CN112210022B - 一种低甲氧基山楂果胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低甲氧基山楂果胶的制备方法,具体涉及一种从山楂中提取、分离、纯化山楂果胶的方法，是以淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶为加工助剂，制备低甲氧基山楂果胶(LMP)的方法。该方法实施过程中不使用果胶酯酶处理，利用本发明制备的果胶纯度高，半乳糖醛酸含量高，线性聚半乳糖醛酸区域比例大，分子量显著低于未经纯化处理过程制备的山楂果胶。本发明适用于以所有类型山楂及其加工副产物为原料制备LMP，不受山楂品种、产地、成熟度的影响；山楂加工副产物包括山楂饮料加工后的山楂废渣、山楂酒加工后的山楂废渣等，能够变废为宝，社会与经济效益显著。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种山楂果胶的制备方法，其显著特征在于制备的山楂果胶为低甲氧基果胶(LMP)，该方法属于食品精深加工技术领域。
二、背景技术
山楂，又名山里红、红果、胭脂果，属蔷薇科植物，为我国原产特有果树，在亚洲和欧洲部分地区也有种植。目前我国共有18个品种，主要分布在山东、河南、河北等地。山楂树抗寒耐旱，是药食同源植株，也可作为观赏植物使用。山楂果除含有丰富的蛋白质、碳水化合物、酚类、有机酸、维生素和微量元素外，其果胶含量尤为突出，且显著高于其他果蔬原料(Cuevas-Bernardino et al.,2016；Li,et al.,2008；Li,Hu,&Xu,2015)。已有研究证实，山楂果胶能够形成比柑橘皮果胶更为稳定的水包油型乳液体系(Cuevas-Bernardino etal.,2016)，且表现出保护心血管、降血脂、改善血管舒张和冠状动脉循环等保健功能。此外，山楂果胶寡糖还能够调节机体脂肪代谢、提高细胞和机体的抗氧化能力、改善肠道微生态环境等，在功能性食品添加剂领域应用前景广阔(Li,et al.,2017；Zhu et al.,2017；侯玉婷,等,2018)。
果胶是由聚半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-I)构成的复杂多糖，常以果胶、果胶酸和原果胶的形式分布在植物软组织的细胞壁、细胞间层及细胞与次生壁连接区。果胶的性质与其半乳糖醛酸中C5位上酯化的羧基有关(Gnanasambandam et al.,2000)，酯化羧基的含量一般用酯化度(Degree of methoxylation,DM)表示。根据DM的不同，果胶可分为高甲氧基果胶(HMP,DM>50％)和低甲氧基果胶(LMP,DM<50％)，山楂果胶为典型的HMP。因为山楂中果胶具有含量高、易提纯、凝胶能力强、功能活性显著等特点，受到研究者的热宠(Cuevas-Bernardino et al.,2016；Jiang et al.,2018；吴瞻邑等,2018)。同时山楂果胶凭借其良好的凝胶、增稠、稳定、乳化和增效作用被广泛用于食品和化妆品领域。
不同来源和结构的果胶性质各异，并导致其功能和应用范围不同。例如，HMP的凝胶机制是果胶分子间疏水基及其氢键的相互作用，凝胶条件是pH 2.0～3.8，可溶性固形物≥55％，且形成的凝胶是热不可逆的。果胶的凝胶能力取决于果胶的DM和凝胶环境。LMP因含有较多的游离羧基，只有高价金属阳离子存在时才能交联，建立起稳定的网络结构并形成凝胶。LMP凝胶时，高价金属阳离子是影响凝胶的关键，pH值要求范围为2.6～6.8，不受固形物含量的影响。由于LMP对溶液中固形物的含量要求较低，且pH适用范围较广，因此食品工业中LMP具有比HMP更为广泛的用途，而且需求量越来越大。
天然植物源的LMP种类相对HMP较少。目前报道的天然LMP的主要来源包括向日葵(Hua et al.,2015)、黄秋葵(Xu et al.,2017)等；工业上则常采用脱酯处理HMP的方式制备LMP，主要方法包括酸化乙醇法、碱化法、酰胺化法、酶催化法、物理法(微波法、超声法和连续逆流萃取法等)等。已有研究证实，铵离子存在时，HMP会在果胶酯酶的作用下发生脱酯反应生成乙酰化的LMP。以山楂为原料直接提取制备LMP的方法目前尚鲜见报道。祝美云等(1993,河南科技,14～15)研究认为可从山楂中提取LMP，但是文章中并没有清楚准确的陈述所得果胶产品的制备技术和对应的果胶产品特性。
三、发明内容
本发明提供了一种从山楂中提取、分离、纯化山楂果胶的方法，该方法的显著特征在于获得的山楂果胶为低甲氧基果胶(LMP)。
一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，主要包括以下步骤：
1、山楂粉的制备
新鲜山楂果去蒂、去籽，切成1～2mm厚的薄片，40℃热风干燥至水分含量≤10％。干燥后的山楂片磨粉，过40目筛，得到山楂粉(粒径≤270μm)。
2、山楂果胶的提取与分离
