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CN112175915B - 一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用 - Google Patents

一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用 Download PDF

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CN112175915B CN202011084828.1A CN202011084828A CN112175915B CN 112175915 B CN112175915 B CN 112175915B CN 202011084828 A CN202011084828 A CN 202011084828A CN 112175915 B CN112175915 B CN 112175915B
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Abstract

本发明涉及一种噬菌体制剂中内毒素(LPS)的去除方法及其应用，所述方法包括步骤：用氯仿杀菌、通过离心的方式去除噬菌体制剂中细菌碎片等杂质→活性剂TritonX‑100将与噬菌体相结合的LPS解离，并使大分子LPS降解成小分子LPS→透析清除游离的小分子LPS→PEG8000浓缩提高噬菌体滴度及去除大分子LPS→氯仿去除引入的杂质→透析去除有机溶剂。其优点表现在：(1)成本低，所用设备简单，常规实验室均能满足。(2)在不影响噬菌体活性的基础上，实现去除噬菌体制剂中LPS含量至5EU/ml以下。(3)回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的120％。(4)对噬菌体或蛋白制剂的内毒素去除具有普遍适用性。

Description

一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及其应用。
背景技术
(一)噬菌体模块：
细菌耐药性已成为抗感染领域面临的巨大挑战，也是全世界医学领域广泛关注的问题之一。根据中国信息耐药网2019年发布的数据，引起的疾病的病原细菌中70％左右是革兰阴性菌。2019年主要临床分离菌种中前五位的分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。其中许多病原菌对不同种类的抗生素均产生了不同程度的耐药性。致使临床治疗效果越来越差、药物副作用也越来越大、治疗成本逐年升高。据世界卫生组织统计，全球每年有70万人死于“超级细菌”感染，其中包括23万名新生儿。针对细菌耐药问题，尽管世界各国都广泛重视抗生素的研发，但近年来新型抗生素的开发速度显著减缓、难度日益加大。针对一些多药耐药细菌，现有抗生素的治疗效果越来越有限。因此，亟须寻找其他方法来治疗临床上的难治性细菌感染，目前国内外的研究热点主要集中在噬菌体抗感染治疗。
噬菌体是一类原核细胞病毒，特异性感染细菌，是天然的抗菌药物，能够裂解细菌，而且治疗效果不因细菌耐药性而改变，为治疗耐药细菌感染提供了新思路。噬菌体一般通过宿主细菌中扩增获得，对革兰阴性细菌来说，噬菌体裂解细菌释放过程中会同时释放大量的内毒素。内毒素水平超标已经成为噬菌体制剂安全性的一大障碍，去除内毒素以获得纯净安全的噬菌体是噬菌体临床应用必须要解决的一大难题。
(二)内毒素模块：
内毒素(endotoxin)，又叫做脂多糖(LPS)，是革兰阴性菌的细胞壁成分，基本单位大小是10kDa到20kDa，但游离的内毒素可以聚集成不同大小的分子团。
内毒素非常耐热，在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏其生物活性。内毒素在人体内会导致广泛的生物学效应。在中等剂量下，内毒素会产生中度发烧并刺激免疫系统。高剂量时，会产生高烧，低血压，弥散性凝血和致命性休克。因此，欧洲和美国药典制定了人体治疗用制剂的内毒素阈值(≦5EU/kg体重*小时。但是目前，在噬菌体制剂中没有一种适应性广且能够工业化生产低内毒素的解决方案。
(三)内毒素去除目前现状：
目前内毒素去除主要有两大类方法：
①非选择性去除法：
1、根据LPS分子量大小采用物理性方法进行去除
