CN112195117B

CN112195117B - 一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用

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Publication number: CN112195117B
Application number: CN202010989323.3A
Authority: CN
Inventors: 董亢; 袁晓路; 杨竞成; 陈振钱; 李玉山
Original assignee: Anhui Redpont Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Redpont Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN112195117A

Abstract

本发明公开一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用，本发明所述的大肠杆菌M910001，保藏编号为CGMCC NO.20430。本发明大肠杆菌M910001转化后所述的大肠杆菌X在0～5％的3‑氰基吡啶溶液、0～50％烟酰胺溶液以及其混合溶液中都能正常进行细胞代谢和生长繁殖，环境适应能力强；为连续传50代以后，质粒留存率在91％以上，100代以后的质粒留存率在80％以上，具有更好的质粒稳定性。

Description

一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用。

背景技术

烟酰胺，即VB₃，又名尼克酰胺(Nicotinamide、Niacinamide)，化学名为3-吡啶甲酰胺，吡啶-3-甲酰胺等，分子式C₆H₆N₂O，分子量122.13，为白色针状结晶或粉末，熔点129～131℃，比重1.400。易溶于水、能溶于乙醇和甘油，不溶于醚，无臭、略带苦味，微毒。

烟酰胺是人体必须的、无法自行合成的维生素，与烟酸同属B族维生素，统称维生素PP，在实际应用中二者可等量替代，普遍存在于动物的内脏和植物体内，是动物体内烟酸代谢过程的代谢物之一，两者均可参与体内的碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢过程。当体内烟酸或者烟酰胺缺乏时，会影响体内细胞的正常代谢和呼吸，从而引起如糙皮病等。烟酰胺大量应用于饲料和食品添加剂行业，同时，在肉制品的发色助剂、维生素强化剂、护色剂等领域也有广泛应用。此外，烟酰胺在医药上也有应用和研究价值，在临床上多用于治疗心血管疾病、糖尿病等，也用于肿瘤放疗增敏剂。

烟酰胺在皮肤科相关产业也有较多应用，在治疗痤疮、大疱性皮肤病、降低皮肤的免疫抑制等方面的作用已获得证实，可为皮肤科提供更加广泛的临床用途。烟酰胺是辅酶Ⅰ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)和辅酶Ⅱ(烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸，NADP)的前体，可经皮肤渗透进入人体，可改善皮肤多种问题，拥有抗氧化能力，能改善表皮屏障功能，提高保湿能力，还能改善红斑和色斑，减少色素沉着，抑制皮肤变黄等功效，是近年来护肤和美白产品的热门成分。

烟酸虽然在人体内会转化成烟酰胺，但烟酸与皮肤中受体相互作用，对皮肤的药物调理作用优于烟酰胺。然而，烟酸受体是G-蛋白偶联受体，刺激导致外周血管扩张，致使皮肤潮红反应。大多数使用者对此强烈排斥。为了降低这种对皮肤的刺激性，对用于化妆品中的烟酸含量需要更加严格控制，所以，低烟酸烟酰胺尤为难得。美国专利US3678060中提到的树脂吸附烟酸的方法，工艺流程十分繁琐，且不经济实用。

现有技术中虽然也有通过微生物转化法生产烟酰胺，但是副产物高，通过基因敲除技术可以降低副产物的产生，但是也存在菌株传代过多会影响质粒留存率的问题，如专利《一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用》(201910706179.5)，其中涉及到的基因敲除技术使得菌种质粒留存率较低，影响实际使用。

发明内容

本发明目的在于提供一株大肠杆菌，以及该菌株在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明提供一株菌株M91001，经鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2020年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20430。

