CN112175884B - 植物乳杆菌sd26及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物乳杆菌SD26及其产品和应用，涉及微生物领域。本发明提供的植物乳杆菌SD26，保藏编号CGMCC No.19328，来源于泡菜，对于包括变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌在内的口腔致病菌，以及包括伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌在内的食源性致病菌具有明显的抑制作用，在口腔致病菌以及食源性致病菌的防治方面具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种植物乳杆菌SD26及其产品和应用。
背景技术
人体口腔环境是由多种属微生物形成的复杂的微生态系统，研究显示口腔中细菌的种类超过700种，口腔微生物通过共生、竞争和拮抗等相互作用影响着口腔微生态平衡，与宿主口腔健康和疾病有着紧密联系。当有外来微生物进入口腔环境或者口腔环境中固有的某些微生物过量生长，逐渐成为优势菌群时，会打破口腔微生态平衡，导致口腔疾病发生。人类常见的口腔感染性疾病包括牙周病、龋齿和口臭等，严重威胁着人类健康。目前，普遍认为牙周疾病主要由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普氏菌等革兰氏阴性厌氧菌联合致病。龋病主要是以变异链球菌和产酸菌的过度生长引起的牙体硬组织感染性疾病。口腔念珠菌病是念珠菌属感染引起的口腔黏膜疾病，其中白色念珠菌是最主要的病原菌。
目前，国内外主要采用口服抗生素的化学疗法来治疗细菌感染性疾病。但长期服用抗生素会破坏口腔生态系统平衡，同时也加剧了细菌耐药性问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种植物乳杆菌SD26，于2020年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19328。
本发明的第二目的在于提供一种植物乳杆菌SD26的生物学纯培养物。
本发明的第三目的在于提供一种菌剂，该菌剂包括上述植物乳杆菌SD26。
本发明的第四目的在于提供一种上述植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物或菌剂的发酵产物。
本发明的第五目的在于提供一种上述植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治口腔致病菌的药物中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种防治口腔致病菌的药物。
本发明的第七目的在于提供一种上述植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治食源性致病菌的药物中的应用。
本发明的第八目的在于提供一种防治食源性致病菌的药物。
为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26，所述植物乳杆菌SD26保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中的，保藏编号为：CGMCC No.19328。
第二方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26的生物学纯培养物。
第三方面，本发明提供了一种菌剂，包括植物乳杆菌SD26。
第四方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物或菌剂的发酵产物。
第五方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治口腔致病菌的药物中的应用。
作为进一步技术方案，所述口腔致病菌包括变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌或牙龈卟啉单胞菌中的至少一种。
第六方面，本发明提供了一种防治口腔致病菌的药物，包括植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物中的至少一种。
第七方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治食源性致病菌的药物中的应用。
作为进一步技术方案，所述食源性致病菌包括伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或单核细胞增生李斯特氏菌中的至少一种。
第八方面，本发明提供了一种防治食源性致病菌的药物，包括植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的植物乳杆菌SD26，来源于泡菜，对于包括变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌在内的口腔致病菌，以及包括伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌在内的食源性致病菌具有明显的抑制作用，在口腔致病菌以及食源性致病菌的防治方面具有良好的应用潜力。本发明提供了一种防治口腔致病菌的药物，该产品能够用于口腔疾病的预防和治疗。本发明提供了一种防治食源性致病菌的药物，该产品能够用于食源性致病菌导致的疾病的预防和治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为菌株SD26基因组与16S rRNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳，M1、M2分别为MarkerDL15000和DL2000，1为菌株SD26基因组，2为16S rRNA扩增产物；