将步骤1)制备的山楂粉和浓度为95％的乙醇按照1:10～20(w/v)混合持续搅拌洗涤1h以上，5000r/min离心10min，弃上清液，使用相同浓度和体积的乙醇重复洗涤沉淀物(以除去非细胞壁组分)。向乙醇洗涤后的沉淀物中加入丙酮，沉淀物与丙酮的质量体积比为1:10～20(w/v)，持续搅拌洗涤30min以上(除去醇不溶性的低分子物质，钝化细胞壁降解酶活力)，5000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀物于室温下自然过夜晾干，得醇不溶物。
醇不溶物和去离子水按1:10～20(w/v)混合，缓慢添加柠檬酸溶液(4mol/L)至醇不溶物和去离子水混合溶液pH值为2.0。混合物于90℃水浴中持续搅拌热浸提2h以上，5000r/min趁热离心10min，弃去沉淀物，保留浸提液并冷却至室温，缓慢加入浓度95％乙醇至浸提液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，继续搅拌15min以上，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，得沉淀物为粗果胶。
3、山楂果胶的纯化
向所述的粗果胶中添加浓度为0.1mol/L、pH＝4.3的醋酸钠缓冲液；粗果胶与醋酸钠缓冲液的质量体积比(w/v)为1:10～20，预热至62.5℃后，向粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中分别按照1％(v/v)的比例(即每100mL粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中添加1mL淀粉葡萄糖苷酶)添加淀粉葡萄糖苷酶和3.2mg/mL(w/v)(即每1mL粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中添加3.2mgα-淀粉酶)的α-淀粉酶酶解4h以上。酶解液冰浴冷却，然后缓慢加入浓度为95％乙醇至混合液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，加完后继续搅拌15min以上，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，弃上清液；再添加占沉淀物质量10～20倍(w/v)的95％乙醇洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；然后继续添加占沉淀物质量10～20倍(w/v)的丙酮洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；将沉淀物完全溶解在占沉淀物质量10～20倍(w/v)体积的去离子水中，转移至透析袋(截留分子量≥3.5kDa)中，20℃在去离子水中透析72h以上，期间每6h换一次透析用的去离子水，透析液经冷冻干燥处理后获得纯化的LMP。
本发明中所述的淀粉葡萄糖苷酶来自Aspergillus niger(3300U/mL,Megazyme)。
所述的α-淀粉酶(Type VI-B)来自porcine pancreas(10U/mg，Sigma-Aldrich)。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首次公开报道了以淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶为加工助剂，从山楂中制备LMP的方法，该方法与已有研究报道的不同点是本申请中山楂LMP的制备过程中未使用果胶酯酶。
(2)本发明获得果胶的纯度高，半乳糖醛酸(GalA)含量高(>83％)，线性聚半乳糖醛酸区域(HG)比例大(HG/RG-I≥8.6)；分子量显著低于未经纯化处理过程制备的山楂果胶。未经纯化处理的山楂果胶的制备参考Jiang et al.(2018)的方法。
(3)本发明获得纯化果胶保持较好乳化稳定性(ES)的同时，乳化活性(EA)显著高于未经纯化处理过程制备的山楂果胶。
(4)本发明获得的山楂果胶既可以作为食品添加剂使用，也可以作为LMP标准品应用于果胶产品的质量评价。
(5)本发明适用于以所有类型山楂及其加工副产物原料制备LMP，不受山楂品种、产地、成熟度的影响；山楂加工副产物包括山楂饮料加工后的山楂废渣、山楂酒加工后的山楂废渣等。
(6)本发明对原料的适用范围较广，能够变废为宝，社会与经济效益显著。
四、具体实施方式
本发明中所述的w/v指质量体积比。
实施例1
本实施例选取山东地区主产山楂品种大金星(DA)为试验原料，具体实施步骤如下：
1、山楂粉的制备
新鲜山楂果去蒂、去籽，切成1mm厚的薄片，40℃热风干燥至水分含量10％。干燥山楂片磨粉，过40目筛，筛下物为制备好的山楂粉。
2、山楂果胶的提取与分离