本发明所述的菌株M91001，在以下3种培养基中30℃下培养48～96小时的培养特征见表1：

表1：大肠埃希氏菌(CGMCC NO.M91001)在3种培养基上的培养特征：

本发明还提供了所述的大肠埃希氏菌M91001在生物催化生产烟酰胺中的应用。

在一些实施例中，本发明所述的大肠埃希氏菌M91001在生物催化生产烟酰胺中的应用，具体为以大肠埃希氏菌M91001作为宿主细胞接入编码腈水合酶的质粒后进行生物催化生产烟酰胺。本发明所述的编码腈水合酶的质粒是指现有技术中能够编码具有腈水合酶的质粒，本发明所述的腈水合酶可以是野生型也可以是突变型的腈水合酶。在一种具体的实施例中，是以大肠埃希氏菌M91001作为宿主细胞接入pNh1229质粒后形成大肠杆菌X，大肠杆菌X以3-氰基吡啶为底物进行生物催化产生烟酰胺。本发明所述的应用可以在生物催化过程中，控制反应中的副产物烟酸的量，使最终烟酰胺成品中的烟酸含量在30ppm以下。

大肠埃希氏菌M91001作为宿主细胞接入pNh1229质粒的方法可以为本领域的常规方法，在一种实施例中，本发明提供一种具体的转化方法：将大肠埃希氏菌菌株M91001用预冷的TB(CaCl2)进行菌株感受态的制备，将pNh1229质粒用热激的方式转化至感受态体内，并用含有50μg/mL硫酸卡那霉素的平板进行阴性对照，以辨别转化效果，最终挑选出成功转化的菌株X作为生物催化剂。

本发明所述的大肠埃希氏菌M91001可以按照本领域常规方法进行培养。

本发明还提供所述的大肠埃希氏菌M91001转入催化生产烟酰胺的质粒后形成的菌株；在一些实施例中，所述菌株为大肠埃希氏菌M91001作为宿主细胞接入pNh1229质粒后形成的大肠杆菌X。

本发明所述的大肠杆菌X也可以按照本领域常规方法进行培养，在一些实施例中，本发明提供一种具体的培养方式：

(1)种子液制备：将大肠杆菌X接种到灭过菌的斜面培养基上，20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到灭菌的液体培养基中，在温度为20～40℃，转速为100～300rpm下振荡培养10～120小时，即为大肠杆菌X的种子液；

(2)扩大培养：将大肠杆菌X种子液以体积百分比3％-10％的接种量进行发酵培养，培养条件为：诱导前：装液量：体积百分比60～80％，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：20～37℃，转速：200～1000rpm，发酵时间：10～30小时；加入诱导剂诱导后：装液量：体积百分比60～80％，通气量：0.1～1(v/v.min)，罐压：0.02～0.05MPa，温度：15～35℃，转速:200～1000rpm，发酵时间：10～90小时，形成大肠杆菌X细胞发酵液。

在一些实施例中，步骤(1)种子液制备的步骤后制备的种子液，作为大肠杆菌X的一级种子液；同样的培养条件下，将一级种子按体积百分比3～10％的接种量转接到第二批同样的液体培养基中，同样条件下培养30～72小时后作为大肠杆菌X的二级种子液，用于后续扩大培养。

在一些实施例中，本发明所述的斜面培养基的配比为：胰蛋白胨：8～12g/L，酵母浸粉：3～8g/L，氯化钠：8～12g/L，琼脂：15～25g/L，硫酸卡那霉素40～60μg/mL，pH：6.8～7.5。

在一些实施例中，本发明所述的液体种子培养基的配比为：胰蛋白胨：10～14g/L，酵母浸粉：20～25g/L，氯化钠：8～12g/L，K₂HPO₄：8～12g/L，KH₂PO₄：2～2.5g/L，甘油：3～5g/L，硫酸卡那霉素40～60μg/mL，pH：6.8～7.5。

在一些实施例中，本发明所述的诱导剂为1～3g/L乳糖和0.05～0.2g/L氯化钴。

本发明还提供本发明所述的大肠杆菌X制备的生物催化剂。

在一些实施例中，本发明提供本发明所述的生物催化剂的制备方法，将大肠杆菌X细胞发酵液以3000～5000rpm、2～5℃条件离心20～40min所得到的沉淀即生物催化剂。

