种选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ IDNO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428(SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的任一个的多肽序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽；或(iii)所述溶素的活性片段，所述片段包括单个点突变和/或单个提高pI的突变(如果有的话)；(b)第二组分，其包含：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39(SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10(SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ IDNO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4(SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ IDNO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性。
通常，与公开的AMP或其片段共有至少80%或更多同一性的任何AMP变体保留其α-螺旋结构和与活性相关的任何残基。例如，如上所示，PMAP-36 (SEQ ID NO:204)的片段通常保留位置23处的疏水性氨基酸(Trp)。
在一些实施方案中，GN37 (SEQ ID NO:84)包含单个提高pI的突变，其中具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)是GN217 (SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，GN316(SEQ ID NO:22)包含单个点突变，其中具有单个点突变的GN37 (SEQ ID NO:84)是GN396(SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQ ID NO:54)和/或GN394 (SEQ IDNO:48)。
在一些实施方案中，所述构建体进一步包含至少一种结构稳定组分。在一些实施方案中，所述至少一种结构稳定组分是肽接头，诸如包含甘氨酸和丝氨酸残基的肽。在某些实施方案中，所述肽接头选自TAGGTAGG (SEQ ID NO:72)、IGEM (BBa_K1485002) (SEQ IDNO:82)、PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)、IGEM +PP (SEQ ID NO:16的残基44-58)和AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:122)。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体选自以下中的至少一种：GN168溶素(SEQ ID NO:2)、GN176溶素(SEQ ID NO:4)、GN178溶素(SEQ ID NO:6)、GN218溶素(SEQ IDNO:10)、GN223溶素(SEQ ID NO:12)、GN239溶素(SEQ ID NO:14)、GN243溶素(SEQ ID NO:16)、GN280溶素(SEQ ID NO:18)、GN281溶素(SEQ ID NO:20)、GN349溶素(SEQ ID NO:30)、GN351溶素(SEQ ID NO:32)、GN352溶素(SEQ ID NO:34)、GN353溶素(SEQ ID NO:36)、GN357溶素(SEQ ID NO:38)、GN359溶素(SEQ ID NO:40)、GN369溶素(SEQ ID NO:42)、GN370溶素(SEQ ID NO:44)、GN371溶素(SEQ ID NO:46)或GN 93溶素(SEQ ID NO:62)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46或62中的至少一个的多肽序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
更具体地，在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含Chp2 amurin多肽(SEQ ID NO:70)和TAGGTAGG接头(SEQ ID NO:72)，其被N-末端引入至GN4溶素(SEQ ID NO:72)以生成GN168溶素(SEQ ID NO:2)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:2具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，编码的溶素-AMP多肽构建体包含LPS结合蛋白的片段(SEQ IDNO:76)和TAGGTAGG接头(SEQ ID NO:72)，其被N-末端引入至GN146溶素(SEQ ID NO:78)以生成GN176溶素(SEQ ID NO:4)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:4具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)和IGEM接头(SEQ ID NO:82)，其被N-末端引入至GN146溶素(SEQ ID NO:78)以生成GN178溶素(SEQ ID NO:6)或与SEQ ID NO:6具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，编码的溶素-AMP多肽构建体包含IGEM接头(SEQ ID NO:86)和RI12抗微生物肽(SEQ ID NO:88)，其被C-末端引入至GN37溶素(SEQ ID NO:84)以生成GN218溶素(SEQ ID NO:10)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:10具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含RPP部分、IGEM接头(SEQ IDNO:86)和抗微生物amurin肽Gkh2 (SEQ ID NO:90)，其被C-末端引入至GN37溶素(SEQ IDNO:84)以生成GN223溶素(SEQ ID NO:12)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:12具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含IGEM接头(SEQ ID NO:86)和RI18肽(SEQ ID NO:92)，其被C-末端引入至GN37溶素(SEQ ID NO:84)以生成GN239溶素(SEQ ID NO:14)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:14具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含PP氨基酸部分、IGEM接头(SEQID NO:86)和TI15肽(SEQ ID NO:94)，其被C-末端引入至GN37溶素(SEQ ID NO:84)以生成GN243溶素(SEQ ID NO:16)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:16具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含RI18抗微生物肽(SEQ ID NO:92)、具有氨基酸序列PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)的接头和TI15抗微生物肽(SEQ ID NO:94)，其被C末端引入至溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)以生成GN280溶素(SEQ ID NO:18)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:18具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含RI18肽(SEQ ID NO:92)、IGEM接头(SEQ ID NO:86)、PP氨基酸部分(经添加以维持所述溶素和/或所述AMP的结构)和TI15肽(SEQ ID NO:94)，其被C末端引入至溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)以生成GN281溶素(SEQ ID NO:20)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:20具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和amurin肽Chp4 (SEQ ID NO:102)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN349溶素(SEQ ID NO:30)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:30具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和amurin肽Ecp2 (SEQ ID NO:104)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN351溶素(SEQ ID NO:32)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:32具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和amurin肽Chp7 (SEQ ID NO:139)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN352溶素(SEQ ID NO:34)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:34具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和amurin肽Osp1 (SEQ ID NO:108)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN353溶素(SEQ ID NO:36)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:36具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和RR12Whydro(SEQ ID NO:110)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQID NO:22)以生成GN357溶素(SEQ ID NO:38)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:38具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含具有氨基酸序列TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)的接头和PMAP-36的TI15肽衍生物(SEQ ID NO:94)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN359溶素(SEQ ID NO:40)或具有溶素活性且与SEQ IDNO:40具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含RR18 (SEQ ID NO:92)，其被C-末端引入至GN316溶素(SEQ ID NO:22)以生成GN369溶素(SEQ ID NO:42)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:42具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含MIDR部分(SEQ ID NO:112)、FIRL部分(SEQ ID NO:114)和NPTH部分(SEQ ID NO:116)，其被N-末端引入至GN202溶素(SEQ ID NO:118)以生成GN370溶素(SEQ ID NO:44)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:44具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含MIDR部分(SEQ ID NO:112 )、FIRL (SEQ ID NO:114)和NPTH部分(SEQ ID NO:116)，其被C-末端引入至GN146溶素(SEQID NO:78)以生成GN371溶素(SEQ ID NO:46)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:46具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述溶素-AMP多肽构建体包含阳离子肽(SEQ ID NO:120)和接头结构域(SEQ ID NO:122)，其被N-末端引入至GN14溶素(SEQ ID NO:124)以生成GN93溶素(SEQ ID NO:62)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:62具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
下表1描绘了本文所述的溶素和溶素-AMP构建体的具体实例。对于GN168 (SEQ IDNO:2)、GN176 (SEQ ID NO:4)、GN178 (SEQ ID NO:6)、GN370 (SEQ ID NO:44)、GN371 (SEQID NO:46)和GN93 (SEQ ID NO:62)，构建体的AMP部分加双下划线。对于所有其他构建体，双下划线对应于溶素。结构稳定组分、诸如接头为斜体。GN486 (SEQ ID NO:66)的纯化标签为斜体并加粗。单个点突变加粗。
Figure 251293DEST_PATH_IMAGE001
Figure 729286DEST_PATH_IMAGE002
Figure 509023DEST_PATH_IMAGE003
Figure 904232DEST_PATH_IMAGE004
Figure 780921DEST_PATH_IMAGE005
在一些实施方案中，本公开的溶素和/或溶素-AMP多肽构建体被化学修饰。化学修饰包括但不限于添加化学部分，产生新键，和除去化学部分。化学修饰可以发生在和/或溶素-AMP多肽构建体中的任何位置，包括氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。例如，在某些实施方案中，所述溶素或溶素-AMP多肽构建体包含N-末端乙酰化修饰。在某些实施方案中，所述溶素或溶素-AMP多肽构建体包含C-末端酰胺化修饰。这种修饰可以存在于溶素和/或溶素-AMP多肽构建体中的多于一个位点处。
此外，溶素和/或溶素-AMP多肽构建体的一个或多个侧基或末端基团可以被本领域普通技术人员已知的保护基团保护。
在一些实施方案中，将所述溶素和/或溶素-AMP多肽构建体缀合至持续时间增强部分。在一些实施方案中，所述持续时间增强部分是聚乙二醇。聚乙二醇(“PEG”)已用于获得持续时间增强的治疗性多肽(Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165(1995); Mehvar, R., J.Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000), 其通过引用以其整体并入本文)。PEG主链(CH2CH2-0-)n(其中n是重复单体的数目)是柔性且两亲性的。当附接至另一化学实体，诸如溶素和/或溶素-AMP多肽构建体时，PEG聚合物链可以保护此类多肽免于免疫反应和其他清除机制。作为结果，聚乙二醇化可以通过优化药代动力学、增加生物利用度和降低免疫原性和给药量和/或频率来导致效力和安全性提高。