图2为基于16S r RNA序列的菌株SD26系统发育树；
图3为乳杆菌SD26的生长曲线及不同培养时间下pH和抑菌圈直径；
图4为乳杆菌SD26 pH 3.81、pH 6.00的发酵上清液对白色念珠菌生长过程的影响；
图5为乳杆菌SD26发酵上清液的不同处理对白色念珠菌的抑制活性，*表示两组之间没有显著差异(p>0.05)，**表示两组之间有显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26，该菌株的分类命名为：植物乳杆菌SD26，拉丁文学名：Lactobacillus plantarum SD26，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年1月10日，保藏编号：CGMCC No.19328。
本发明的植物乳杆菌SD26来源于四川大凉山农家泡菜，由菌落形态试验得，菌株SD26菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑，边缘齐整，质地均匀。菌体形态为杆状，革兰氏染色结果为阳性。
本发明对植物乳杆菌SD26的实验研究发现，植物乳杆菌SD26对于包括变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌在内的口腔致病菌，以及包括伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌在内的食源性致病菌具有明显的抑制作用，在口腔致病菌以及食源性致病菌的防治方面具有良好的应用潜力。
第二方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26的生物学纯培养物。第三方面，本发明提供了一种菌剂，包括植物乳杆菌SD26。
本发明提供的菌剂，包括本发明的植物乳杆菌SD26，或者植物乳杆菌SD26与辅料或者其他菌的混合，例如，可以是本发明的植物乳杆菌SD26与其他的菌混合制备的菌剂，也可以是本发明的植物乳杆菌SD26与辅料制备得到的菌剂。该菌剂具有本发明植物乳杆菌SD26的所有有益效果。
第四方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物或菌剂的发酵产物。
经发明人研究发现，植物乳杆菌SD26的抑菌物质主要为该乳杆菌代谢分泌的有机酸，因此，含有该有机酸的发酵产物也具有抑菌作用。
第五方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治口腔致病菌的药物中的应用。
本发明的植物乳杆菌SD26对于口腔致病菌具有明显的抑制作用，能够用于制备防治口腔致病菌的药物。
在一些优选的实施方式中，所述口腔致病菌包括但不限于变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌或牙龈卟啉单胞菌中的至少一种。
第六方面，本发明提供了一种防治口腔致病菌的药物，包括植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物中的至少一种。
本发明的植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物均具有抑制口腔致病菌的作用，以其为组分的药物也具有防治口腔致病菌的作用。
第七方面，本发明提供了一种植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物在制备防治食源性致病菌的药物中的应用。
本发明的植物乳杆菌SD26对于食源性致病菌具有明显的抑制作用，能够用于制备防治食源性致病菌的药物。
在一些优选的实施方式中，所述食源性致病菌包括但不限于伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或单核细胞增生李斯特氏菌中的至少一种。
第八方面，本发明提供了一种防治食源性致病菌的药物，包括植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物中的至少一种。
本发明的植物乳杆菌SD26、生物学纯培养物、菌剂或发酵产物均具有抑制食源性致病菌的作用，以其为组分的药物也具有防治食源性致病菌的作用。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的实验操作方法，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。
MRS培养基制备可参考如下文献：
D'AIMMO M R,MODESTO M,BIAVATI B.Antibiotic resistance of lactic acidbacteria and Bifidobacteriumspp.isolated from dairy and pharmaceuticalproducts[J].International Journal of Food Microbiology,2007,115(1):35-42.