本发明还提供本发明所述的大肠杆菌X或生物催化剂含有在生物催化生产烟酰胺中的应用。

在一些实施例中，本发明所述的大肠杆菌X或生物催化剂在生物催化生产烟酰胺中的应用,是以3-氰基吡啶为底物，以大肠杆菌X为生物催化剂。

在一些实施例中，本发明所述的大肠杆菌X或生物催化剂在生物催化生产烟酰胺中的应用,以3-氰基吡啶为底物，以大肠杆菌X为生物催化剂，采用底物流加的方式，在温度为5～35℃、搅拌速度100～300rpm下进行催化水合而反应得到副产物烟酸较低的烟酰胺。

本发明所述应用中的生物催化反应可以在本领域常用的容器中进行，例如在反应釜中进行。在一些实施例中，装液体积为容器总容量的40～70％(％：v/v)；其中3-氰基吡啶的起始添加量为0.1～10％(％：g/100mL)，大肠杆菌X或生物催化剂的累积添加总量为1×10⁴～1×10⁵U/L；当3-氰基吡啶浓度低于0.5～2g/L时，开始以底物流加方式补加3-氰基吡啶，补加速度为每小时补加3-氰基吡啶质量为起始添加量的10～20倍。本发明所述的生物催化反应，最终烟酰胺累积浓度可达40％(％：g/100mL)以上。

在一些实施例中，3-氰基吡啶的起始添加量为0.1～5％(％：g/100mL)。

在一些实施例中，以底物流加方式补加3-氰基吡啶，补加速度为每小时补加3-氰基吡啶质量为起始添加量的15～20倍。在一些实施例中，补加时间为5～10h。

在一些实施例中，大肠杆菌X或生物催化剂添加量为1×10⁴～5×10⁴U/L。

在一些实施例中，生物催化的反应温度15～30℃。

在一些实施例中，本发明所述的大肠杆菌X或生物催化剂在生物催化生产烟酰胺中的应用，生物催化反应进行2～48小时，当3-氰基吡啶补加完毕且底物浓度逐渐降低，趋向于零时即可终止。

在一些实施例中，本发明所述的大肠杆菌X或生物催化剂在生物催化生产烟酰胺中的应用，反应终止后，可以通过过滤、纯化、干燥后得到烟酰胺成品。

在一些实施例中，本发明的过滤可以采用2.0kd～5.0kd的陶瓷膜对反应液进行除菌过滤。

在一些实施例中，本发明的纯化可以采用0.5kd～1.5kd的超滤膜和500d～50d的纳滤膜进行纯化。

在一些实施例中，本发明的干燥可以为喷雾干燥和流化床干燥。

本发明的有益效果：

(1)本发明大肠埃希氏菌M91001转化后的大肠杆菌X在0～5％的3-氰基吡啶溶液、0～50％烟酰胺溶液以及其混合溶液中都能正常进行细胞代谢和生长繁殖，环境适应能力强；

(2)本发明所述的大肠杆菌X自身代谢不产生烟酸，且不会转化3-氰基吡啶或者烟酰胺生成烟酸，在保持高催化效果的同时，对副产物烟酸产生极大的抑制效果，提高了烟酰胺产品的品质，增加了产品的用途，是生物催化法生产烟酰胺领域的优良菌种；

(3)本发明有效解决了烟酰胺产品中烟酸含量过高的问题，本发明所述菌株生产的烟酰胺成品中的烟酰胺含量为99.5％以上，颗粒度在150μm～400μm，且烟酸含量低于30ppm，极大的减少了添加烟酰胺的化妆品对皮肤的刺激性反应，增加了烟酰胺的使用范围。

(4)本发明所述的大肠杆菌X连续传50代以后，质粒留存率在91％以上，100代以后的质粒留存率在80％以上，具有更好的质粒稳定性。

附图说明

图1是本发明所涉及大肠杆菌X在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板中培养16小时后的形态，菌落呈圆形凸起状，边缘光滑整齐，颜色呈半透明，菌落大小约为1.0mm。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明涉及到的质粒pNh1229的制备详见2013年刊载于《Process Biochemistry》的文章《Effificient cloning and expression of a thermostable nitrile hydratasein Escherichia coli using an auto-induction fed-batch strategy》，其序列如SEQID NO:1所示。

实施例1

从安徽瑞邦生物科技有限公司污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：

称取10克污泥，加无菌水50mL，用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮取3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体分别添加到含1％(％：g/100mL)3-氰基吡啶和烟酰胺的PBS缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液4000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果转化液含有烟酸，则说明该菌会转化烟酰胺或者3-氰基吡啶，生成烟酸；选择其中烟酸转化率最低的一株，命名为大肠埃希氏菌M91001，培养特征见表2。

表2：大肠埃希氏菌(CGMCC NO.20430)在3种培养基上的培养特征：

筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基如下：

富集培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母浸粉：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，pH：7，121℃灭菌20min。

固体初筛培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，3-氰基吡啶：1，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，琼脂：2，pH：7，121℃灭菌20min。

液体发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖：3，酵母浸粉：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，甘油：0.5，pH：7，121℃灭菌20min。

实施例2：菌株鉴定

对获得的菌株进行16S rDNA的扩增和序列分析，使用QIAamp试剂盒，严格按照试剂盒操作步骤，提取细菌DNA，通过PCR反应扩增出该细菌的16S rDNA。PCR反应体系(50μL)：模板DNA 50ng，Primer F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)20pmol/L，Primer R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3’)20pmol/L，Taq DNA聚合酶2.5U，加超纯水至50μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30sec，57℃45sec，72℃1min(32cycles)；72℃5min。2﹪的琼脂糖电泳分离PCR产物，确认有1500bp左右的条带之后，将纯化后的PCR产物送至上海生物工程公司进行测序，测序结果用SerialCloner软件进行处理，16SrDNA序列如SEQ ID NO:2所示。按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2020年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20430。

实施例3：大肠埃希氏菌M91001效果验证

转移1.6mL的感受态细胞悬浮液至已消过毒的冷藏管内，并加入已灭菌的0.4mL甘油使最终浓度达到20％，混匀。甘油储液在-80℃下分别储存待用。取已筛选菌种M91001和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)分别接入LB液体培养基中，35℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15mL培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体分别添加到含1％(％：g/100mL)3-氰基吡啶和烟酰胺的PBS缓冲液中分别转化2小时、8小时、24小时、72小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/L。取5mL转化液4000rpm下离心10min得上清液，HPLC法分析上清液，检测烟酸、烟酰胺和3-氰基吡啶含量，结果如下表2和表3，本发明所述的菌株M91001可显著降低烟酸的形成：

表3含有1％3-氰基吡啶的PBS缓冲溶液

表4含有1％烟酰胺的PBS缓冲溶液

实施例4：感受态细胞制备

将筛选出的大肠埃希氏菌菌株M91001在室温下使其加入40mL LB液体培养基。在37℃培养1h，然后将其转移到37℃摇床上以200r/min速度培养2～3h，直到OD600达到0.2～0.4。在4℃下以8000r/min的速度离心1min，然后用一半体积(20mL)已灭菌的预冷的TB(CaCl₂)溶液进行悬浮,并在冰上保存25min。如上进行另一次离心后，所得到的细胞沉淀用十分之一体积(4mL)预冷的TB(CaCl₂)溶液进行悬浮获得感受态细胞。感受态细胞可于4℃下保存3d。

转移1.6mL的感受态细胞悬浮液至已消过毒的冷藏管内，并加入已灭菌的0.4mL甘油使最终浓度达到20％，混匀。甘油储液在-80℃下分别储存待用。

实施例5：菌株构建

1、将存有感受态细胞的冷藏管从-80℃冰箱中取出，用手握住进行解冻。待细胞解冻后将冷藏管转移到冰浴中，静置10min；

2、使用预冷的无菌枪头，取200μL感受态细胞于灭过菌的EP离心管内，并将2μLpNh1229质粒加入感受态细胞的EP管内，轻轻旋转EP离心管多次，混匀，后将该EP管置于冰上5min；