多核苷酸
在一个方面，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含编码如本文所述的溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的核酸分子。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸序列是DNA序列。在其他实施方案中，所述分离的多核苷酸是cDNA序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码与如本文所述的溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子，其中在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，编码的多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码选自GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQID NO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50 )、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ IDNO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN123 (SEQ ID NO:173)或GN121 (SEQ ID NO:175)的溶素或其变体或活性片段或衍生物的核酸分子，其中由所述分离的多核苷酸编码的溶素变体或其活性片段或衍生物在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。在某些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含核酸分子，所述核酸分子编码溶素、其变体或活性片段或衍生物，其含有相对于SEQ ID NO:8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68、96、173和175中的至少一个的至少一个修饰，诸如至少一个氨基酸取代、插入或缺失。在某些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含分别选自SEQ ID NO:7、23、21、25、27、47、49、51、53、55、57、59、63、65、67 95、172和174的核酸序列、其互补序列或与SEQ ID NO:7、23、21、25、27、47、49、51、53、55、57、59、63、65、67 95、172和174之一或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列，其中编码的多肽在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码选自GN217溶素(SEQ ID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)和GN486 (SEQ ID NO:66)中的至少一种的溶素或其变体或活性片段或衍生物的核酸分子。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:7、47、49、51、53和65的核酸序列、其互补序列或与SEQ ID NO:77、47、49、51、53或65之一或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列，其中编码的多肽在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码选自GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ IDNO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN485 (SEQ ID NO:68)中的至少一种的溶素或其变体或活性片段或衍生物的核酸分子，其中编码的多肽在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。在某些实施方案中，所述其变体、活性片段或衍生物含有相对于SEQ ID NO:22、26、28、56、58、60、64或68中的至少一个的至少一个修饰，诸如至少一个取代、插入或缺失。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:21、25、27、55、57、59、63和67的核酸序列、其互补序列或与SEQ ID NO:21、25、27、55、57、59、63或67之一或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列，其中编码的多肽在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。
在另一个方面，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，所述核酸分子包含：
(a)编码第一组分的第一核酸分子，所述第一组分包含：(i)选自以下的溶素：GN76(SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ ID NO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316(SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)和GN485 (SEQ IDNO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或(ii)具有溶素活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个具有至少80%同一性；或(iii)所述溶素的活性片段；
(b)编码第二组分的第二核酸分子，所述第二组分包含：(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ IDNO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11(SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ IDNO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1(SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ IDNO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2(SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ IDNO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ IDNO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP构建体的第一组分的核酸分子，其中所述第一组分选自GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)和GN418 (SEQ ID NO:54)。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP构建体的第二组分的核酸分子，其中所述第二组分选自Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ ID NO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6 (SEQ IDNO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10(SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1 (SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQ ID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ IDNO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ ID NO:177)、Ecp4(SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ IDNO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸进一步包含编码溶素-AMP多肽构建体的至少一种结构稳定组分的核酸分子，以维持所述构建体中的第一和/或第二组分的结构的至少一部分与未缀合的溶素和/或AMP实质上相同。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含编码至少一种结构稳定组分的核酸分子，其中所述至少一种结构稳定组分是肽，诸如包含甘氨酸和/或丝氨酸残基的肽。在一个实施方案中，所述肽选自TAGGTAGG(SEQ ID NO:72)、IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO:82)、PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)、IGEM +PP (SEQ ID NO:16的残基44-58)和AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:122)。
更具体地，在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN168溶素(SEQ ID NO:2)或具有溶素活性且与SEQ ID NO:2具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，编码GN168溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:1或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN176溶素(SEQ ID NO:4)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:4具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN176溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:3的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:3或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN178溶素(SEQ ID NO:6)或编码与SEQ ID NO:6具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN178溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:5的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:5或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN218溶素(SEQ ID NO:10)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:10具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN218溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:9的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:9或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN223溶素(SEQ ID NO:12)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:12具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN223溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:11的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:11或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN239溶素(SEQ ID NO:14)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:14具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN239溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:13的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:13或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN243溶素(SEQ ID NO:16)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:16具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN243溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:15的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:15或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN280溶素(SEQ ID NO:18)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:18具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN280溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:17的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:17或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN281溶素(SEQ ID NO:20)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:20具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN281溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:19的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:19或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN349溶素(SEQ ID NO:30)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:30具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN349溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:29的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:29或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN351溶素(SEQ ID NO:32)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:32具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN351溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:31的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:31或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN352溶素(SEQ ID NO:34)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:34具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN352溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:33的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:33或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN353溶素(SEQ ID NO:36)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:36具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN353溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:35的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:35或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN357溶素(SEQ ID NO:38)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:38具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN357溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:37的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:37或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN359溶素(SEQ ID NO:40)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:40具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN359溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:39的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:39或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN369溶素(SEQ ID NO:42)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:42具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN369溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:41的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:41或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN370溶素(SEQ ID NO:44)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:44具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN370溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:43的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:43或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN371溶素(SEQ ID NO:46)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:46具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN371溶素的核酸分子包含SEQ ID NO:45的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:45或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码溶素-AMP多肽构建体的核酸分子，其中所述溶素-AMP多肽构建体是GN93溶素(SEQ ID NO:62)或编码具有溶素活性且与SEQ ID NO:62具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，编码GN93的核酸分子包含SEQ ID NO:61的核酸序列、其互补序列或编码具有溶素活性的多肽且与SEQ ID NO:61或其互补序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的核酸序列。
载体和宿主细胞
在另一个方面，本公开涉及载体，所述载体包含含有编码本文公开的任何溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的核酸分子的分离的多核苷酸或本发明的分离的多核苷酸的互补序列。在一些实施方案中，所述载体是质粒或粘粒。在其他实施方案中，所述载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连接至病毒载体中。在一些实施方案中，所述载体可以在其引入的宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中，所述载体可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。
在一些实施方案中，特定载体，在本文中称为“重组表达载体”或“表达载体”，可以指导与其可操作连接的基因的表达。当多核苷酸序列被置于与另一核苷酸序列的功能关系中时，其被“可操作连接”。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA和/或蛋白的DNA序列可操作连接或定位成使得所述启动子或调节DNA序列影响编码或结构DNA序列的表达水平，则所述启动子或调节DNA序列被称为“可操作连接”至编码RNA和/或蛋白的DNA序列。可操作连接的DNA序列通常但不一定是连续的。
通常，适合于在宿主中维持、繁殖或表达多肽的任何系统或载体都可用于表达本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物。可以通过任何各种众所周知和常规的技术、诸如例如Sambrook等人, 编, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)中所述的那些，将适当的DNA/多核苷酸序列插入表达系统中。另外，也可以将标签添加至本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物以提供方便的分离方法，例如c-myc、生物素、多-His等。用于此类表达系统的试剂盒是商业可得的。
各种各样的宿主/表达载体组合可用于表达编码本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的多核苷酸序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，并且是商业可得的。例如在Sambrook等编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中提供了合适的载体的实例。此类载体尤其包括，染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如，衍生自以下的载体：细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒、诸如杆状病毒、乳多空病毒(papova virus)、诸如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒，以及衍生自其组合的载体，诸如衍生自质粒和细菌噬菌体遗传元件、诸如粘粒和噬菌粒的载体。
此外，所述载体可以提供本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的组成型或诱导型表达。合适的载体包括但不限于SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如大肠杆菌质粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9和它们的衍生物，质粒、诸如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO；噬菌体DNAS，例如噬菌体A的许多衍生物，例如NM989和其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒、诸如2D质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已经修饰为使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。上述载体中的许多可从供应商、诸如New England Biolabs Inc.、Addgene, Takara Bio Inc.、ThermoFisher ScientificInc.等商业可得。
另外，载体可以包含各种调节元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件)，其中载体根据宿主细胞而构建。各种各样的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任何一种可用于这些载体中以表达编码本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的多核苷酸序列。有用的控制序列包括但不限于：SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体A的主要操作子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酯激酶或其他糖分解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母交配因子的启动子、用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他启动子序列，及其各种组合。通常，编码溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的多核苷酸序列可操作地连接至异源启动子或调节元件。
在另一个方面，本公开涉及宿主细胞，其包含本文公开的任何载体，包括包含编码本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的多核苷酸序列的表达载体。各种各样的宿主细胞可用于表达本发明的多肽。适用于表达本发明的多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主，诸如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属的菌株，真菌，诸如酵母，和动物细胞，诸如CHO、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS1、COS7、BSCl、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养物中的人细胞和植物细胞。尽管表达宿主可以是任何已知的表达宿主细胞，但在一个典型的实施方案中，表达宿主是大肠杆菌菌株之一。这些包括但不限于商业可得的大肠杆菌菌株、诸如Top10 (ThermoFisher Scientific, Inc.)、DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.)、SCSllO (Agilent Technologies, Inc.)、JM109 (Promega, Inc.)、LMG194 (ATCC)和BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)。
使用大肠杆菌作为宿主系统存在几个优点，包括：快速生长动力学，其中在最佳环境条件下，其倍增时间为约20分钟(Sezonov等人, J. Bacterial. 189 8746-8749(2007))，容易实现高密度培养，用外源DNA容易且快速转化等。关于大肠杆菌中蛋白表达的详细信息，包括质粒选择以及菌株选择，由Rosano, G.和Ceccarelli, E.，Front Microbial., 5: 172 (2014)详细讨论。
本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的有效表达取决于各种因素，诸如最佳表达信号(在转录和翻译水平二者)、正确的蛋白折叠和细胞生长特征。关于用于构建载体的方法和用于将构建的重组载体转导入宿主细胞的方法，可以使用本领域中已知的常规方法。尽管理解并非所有载体、表达控制序列和宿主将同样良好地发挥功能以表达编码本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的多核苷酸序列，但在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员将能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主，而无需过多实验以完成期望的表达。
在一些实施方案中，本发明人已经发现表达水平和表达的多肽的活性之间的相关性；特别是在大肠杆菌表达系统中，中等水平的表达(例如，约1和10 mg/升之间)已经产生溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物，其活性水平高于在大肠杆菌中以较高水平表达的那些(例如，约20和约100mg/升之间)，后者有时产生完全无活性的多肽。
通过众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱，可以从重组细胞培养物回收和纯化本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物。高效液相色谱也可用于溶素多肽纯化。
或者，用于产生本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的载体系统可以是无细胞表达系统。各种无细胞表达系统是商业可得的，包括但不限于可得自Promega、LifeTechnologies、Clonetech等的那些。
如上所示，当提到蛋白生产和纯化时，存在许多选择。在蛋白生产和纯化中待考虑的合适方法和策略的实例提供于WO 2017/049233，其通过引用以其整体并入本文，并且进一步提供于Structural Genomics Consortium等人, Nat. Methods., 5(2): 135-146(2008)。
药物组合物