将步骤1)制备的山楂粉10g和浓度为95％的乙醇200mL混合持续搅拌洗涤1h，5000r/min离心10min，弃上清液，再使用浓度95％的乙醇200mL重复洗涤沉淀物(以除去非细胞壁组分)。向乙醇洗涤后的沉淀物中加入丙酮，沉淀物与丙酮的质量体积比为1:10(w/v)，持续搅拌洗涤50min(除去醇不溶性的低分子物质，钝化细胞壁降解酶活力)，5000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀物于室温下自然过夜晾干，得醇不溶物。
醇不溶物和去离子水按1:10(w/v)混合，缓慢添加柠檬酸溶液(4mol/L)至pH值为2.0。混合物于90℃水浴中持续搅拌热浸提4h，5000r/min趁热离心10min，弃去沉淀物，保留浸提液并冷却至室温，缓慢加入浓度95％乙醇至浸提液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，继续搅拌20min，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，得沉淀物为粗果胶。
3、山楂果胶的纯化
向所述的粗果胶中添加浓度为0.1mol/L、pH＝4.3的醋酸钠缓冲液；粗果胶与醋酸钠缓冲液的质量体积比(w/v)为1:20，预热至62.5℃后，添加1％(v/v)的淀粉葡萄糖苷酶和3.2mg/mL(w/v)的α-淀粉酶酶解4h。酶解液冰浴冷却，然后缓慢加入浓度为95％乙醇至混合液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，加完后继续搅拌20min，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，弃上清液，添加占沉淀物质量20倍(w/v)的95％乙醇洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；然后继续添加占沉淀物质量20倍(w/v)的丙酮洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；将沉淀物完全溶解在占沉淀物质量10倍(w/v)体积的去离子水中，转移至透析袋(截留分子量≥3.5kDa)中，20℃在去离子水中透析72h以上，每6h换一次透析用的去离子水，透析液经冷冻干燥处理后获得纯化的LMP。
按上述方法制备山楂果胶(LMP-DA)的理化性质如表1所示。
表1 山楂果胶的半乳糖醛酸和蛋白质含量，酯化度、分子量和乳化特征
同列中不同小写字母表示差异性显著(p<0.05)。Control1(对照1)，从DA中提取的山楂果胶，制备方法参考Jiang et al.(2018)的方法，未经淀粉酶纯化处理。LMP-DA，按本申请技术方案从DA中分离制备的山楂果胶。EA，乳化活性；ES，乳化稳定性。
实施例2
本实施例选取山东地区主产山楂品种-棉球(MI)为试验原料，具体实施步骤如下：
1、山楂粉的制备
新鲜山楂果去蒂、去籽，切成1mm厚的薄片，40℃热风干燥至水分含量8.9％。干燥山楂片磨粉，过40目筛，筛下物为制备好的山楂粉。
2、山楂果胶的提取与分离
将步骤1)制备的山楂粉20g和浓度为95％的乙醇200mL混合持续搅拌洗涤2h，5000r/min离心10min，弃上清液，使用相同浓度(95％)和体积(200mL)的乙醇重复洗涤沉淀物，除去非细胞壁组分。向乙醇洗涤后的沉淀物中加入丙酮，沉淀物与丙酮的质量体积比为1:10(w/v)，持续搅拌洗涤40min(除去醇不溶性的低分子物质，钝化细胞壁降解酶活力)，5000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀物于室温下自然过夜晾干，得醇不溶物。
醇不溶物和去离子水按1:20(w/v)混合，缓慢添加柠檬酸溶液(4mol/L)至pH值为2.0。混合物于90℃水浴中持续搅拌热浸提3h，5000r/min趁热离心10min，弃去沉淀物，保留浸提液并冷却至室温，缓慢加入浓度95％乙醇至浸提液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，继续搅拌15min，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，得沉淀物为粗果胶。
3、山楂果胶的纯化
向所述的粗果胶中添加浓度为0.1mol/L、pH＝4.3的醋酸钠缓冲液；粗果胶与醋酸钠缓冲液的质量体积比(w/v)为1:10，预热至62.5℃后，添加1％(v/v)的淀粉葡萄糖苷酶和3.2mg/mL(w/v)的α-淀粉酶酶解4h。酶解液冰浴冷却，然后缓慢加入浓度为95％乙醇至混合液中乙醇的最终浓度为70％(添加乙醇时持续搅拌)，加完后继续搅拌15min，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，弃上清液，添加占沉淀物质量15倍(w/v)的95％乙醇洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；然后继续添加占沉淀物质量15倍(w/v)的丙酮洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；将沉淀物完全溶解在占沉淀物质量10倍(w/v)体积的去离子水中，转移至透析袋(截留分子量≥3.5kDa)中，20℃在去离子水中透析96h，每6h换一次透析用的去离子水，透析液经冷冻干燥处理后获得纯化的LMP。