1)超滤法：选用合适的超滤膜可以将溶液中游离的小分子LPS进行去除，主要适用于目标产物分子量大的溶液，但对于与噬菌体相结合的LPS以及大分子LPS效果比较差，并且回收率较低。
2)密度梯度超速离心法：利用蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度超速离心的方法来分离去除LPS。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是：因LPS不同的存在形式，分子大小、密度、沉降系数的不同，此方法应用受限。对于设备、人员要求较高，需要具备超速离心机以及专业的人员来操作，操作严格，不易掌握，对于普通实验室很难达到。此方法对于样本的要求也较高，对于噬菌体来说，病毒滴度需要达到较高的滴度才能出现较为明显的目标条带，但大部分噬菌体(病毒)很难达到较高的滴度，所以难以采用此方法进行噬菌体制剂中内毒素的去除。另外一个制约此方案的原因在于，每次处理样品量较少，离心时间较长，过程较为复杂，很难进行工业化生产，尤其对于种类繁多的噬菌体来说。
3)活性炭吸附：适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中LPS的去除，选择性较差，易吸附有效成分，残余活性炭不易去除。分子筛：利用凝胶分子的空间网状结构进行过滤层析，处理量小，且耗时长，适用于蛋白分子量小溶液。
2、根据LPS在溶液中带负电的特性进行去除。
1)荷电微滤：选用带正电荷的膜材质如聚矾、聚丙烯腈等微孔滤膜进行荷电微滤，并筛选合适的PH条件，可提高对LPS分子的去除效果，但前期需要对每一种噬菌体的最适条件进行摸索，操作较为复杂，样本回收率较低，同样很难进行工业化生产。
2)离子交换：适于从碱性蛋白质中去除LPS，成本低，吸附容量大。但不适合于溶液中存在其他带负电荷物质(如噬菌体)的情况。
3、根据类脂A(是LPS的生物活性中心，具有亲、疏水双性)的特性进行LPS的去除。双相萃取法：TritonX-114萃取：TritonX-114是一种疏水的表面活性剂，用其采用相分离法去除细胞色素C、过氧化氢酶以及血清白蛋白中的LPS，有较好效果。但是Triton X-114毒性较高、易残留，影响产品的性能。
②选择性去除：
1、免疫配基：根据抗原-抗体高特异性结合的机制，研究者用抗rHu-TNFa单克隆抗体为配基的吸附柱，用于清除LPS血症中的LPS。免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问题。
2、多粘菌素B(PMX-B)：PMX-B能依靠其环形肽结构降解革兰阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂A的磷酸基团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的LPS分子。采用固定PMX-B的纤维素(或琼脂糖)载体去除LPS，有良好的效果和稳定性。但是PMX-B的价格昂贵，且有肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
3、脱氧胆酸盐(DOC)：DOC是一种表面活性剂，可以解离破坏LPS因疏水作用而形成的胶束结构，阻碍LPS的结合实现分离。从而对于溶液中的内毒素具有一定的清除作用，但单独使用对于溶液中的内毒素去除效果一般。
TritonX-100：Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种亲水的非离子型表面活性剂(或称去污剂)。它能溶解脂质，以增加细胞膜对抗体的通透性，对病毒及蛋白中的LPS具有较好的解离性，使与蛋白结合的LPS解离下来，以及使大分子LPS降解成小分子LPS，但不具有清除LPS的能力。所以，单独使用效果不理想。
聚阳离子：聚阳离子能以静电作用，范德华力和氢键与LPS分子稳定结合，以其为配基的吸附介质，其吸附LPS分子的过程似于絮凝过程，与蛋白分子的吸附很少。此类配基如聚乙稀亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚L-组氨酸(PLH)等，生物相容性要优于PMX-B，吸附能力优于组氨酸。但中的效果来看，LPS去除效果一般，且操作复杂，成本较高，不能用于工业化生产。
(四)低内毒素噬菌体制剂应用市场
