CN112156095A

CN112156095A - M2型丙酮酸激酶小分子激活剂及其应用

Info

Publication number: CN112156095A
Application number: CN202011166333.3A
Authority: CN
Inventors: 刘焕香; 葛慧珍; 刘瑞娟; 袁苗苗; 郭婧筠; 彭立增; 姚小军
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-01-01

Abstract

本发明提供了一种以人源M2型丙酮酸激酶(M2 type pyruvate kinase,PKM2)为靶点的小分子激活剂及其应用，属于制药技术领域。本发明以PKM2为靶点，利用基于对接的虚拟筛选和体外生物活性评价相结合进行小分子激活剂的筛选。体外活性测试结果表明，筛选的化合物中有两个具有较好的PKM2激活活性，并且具有较好的癌细胞抑制活性，所发现的小分子可以为治疗PKM2有关的疾病，例如宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、血癌、黑色素瘤以及多发性骨髓瘤的新药研发提供基础。本发明的先导化合物可进一步的结构优化，具有较好的应用前景。

Description

M2型丙酮酸激酶小分子激活剂及其应用

技术领域

本发明属于医药化学技术领域，具体涉及以M2型丙酮酸激酶(M2 type pyruvatekinase,PKM2)蛋白为靶点激活人PKM2激酶活性的先导化合物在制备PKM2相关的病症药物中的应用。

背景技术

细胞中，由葡萄糖代谢转化成为乳酸的过程称为糖酵解，其反应过程可以分为两个阶段；第一阶段称为糖酵解途径(glycolytic pathway),即由葡萄糖分解成为丙酮酸的过程；第二阶段是由丙酮酸转变为乳酸的过程。糖酵解途径的最后一步反应是由丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK)催化完成的，其将磷酸根从磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoneolpyruvic acid,PEP)上转移至腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP),从而产生丙酮酸和ATP。

肿瘤细胞与正常细胞摄取、代谢营养物质的方式不同，这为我们对抑制肿瘤细胞生长的研究提供了一个可能的策略。在有氧情况下，正常细胞主要经过氧化磷酸化进行代谢，即细胞内的葡萄糖通过糖酵解途径产生的丙酮酸主要进入线粒体内，并经过氧化脱羧的方式生成乙酰辅酶A而进入三羧酸循环，被完全氧化为水和二氧化碳，并释放大量的能量以供机体正常运转；只有少量的丙酮酸依然留在胞质中，并转化为乳酸。在缺氧的条件下，正常细胞主要通过糖酵解代谢，即细胞内的葡萄糖经过糖酵解途径产生的丙酮酸转化为大量的乳酸排出体外，并释放少量的能量。然而，肿瘤细胞却不同，并且随着肿瘤的生长，癌细胞增殖的生物合成需求也在不断增加。即使在氧气充足的条件下，肿瘤细胞仍以糖酵解作为主要的代谢方式，将产生的丙酮酸转化为乳酸排出细胞外(有氧糖酵解)。这一现象又被称为Warburg效应，是由德国化学家Otto Warburg等人与上世纪20年代发现的。后来人们发现多种糖酵解途径的关键酶(如丙酮酸激酶、己糖激酶等)的表达及翻译后修饰都可引起糖酵解途径的失调，从而影响正常细胞代谢方式，导致肿瘤的发生。

丙酮酸激酶一共存在4种亚型，分别是L、R、M1、M2。PKL和PKR都是由Pkrl基因进行编码，分别在肝脏和红细胞中进行表达。PKM1和PKM2均由Pkm基因编码，PKM1常见于需要快速提供大量能量的组织，如大脑和肌肉组织；PKM2出现在一些分化的组织如脂肪组织、肺、视网膜和胰岛细胞中，亦存在于所有增值细胞如正常增值细胞、胚胎细胞、以及成体干细胞特别是肿瘤细胞中。近几年来有大量的研究结果表明，M2型丙酮酸激酶(PKM2)的含量与肿瘤的分期密切相关，并且低活性PKM2(二聚体)的过表达已确证可明显增强肿瘤细胞的Warburg效应，而靶向激活PKM2使其四聚体形式稳定存在，可逆转肿瘤Warburg效应，从而有效地抑制肿瘤的发生和发展。