在另一个方面，本公开涉及药物组合物，其包含有效量的如本文所述的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括至少一种选自以下的活性：在人血清不存在和/或存在的情况下或在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种适合于治疗革兰氏阴性细菌的抗生素。典型的抗生素包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。额外的合适的抗生素描述于表3中。
在一些实施方案中，所述药物组合物是溶液剂、悬浮剂、乳剂、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂。本公开的药物组合物可以采取溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、丸粒、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、粉剂、缓释制剂、栓剂、棉条应用乳剂、气溶胶、喷雾剂、悬浮剂、锭剂、含片、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂布剂、定时释放的贴剂、吸收液体的湿巾及其组合的形式。
本公开的药物组合物的施用可以是局部的，即，在期望其作用之处直接应用所述药物组合物(例如直接应用至伤口)。本公开的局部组合物可以进一步包含药学上或生理学上可接受的载体，诸如皮肤病学或耳可接受的载体。在皮肤病学可接受的载体的情况下，此类载体优选地与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的任何常规使用的皮肤病学载体。在耳可接受的载体的情况下，所述载体优选地与耳朵的所有部分相容。本领域普通技术人员可以容易地选择此类载体。
用于局部施用本文公开的溶素、其活性片段和/或溶素-AMP多肽构建体的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。在配制皮肤软膏剂时，本公开的活性组分可以配制在油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油水可移除基质和/或水溶性基质中。在配制耳用组合物时，本公开的活性组分可以配制在包括载体的水性聚合悬浮液中，所述载体诸如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、Gelrite®、纤维素聚合物、诸如羟丙基甲基纤维素和含羧基聚合物、诸如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其他聚合缓和剂。
根据公开的局部组合物可以呈适合于局部应用的任何形式，包括水性、水性-醇性、或油性溶液，洗剂或精华液分散体，水性、无水或油性凝胶，通过将脂肪相分散于水相(OAV或水包油)或相反(W/O或油包水)中获得的乳液、微乳液或者可替代地微囊、微粒或者离子型和/或非离子型的脂质囊泡分散体，乳膏，洗剂，凝胶剂，泡沫剂(其将通常需要加压罐、合适的涂抹器、乳化剂和惰性推进剂)，香精，奶类产品，悬浮剂或贴剂。本公开的局部组合物还可以含有助剂，诸如亲水或亲脂胶凝剂、亲水或亲脂活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、填料、防晒剂、气味吸收剂和染料。在一个进一步方面，所述局部组合物可以与能够粘附至受试者的皮肤或其他组织或以其他方式与受试者的皮肤或其他组织缔合的装置、诸如经皮贴片、敷料、垫、包裹物、基质和绷带结合施用，其能够递送治疗有效量的根据公开的一种或多种抗细菌多肽。
在一些实施方案中，本公开的局部组合物另外包含用于治疗局部烧伤的一种或多种组分。此类组分通常包括但不限于丙二醇水凝胶；二醇、纤维素衍生物和水溶性铝盐的组合；防腐剂；抗生素；和皮质类固醇。还可添加湿润剂(诸如固体或液体蜡酯)、吸收促进剂(诸如亲水性粘土、或淀粉)、粘性增加剂(viscocity building agent)和皮肤保护剂。局部制剂可以呈冲洗剂、诸如漱口水的形式。参见例如WO2004/004650。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物的施用可以是全身的。全身施用可以是肠内或口服的(即，物质经由消化道给予)，肠胃外(即，物质通过除了消化道以外的其他途径、诸如通过注射或吸入给予)。因此，可以将本公开的多肽(包括溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物)口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、经鼻、经颊或经由植入的储库或通过任何其他已知方法施用于受试者。本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物也可以通过持续释放剂型的方式施用。
对于口服施用，可以将本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末、溶液剂、混悬剂和分散剂。所述溶素、其活性片段和/或溶素-AMP多肽构建体可以与赋形剂、诸如例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、明胶、马铃薯淀粉、海藻酸和/或硬脂酸镁一起配制。
为了制备固体组合物、诸如片剂和丸剂，将本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物与药物赋形剂混合以形成固体预配制组合物。如果期望，片剂可以通过标准技术被糖包衣或肠溶包衣。片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合以提供赋予延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者呈前者上的包膜的形式。两种剂量组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。各种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。
本公开的药物组合物也可以通过注射施用。例如，可以肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用所述药物组合物，以治疗革兰氏阴性细菌的感染，更具体地由铜绿假单胞菌引起的感染。所述药学上可接受的载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合构成。另外，肠胃外注射剂的药物组合物可以包含pH缓冲溶液、助剂(例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
在肠胃外注射是所选择的施用模式的情况下，使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液、诸如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可以包括明胶和白蛋白。可以将血管收缩剂添加至所述制剂中。提供根据该类型应用的药物制剂，其为无菌且无热原的。
在另一个实施方案中，本公开的药物组合物是可吸入组合物。在一些实施方案中，本发明的药物组合物被有利地配制为干燥的可吸入粉末。在具体实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。合适的推进剂的实例包括但不限于：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷和二氧化碳。在某些实施方案中，可以将制剂雾化。
可以将表面活性剂添加至本公开的可吸入药物组合物中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。所述表面活性剂可以是与本发明的多肽不反应的任何合适的无毒化合物。
合适的表面活性剂的实例包括但不限于：油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯；氯化鲸蜡基吡啶；大豆卵磷脂；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚氧乙烯(10)硬脂基醚；聚氧乙烯(2)油基醚；聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；蓖麻油乙氧基化物；及其组合。
在一些实施方案中，所述可吸入药物组合物包括赋形剂。合适的赋形剂的实例包括但不限于：乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯；中链、短链或长链脂肪酸的甘油三酯，或其任何组合；全氟二甲基环丁烷；全氟环丁烷；聚乙二醇；薄荷醇；丙二醇单月桂酸甘油酯(lauroglycol)；二甘醇单乙基醚；中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯；醇；桉树油；短链脂肪酸；及其组合。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物包括鼻用制剂。鼻用制剂包括例如鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏剂、洗鼻液、鼻用注射液、鼻用填充物、支气管喷雾剂和吸入剂、或间接通过使用咽喉锭剂、漱口水或漱口剂、或通过使用涂敷至鼻孔或面部的软膏，或这些和类似应用方法的任何组合。
在另一个实施方案中，本公开的药物组合物包含补充剂，包括一种或多种抗微生物剂和/或一种或多种常规抗生素。为了加速感染的治疗或加强抗细菌效果，含有本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物的治疗剂可以进一步包括至少一种补充剂，所述补充剂也可以加强该肽的杀细菌活性。所述补充剂可以是一种或多种用于治疗革兰氏阴性细菌的抗生素。在一个实施方案中，所述补充剂是用于治疗由铜绿假单胞菌引起的感染的抗生素或抗微生物剂。
本公开的药物组合物可以以单位剂型呈现并且可以通过本领域中众所周知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、接受者暴露于感染性细菌的持续时间、受试者的体型和重量，和具体施用模式而不同。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的每种化合物的量。通常，在百分之一百中，活性成分的总量将范围为约百分之一至约百分之九十九，优选地约百分之五至约百分之七十，最优选地约百分之十至约百分之三十。
剂量和施用
施用的剂量取决于许多因素，包括所治疗的感染的活性，待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况，特定的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的活性；根据本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物与其配对的抗生素(如果有的话)的性质和活性，以及这种配对的组合效果。通常，预期待施用的本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的有效量可以落入1-50 mg/kg (或1至50毫克/ml)的范围内，其每天1-4次施用，持续最长达14天的时段。如果还使用抗生素，则将以标准给药方案或鉴于协同作用以较低量施用抗生素。然而，所有此类剂量和方案(不论是所述溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物还是与其结合施用的任何抗生素)都进行优化。可以通过进行体外和体内试验性效力实验确定最佳剂量，如在本领域的技能之内，但将本公开纳入考虑。
考虑本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物提供杀细菌作用，并且当以较小量使用时，提供抑细菌作用，并且针对一定范围的抗生素抗性细菌有活性，并且与抗性进化无关。基于本公开，在临床环境中，本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物是用于单独或与抗生素(甚至是已对其发展抗性的抗生素)一起治疗由药物抗性和多药抗性细菌引起的感染的组合物的有效替代物(或添加剂或组分)。革兰氏阴性细菌的现有抗性机制不应影响对本发明的多肽的裂解活性的敏感性。
在一些实施方案中，暴露于本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的时间可以影响每ml的活性多肽单位的期望浓度。被分类为“长”或“慢”释放载体(诸如例如某些鼻用喷雾剂或锭剂)的载体可以具有或提供每ml的更低浓度的多肽单位，但经历更长时间段，而“短”或“快”释放载体(诸如例如漱口液)可以具有或提供每ml的高浓度多肽单位(微克)，但经历更短时间段。存在这样的情况，其中具有高得多的单位/ml剂量或更低的单位/ml剂量可以是期望的。
对于本公开的任何多肽，可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中初始地估计治疗有效剂量。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。获得的信息然后可用于确定在人中的有效剂量以及施用途径。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望效果。可以纳入考虑的额外的因素包括疾病状态的严重程度，患者的年龄、重量和性别；饮食，期望的治疗持续时间，施用方法，施用的时间和频率，药物组合，反应灵敏度，和对疗法的耐受性/应答，以及治疗医师的判断。
治疗方案可以使得有必要每日(例如，每天一次、两次、三次等)，每隔一天(例如每隔一天一次、两次、三次等)、每半周、每周、每两周一次、一个月一次等施用。在一个实施方案中，治疗可以作为连续输注给予。单位剂量可以在多个时机施用。如通过监测临床症状所示，间隔也可以是不规则的。或者，单位剂量可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率可以根据患者变化。本领域技术人员将理解，此类指南将根据局部施用，例如鼻内、吸入、直肠等，或全身施用，例如口服、直肠(例如经由灌肠)、i.m.(肌内)、i.p.(腹膜内)、i.v.(静脉内)、s.c.(皮下)，经尿道等而调整。
方法
在另一个方面，本公开涉及治疗由如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种引起的细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用如本文所述的药物组合物。在一个方面，所述细菌感染是其中存在肺表面活性剂的器官或组织的感染。
术语“感染”和“细菌感染”意在包括呼吸道感染(RTI)，诸如患者中的呼吸道感染，所述患者具有囊性纤维化(CF)，下呼吸道感染，诸如慢性支气管炎的急性恶化(ACEB)，急性鼻窦炎，社区获得性肺炎(CAP)，医院获得性肺炎(HAP)和医院呼吸道感染；性传播疾病，诸如淋球菌性宫颈炎和淋球菌性尿道炎；尿道感染；急性中耳炎；败血症，包括新生儿败血症和导管相关的败血症；和骨髓炎。还考虑由药物抗性细菌和多药抗性细菌引起的感染。
由铜绿假单胞菌引起的感染的非限制性实例可以包括：A)医院感染：1.呼吸道感染，特别是在囊性纤维化患者和机械通气患者中；2.菌血症和败血症；3.伤口感染，尤其是烧伤受害者的那些；4.泌尿道感染；5.侵入性装置上的手术后感染；6.静脉内施用受污染的药物溶液引起的心内膜炎；7.具有获得性免疫缺陷综合征、癌症化疗、类固醇疗法、血液恶性肿瘤、器官移植、肾脏替换疗法和具有严重中性粒细胞减少症的其他病况的患者中的感染。B)社区获得性感染：1.社区获得性呼吸道感染；2.脑膜炎；3.由受污染的水引起的毛囊炎和耳道感染；4.老年人和糖尿病患者中的恶性外耳炎；5.儿童中跟骨的骨髓炎；6.通常与被污染的隐形眼镜相关的眼部感染；7.皮肤感染，诸如手经常暴露于水的人中的指甲感染；8.胃肠道感染；和9.肌肉骨骼系统感染。