“超级细菌”所引起的多重耐药(multi-drug resistant，MDR)细菌感染，在欧洲，每年约有25000名患者死于多重耐药菌感染，其死亡率超过了50％。在美国，每年由耐药细菌感染所导致的医疗支出高达200亿美元。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MARS)在美国首次出现就导致了每年约19000人的死亡和30-40亿美元的财产损失。新抗生素的发现已经变得很困难，而细菌的耐药的问题却愈演愈烈。根据兰德公司(RNAD Coperation)预测，按照目前的细菌耐药速度，即将到来了的2020年将有250万人死于细菌耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)，十年后上升至590万人，到2050年达到惊人的每年1400万人。而如果按照恶化至100％耐药率的极端情况，2050年的这一数字高达4.44亿。另一方面，这两种情况下AMR对世界经济带来的损失将占GDP的0.06％至3.1％之间每年，导致的累计GDP损失在2.1万亿美元到124.5万亿美元之间。
在抗生素治疗穷途末路的时代，噬菌体治疗在这场战役中能否维持甚至降低细菌耐药性进展的速度和其带来的损失，是所有人拭目以待的。噬菌体由于独特的杀菌机制，在对抗耐药细菌方面显示出了卓越的天赋。因此，世界各国和医药企业对噬菌体的关注和投入日益加大。国内外先后成立多家噬菌体治疗、研发机构和公司。近几年，仅勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)和Roivant两家公司就在噬菌体抗感染领域投资20多亿美金；Locus Biosciences以8.18亿美元授权强生公司开发商业化工程噬菌体技术平台及管线；Bioharmony Therapeutics与勃林格殷格翰签订了总价值约5亿美元的噬菌体裂解酶在研产品授权协议；iNtRon Biotechnology与Roivant就一项噬菌体裂解酶药物达成了总价值6.67亿美元的授权。国内也出现了一些很有潜力的噬菌体公司。如曾获得包括药明康德、复星医药、博源资本、元禾原点等投资的菲吉乐科拥有两个噬菌体鸡尾酒管线和两个噬菌体裂解酶管线，已有针对植物和动物的噬菌体产品上市。青岛诺安百特、青岛瑞科盟、大连赛姆、大连汉信、南京巨豹等公司已有已上市或正在开发的动物、水产养殖用噬菌体及噬菌体蛋白类药物。虽然，国内外噬菌体相关产品很多，但据真正的临床应用还是有一段距离的。这其中较为主要的瓶颈问题就是噬菌体生物制剂中的内毒素含量，是否能够达到国际要求的标准。
耐药菌感染的复杂性会给噬菌体治疗带来一定的难度。噬菌体能否和病原菌直接接触，直接关系到噬菌体的治疗效果。噬菌体在不入血的情况下，其治疗难度在一定程度上源于噬菌体给药途径的选择上。如果噬菌体入血治疗，则要求噬菌体达到国家相关法规下药物入血的标准，而这也是目前噬菌体治疗需要解决的问题。
总之，目前的方法制备的噬菌体制剂中内毒素指标远高于5EU/ml，噬菌体制剂去除内毒素工艺还需提升，批量化去除噬菌体制剂中的内毒素是势在必行的，是噬菌体走向临床治疗必须要克服的重大难题之一。
本发明旨在针对现有技术的不足提供一种噬菌体裂解液中细菌内毒素的去除方法。关于本发明目前还未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一方面，本发明提供了一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法，包括步骤：
(1)加入氯仿到噬菌体制备母液中裂解细菌释放全部噬菌体；
(2)加入5％TritonX-100将与噬菌体制剂结合的LPS解离、将溶液中游离的大分子LPS降解为小分子LPS；
(3)透析去除溶液中游离的小分子LPS；
(4)PEG8000浓缩去除大分子LPS和TritonX-100，提高噬菌体滴度；
(5)加入氯仿去除残留的TritonX-100和PEG8000；
(6)透析去除残留的氯仿、TritonX-100、PEG8000及其余杂质。
优选地，步骤(2)中所述TritonX-100的浓度为5％。
优选地，步骤(2)的具体步骤为：加入5％TritonX-100，涡旋振荡，再置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm离心15min，取上清，即可。
优选地，步骤(4)中加入的PEG8000的比例为10％。
优选地，得到的噬菌体制剂中内毒素含量为5EU/ml及以下。