3、将EP离心管放在42℃的恒温金属浴中热激90s，然后迅速放置在冰上，静置2分钟；

4、在EP离心管中迅速加入800μL的LB培养基，并放置于50rpm、37℃的摇床上培养1小时；

5、将EP离心管的菌液充分混匀后，取200μL菌液涂抹于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，同时取200μL纯感受态细胞涂抹于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，并都置于37℃培养箱培养16小时；

6、培养16小时后，涂有纯感受态细胞的LB平板上并没有长出菌落，而涂有转化过菌液的平板上出现少量单菌落，转化后的菌株即为大肠杆菌菌株X。

实施例6：大肠杆菌X酶活测定

本实施例采用大肠杆菌X发酵液进行酶活测定。酶活的定义：在25℃下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，即为总酶活力单位数U。该检测的反应体系为0.5mL，其中50Mm磷酸缓冲溶液中含35μg底物3-氰基吡啶，加入适当的发酵液，在25℃下反应10分钟后，立即添加0.5mL纯乙腈终止反应。12000rpm离心3分钟后，去上层清液采用高效液相色谱(HPLC)测定上层清液中的烟酰胺的含量。高效液相色谱的检测条件如下：

结果：大肠杆菌X在100mL LB培养基中培养12小时，后诱导并再培养12小时，酶活约为12U/mL。而在2.0t的发酵罐、本发明的发酵培养条件下，酶活最高达到5893U/mL。

实施例7：大肠杆菌X宿主效果比对

按照实施例3、4的方式，将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)制成感受态细胞，并完成pNh1229质粒的转化，得到大肠杆菌Y。

将大肠杆菌Y与大肠杆菌X在相同的条件下进行培养、诱导，分别取不同酶量的发酵液进行12000rpm、1分钟的离心，去除上层清液后，加入pH为7.0的磷酸缓冲溶液900μL，再加入100μL 10％含量的3-氰基吡啶溶液，混合均匀后将离心管放入20℃恒温金属浴中震荡反应10分钟。

反应结束后，将反应液进行12000rpm、1分钟的离心，取上层清液，检测其中的3-氰基吡啶、烟酸和烟酰胺含量，结果如下表5所示：

【表5】

结果显示，本发明所述的大肠埃希氏菌M91001转化形成的大肠杆菌X可以极大的抑制副产的形成，提高烟酰胺产品的品质。

实施例8：生物催化剂的制备

将大肠杆菌X斜面菌种接种到液体种子培养基中(一级液体种子培养基(g/L)：胰蛋白胨：10，酵母浸粉：5，氯化钠：10，pH：7.4)。在温度为37℃，转速为150rpm下振荡培养12小时即可得大肠杆菌X一级种子液，将该一级种子液按照3％的接种量转接到二级液体种子培养基中继续进行培养(二级液体种子培养基(g/L)：胰蛋白胨：11.8，酵母浸粉：23.6，K₂HPO₄：9.4，KH₂PO₄：2.2，甘油：4)，12小时后可得大肠杆菌X二级种子液。

将大肠杆菌X二级种子液按照5％的接种量接种到38L已灭菌的液体发酵培养基中，(发酵培养基(g/L)：工业级甘油：10g/L，酵母浸粉：18g/L，Na₂HPO₄·12H₂0：12.8g/L，NH₄Cl：1g/L，KH₂PO₄：3g/L，NaCl：0.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L)，发酵罐体积为50L，采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于30％，通气量：0.2v/v.min，罐压：0.03MPa，温度：37℃，起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过1000rpm。发酵12小时后将降低发酵温度至20℃，并添加诱导剂诱导质粒的蛋白表达(诱导剂(g/L)：乳糖：2，氯化钴：0.1)，后发酵24小时后即可制得大肠杆菌X细胞发酵液。