本发明的方法的革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种可以包括如本文所述的革兰氏阴性细菌的任何额外物种。通常，革兰氏阴性细菌的额外物种选自以下中的一种或多种：鲍氏不动杆菌，溶血不动杆菌，放线共生放线杆菌，嗜水气单胞菌，拟杆菌属物种，诸如，脆弱拟杆菌，多形拟杆菌(Bacteroides theataioatamicron)，吉氏拟杆菌，椭圆形拟杆菌，普通拟杆菌，五日热巴尔通体，百日咳博德特氏菌，布鲁氏菌属物种，诸如，马尔他布鲁氏菌，伯克霍尔德菌属物种，诸如，洋葱伯克霍尔德菌，假鼻疽伯克霍尔德菌，和鼻疽伯克霍尔德菌，梭杆菌属，人体普雷沃氏菌，中间普雷沃氏菌，Prevotella endodontalis，不解糖卟啉单胞菌，空肠弯曲杆菌，胎儿弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，衣原体属物种，诸如肺炎衣原体和沙眼衣原体，弗氏柠檬酸杆菌，克氏柠檬酸杆菌，伯纳特氏立克次氏体，爱德华氏菌属物种，诸如，迟缓爱德华菌，侵蚀艾肯菌，肠杆菌属物种，诸如，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌和聚团肠杆菌，大肠杆菌，土拉热弗朗西斯氏菌，流感嗜血杆菌，杜氏雷嗜血杆菌，幽门螺杆菌，金氏金氏菌，克雷伯氏菌属物种，诸如，肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，鼻硬结克雷伯氏菌和臭鼻克雷伯氏菌，嗜肺军团菌，莫拉克斯氏菌属物种，诸如，卡他莫拉菌，摩根氏菌属物种，诸如，摩氏摩根氏菌，淋病奈瑟氏菌，脑膜炎奈瑟氏菌，铜绿假单胞菌，多杀巴斯德氏菌，类志贺邻单胞菌，奇异变形菌，普通变形菌，彭氏变形菌，产粘变形菌，普罗维登斯菌属物种，诸如，斯氏普罗威登斯菌，雷氏普罗威登斯菌，产碱普罗威登斯菌，荧光假单胞菌，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属物种，诸如，粘质沙雷氏菌，志贺氏菌属物种，诸如，福氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌，嗜麦芽寡养单胞菌，念珠状链杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，肺炎衣原体，沙眼衣原体，普氏立克次氏体，伯纳特氏立克次氏体，恰菲埃里希氏体和/或汉氏巴尔通氏体。
更通常地，革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种选自以下中的一种或多种：鲍氏不动杆菌、百日咳博德特氏菌、洋葱伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、杜氏雷嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、多杀巴斯德氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、霍乱弧菌和/或肺炎衣原体。
甚至更通常地，革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种选自以下中的一种或多种：鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌属物种、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、沙雷氏菌属物种，奇异变形杆菌、摩氏摩根氏菌、普罗维登斯菌属物种、爱德华菌属物种、耶尔森氏菌属物种、流感嗜血杆菌、五日热巴尔通体、布鲁氏菌属物种、百日咳博德特氏菌、伯克霍尔德菌属物种、莫拉克斯氏菌属物种、土拉热弗朗西斯氏菌、嗜肺军团菌、伯纳特氏立克次氏体、拟杆菌属物种、肠杆菌属物种和/或衣原体属物种。
又甚至更通常地，革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种是克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和/或土拉热弗朗西斯氏菌。
在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌的感染导致局部感染，诸如局部细菌感染，例如皮肤伤口。在其他实施方案中，所述细菌感染是全身性病原性细菌感染。常见的革兰氏阴性病原体和相关的感染列于本公开的表2中。这些意欲充当可以用本发明的溶素、其活性片段和溶素-AMP多肽构建体治疗、减轻或预防的细菌感染的实例，并且无意进行限制。
表2. 医学相关的革兰氏阴性细菌和相关疾病。
鼠伤寒沙门氏菌 胃肠道(GI)感染-沙门氏菌病
志贺氏菌属物种 志贺氏菌病
大肠杆菌 尿道感染(UTis)
鲍氏不动杆菌 伤口感染
铜绿假单胞菌 血流感染和肺炎
肺炎克雷伯氏菌 UTis和血流感染
淋病奈瑟氏菌 性传播疾病(STD)-淋病
脑膜炎奈瑟氏菌 脑膜炎
沙雷氏菌属物种 导管污染、UTIs和肺炎
奇异变形杆菌 UTIs
摩根氏菌属物种 UTIs
普罗维登斯菌属物种 UTIs
爱德华菌属物种 UTIs
伤寒沙门氏菌 GI感染 – 伤寒热
鼠疫耶尔森氏菌 淋巴腺鼠疫和肺炎性鼠疫
小肠结肠炎耶尔森氏菌 GI感染
假结核耶尔森氏菌 GI感染
流感嗜血杆菌 脑膜炎
五日热巴尔通体 战壕热
布鲁氏菌属物种 布鲁氏菌病
百日咳博德特氏菌 呼吸道-百日咳
伯克霍尔德菌属物种 呼吸道
莫拉克斯氏菌属物种 呼吸道
土拉热弗朗西斯氏菌 土拉菌病
嗜肺军团菌 呼吸道-军团菌病
伯纳特氏立克次氏体 Q热
拟杆菌属物种 腹部感染
肠杆菌属物种 UTis和呼吸道
衣原体属物种 STDs、呼吸道和眼科
大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌属物种、奇异变形杆菌和/或铜绿假单胞菌 植入物、导管、假体关节和其他医疗装置的感染
。
在一些实施方案中，本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物用于治疗处于由于铜绿假单胞菌和/或另一种革兰氏阴性细菌而获得感染的风险中的受试者。处于获得铜绿假单胞菌或其他革兰氏阴性细菌感染的风险中的受试者包括，例如，囊性纤维化患者、中性粒细胞减少症患者、具有坏死性小肠结肠炎的患者、烧伤受害者、具有伤口感染的患者，以及更通常，医院环境中的患者，尤其是手术患者和在使用可植入医疗装置(诸如导管，例如中心静脉导管、Hickman装置或电生理心脏装置(例如起搏器和可植入除颤器)进行治疗的患者。处于被革兰氏阴性细菌(包括铜绿假单胞菌)感染的风险中的其他患者群体包括但不限于具有植入的假体、诸如全关节置换术(例如全膝或髋关节置换术)的患者。
在另一个方面，本公开涉及预防或治疗细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一有效量的含有有效量的如本文所述的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的组合。
如在本领域的技术之内，本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物可以与标准护理抗生素或与最后手段的抗生素单独或以各种组合共同施用。针对铜绿假单胞菌使用的传统抗生素描述于表3中。用于其他革兰氏阴性细菌、诸如克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌的抗生素与表3中对于铜绿假单胞菌提供的抗生素是类似的。
表3. 用于治疗铜绿假单胞菌的抗生素
Figure 603384DEST_PATH_IMAGE006
。
在更具体实施方案中，所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。在某些实施方案中，所述抗生素是美罗培南。
组合本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物与抗生素提供了有效的抗细菌方案。在一些实施方案中，本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物与一种或多种抗生素的共同施用可以在溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物或抗生素中的任一或两者的降低的剂量和量、和/或降低的频率和/或治疗持续时间下实施，具有加强的杀细菌和抑细菌活性、降低的抗生素抗性风险，并具有降低的有害的神经或肾脏副作用(诸如与粘菌素或多粘菌素B使用有关的那些)的风险。先前的研究已经显示，粘菌素的总累积剂量与肾脏损害有关，表明使用与溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物的组合疗法的剂量的减少或治疗持续时间的缩短可以降低肾毒性的发生率(Spapen等人，Ann IntensiveCare. 1: 14 (2011)，其通过引用以其整体并入本文)。如本文所用，术语“减少的剂量”是指与用相同活性成分的单一疗法相比的组合中的一种活性成分的剂量。在一些实施方案中，组合中溶素、其活性片段和溶素-AMP多肽构建体或抗生素的剂量相比于各自的单一疗法可以是次优的或甚至亚阈值的。
在一些实施方案中，本公开提供了通过向受试者施用本文公开的一种或多种溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物连同目标抗生素，与单独使用的一种或多种抗生素的活性相比，加强所述抗生素针对革兰氏阴性细菌的抗生素活性的方法。该组合针对细菌是有效的并允许克服针对该抗生素的抗性和/或以较低剂量使用该抗生素，减少不期望的副作用，诸如多粘菌素B的肾毒性和神经毒性作用。
任选地与本公开的抗生素组合的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物可以进一步与革兰氏阴性细菌的外膜的额外透化剂组合，所述透化剂包括但不限于金属螯合剂，诸如例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸(Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992)，其通过引用以其整体并入本文)。
在又另一个方面，本公开涉及抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，所述方法包括使所述细菌与含有有效量的如本文所述的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物的组合物接触，其中所述溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。
在一些实施方案中，抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括使细菌与如本文所述的溶素、其活性片段和/或溶素-AMP多肽构建体接触，其中所述细菌存在于例如医疗装置、医院和其他健康相关或公共使用建筑中的地板、楼梯、墙壁和工作台面的表面以及手术室、急诊室、病房、诊所和浴室等中的设备的表面上。
可使用本文所述的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物保护的医疗装置的实例包括但不限于管道和其他表面医疗装置，诸如导尿管、粘液提取导管、抽吸导管、脐带插管、隐形眼镜、子宫内装置、阴道内和肠内装置、气管内管、支气管镜、牙齿假体和牙齿矫正装置、手术器械、牙科器械、管道、牙科用水线、织物、纸张、指示条(例如纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如水凝胶粘合剂、热融粘合剂或基于溶剂的粘合剂)、绷带、组织敷料或愈合装置和闭塞贴片，以及医疗领域中使用的任何其他表面装置。装置可以包括各种类型的电极、外部假体、固定带、压迫绷带和监视器。医疗装置还可以包括可以放置在插入或植入部位处的任何装置，所述部位诸如插入或植入部位附近的皮肤，并且其可以包括易感于革兰氏阴性细菌的定殖的至少一个表面。
可以如本文所述在体内或体外使用的本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物也可用于治疗由于革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌导致的与生物膜形成相关的细菌感染。
例如，在一些实施方案中，本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、变体、其活性片段或衍生物可用于预防、控制、破坏和/或根除由革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌形成的细菌生物膜。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)的基质中时，生物膜形成发生。微生物在富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白)和营养素的这种受保护环境中的生长允许增强的微生物串扰(cross-talk)和增加的毒力。生物膜可以在任何支持环境(包括活体和非生命体表面、诸如CF肺的粘液栓、污染的导管、隐形眼镜等)中发展(Sharma等人. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)，其通过引用以其整体并入本文)。因此，在一个实施方案中，当细菌被细菌生物膜保护时，本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物可用于预防、控制、破坏、根除和治疗由于革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌导致的细菌感染。
更具体地，在一些方面，本公开涉及用于预防、破坏或根除革兰氏阴性细菌生物膜的方法，其包括使表面(包括生物或非生物表面)与包含有效杀死革兰氏阴性细菌的本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物的组合物接触，其中有效地预防、破坏或根除生物膜。
在一些方面，本公开涉及用于预防、破坏或根除革兰氏阴性细菌生物膜的方法，其包括向有此需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包含有效杀死表面上的革兰氏阴性细菌的本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物，其中有效地预防、破坏或根除生物膜。
在一些实施方案中，所述表面是生物表面，诸如固体生物表面，例如皮肤。在其他实施方案中，所述表面是非生物表面。在一些实施方案中，所述表面是以下的表面：医疗装置，诸如隐形眼镜；药物泵，植入物，包括牙科植入物，心脏植入物，诸如起搏器，假体心脏瓣膜，心室辅助装置，合成血管移植物和支架；导管，包括腹膜透析导管，用于血液透析和用于长期施用化学治疗剂的留置导管(Hickman导管)，导尿管和假体装置，包括尿道假体，假关节；整形外科材料以及气管和呼吸机管路。
在一些实施方案中，所述受试者患有与生物膜相关的革兰氏阴性细菌感染。此类细菌感染包括如本文所述的扁桃体炎、骨髓炎、细菌性心内膜炎、鼻窦炎、角膜的感染、尿道感染、胆道的感染、感染性肾结石、尿道炎、前列腺炎、中耳感染、牙菌斑的形成、牙龈炎、牙周炎、囊性纤维化、伤口感染(尤其是与糖尿病相关的伤口)和医疗装置的感染，包括导管感染和关节假体和心脏瓣膜的感染。
在一些实施方案中，用于治疗生物膜感染的组合物包含一种或多种如本文所述的抗生素。在其他实施方案中，将如本文所述的本发明的溶素或其活性片段或其变体或衍生物与一种或多种如本文所述的抗生素同时施用于受试者和/或与表面接触。在其他实施方案中，将本公开的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物以及一种或多种如本文所述的抗生素以任何顺序依次施用于受试者和/或与表面接触。在一些实施方案中，本公开的本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物以及一种或多种如本文所述的抗生素可以单一或组合地，在单个剂量或多个剂量中施用于受试者和/或与表面接触。
在一些实施方案中，本发明的组合物用于预防生物膜形成。在这些实施方案中，接触的表面可以含有生物膜，可以不含生物膜，或者仅含有最少量的建立的生物膜。在一些实施方案中，根据本文所述的任何机理预防在表面上从头形成生物膜。
在一些实施方案中，接触的表面包含生物膜，且所述生物膜被破坏或根除。在一些实施方案中，根除包括杀死生物膜中的细菌，包括持久细菌。在其他实施方案中，本公开的本发明的溶素-AMP多肽、溶素多肽、其变体、活性片段或衍生物不仅杀死生物膜内的细菌，因此根除生物膜，而且破坏或毁坏生物膜基质。该能力是有利的，因为甚至在活细菌不存在的情况下，基质也经常变得被快速重新感染。
实施例
实施例1. 溶素和溶素-AMP多肽构建体在补充有人血清的培养基中的活性。
材料和方法