优选地，回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的50％-120％。
另一方面，本发明还提供了如上所述的方法在利用细菌制备药物中的应用。
优选地，所述的细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等产LPS的革兰阴性菌。
本发明优点在于：
1、成本低，所用设备简单，操作规程简便，效果稳定，易于规模化工业化生产。
2、内毒素去除效果良好，低于国际对入血制剂内毒素含量的要求标准，且对噬菌体活性影响较小，回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的120％。
3、适用性广，对短尾科、肌尾科和长尾科噬菌体的裂解液均有良好的内毒素去除效果，且对其他细菌发酵制备产品有普遍适用性。
4、经济效果：成本低，市场广：
成本低：制作每升超低内毒素噬菌体制剂仅需要2800余元，平均为2.8元/ml。
材料名称 价格/规格 用量 成本
Diamond胰蛋白胨(Tryptone) 1238元/500g 10g 24.76元
Diamond酵母提取物(Yeastextract) 675元/500g 5g 6.75元
Diamond氯化钠(NaCl) 118元/500g 68.5g 16.16元
氯仿 850元/500ml 30ml 51元
TritonX-100 198元/500ml 50ml 19.8元
透析膜 5700元/10m 3.1m 1767元
生理盐水 20元/3000ml 220000ml 800元
PEG8000 100元/500G 100g 20元
50ml离心管 1.76元/个 10个 18元
EP管、枪头等 0.545/个 18个 10元
合计 2733.47≈2800
市场广：
此专利能够批量化去除噬菌体制剂中内毒素的含量，从而能够达到入血标准，这样就极大的加快了噬菌体应用的步伐。从而能够形成一整套的噬菌体治疗产业链。其经济价值不可估量，所带来的社会效应巨大。
具体地，本发明较现有技术的优点具体见下表：
Figure GDA0003824949100000061
Figure GDA0003824949100000071
附图说明
附图1是本发明噬菌体制剂中内毒素(LPS)去除技术路线。
附图2是实施例4中不同浓度TritonX-100对噬菌体的安全性验证实验结果。
附图3是通过Tritonx-100(包括多个浓度)-透析-浓缩-透析处理后不同浓度Tritonx-100对噬菌体滴度变化影响的结果。
附图4是通过Tritonx-100(包括多个浓度)-透析-浓缩-透析处理后不同浓度的TritonX-100对内毒素变化影响的结果。
附图5是短、肌、长尾噬菌体制剂处理前后滴度变化结果。
附图6是短、肌、长尾噬菌体制剂处理前后内毒素变化结果。
附图7是短、肌、长尾噬菌体制剂处理前后内毒素与滴度比率变化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明是总结摸索已报道、研究中对溶液中LPS去除有效果的方法进行综合应用及优化，能够通过普通的仪器设备、简单的操作来达到临床应用的标准，并且能够进行工业化生产。本发明方法分为三部分：第一部分主要是去除溶液中游离及小分子LPS；第二部分主要是去除大分子LPS以及提高噬菌体的滴度；第三部分是去除有机试剂的残留。详细内容可参照以下实施例。
以下实施例中所涉及到的试剂、器材如下：
台式离心机(eppendorfCentrifuge 5810R)
磁力搅拌器MS-H380-Pro
LB肉汤、LB琼脂、琼脂粉-购置北京索莱宝科技有限公司
氯仿-购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司
曲拉通X-100(TritonX-100)-购置生工生物工程(上海)股份有限公司
Biotech CE Tubing MWCO:1000kD-美国SpectraPor透析膜
0.9％生理盐水-购置山东齐都药业有限公司
氯化钠-购自生工生物工程(上海)股份有限公司
聚乙二醇8000-购自生工生物工程(上海)股份有限公司
革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒(显色法)-购置天津喜诺生物医药有限公司。
实施例1去除溶液中游离及小分子LPS
1、噬菌体扩增