实验用到的指示菌及其培养基如表1所示。
表1指示菌及培养基
注:a:ATCC，美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)；CMCC，中国医学细菌菌种保藏管理中心(National Center For Medicial CultureCollection)。
实施例1乳酸菌的分离方法
称取5g泡菜样品放入无菌均质袋中，加入45mL无菌生理盐水拍打混匀后，梯度稀释，分别吸取稀释倍数为10-3、10-4、10-5、10-6的样品100μL，涂布于含2.5％CaCO3的MRS和M17平板上，37℃培养24h。挑取长势良好，溶钙圈明显的菌落，通过平板划线分离法反复分离纯化，从泡菜样品中筛选分离出乳酸菌9株，编号为SD23-SD31。
实施例2抑制口腔致病菌乳酸菌的筛选
将分离所得乳酸菌接种于MRS液体培养基上活化后，以2％的接种量接种于5mLMRS液体培养基中，37℃培养24h。于10000r/min离心10min后，用0.22μm无菌过滤器过滤得无细胞发酵上清液。采用牛津杯法筛选出对变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌产生明显抑菌圈的菌株。并用MRS液体培养基做阴性对照(CK)，Nisin、山梨酸钾和纳他霉素做阳性对照。每个试验重复三次，拍照并用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径，试验结果如表2所示。
表2不同菌株对各指示菌的抑制活性
注:1.抑菌活性用抑菌圈的宽度(mm)表示，+++,>20mm；++,15-20mm；+,10-15mm；±,<10mm；-,无抑制作用；CK:MRS液体培养基。
由表2可知，9株菌株表现出对不同口腔致病菌的不同抑制作用，其中植物乳杆菌SD26(以下简称SD26)对口腔致病菌的抑制作用强于其余菌株。尤其是SD26对白色念珠菌的抑制作用明显强于其余菌株及对照组Nisin、山梨酸钾和纳他霉素，且SD26对白色念珠菌的抑菌圈直径大于20mm。故选择SD26菌株作为目标菌株做进一步的试验研究。
实施例3 16S r RNA鉴定
根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明操作提取未知菌株基因组DNA，以基因组DNA为模版进行16S r RNA基因的PCR扩增。扩增引物使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系见表3。
表3 PCR反应体系
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34次循环；最后72℃延伸5min。
将提取的基因组和PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析检测后，将PCR产物进行DNA测序(上海生工生物工程有限公司)。测序序列结果在NCBI数据库中用Blast软件搜索近似序列，将所测得的序列和从Gen Bank中获得的相关种属的16S r RNA基因序列，运用Mega7.0软件构建系统发育树。结果如图1和图2所示。
图1所示为SD26的基因组和16S r RNA扩增片段。16S r RNA测序结果经BLAST分析和多重比对后，构建系统发育树见图2。分析得出菌株SD26与植物乳杆菌(L.plantarum)16Sr RNA基因序列相似性为98％，当16S r RNA序列同源性≥98％时可以认为是同种，由此可知菌株SD26为植物乳杆菌。
实施例4乳酸菌SD26不同生长时间上清液pH及抑菌活力的测定
将SD26以2％接种于200mL MRS液体培养基中，37℃培养24h。每隔4h取培养液20mL，测定其OD600nm。以10000r/min，4℃离心10min后测定上清液pH及其对白色念珠菌的抑菌活力，设三组平行，取平均值。结果如图3所示。
由图3可知培养4h时，SD26开始进入对数生长期，此时其发酵上清液的pH值在5.0左右，已对白色念珠菌有较高的抑制活性。随着培养时间的增加，SD26发酵上清液的pH值在不断的降低，而对白色念珠菌的抑菌圈直径在不断的变大。当培养到20h时，SD26进入稳定期后期，其发酵上清液的pH值趋于稳定且最小，此时对白色念珠菌的抑菌圈直径达到最大。
实施例5乳酸菌SD26上清液对白色念珠菌生长过程的影响
将SD26以2％接种于200mL MRS液体培养基中，37℃培养12h后4℃，10000r/min离心10min得上清液，测定上清液的pH值，并将上清液分装试管编号。用pH计将上清液的pH调为6.00，然后测定不同pH的SD26发酵上清液对白色念珠菌生长的影响。
将白色念珠菌以2％的接种量接种于10mL YPD液体培养基中，编号。再分别添加不同pH的10mL SD26发酵上清液，37℃培养24h，每4h取出一定量培养液，测定其OD600nm。设三组平行，绘制白色念珠菌的生长曲线。以不添加SD26上清液的白色念珠菌的生长曲线作为阴性对照。结果如图4所示。
由图4可知SD26不同pH值的发酵上清液对白色念珠菌的生长有不同的影响，其中将白色念珠菌的生长曲线作为空白对照。当SD26发酵上清液的pH值为3.81时，白色念珠菌24h都处于较低的OD600nm且几乎恒定在零水平。而当SD26发酵上清液的pH值为6.00时，白色念珠菌的生长曲线趋势几乎与空白对照组相吻合。由此可推测SD26上清液的低酸性环境对白色念珠菌的生长起抑制作用。
实施例6抑菌物质的确定
为了确定乳酸菌SD26发酵上清液中的抑菌物质，进行了如下3种不同的试验。