将革兰氏阴性细菌，例如铜绿假单胞菌，在酪蛋白氨基酸(CAA)培养基(5 g/L酪蛋白氨基酸, Ameresco/VWR; 5.2 mM K2HPO4, Sigma-Aldrich; 1 mM MgSO4, Sigma-Aldrich)、补充有150 mM NaCl的CAA、补充有2.5%人血清(AB型，男性，合并的；Sigma-Aldrich)的CAA、补充有12.5%人血清的CAA和补充有6.25% Survanta®的CAA中进行培养和测试。对于补充有12.%人血清和6.25% Survanta®的CAA两者，评估一系列的铜绿假单胞菌分离株。6.25%Survanta®对应于1.5 mg/mL磷脂。
最小抑制浓度(MIC)的测定
使用由Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015.Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria ThatGrow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and LaboratoryStandards Institute, Wayne, PA定义的标准培养液微量稀释参考方法的修改版测定MIC值。所述修改版基于用CAA培养基(有或没有NaCl)、补充有2.5%人血清的CAA(表4)、补充有12.5%人血清的CAA(表A)或补充有6.25% Survanta®的CAA(表B)替换Mueller Hinton培养液。MIC是与对照相比足以抑制至少80%的细菌生长的肽的最小浓度。
结果
这些实验的结果概述于下表4、A和B中。表4还提供了本发明的多肽的分子量和等电点。通过比较各种多肽的序列和组分，可以确定特定结构修饰对等电点(较高的pI有利于外膜穿透)和活性(如通过MIC所评价)的影响。
例如，可以看到单个点突变对GN316 (SEQ ID NO:22)的影响。GN394 (SEQ ID NO:48)在CAA中具有较低的pI和较高的活性，但在具有人血清的CAA中具有较低的活性。对于GN396 (SEQ ID NO:50)，人血清中的活性降低较少，而在人血清存在和不存在的情况下，GN408 (SEQ ID NO:52)都显著更有效。另一方面，GN418 (SEQ ID NO:54)在未补充的CAA培养基中丧失活性，但在人血清存在的情况下获得功效。
在人血清不存在和存在的情况下，GN217 (SEQ ID NO:8)中的单个点突变使其功效提高超过GN37。对GN37 (SEQ ID NO:84)的修饰(产生GN218 (SEQ ID NO:10)、GN223(SEQ ID NO:12)、GN239 (SEQ ID NO:14)和GN243 (SEQ ID NO:16))在人血清存在的情况下导致非常强的活性。基于其他多肽的序列和组分的比较，可以得出类似的观察。
实施例2. 抗生素和溶素或溶素-AMP多肽构建体之间的协同作用。
在棋盘测定中，使用补充有如本文所述的人血清的CAA培养基，使用碳青霉烯抗性的临床菌株WC-452检测GN76 (SEQ ID NO:203)、GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123 (SEQ IDNO:173)、GN351 (SEQ ID NO:32)、GN370 (SEQ ID NO:44)和GN428 (SEQ ID NO:60)和12种不同的抗生素之间的协同作用。对于所有组合测定分数抑制剂浓度指数(FICI)值；<0.5的值指示协同作用。
如下表5中所示，前述溶素和溶素-AMP构建体在广泛范围的抗生素间是协同作用的。对于亚胺培南，协同作用与对碳青霉烯抗生素的重新敏化一致。
实施例3. 使用抗生素与溶素的组合使对碳青霉烯抗性的临床菌株重新敏化。
通过将前述溶素各自与两种碳青霉烯(即亚胺培南(IPM)或美罗培南(MEM))组合来评价GN121 (SEQ ID NO:175)或GN123 (SEQ ID NO:173)对碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌菌株重新敏化的能力。评价最多达七种碳青霉烯抗性的分离株。重新敏化发生在协同组合中，其中碳青霉烯MIC值低于确立的断点，例如对于碳青霉烯敏感的分离株的<2的MIC值，对于中等敏感的碳青霉烯分离株的4的MIC值，和对于碳青霉烯抗性的分离株的> 8的MIC值。参见Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition.Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA。
如表6-9中所示，与GN123 (SEQ ID NO:173)或GN121(SEQ ID NO:175)的协同组合表明，对于所检查的七种碳青霉烯中的每一种，IPM和MEM MICS降低至低于断点值。这些观察与重新敏化一致。
实施例4. 使用抗生素与其他的溶素或溶素-AMP构建体的组合，碳青霉烯抗性的临床分离株的重新敏化。
通过将下述溶素或溶素-AMP多肽构建体各自与IPM或MEM组合来评价GN351 (SEQID NO:32)、GN370 (SEQ ID NO:44)或GN428 (SEQ ID NO:60)使碳青霉烯抗性的临床菌株对碳青霉烯重新敏化的能力。评价碳青霉烯抗性的分离株WC-452。如以上实施例3中所示，重新敏化发生在协同组合中，其中碳青霉烯MIC值降至低于前述断点。
如表10中所示，与GN351 (SEQ ID NO:32)、GN370 (SEQ ID NO:44)或GN428 (SEQID NO:60)的协同组合表明对于WC-452，IPM和MEM MICS降低至低于断点值。这些观察结果与重新敏化一致。
实施例3和4中的发现表明，本文所述的溶素和溶素-AMP多肽构建体可以使铜绿假单胞菌对碳青霉烯抗生素重新敏化，在体外使MIC低于断点值。溶素和溶素-AMP多肽构建体使抗生素抗性的菌株对常规抗生素重新敏化的这种新型能力表明这些生物制剂作为抗击和逆转抗微生物抗性的治疗剂的益处。
表A –溶素或溶素-AMP多肽构建体在人血清中的活性
Figure 870417DEST_PATH_IMAGE007
。
表B –肺表面活性剂(Survanta®)中的活性
Figure 131634DEST_PATH_IMAGE008
。
表4. 溶素或溶素-AMP多肽构建体在人血清中的敏感性
Figure 800513DEST_PATH_IMAGE009
Figure 793877DEST_PATH_IMAGE010
。
表5. 抗生素和溶素或溶素-AMP多肽构建体之间的协同作用
Figure 548206DEST_PATH_IMAGE011
。
表6. 使用IMIPENEM和GN123 (SEQ ID NO:173)的组合的革兰氏阴性细菌重新敏化
Figure 347535DEST_PATH_IMAGE012
。
表7. 使用美罗培南和GN123 (SEQ ID NO:173)的组合的革兰氏阴性细菌重新敏化
Figure 870920DEST_PATH_IMAGE013
(R) = 抗性的；(S)= 敏感的。
表8. 使用亚胺培南和GN121 (SEQ ID NO:175)的组合的革兰氏阴性细菌重新敏化
Figure 300764DEST_PATH_IMAGE014
表9. 使用美罗培南和GN121 (SEQ ID NO:175)的组合的革兰氏阴性细菌重新敏化
Figure 106172DEST_PATH_IMAGE015
。
表10. 使用MEM或IPM和GN351 (SEQ ID NO:32)、GN370 (SEQ ID NO:44)或GN428(SEQ ID NO:60)的组合的革兰氏阴性细菌重新敏化
Figure 381295DEST_PATH_IMAGE016
。
实施例5. 人血清和肺表面活性剂中针对铜绿假单胞菌的革兰氏阴性溶素杀细菌活性
使用并入人血清或肺表面活性剂的标准体外敏感性测试形式，评估本文所述的四种抗假单胞菌溶素GN121、GN351、GN370和GN428的细菌裂解活性的进一步表征。通过荧光和透射电子显微镜(TEM)进一步评估革兰氏阴性溶素作用的机制，如实施例6和7中所讨论。
材料和方法：通过在补充有人血清和肺表面活性剂(Survanta®; MyodermClinical Supplies)的培养基中，通过培养液微量稀释测定MIC。在棋盘测定中检查与抗生素的协同作用，并且使用标准方法测定最小生物膜根除浓度(MBEC)。使用补充有12.5%人血清的CAA测量MBEC。在进行LIVE/DEAD染色(ThermoFisher)和TEM之后进行荧光显微镜检查。
结果：观察到革兰氏阴性溶素在人血清和肺表面活性剂(Survanta®)中的活性。在单独的标准AST形式培养基(25%酪蛋白氨基酸培养基，具有0.25 mM MgSO4)中且在12.5%人血清和0.78% Survanta®存在的情况下，测定溶素MIC值。0.78%的Survanta®浓度代表肺表面活性剂的生理水平。铜绿假单胞菌菌株CFS-1292(美罗培南抗性的)用作报告菌株。如下表11中所示，得出结论：革兰氏阴性溶素GN121、GN351、GN428和GN370在人血清和肺表面活性剂中是活性的。同样，如下表C中所示，使用12.5%人血清，所述溶素和AMP-溶素多肽构建体表现出有效的抗生物膜作用，其中MBEC值≤1µg/mL，与对于MIC观察到的那些相似。
表11 –溶素在单独和补充有人血清或肺表面活性剂的培养基(25% CAA)中的MIC值
克隆 革兰氏阴性溶素 25% CAA MIC CAA中的人血清(12.5%)中的MIC (μg/mL) 0.78% Survanta®中的MIC (μg/mL)
1525 GN121 1 0.5 2
1799 GN351 1 0.0625 4
1876 GN428 4 0.125 4
1818 GN370 4 2 2
表C –溶素和溶素-AMP多肽构建体的MBEC值
溶素或溶素-AMP多肽构建体 补充有12.5%人血清的CAA中的MBEC (μg/mL)
GN121 0.25
GN351 0.5
GN428 1
GN370 1
以MIC测定形式在一定范围浓度的Survanta®下测量革兰氏阴性溶素在肺表面活性剂(Survanta®)存在的情况下的活性。在补充至AST-形式(25% SAA)中的各种浓度的Survanta® (25%、12.5%、6.25%、3.12%、1.56%、0.78%和0.39%)存在的情况下MIC的倍数变化显示于表12中。倍数变化基于MIC值与单独的25% CAA中测定的MIC值的比较。肺表面活性剂的生理浓度范围为0.78%和0.39%之间。铜绿假单胞菌菌株CFS-1292(美罗培南抗性的)用作报告菌株。得出结论：在生理水平的肺表面活性剂(Survanta®)存在的情况下，测试的革兰氏阴性溶素是活性的。
表12 –在Survanta®存在的情况下的倍数增加(MIC)
Figure 24766DEST_PATH_IMAGE017
。
评估在二价阳离子存在的情况下革兰氏阴性溶素的活性，并以MIC测定形式检查生理浓度的二价阳离子的影响。在补充至AST培养基(25% CAA)中的各种浓度的阳离子(1.25 mM CaCl2，0.78 mM MgCl2，1.25 mM CaCl2和0.78 mM MgCl2的组合)存在的情况下，测量MIC的倍数变化。结果显示于下表13中。注意，25% CAA通常具有0.25 nM MgSO4。铜绿假单胞菌菌株CFS-1292(美罗培南抗性的)用作报告菌株。得出结论：在生理水平的钙和镁存在的情况下，测试的革兰氏阴性溶素是活性的。
表13 –在阳离子存在的情况下的倍数增加(MIC)
Figure 359933DEST_PATH_IMAGE018
。
实施例6. 革兰氏阴性溶素使细菌外膜去稳定的能力
通过使用N-苯基-1-萘胺(NPN)摄取测定法，评估革兰氏阴性溶素使铜绿假单胞菌的外膜去稳定的能力。参见Dassanayake, R.P. 等人, Antimicrobial activity of bovineNK-lysin-derived peptides on Mycoplasma bovis, PLOS One 2018; 9(1):e86364。收获指数期铜绿假单胞菌(CFS 1292)，洗涤，且重悬浮于pH 7.4的5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和5 mM葡萄糖中。添加NPN至10 mM的最终浓度。以100 μg/孔的最终浓度添加革兰氏阴性溶素，包括GN121、GN351、GN428和GN370。经两小时，记录荧光的变化(激发l = 350 nm；发射l = 420 nm)。并入膜中的NPN导致荧光的增强。如图2A和2B中所示，革兰氏阴性溶素介导细菌细胞壁的外膜的破坏。每种革兰氏阴性溶素的数据显示于下表14中。
表14 –暴露于NPN和革兰氏阴性溶素的铜绿假单胞菌随时间的荧光
Figure 151171DEST_PATH_IMAGE019
。
实施例7. 显微镜检查显示血清中的革兰氏阴性溶素的杀细菌性
将铜绿假单胞菌1292菌株用GN121 (10μg/mL)或缓冲液对照在100%人血清中处理15分钟。将样品使用活/死细胞活力试剂盒(ThermoFisher)染色，并通过微分干涉反差(DIC)和荧光显微镜检查。如图3(其显示一系列显微照片，所述显微照片显示显微镜分析(2000倍放大))中所描绘，在未处理的行中不存在死细菌，且在经处理的行中存在活细菌的减少。
实施例8. 人血清中的革兰氏阴性溶素和美罗培南的协同作用
进行标准的棋盘测定以评价在人血清存在的情况下革兰氏阴性溶素与美罗培南的协同作用。将铜绿假单胞菌菌株CFS 1292、1557 (PA19)、1558 (PA20) CFS 1559 (PA21)、CFS1560 (PA22)、CFS 1561 (PA23)、CFS 1562 (PA24)和CFS 1766 (ATCC 27853)悬浮于25%CAA和12.5%人血清的溶液中，并通过测量分数抑制浓度指数(FICI)值来评估协同作用。小于或等于0.5的FICI值与有效的协同作用一致。如下表15中所示，对于评估的三种铜绿假单胞菌菌株中的每一种，GN121、GN351、GN370和GN428全部都表现出与美罗培南的协同作用。
表15 –在人血清中的美罗培南和革兰氏阴性溶素之间的协同作用
Figure 229985DEST_PATH_IMAGE020
Figure 727963DEST_PATH_IMAGE021
。
实施例9. 对GN溶素的抗性的低倾向性
在另一项实验中，在21天的连续传代抗性测定中，确定革兰氏阴性细菌没有发展对GN121、GN351、GN370和GN428的抗性。在连续21天的连续传代中，在GN-溶素稀释系列存在的情况下(一式两份)，使用铜绿假单胞菌(菌株WC-452)进行细菌抗性的分析。简而言之，使用培养液微量稀释MIC形式，其中将2倍稀释范围的GN溶素与细菌(5x10e6 CFU/ml起始浓度)在CAA培养液中在37℃下培养18小时。然后将具有其中看到细菌生长的最高浓度的GN溶素的孔用作用于第二天的传代的接种物，并且在21天时段内重复该过程。记录每个每天时间点的MIC，并且测量作为逐步增加的MIC的抗性。
在该测定中，GN121、GN351、GN370和GN428溶素MIC在18天内增加最多达1-log2稀释度(2倍)，这与传代对照(未处理)相当。图4A-4D。相比之下，环丙沙星对照在18天内增加4-log2稀释度(16倍)(图4E)。D'Lima等人还发现环丙沙星MIC在连续传代期间增加。参见D'Lima et al., 2012, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56: 2753-2755，其报告环丙沙星MIC在21天连续传代内增加最多达32倍。我们的结果与GN溶素抗性的低倾向性一致，这与用革兰氏阳性溶素观察到的相似。参见，例如，PCT/US19/19638，其在2019年2月26日提交，并且通过引用以其整体并入本文。
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Claims (57)

1.溶素-AMP多肽构建体，其包含：
(a)包含以下多肽序列的第一组分：
(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ IDNO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、GN76 (SEQ ID NO:203)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17(SEQ ID NO:96)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486(SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或
(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或