将宿主菌在LB固体培养基上进行平板划线，置于37℃恒温培养箱中培养12h左右，挑取单个符合菌体形态的菌落置于5ml LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h左右。按照1％比例进行转接，把宿主菌培养至对数生长期。
按照1％比例转接对数生长期的宿主菌，同时加入等比例的目标噬菌体，然后，置于37℃、220rpm振荡培养2h左右。另外设置2组对照试验，一组只接菌，另一组既不接种宿主菌也不加入噬菌体。对比三组变化，对照1组(只加菌)溶液应该出现浑浊，对照2组(不加噬菌体，不加菌)溶液应该澄清无变化，扩增组正常情况下应该是澄清透亮的，如有浑浊则扩增失败。在澄清的扩增组中再添加适量的对数生长期的宿主菌，37℃、220rpm振荡培养30min左右，观察溶液变化，溶液澄清后再培养30min，如若溶液依旧澄清，再加入适量的对数生长期的宿主菌液。如此往复3到5次，最后母液依旧澄清(可能会有些许细菌碎片)，即扩增完成，所得到的澄清液即为噬菌体母液。
2、氯仿除菌
在噬菌体母液中按照1％的比例加入氯仿，涡旋震荡1min，充分混匀，然后冰浴20min，期间上下颠倒2-3次。冰浴完成后进行8000rpm离心10min。取上清液，上清液即为噬菌体扩增除菌液。
此步操作目的及作用：
(1)裂解细菌释放全部噬菌体。
(2)通过氯仿除去噬菌体制剂中噬菌体裂解细菌所产生的细菌碎片等杂质。
3、在前期预实验的基础上用TritonX-100解离以及降解LPS
在噬菌体扩增除菌液中按照5％的比例加入TritonX-100，涡旋震荡，使TritonX-100完全溶解于溶液中。然后置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm离心15min，取上清(可能没有明显分层现象，但底部几毫升溶液弃去)以进行下一步处理。
此步操作的目的及作用：
(1)利用TritonX-100的特性使与噬菌体相结合的LPS解离下来，使两者分离开来。
(2)使溶液中游离的大分子LPS降解为小分子LPS，方便后续除去。
4、透析
将步骤3中处理后的上清液置于Biotech CE Tubing MWCO:1000kD的透析膜中，置于样品溶液100倍体积的生理盐水中，在400rpm磁力搅拌器上进行透析两次，每次4h。透析后溶液颜色有淡黄色液体(培养基颜色)变成无色透明液体。
此步骤的目的及作用：
(1)透析去除溶液中游离的小分子LPS，进而达到一定的LPS去除效果。
(2)置换样品溶液中培养基成分及杂质，使其样品溶液中不含培养基成分及杂质，为后续临床应用做安全保障。
实施例2去除大分子LPS以及提高噬菌体的滴度
5、PEG浓缩
将实施例1步骤4中透析后的溶液置于合适的离心管(15ml或50ml)中，按照5.84g/100ml加入固体NaCl，充分溶解。再按照10％(W/V)比例加入PEG8000使其溶解，使溶液变成均质的溶液。然后置于4℃过夜静置或静置8h以上，再进行12000rpm离心20min，离心后弃去上清，离心管倒置2-3min使上清溶液尽可能的清除干净。按照原溶液的10％加入洗涤液(0.9％的生理盐水或PBS溶液或SM buffer等)进行重悬，充分清洗管壁。所得的液体即为噬菌体浓缩液。
此步骤的目的：
(1)去除噬菌体制剂中大分子的LPS。
(2)去除TritonX-100试剂，把引入的试剂尽可能的去除出去。
(3)使噬菌体的滴度升高，为后续临床应用提供保障(临床应用一般对噬菌体的滴度要求较高)。
实施例3去除有机试剂的残留
6、氯仿抽提
将实施例2步骤5中重悬的溶液按照1：1的比例加入氯仿溶液，涡旋震荡1min，充分混匀，然后进行5000rpm离心5min，溶液有明显分层，取上清重复抽提一次。
此步骤的目的：
(1)进一步去除残留的TritonX-100试剂。
(2)去除溶液中的PEG8000及其他杂质。
7、透析
将步骤6中所获得的溶液根据临床需要进行合适比例的稀释，稀释后移入BiotechCE Tubing MWCO:1000kD的透析膜中置于100倍体积的生理盐水中进行透析，透析2次，除去溶液中的氯仿溶液。
此步骤的目的：
(1)主要作用是去除溶液中所引入的各种试剂。
(2)除去溶液中残留的氯仿溶液。
(3)更进一步除去TritonX-100试剂。
(4)更近一步除去PEG8000试剂。
(5)除去溶液中其他的离子及杂质。
实施例4安全性验证实验
本实施例仅使用TritonX-100对噬菌体制剂处理，各组区别在于TritonX-100的浓度不同，验证TritonX-100浓度对噬菌体制剂影响。