酸碱作用：测量发酵上清液的pH，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将发酵上清液的pH调为3.00、4.00、5.00、6.00、7.00。分别吸取调过pH的发酵上清液和原发酵上清液，用牛津杯法进行抑菌试验。
酸对照：用盐酸、乙酸、L-乳酸、D-乳酸将空白的MRS培养基调节到与SD26发酵上清液相同的pH值，以MRS液体培养基作为空白对照，用牛津杯法进行抑菌试验。
盐析：取100mL SD26发酵上清液，向其中加入硫酸铵至饱和度为75％，待硫酸铵盐完全溶解，将样品置于4℃中搅拌过夜后10000r/min离心30min，分别收集上清和沉淀。测量上清的pH，并用1mol/L的NaOH将上清的pH调为6.00和7.00，用pH为7.00的无菌水将沉淀复溶至10mL，取上清和沉淀复溶液，以白色念珠菌为指示菌做抑菌试验。结果如表4和图5所示。
表4乳酸菌SD26不同pH值的发酵上清液对白色念珠菌的抑制活性
注：CK:原发酵上清液；同列肩标有字母相同表示和CK差异不显著(p>0.05),不同表示差异显著(p<0.05)；-,无抑制作用。
由表4可知，随着SD26发酵上清液pH值的升高，对白色念珠菌的抑菌圈在变小。当SD26发酵上清液pH值大于5.00时，对白色念珠菌无抑菌作用。而SD26发酵上清液的不同pH值对白色念珠菌的抑菌圈直径存在显著性差异(p<0.05)，由此可推测，对白色念珠菌的抑制作用依赖于SD26发酵上清液的pH值，且低酸性环境对白色念珠菌有强抑制作用。
由图5可知，在与SD26发酵上清液pH值相同时，盐酸、乙酸、D-乳酸均对白色念珠菌有明显的抑制作用，而L-乳酸对白色念珠菌无抑制作用。且盐酸、D-乳酸的抑菌圈直径与SD26发酵上清液的抑菌圈直径有着显著差异(p<0.05)，而乙酸的抑菌圈直径与SD26发酵上清液的抑菌圈直径没有显著差异(p>0.05)，由此推测SD26发酵上清液中对白色念珠菌起抑菌作用的物质很可能为乳酸菌分泌的有机酸中的乙酸。
由图5可知，用75％硫酸铵盐析后酸性上清液有明显抑菌圈，而中性沉淀复溶液无抑菌圈，表明SD26发酵上清液中对白色念珠菌起抑菌作用的物质非蛋白质类化合物，而是该乳酸菌代谢分泌的有机酸。
实施例7对食源性常见致病菌抑菌谱的测定
取SD26发酵上清液，用牛津杯法分别做以伤寒沙门氏菌CMCC50071、大肠杆菌ATCC43888、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54003和单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54002为指示菌的抑菌实验。设三组平行，取平均值。结果如表5所示。
表5乳酸菌SD26对食源性致病菌的抑菌谱
注:1.抑菌活性用抑菌圈的宽度(mm)表示，+++,>20mm；++,15-20mm；+,10-15mm；±,<10mm；-,无抑制作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌SD26，其特征在于，所述植物乳杆菌SD26保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19328。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌SD26的生物学纯培养物。
3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌SD26。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌SD26、权利要求2所述的生物学纯培养物或权利要求3所述的菌剂的发酵产物。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌SD26、权利要求2所述的生物学纯培养物、权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的发酵产物在制备防治口腔致病菌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口腔致病菌包括变异链球菌、白色念珠菌、具核梭杆菌或牙龈卟啉单胞菌中的至少一种。
7.一种防治口腔致病菌的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌SD26、权利要求2所述的生物学纯培养物、权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的发酵产物中的至少一种。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌SD26、权利要求2所述的生物学纯培养物、权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的发酵产物在制备防治食源性致病菌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食源性致病菌包括伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或单核细胞增生李斯特氏菌中的至少一种。
10.一种防治食源性致病菌的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌SD26、权利要求2所述的生物学纯培养物、权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的发酵产物中的至少一种。
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