(iii)所述溶素的活性片段；和
b)包含以下多肽序列的第二组分：
(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ IDNO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6(SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1(SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ IDNO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930(SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ IDNO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或
(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，
其中所述溶素-AMP多肽构建体包括至少一种选自以下的活性：在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述第一组分选自GN394 (SEQ IDNO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)和GN418 (SEQ ID NO:54)。
3.根据权利要求1或2所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述构建体进一步包含至少一种结构稳定组分，以维持所述构建体中的所述第一和/或第二组分的结构的至少一部分与未缀合的溶素和/或AMP中实质上相同。
4.根据权利要求3所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述至少一种结构稳定组分是肽。
5.根据权利要求4所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述肽选自TAGGTAGG (SEQ IDNO:72)、IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO:82)、PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)、IGEM +PP(SEQ ID NO:16的残基44-58)和AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:122)。
6.权利要求1-5中任一项的溶素-AMP多肽构建体，其中所述GN37溶素(SEQ ID NO:84)包含单个提高pI的突变，且其中所述GN316 (SEQ ID NO:22)包含单个点突变，其中具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)是GN217 (SEQ ID NO:8)，且其中具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)选自GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418(SEQ ID NO:54)和GN394 (SEQ ID NO:48)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：(i)选自以下的多肽序列：GN168 (SEQ ID NO:2)、GN176 (SEQ ID NO:4)、GN178(SEQ ID NO:6) GN218 (SEQ ID NO:10)、GN223 (SEQ ID NO:12)、GN239 (SEQ ID NO:14)、GN243 (SEQ ID NO:16)、GN280 (SEQ ID NO:18)、GN281 (SEQ ID NO:20)、GN349 (SEQ IDNO:30)、GN351 (SEQ ID NO:32)、GN352 (SEQ ID NO:34)、GN353 (SEQ ID NO:36)、GN357(SEQ ID NO:38)、GN359 (SEQ ID NO:40)、GN369 (SEQ ID NO:42)、GN370 (SEQ ID NO:44)、GN371 (SEQ ID NO:46)、GN428 (SEQ ID NO:60)和GN93 (SEQ ID NO:62)，或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46、60和62中的至少一个具有至少80%序列同一性的多肽。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的溶素-AMP多肽构建体，其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：(i)选自GN351 (SEQ ID NO:32)和GN370 (SEQ ID NO:36)的多肽序列，或(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:32和36中的至少一个具有至少80%同一性的多肽。
9.分离的多肽，其包含选自GN121 (SEQ ID NO:175)、GN217溶素(SEQ ID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)、GN428 (SEQ ID NO:60)和GN486 (SEQ ID NO:66)的溶素或其活性片段，其中所述溶素或其活性片段包括至少一种选自以下的活性：在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
10.权利要求9的分离的多肽，其中所述溶素选自GN121 (SEQ ID NO:175)和GN428(SEQ ID NO:60)。
11.分离的多核苷酸，其包含编码溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的核酸分子，
所述核酸分子包含：
(a)编码第一组分的第一核酸分子，所述第一组分包含：
(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ IDNO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329(SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或
(ii)具有溶素活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个具有至少80%同一性；或
(iii)所述溶素的活性片段；
(b)编码第二组分的第二核酸分子，所述第二组分包含以下的多肽序列：
(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ IDNO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6(SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1(SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ IDNO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930(SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ IDNO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或
(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，
其中所述溶素-AMP多肽构建体包括至少一种选自以下的活性：在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
12.权利要求11的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子进一步包含(c)编码包含至少一种结构稳定组分的第三组分的第三核酸分子，其中所述至少一种结构稳定组分维持所述构建体中的所述第一和/或第二组分的结构的至少一部分与未缀合的溶素和/或AMP中实质上相同。
13.权利要求12的分离的多核苷酸，其中所述至少一种结构稳定组分包含肽。
14.权利要求13的分离的多核苷酸，其中所述肽选自TAGGTAGG (SEQ ID NO:72)、IGEM(BBa_K1485002) (SEQ ID NO:82)、PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)、IGEM +PP (SEQ ID NO:16的残基44-58)和AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:122)。
15.权利要求11-14中任一项的分离的多核苷酸，其中所述GN37 (SEQ ID NO:84)包含单个提高pI的突变，且其中所述GN316 (SEQ ID NO:22)包含单个点突变，其中具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)是GN217 (SEQ ID NO:8)，且其中具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)选自GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418 (SEQID NO:54)和GN394 (SEQ ID NO:48)。
16.权利要求11-14中任一项的分离的多核苷酸，其中编码所述溶素-AMP多肽构建体的核酸分子是
(i)选自GN168 (SEQ ID NO:2)、GN176 (SEQ ID NO:4)、GN178 (SEQ ID NO:6)、GN218(SEQ ID NO:10)、GN223 (SEQ ID NO:12)、GN239 (SEQ ID NO:14)、GN243 (SEQ ID NO:16)、GN280 (SEQ ID NO:18)、GN281 (SEQ ID NO:20)、GN349 (SEQ ID NO:30)、GN351 (SEQID NO:32)、GN352 (SEQ ID NO:34)、GN353 (SEQ ID NO:36)、GN357 (SEQ ID NO:38)、GN359溶素(SEQ ID NO:40)、GN369溶素(SEQ ID NO:42)、GN370溶素(SEQ ID NO:44)、GN371溶素(SEQ ID NO:46)和GN93溶素(SEQ ID NO:62)；或
(ii) 编码多肽的核酸分子，所述多肽具有溶素活性且与SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46或62中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性。
17.分离的多核苷酸序列，其包含编码选自GN121 (SEQ ID NO:175)、GN217溶素(SEQID NO:8)、GN394溶素(SEQ ID NO:48)、GN396溶素(SEQ ID NO:50)、GN408溶素(SEQ ID NO:52)、GN418溶素(SEQ ID NO:54)、GN428 (SEQ ID NO:60)和GN486 (SEQ ID NO:66)的溶素或其活性片段的核酸分子，其中所述溶素或其活性片段在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
18.权利要求11-17中任一项的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含DNA。
19.权利要求11-17中任一项的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含cDNA。
20.重组载体，其包含根据权利要求11-18中任一项所述的分离的多核苷酸序列。
21.权利要求20中任一项的重组载体，其中所述分离的多核苷酸序列可操作地连接至异源启动子。
22.权利要求20-21中任一项的重组载体，其中所述重组载体是重组表达载体。
23.分离的宿主细胞，其包含权利要求20-22中任一项的重组载体。
24.药物组合物，其包含分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体和药学上可接受的载体，
其中所述分离的溶素包含以下中的至少一种：
(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123 (SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ IDNO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418(SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，
(ii)其活性片段，或
(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：
(a)包含以下多肽序列的第一组分：
(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ IDNO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329(SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或
(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或
(iii)所述溶素的活性片段；和
b)包含以下多肽序列的第二组分：
(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ IDNO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6(SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1(SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ IDNO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930(SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ IDNO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，
其中所述药物组合物在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述溶素-AMP多肽构建体进一步包含至少一种结构稳定组分，以维持所述构建体中的所述第一和/或第二组分的结构的至少一部分与未缀合的溶素和/或AMP中实质上相同。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述至少一种结构稳定组分是肽。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述肽选自TAGGTAGG (SEQ ID NO:72)、IGEM(BBa_K1485002) (SEQ ID NO:82)、PPTAGGTAGG (SEQ ID NO:98)、IGEM +PP (SEQ ID NO:16的残基44-58)和AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:122)。
28.权利要求24-27中任一项的药物组合物，其中所述溶素选自GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ ID NO:28)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)及其活性片段。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述溶素或其活性片段相对于SEQ ID NO:22、26、28、56、58、60、64、68或96包含至少一个氨基酸取代。