实验结果图2。
由图2可知：TritonX-100浓度从0.5％--10％对噬菌体滴度、侵染性不会造成不利影响。
实施例5对照试验
本实施例各组按照Tritonx-100-透析-浓缩-透析的方法对噬菌体制剂处理，各组区别在于TritonX-10的浓度不同，验证TritonX-100浓度对噬菌体制剂影响并记录结果。
实验结果见图3-图4，表明5％TritonX-10处理效果最佳。
实施例6效果实验
本实施例旨在对实施例1-3制备得到的噬菌体制剂(包括短尾、肌尾和长尾菌株)检测。
1、实验方法
试验过程中内毒素检测均采用的是：天津喜诺生物医药有限公司的革兰阴性脂多糖检测试剂盒(显色法)EKT-25M:50人份/盒，该试剂盒能够准确定量溶液中内毒素的含量。标曲范围为：0.005--5EU。
2、实验结果
2.1短尾、肌尾和长尾菌株噬菌体制剂处理前后滴度、内毒素、内毒素与滴度比率变化结果分别见图5-7。
3结论
本发明的方法解决了现有技术中限制噬菌体制剂发展一个难点---内毒素超标问题，实现了规模化、批量化去除噬菌体制剂中的内毒素，并保持较高的回收率，且不损害噬菌体的侵染性，内毒素去除标准能够达到美国FDA标准，为噬菌体临床应用提供了保障。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法，其特征在于，包括步骤：
（1）加入氯仿到噬菌体母液中裂解细菌释放全部噬菌体；
（2）加入5% TritonX-100将与噬菌体制剂结合的LPS解离，将溶液中游离的大分子LPS降解为小分子LPS；
（3）透析去除溶液中游离的小分子LPS；
（4）PEG8000浓缩去除大分子LPS和TritonX-100，提高噬菌体滴度；
（5）加入氯仿去除残留的TritonX-100和PEG8000；
（6）透析去除残留的杂质，获得超低内毒素水平的噬菌体制剂；
所述步骤（1）的细菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌；
所述步骤（2）的具体步骤为：加入5% TritonX-100，涡旋振荡，再置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm离心15min，取上清；
所述步骤（3）使用透析膜，透析膜分子量为1000 kD；
所述步骤（4）中加入的PEG8000的浓度为10%；
回收后活性噬菌体滴度可达回收前的50%-120%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括步骤：
（1）氯仿除菌：在噬菌体母液中按照1%的比例加入氯仿，涡旋震荡1min，充分混匀，然后冰浴20min，期间上下颠倒2-3次，冰浴完成后进行8000rpm离心10min，取上清液，上清液即为噬菌体扩增除菌液；
（2）TritonX-100解离以及降解LPS：在噬菌体扩增除菌液中按照5%的比例加入TritonX-100，涡旋震荡，使TritonX-100完全溶解于溶液中，然后置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm离心15min，取上清液；
（3）透析：将上清液置于Biotech CE Tubing MWCO:1000 kD的透析膜中，置于100倍体积的生理盐水中，在400rpm磁力搅拌器上进行透析两次，每次4h；
（4）PEG8000浓缩：将透析后的溶液置于离心管中，按照5.84g/100ml加入固体NaCl，充分溶解，再按照10%比例加入PEG8000使其溶解，使溶液变成均质的溶液，然后置于4℃过夜静置或静置8h，再进行12000rpm离心20min，离心后弃去上清，离心管倒置2-3min，按照原溶液的10%加入洗涤液进行重悬，充分清洗管壁，所得的液体即为噬菌体浓缩液；
（5）氯仿抽提：将重悬后的溶液按照1：1的比例加入氯仿溶液，涡旋震荡1min，充分混匀，然后进行5000rpm离心5min，取上清重复抽提一次；
（6）透析：将步骤(5)中所获得的溶液稀释，稀释后移入Biotech CE Tubing MWCO:1000kD的透析膜中置于100倍体积的生理盐水中进行透析，透析2次，除去溶液中的氯仿溶液。
3.权利要求1-2任一所述的方法在制备噬菌体药物中的应用。
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