PKM2同源四聚体的晶体结构如附图1所示，以肽链A为例，我们可以看到四种不同的结合位点：(1)底物结合位点(Active Site):PKM2与底物PEP结合的活性中心。反应过程中，底物PEP可以将高能磷酸基团转移给ADP,同时合成ATP供能。(2)别构调节位点(Allosteric pocket):与这个结合位点结合的配体称为调节剂(modulator)。PKM2复合物的晶体结构反映苯丙氨酸Phe与丝氨酸Ser都能与该结合位点作用，引起PKM2构象的变化，影响底物PEP的结合，从而调节PKM2丙酮酸激酶活性。(3)内源性FBP结合位点(Effectorsite):这个结合位点是内源性激活剂FBP的作用位点，FBP与该位点的结合可激活PKM2,增强C-C’界面氨基酸残基间的相互作用力，从而使PKM2形成稳定的四聚体激活态。(4)PKM2激活剂作用位点(Activators binding site):PKM2的四聚体A-A’界面上形成一个对称的口袋，变构激活剂(Activators)的结合可以稳定PKM2四聚体激活态。

研究表明，肿瘤中的PKM2主要以低活性二聚体形式为主；PKM2激活剂通过活化PKM2将其二聚体形态转化为高活性的四聚体形式，可使更多的葡萄糖代谢中间产物转而进入产能途径而不是转向合成代谢。这使得乳酸产生减少，细胞耗氧量增加，从而逆转Warburg效应，有效抑制肿瘤的发生和发展。因此，近些年来人们将目光逐渐集中在了PKM2激活剂的研发上。但是，目前已经报道的PKM2激动剂的类型及数量还相当有限，还需要设计和发现具有新型骨架的特异性靶向PKM2的激活剂。

随着计算机技术在药物研发领域的应用，计算机虚拟筛选为药物先导化合物的发现提供了一种快速、高效的筛选技术。该技术针对重要疾病特定靶标生物大分子的三维结构，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标结合较好的化合物，可以大大降低实验筛选化合物数量，缩短了研发周期。

发明内容

本发明的目的是提供靶向人PKM2蛋白的先导化合物在制备PKM2激酶激活剂中的应用。其中所述的PKM2介导的疾病选自以下疾病中的至少一种：宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、血癌、黑色素瘤以及多发性骨髓瘤。

本发明在对靶标PKM2蛋白的激活剂结合口袋的研究基础上，筛选得到具有新结构实体的靶向PKM2蛋白的小分子激活剂化合物Ⅰ和化合物Ⅱ，所述的靶向PKM2蛋白的小分子抑制剂为针对PKM2与Activators(如附图1所示)结合位点的小分子结构的化合物。

本发明通过基于对接的虚拟筛选，通过Lipinski’s五规则筛选、打分函数评分、结合自由能计算、对人PKM2蛋白激酶活性的激活试验等多因素综合分析，最终得到了对PKM2有激活活性的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。

本发明的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ经实验证实，在体外有显著的激活人PKM2激酶活性,并且具有较好的癌细胞抑制活性。本发明的化合物可进一步的结构优化，制备治疗PKM2蛋白相关疾病(宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、血癌、黑色素瘤以及多发性骨髓瘤)的制剂或药物。

本发明根据筛选结果挑选化合物进行PKM2酶激活实验和细胞毒性MTT实验，结果显示，筛选的化合物中有两个具有较好的PKM2激活活性，并且具有较好的癌细胞抑制活性；所述化合物具有如下特征：

化合物Ⅰ，

英文名称：

ethyl((2-methyl-5-(4-(m-tolylamino)phthalazin-1-yl)phenyl)sulfonyl)glycinate

化合物结构：

化合物Ⅱ，

英文名称：

(R)-2-(3,4-dimethylphenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)thiazolidin-4-one

化合物结构

表1显示了筛选得到的2个化合物的理化性质和PKM2酶激活数据。

表1

表2显示了通过MTT实验测定2个化合物对人肝癌细胞系HepG2、人宫颈癌细胞系Hela和人非小细胞肺癌细胞系A549癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

表2

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的靶向人PKM2蛋白的小分子激活剂进行详细的描述。

附图说明

图1为PKM2四聚体及其与底物的作用位点图。

图2为3SZ与PKM2靶蛋白的对接模式图。

图3为化合物-Ⅰ与PKM2靶蛋白的对接模式图。

图4为化合物-Ⅱ与PKM2靶蛋白的对接模式图。

具体实施方式

1.小分子化合物Ⅰ和Ⅱ的虚拟筛选方法

(1)蛋白准备

在蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中搜寻并获得PKM2的三维结构(PDBcode:3ME3),由于PKM2为四聚体形式(附图1所示)，其结构延C-C＇界面对称，而小分子激活剂结合位点在A-A＇界面上，因此我们选取A链和B链的二聚体作为研究对象。使用Schrodinger9.4.5软件包所含的maestro中的Protein preparation wizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，然后在OPLS_2005力场下对蛋白进行能量优化和最小化。