30.权利要求24-29中任一项的药物组合物，其中所述溶素-AMP多肽构建体包含选自GN168 (SEQ ID NO:2)、GN176 (SEQ ID NO:4)、GN178 (SEQ ID NO:6) GN218 (SEQ ID NO:10)、GN223 (SEQ ID NO:12)、GN239 (SEQ ID NO:14)、GN243 (SEQ ID NO:16)、GN280 (SEQID NO:18)、GN281 (SEQ ID NO:20)、GN349 (SEQ ID NO:30)、GN351 (SEQ ID NO:32)、GN352 (SEQ ID NO:34)、GN353 (SEQ ID NO:36)、GN357 (SEQ ID NO:38)、GN359 (SEQ IDNO:40)、GN369 (SEQ ID NO:42)、GN370 (SEQ ID NO:44)、GN371 (SEQ ID NO:46)、GN428(SEQ ID NO:60)、GN93 (SEQ ID NO:62)中的至少一个的多肽序列，或具有溶素活性且与SEQ ID NOS:2、4、6、10、12、14、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46、60和62中的至少一个具有至少80%同一性的多肽序列。
31.权利要求24-29中任一项的药物组合物，其中所述分离的溶素包含选自GN121 (SEQID NO:175)和GN428 (SEQ ID NO:60)中的至少一个的多肽序列，或具有溶素活性且与SEQID NO:175和60中的至少一个具有至少80%同一性的多肽序列。
32.权利要求24-31中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂。
33.权利要求24-32中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含适合于治疗革兰氏阴性细菌的抗生素。
34.治疗由革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的方法，其中所述革兰氏阴性细菌包括铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种，所述方法包括：
向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用根据权利要求24-33中任一项所述的药物组合物。
35.权利要求34的方法，其中所述细菌感染是局部或全身性病原性细菌感染。
36.预防或治疗细菌感染的方法，其包括：
向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一有效量的根据权利要求24-35中任一项所述的药物组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的组合。
37.用于加强适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的效力的方法，
其包括：
将所述抗生素与含有有效量的分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的组合物组合共同施用，
其中所述分离的溶素包含以下中的至少一种：
(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123 (SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ IDNO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418(SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，或
(ii)其活性片段，或
(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：
(a)包含以下多肽序列的第一组分：
(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ IDNO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329(SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或
(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或
(iii)所述溶素的活性片段；和
b)包含以下多肽序列的第二组分：
(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ IDNO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6(SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1(SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ IDNO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930(SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1 (SEQ IDNO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ ID NO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQ ID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或
(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，
其中所述组合物包括至少一种选自以下的活性：在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌，且
其中在肺表面活性剂存在的情况下，与单独施用所述抗生素或所述溶素或溶素-AMP多肽构建体相比，所述组合的施用更有效地抑制革兰氏阴性细菌的生长，或减少革兰氏阴性细菌的种群，或杀死革兰氏阴性细菌。
38.抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，其中所述革兰氏阴性细菌的至少一种物种是铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种，所述方法包括：
使所述细菌与含有有效量的分离的溶素和/或溶素-抗微生物肽(AMP)多肽构建体的组合物接触，
其中所述分离的溶素包含以下中的至少一种：
(i) GN121 (SEQ ID NO:175)、GN123 (SEQ ID NO:173)、GN217 (SEQ ID NO:8)、GN316变体(SEQ ID NO:24)、GN316 (SEQ ID NO:22)、GN329 (SEQ ID NO:26)、GN333 (SEQ IDNO:28)、GN394 (SEQ ID NO:48)、GN396 (SEQ ID NO:50)、GN408 (SEQ ID NO:52)、GN418(SEQ ID NO:54)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN485 (SEQ ID NO:68)、溶素PaP2_gp17 (SEQ ID NO:96)，或
(ii)其活性片段，或
(iii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:175、173、8、24、22、26、28、48、50、52、54、56、58、60、64、66、68或96中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；
其中所述溶素-AMP多肽构建体包含：
(a)包含以下多肽序列的第一组分：
(i)选自以下的溶素：GN76 (SEQ ID NO:203)、GN4 (SEQ ID NO:74)、GN146 (SEQ IDNO:78)、GN14 (SEQ ID NO:124)、任选地具有单个提高pI的突变的GN37 (SEQ ID NO:84)、任选地具有单个点突变的GN316 (SEQ ID NO:22)、溶素Pap2_gp17 (SEQ ID NO:96)、GN329(SEQ ID NO:26)、GN424 (SEQ ID NO:56)、GN202 (SEQ ID NO:118)、GN425 (SEQ ID NO:58)、GN428 (SEQ ID NO:60)、GN431 (SEQ ID NO:64)、GN486 (SEQ ID NO:66)、GN333 (SEQID NO:28)、GN485 (SEQ ID NO:68)、GN123 (SEQ ID NO:173)和GN121 (SEQ ID NO:175)；或
(ii)具有溶素活性且与SEQ ID NO:203、74、78、124、84、22、96、26、56、118、58、60、64、66、28、68、173或175中的至少一个的多肽序列具有至少80%序列同一性的多肽；或
(iii)所述溶素的活性片段；和
b)包含以下多肽序列的第二组分：
(i)至少一种选自以下的抗微生物肽(AMP)：Chp1 (SEQ ID NO:133)、Chp2 (SEQ IDNO:70)、CPAR39 (SEQ ID NO:135)、Chp3 (SEQ ID NO:137)、Chp4 (SEQ ID NO:102)、Chp6(SEQ ID NO:106)、Chp7 (SEQ ID NO:139)、Chp8 (SEQ ID NO:141)、Chp9 (SEQ ID NO:143)、Chp10 (SEQ ID NO:145)、Chp11 (SEQ ID NO:147)、Chp12 (SEQ ID NO:149)、Gkh1(SEQ ID NO:151)、Gkh2 (SEQ ID NO:90)、Unp1 (SEQ ID NO:153)、Ecp1 (SEQ ID NO:155)、Ecp2 (SEQ ID NO:104)、Tma1 (SEQ ID NO:157)、Osp1 (SEQ ID NO:108)、Unp2 (SEQID NO:159)、Unp3 (SEQ ID NO:161)、Gkh3 (SEQ ID NO:163)、Unp5 (SEQ ID NO:165)、Unp6 (SEQ ID NO:167)、Spi1 (SEQ ID NO:169)、Spi2 (SEQ ID NO:171)、Ecp3 (SEQ IDNO:177)、Ecp4 (SEQ ID NO:179)、ALCES1 (SEQ ID NO:181)、AVQ206 (SEQ ID NO:183)、AVQ244 (SEQ ID NO:185)、CDL907 (SEQ ID NO:187)、AGT915 (SEQ ID NO:189)、HH3930 (SEQ ID NO:191)、Fen7875 (SEQ ID NO:193)、SBR77 (SEQ ID NO:195)、Bdp1(SEQ ID NO:197)、LVP1 (SEQ ID NO:199)、Lvp2 (SEQ ID NO:201)、七叶内酯片段(SEQ IDNO:80)、RI12 (SEQ ID NO:88)、TI15 (SEQ ID NO:94)、RI18 (SEQ ID NO:92)、FIRL (SEQID NO:114)、LPS结合蛋白的片段(SEQ ID NO:76)、RR12whydro (SEQ ID NO:110)、RI18肽衍生物(SEQ ID NO:131)和阳离子肽(SEQ ID NO:120)，或
(ii)具有AMP活性的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:133、70、135、137、102、106、139、141、143、145、147、149、151、90、153、155、104、157、108、159、161、163、165、167、169、171、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、80、88、94、92、114、76、110、131和120中的至少一个具有至少80%同一性，且
其中所述组合物包括至少一种选自以下的活性：在肺表面活性剂存在的情况下，抑制铜绿假单胞菌细菌生长，减少铜绿假单胞菌细菌种群和/或杀死铜绿假单胞菌。
39.权利要求34、35和38中任一项的方法，其中所述革兰氏阴性细菌的一种或多种额外物种选自：克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌。
40.权利要求36或37的方法或权利要求33的药物组合物，其中所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。
41.前述权利要求中任一项的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中所述至少一种活性进一步包括抑制除了铜绿假单胞菌以外的革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少除了铜绿假单胞菌以外的革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群。
42.权利要求38的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中所述除了铜绿假单胞菌以外的革兰氏阴性细菌的至少一种物种选自：克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌。
43.前述权利要求中任一项的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中所述溶素-AMP多肽构建体或所述分离的多肽使铜绿假单胞菌对抗生素重新敏化。
44.权利要求43的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中所述抗生素是碳青霉烯。
45.前述权利要求中任一项的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中所述抗生素是美罗培南。
46.前述权利要求中任一项的溶素-AMP多肽构建体、分离的多肽、分离的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、药物组合物或方法，其中由革兰氏阴性细菌引起的细菌感染是其中存在肺表面活性剂的器官或组织的细菌感染。
47.预防、破坏或根除革兰氏阴性细菌生物膜的方法，其包括：
使表面与包含有效杀死生物膜中的革兰氏阴性细菌的权利要求1-8中任一项的溶素-AMP多肽构建体、权利要求9-10中任一项的分离的多肽或权利要求24-32中任一项的药物组合物的组合物接触，其中有效地预防、破坏或根除所述生物膜。
48.预防、破坏或根除革兰氏阴性细菌生物膜的方法，其包括：
向有此需要的受试者施用包含有效杀死生物膜中的革兰氏阴性细菌的权利要求1-8中任一项的溶素-AMP多肽构建体、权利要求9-10中任一项的分离的多肽或权利要求24-32中任一项的药物组合物的组合物，其中有效地预防、破坏或根除表面上的所述生物膜。
49.权利要求47或48的方法，其中所述表面包括医疗装置的表面。
50.权利要求49的方法，其中所述医疗装置是隐形眼镜、药物泵、植入物、导管或假体装置。
51.权利要求47-50中任一项的方法，其中所述组合物或药物组合物进一步包含一种或多种抗生素。
52.权利要求47-50中任一项的方法，其中所述表面另外与一种或多种抗生素接触。
53.权利要求51或52的方法，其中所述一种或多种抗生素选自青霉素、头孢菌素、单环内酰胺、氟喹诺酮、碳青霉烯类、氨基糖苷、多粘菌素、大环内酯类或磷霉素。
54.权利要求47-53中任一项的方法，其中所述表面是生物表面。
55.权利要求47-54中任一项的方法，其中所述表面感染具有选自以下的革兰氏阴性细菌感染：骨髓炎、细菌性心内膜炎、扁桃体炎鼻窦炎、角膜的感染、尿道感染、胆道的感染、感染性肾结石、尿道炎、前列腺炎、中耳感染、牙菌斑的形成、牙龈炎、牙周炎、囊性纤维化、伤口感染和医疗装置的感染。
56.权利要求47-55中任一项的方法，其中预防生物膜形成。
57.权利要求47-55中任一项的方法，其中破坏或根除所述生物膜。
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