按上述方法制备山楂果胶(LMP-MI)的理化性质如表2所示。
表2 山楂果胶的半乳糖醛酸和蛋白质含量，酯化度、分子量和乳化特征
同列中不同大写字母表示差异性显著(p<0.05)。Control2(对照2)，从MI中提取的山楂果胶，制备方法参考Jiang et al.(2018)的方法，未经淀粉酶纯化处理。LMP-MI，按本申请发明专利技术方案从MI中分离制备的山楂果胶。EA，乳化活性；ES，乳化稳定性。
Claims (7)
1.一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)山楂粉的制备
新鲜山楂果去蒂、去籽，切成薄片，40℃热风干燥至水分含量≤10％；干燥后的山楂片磨粉，过40目筛，得到山楂粉；
2)山楂果胶的提取与分离
将步骤1)制备的山楂粉和浓度为95％的乙醇按照质量体积比1:10～20混合持续搅拌洗涤1h以上，5000r/min离心10min，弃上清液；再使用上述相同浓度和体积的乙醇重复洗涤沉淀物；向乙醇洗涤后的沉淀物中加入丙酮，沉淀物与丙酮的质量体积比为1:10～20，持续搅拌洗涤30min以上，5000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀物于室温下自然过夜晾干，得醇不溶物；
醇不溶物和去离子水按质量体积比1:10～20混合，向醇不溶物和去离子水混合溶液中缓慢添加柠檬酸溶液至pH值为2.0；将上述混合物于90℃水浴中持续搅拌热浸提2h以上，5000r/min趁热离心10min，弃去沉淀物，保留浸提液并冷却至室温，缓慢加入浓度95％乙醇至浸提液中并持续搅拌至乙醇的最终浓度为70％，继续搅拌15min以上，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，得沉淀物为粗果胶；
3)山楂果胶的纯化
向所述的粗果胶中添加浓度为0.1mol/L、pH＝4.3的醋酸钠缓冲液；粗果胶与醋酸钠缓冲液的质量体积比为1:10～20，预热至62.5℃后，向粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中分别添加淀粉葡萄糖苷酶和α-淀粉酶酶解4h以上；酶解液冰浴冷却，然后缓慢加入浓度为95％乙醇至混合液中并持续搅拌至乙醇的最终浓度为70％，加完后继续搅拌15min以上，然后4℃静置过夜，5000r/min离心10min，弃上清液；再添加占沉淀物质量10～20倍(w/v)的95％乙醇洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；然后继续添加占沉淀物质量10～20倍体积的丙酮洗涤沉淀物，5000r/min离心10min，弃上清液；将沉淀物完全溶解在占沉淀物质量10～20倍体积的去离子水中，转移至透析袋中，20℃在去离子水中透析72h以上，期间每6h换一次透析用的去离子水，透析液经冷冻干燥处理后获得纯化的LMP。
2.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于步骤1)中，所述山楂薄片厚1～2mm；所述山楂粉粒径≤270μm。
3.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于步骤2)中，所述柠檬酸溶液浓度4mol/L。
4.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于步骤3)中，所述透析袋截留分子量≥3.5kDa。
5.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于步骤3)中，每100mL粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中添加1mL淀粉葡萄糖苷酶；每1mL粗果胶和醋酸钠混合缓冲液中添加3.2mgα-淀粉酶。
6.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于所述淀粉葡萄糖苷酶来自Aspergillus niger，3300U/mL,Megazyme。
7.如权利要求1所述的一种低甲氧基山楂果胶的制备方法，其特征在于所述α-淀粉酶Type VI-B来自porcine pancreas，10U/mg，Sigma-Aldrich。
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