(2)配体准备

建立对接用小分子分别来自Chembridge数据库和SPECS数据库。其中，Chembridge数据库大约包含40多万个小分子；SPECS数据库包含30多万个化合物；对上述这些数据库使用Schrodinger9.4.5软件包所含的maestro中的Ligprep模块对配体进行优化，分别利用Lipinski’s五规则，是否具有可反应基团，对化合物进行对接前筛选工作。

(3)格点生成

使用Schrodinger9.4.5中的Grid Generation以配体3SZ作为格点盒子的中心生成格点文件。

(4)基于分子对接的虚拟筛选

将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接。首先使用Schrodinger9.4.5软件包中的“虚拟筛选工作流程”(Virtual Screening Workflow,VSW),以3ME3晶体结构复合物结构为靶标，分别逐级使用Glide的三种精度(HTVS、SP、XP)的筛选方法对Chembridge数据库、SPECS数据库进行分层筛选，输出结果各自保留适宜比例。

2.PKM2酶激活实验

通过与乳酸脱氢酶偶联的酶体系测量PKM2的活性，在这个过程中PKM2产生的丙酮酸被还原为乳酸，同时NADH(还原型辅酶)被氧化为NAD+(氧化型辅酶)。反应进行之后，使用Cytation5细胞成像多模式检测器在340nm处用分光光度法测定了辅因子的氧化态。简要地，将48μL底物混合物(最终浓度，50mM Tris-HCl,pH 8.0,200mM KCl,15mM MgCl₂,0.1mMPEP,4.0mM ADP,0.2mM NADH和1单位LDH)分配到96孔板中并递送1μL化合物，FBP用作阳性对照，将DMSO用作溶剂对照。然后加入1μL PKM2酶(最终浓度，4μg)。将孔板立即置于Cytation5细胞成像多模式检测器中，在340nm每隔3-6分钟暴露30s监测NADH向NAD+的转化，在SPSS19.0中计算AC₅₀值。

3.MTT实验测定有效化合物对癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

MTT比色法方便且高效，是细胞毒性实验最常用的方法。MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,是一种黄色燃料。活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时可在细胞色素C的作用下，生成蓝色或蓝紫色不溶于水的甲臜(Formazan),其在490nm处有紫外吸收。在通常情况下，活细胞数与甲臜生成量成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数量。而死细胞中却不含琥珀酸脱氢酶，加入MTT不会有反应。MTT法检测时所需要的细胞量较少，实验步骤相对比较简单，检测周期也较短，因此，我们选用MTT法进行细胞毒性实验，具体步骤如下：

消化并收集对数期的癌细胞，使用DMEM完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为5～10×10⁴/ml。在96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，细胞浓度为5000-10000/孔，在37℃含5％二氧化碳的培养箱中培养6小时，使细胞贴壁。在实验孔组中依次加入按照预先设计的已配置好的候选化合物梯度浓度溶液，对照组中加入等体积的DMSO,并设置空白对照组，继续培养细胞48小时。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时。4小时后，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO,置于摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解。使用酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度值。

我们按照上述MTT实验步骤测定两个化合物对人肝癌细胞系HepG2、人宫颈癌细胞HeLa和人非小细胞癌细胞A549三种细胞系的毒性。最终确定实验中化合物的测试终浓度为：化合物I按浓度梯度为5μM，10μM，20μM，40μM，80μM；化合物Ⅱ按浓度20μM，40μM，60μM，80μM，120μM。扣除溶剂DMSO对癌细胞增殖的抑制作用，与空白对照组相比，按照公式(1)计算不同浓度下候选化合物对癌细胞增殖的抑制率并求取各自的IC₅₀值。

Claims

1.化合物Ⅰ和化合物Ⅱ及其药用盐在制备靶向人PKM2蛋白药物中的应用。

2.权利要求1中的两个化合物及其药用盐在制备PKM2激酶介导疾病宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中的至少一种疾病药物中的应用。

3.权利要求1中的两个化合物及其药用盐在制备PKM2激酶介导疾病肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌中的至少一种疾病药物中的应用。

4.权利要求1中的两个化合物及其药用盐在制备PKM2激酶介导疾病血癌、黑色素瘤以及多发性骨髓瘤中的至少一种疾病药物中的应用。

化合物Ⅰ

化合物Ⅱ