将上述的细胞发酵液以4000rpm、4℃条件离心30min所得到的沉淀得到生物催化剂。

实施例9：烟酰胺的制备

在200L搅拌釜中，先添加80L去离子水，调pH到7.0，温度为30℃。向反应釜中添加0.4kg的3-氰基吡啶，实施例7制备的生物催化剂的添加量为2.0×10⁶U。每隔1小时检测一次反应液中的3-氰基吡啶浓度，当底物浓度低于1.0g/L后开始补加底物，补充底物浓度为70％含量的3-氰基吡啶溶液，补加流速为10L/h，补料时间为8.5h。补加物料结束后1.5小时检测反应液中的3-氰基吡啶的浓度，当底物浓度趋向于零时即可终止反应。所述的反应结束后，先用3.0kd的陶瓷膜对反应液进行除菌过滤，然后用1.0kd的超滤膜和300d的纳滤膜再进一步对反应液进行纯化，最终利用蒸汽进行浓缩、喷雾干燥、流化床干燥，得到纯度在99.5％、颗粒度在150μm～400μm且烟酸含量低于30ppm的高品质烟酰胺。该实验得到烟酰胺成品59.6kg，收率为93.8％。

实施例10：反应效果对比

与浙江大学沟通并得到中国发明专利201710910450.8，名称为一种重组腈水合酶的高效表达方法中构建的菌种E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N-SD17K、E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act和E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N，通过专利中所描述的方式进行培养并诱导，得到可用作烟酰胺生物催化剂的细胞蛋白超过2.0×10⁶U。

将上述3个菌种与大肠杆菌X按照实施例8中的方式进行腈水合反应，其中底物添加速度根据每个菌的实际反应情况进行调整，反应情况如下表6所示：

【表6】

将上述4种反应结束后的反应液放置于35℃、220rpm的摇床中，每隔12小时进行取样，检测其中的烟酸、烟酰胺、3-氰基吡啶的浓度，结果如下表7所示：

【表7】

从上述数据看，大肠杆菌X在腈水合反应中反应持续时间最长，同时反应后的溶液中，烟酰胺浓度最高，达到402g/L。而其他3个菌种的反应时间持续时间明显低于大肠杆菌X，而且除E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act菌外，其他两种菌腈水合反应过后的溶液中，烟酰胺浓度都在30％以下。

在腈水合反应过程中，大肠杆菌X所产生的副产物烟酸生成量都控制在10ppm，且反应结束48内烟酸依然控制在15ppm以内，与其他菌种拉开的差距较大。

实施例11：菌株传代稳定性实验

从大肠杆菌X的原代培养基上挑选出单菌落，接种于含有50μL/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，35℃、220rpm的摇床中培养16小时，然后按被接培养基体积1％的接种量转接到含50μL/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，35℃、220rpm的摇床中连续震荡培养，每隔16h转管，每传1次记为1代。间隔一定时间取样，获得不同代次的菌液并于-80℃保存。分别取第1、10、20、30、50、75、100代菌液适量稀释，涂布于不含抗生素的LB培养基上，35℃培养过夜，再分别挑取单菌落100个到含与不含硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃培养过夜，计算传代时质粒保有率。质粒保有率＝含卡那霉素LB平板上菌落数/不含卡那霉素LB平板上菌落数×100％。结果显示，连续传50代以后，大肠杆菌X的质粒留存率在91％，100代以后的质粒留存率在80％。结果如下表8所示：

【表8】

以上述验证方法对专利《一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用》201910706179.5中涉及到的基因敲除技术所构建的腈水合菌种△EKO-Epn、△EKO-Eno和△EKO-Scn进行菌种质粒留存率实验，结果如下表9所示：

【表9】

序列表

<110> 安徽瑞邦生物科技有限公司

<120> 一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatgacgg gatcgcacgg cagggacggt gatcaccacg gccatcacca cgaccgtgat 60

cacgacaacc atctcgaccc gatgaccgcg cgggtcatgg cgctggagac gatcctcacc 120

gaaaagggca tggtcgaccc ggacgccctc gacgccatca tcgacaccta cgagaccaag 180

gtcgggccgc gcaacggcgc cagcgtcgtc gccaaggcct ggagcgaccc ggactacgcc 240

gactggctgg cgcgcgacgc aaccgccgcc attgcctcgc ttggcttcac cggccgccag 300

ggcgagcaca tgcaggcggt gttcaacacc ccggagcgcc acaacctcgt cgtctgcacc 360

ctgtgctcct gctatccgtg gtcagtgctc ggcctgccgc cggtctggta caagtcgccg 420

ccctatcgct cgcgcgccgt ctccgatccg cgcggcgtcc tgcgcgaatt cggcgtcgcg 480

ctgccggacg gcgtctcggt gcgagtctgg gactccaccg ccgagctgcg ctacctcgtc 540

gtgcccgagc gcccggcggg taccgaggga ctgtccgagg cggcgctggc ggcgctcgtc 600

acccgcaagt ccatgatcgg taccgagcgt gacctgagcc cgcatgccgc gccggagacg 660

gcggcatgaa cggcccccac gatctcggcg gtcggcacgg cttcgggccg atcgcgccga 720

aggcagacga gccgctgttc catgcgccct gggagcgccg cgccctcgcc ctgacgctcg 780

ccgccggtgc gatgggccat tggtcgatcg acgaaagccg cgccgcccgt gaggatcgcc 840

acccggccga ctattacggt tcgtcctatt acgagatctg gaccaagggc cttgagacgc 900

tgctcctgcg ccacggcctc atcagccatc gcgaattgcg cgccgggcgg cccctcgacc 960

tgaccgtgcc gccgaaccgc atcctgaagg ccgatgccgt cgcgccggcc cttgccaagg 1020

gcagtccggc caaccgcgat cccgaaggca gcacgcccgt tttcgcgccg ggcgacaggg 1080

tccgcacgct gaacctgcag ccgcgccatc acatccgcct gcccgcctat gcccgcgaga 1140

aggccggcac catcgaaacc gttcagggtt tccatgtctt cgcggatgcc agcgccaagg 1200

gcgacgacca tgtcgcgcac tggctctaca cggtggtctt cgacgcattc acgctgtggg 1260

gcggcgacgc ttcgcccaac gacaccgtct ccatcgatgc ctgggagccc tatcttgcgc 1320

acgcctgaga ccggcatcgc cgcatcgccc ggcctgccac gcgatgcggc gggtgaaccc 1380

gtcttcttcg cgccctggca ggccaaggcc ttcgccatga ccgtcgcgct gaacgagcgc 1440

ggcatccttg cctggaccga ctgggctgcc gcgctcggcc gcgcctgcgc cagcctgccc 1500

gccgccggcc cctcgcccga agcaacagcg gatgcctatt tcaccgcatg gctcgtcgcg 1560

ctcgaagaaa tcctcacggc acgggcgctg gtaagcgcca atgccgtcga cgcggcgcag 1620

gccgtctggc accgcgccgc cgaggccacg ccccacggca cgccgatccg cttcgaggcc 1680

ggcctgccga acccacacga ctgaaagctt 1710

<210> 2

<211> 1465

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacagga agcagcttgc 60

tgcttcgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg 120

gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc 180

ttagggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc 240

tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga 300

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 360

gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg 420

aggaagggag taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 480

taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540

gcgtaaagcg cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg 600

gaactgcatc tgatactggc aagcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa 720

gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg 840

cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg 960

gtcttgacat ccacggaagt tttcagagat gagaatgtgc cttcgggaac cgtgagacag 1020

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac tcaaaggaga ctgccagtga 1140

taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca 1200

cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata 1260

aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320

taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440

actttgtgat tcatgactgg ggtga 1465

Claims

1.一株大肠杆菌（Escherichia coli）M91001，保藏编号为CGMCC NO. 20430。

2.权利要求1所述的大肠杆菌M91001在生物催化生产烟酰胺中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是以大肠杆菌M91001作为宿主细胞接入编码腈水合酶的质粒后进行生物催化生产烟酰胺。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是以大肠杆菌M91001作为宿主细胞接入pNh1229质粒后形成大肠杆菌X，大肠杆菌X以3-氰基吡啶为底物进行生物催化产生烟酰胺。

5.权利要求1所述的大肠杆菌M91001转入催化生产烟酰胺的质粒后形成的菌株。

6.根据权利要求5所述的菌株，其特征在于，以大肠杆菌M91001作为宿主细胞接入pNh1229质粒后形成的大肠杆菌X。

7.权利要求6所述的大肠杆菌X制备的生物催化剂，其特征在于，所述生物催化剂为将大肠杆菌X细胞发酵液以3000～5000 rpm、2～5℃条件离心20～40 min所得到的沉淀。

8.根据权利要求7所述的生物催化剂，其特征在于，大肠杆菌X细胞发酵液的制备方法：

（1）种子液制备：将大肠杆菌X接种到灭过菌的斜面培养基上，20～35℃下培养3～7天，刮取3～5环菌种接种到灭菌的液体培养基中，在温度为20～40℃，转速为100～300 rpm下振荡培养10～120小时，即为大肠杆菌X的种子液；

（2）扩大培养：将大肠杆菌X种子液以体积百分比3%~10%的接种量进行发酵培养，培养条件为：诱导前：装液量：体积百分比60~80%，通气量：0.1~1vvm，罐压：0.02~0.05 MPa，温度：20~37℃，转速：200~1000 rpm，发酵时间：10~30小时；加入诱导剂诱导后：装液量：体积百分比60~80%，通气量：0.1~1vvm，罐压：0.02~0.05 MPa，温度：15~35℃，转速:200~1000rpm，发酵时间：10~90小时，形成大肠杆菌X细胞发酵液。

9.根据权利要求8所述的生物催化剂，其特征在于，将步骤（1）制备的种子液，作为大肠杆菌X的一级种子液；同样的培养条件下，将一级种子按体积百分比3～10％的接种量转接到第二批同样的液体培养基中，同样条件下培养30～72小时后作为大肠杆菌X的二级种子液，用于后续扩大培养。

10.根据权利要求8所述的生物催化剂，其特征在于，所述的斜面培养基的配比为：胰蛋白胨：8～12 g/L，酵母浸粉：3～8 g/L，氯化钠：8～12 g/L，琼脂：15～25 g/L，硫酸卡那霉素40～60 μg/mL，pH：6.8～7.5；所述的液体培养基的配比为：胰蛋白胨：10～14 g/L，酵母浸粉：20～25 g/L，氯化钠：8～12 g/L，K₂HPO₄：8～12 g/L，KH₂PO₄：2～2.5 g/L，甘油：3～5g/L，硫酸卡那霉素40～60 μg/mL，pH：6.8～7.5；所述的诱导剂为1～3 g/L乳糖和0.05～0.2 g/L氯化钴。

11.权利要求6所述的大肠杆菌X或权利要求7所述的生物催化剂在生物催化生产烟酰胺中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用是以3-氰基吡啶为底物。

13.权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用以3-氰基吡啶为底物，采用底物流加的方式，在温度为5～35℃、搅拌速度100～300 rpm下进行催化水合反应得到烟酰胺。

14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，催化水合反应的装液体积为容器总容量的40～70％；其中3-氰基吡啶的起始添加量为每100 mL装液体积中加入0.1～10 g，大肠杆菌X或生物催化剂的累积添加总量为1×10⁴～1×10⁵U/L；当3-氰基吡啶浓度低于1 g/L时，开始以底物流加方式补加3-氰基吡啶，补加速度为每小时补加3-氰基吡啶质量为起始添加量的10～20倍。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，以底物流加方式补加3-氰基吡啶，补加速度为每小时补加3-氰基吡啶质量为起始添加量的15～20倍。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，大肠杆菌X或生物催化剂添加量为1×10⁴～5×10⁴U/L。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，生物催化的反应温度15~30℃。

18.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，生物催化反应进行2～48小时，当3-氰基吡啶补加完毕且底物浓度逐渐降低，趋向于零时终止。

19.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，反应终止后，通过过滤、纯化、干燥后得到烟酰胺成品。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，采用2.0 kD～5.0 kD的陶瓷膜对反应液进行除菌过滤；采用0.5 kD～1.5 kD的超滤膜和500 D ~50 D的纳滤膜进行纯化；干燥为喷雾干燥和流化床干燥。