CN112154214B

CN112154214B - 用于核酸的合成后修饰的试剂和方法

Info

Publication number: CN112154214B
Application number: CN201980033875.2A
Authority: CN
Inventors: A·尼尔思
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2025-01-14
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: JP2021525513A; US20200017895A1; EP3802863A1; CN112154214A; WO2019229128A1; US11384376B2; JP7443251B2

Abstract

本发明涉及用于使用标记物(例如荧光染料)对核酸进行合成后修饰的组合物和方法(试剂和方案)，所述核酸获得自固相寡核苷酸合成。偶联剂在反荷阴离子存在下是基于三嗪的盐4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉鎓(DMT‑MM)。

Description

用于核酸的合成后修饰的试剂和方法

技术领域

本发明总体上涉及核酸化学领域，特别涉及使用偶联剂用标记物对核酸进行合成后修饰的方法和组合物。

背景技术

生物医学研究和重组DNA技术中采用的许多程序均依赖于标记的核苷酸或多核苷酸衍生物的使用。为了使修饰的核苷酸适合作为天然存在的核苷酸的标记形式，通常必须满足几个标准。首先，修饰的化合物必须包含独特的取代基或探针(即，通常不与核苷酸或多核苷酸缔合)。其次，探针必须与化学或生物试剂发生特异性反应，以提供灵敏的检测系统。第三，类似物必须是通常研究的核酸酶的有效底物，因为许多实际应用要求该类似物经酶促代谢(例如，该类似物必须作为核酸聚合酶的底物)。为此，不应将探针部分置于空间上或以其他方式干扰碱基正常的Watson-Crick氢键势的环位置上。在这种情况下，取代基可以产生作为聚合酶底物无活性的化合物。第四，检测系统应能够与掺入单链和双链多核苷酸中的探针取代基相互作用，以与核酸杂交方法相容。第五，不应显著改变含少量探针取代基的多核苷酸的物理和生化特性，从而无需对当前使用杂交探针的程序进行大量修改。无论是通过酶促方法还是直接化学方法引入探针，均必须满足该标准。最后，附着探针部分的连接应承受正常核苷酸和多核苷酸常规经受的所有实验条件(例如，在升高的温度下杂交时间延长、苯酚和有机溶剂萃取或电泳)。

在现代生命科学中，用荧光、发光、淬灭或磷光染料或亲和标签标记生物分子的方法已成为必不可少的方法，对于这些缀合策略，重要的是它们允许复合分子在温和条件下发生位点特异性合成后偶联。虽然N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化学已主导蛋白和核酸分子的标记，但简易性和成本方面的考虑促使人们需要应适用于小型化学合成的寡核苷酸以及较长的酶促扩增DNA链的新标记方法。

近年来，最初开发用于天然产物和肽合成的基于三嗪的化合物(Kunishima等人，Tetrahedron 55，13159-13170，1999)作为有效偶联剂而引起人们的注意，发现其在酰胺化、酯化、糖苷化和膦酰化反应中的应用。尽管4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(DMT-MM)对羧基和氨基缩合生成酰胺具有高反应活性，但其在水和乙醇中极稳定。因此，DMT-MM是其他水相容性试剂(诸如碳二亚胺EDC[N-(3-二甲基-氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺])，其可以与磷酸盐反应并在低pH下易于分解，或肽偶联剂TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸铵)的有吸引力的替代品。

发明内容

本发明提供了用于使用4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(DMT-MM)盐作为偶联剂，使用标记物(诸如荧光染料)对固相寡核苷酸合成获得的核酸进行合成后修饰的方法。DMT-MM的化学结构如图1所示。因此，一方面，本发明涉及一种用于使用标记物对核酸进行合成后修饰的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备氨基修饰的核酸分子，其包括一个或多个氨基修饰；(b)使用DMT-MM活化羧基修饰的标记物；以及(c)将氨基修饰的核酸分子与活化的羧基修饰的标记物反应以产生标记的核酸分子。在一实施例中，活化步骤涉及在反荷阴离子存在下的DMT-MM。在一个实施例中，反荷阴离子是弱配位或非配位阴离子，其中所述弱配位或非配位阴离子不是羧酸。在一个实施例中，反荷阴离子或弱配位或非配位阴离子选自由以下项组成的组：四氟硼酸根(BF₄ ^-)、六氟磷酸根(PF₆ ^-)、苯磺酸根(CH₅SO₃ ^-)、双(三氟甲磺酰基)酰亚胺((N[SO₂(CF₃)]₂)^-)、溴离子(Br^-)、10-樟脑磺酸根、氯离子(Cl^-)、碘离子(I^-)、甲基磺酸根(甲磺酸根，CH₃SO₃ ^-)、高氯酸根(ClO₄ ^-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、四氯铝酸根(AlCl₄ ^-)、四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸根(B[3，5-(CF₃)₂C₆H₃]₄ ^-)、四(六氟异丙基)铝酸根Al[OC(CF₃)₃]₄ ^-)、四(五氟苯基)硼酸根[B(C₆F₅)₄ ^-]、对甲苯磺酸根(甲苯磺酸盐，CH₃C₆H₄SO₃ ^-)、三氟甲烷磺酸根(三氟甲磺酸根，CF₃SO₃ ^-)。在一个实施例中，反荷阴离子或者弱配位或非配位阴离子是四氟硼酸根(BF₄ ^-)或六氟磷酸根(PF₆ ^-)。在一个实施例中，核酸分子是寡核苷酸。在另一实施例中，寡核苷酸的长度在3至500个核苷酸之间。在另一实施例中，寡核苷酸的5′或3′末端经氨基修饰。在另一实施例中，寡核苷酸的5′和3′末端经氨基修饰。在另一实施例中，寡核苷酸经内部氨基修饰。在又一实施例中，标记物选自由荧光染料、发光染料、淬灭染料、磷光染料和亲和标签组成的组。在一个实施例中，标记物是荧光染料。在另一实施例中，荧光染料与基于亚磷酰胺的DNA合成本质上不相容。在另一实施例中，荧光染料包含磺酸盐部分。在一个实施例中，如果寡核苷酸的长度小于100个核苷酸，则氨基修饰的寡核苷酸和活化的羧基修饰的标记物的化学计量为1∶3或在1∶3至1∶1.5之间。在另一实施例中，如果寡核苷酸的长度大于100个核苷酸，则以氨基修饰的寡核苷酸的2-20倍摩尔过量使用活化的羧基修饰的标记物。在一个实施例中，使用基于亚磷酰胺的DNA合成法合成寡核苷酸。在一个实施例中，寡核苷酸在合成后被纯化。在另一实施例中，寡核苷酸在合成后未被纯化。在一个实施例中，在寡核苷酸的合成过程中实施步骤的方法，其中寡核苷酸结合在固体支持物上。在一个实施例中，核酸分子是单链的。在另一实施例中，核酸分子是双链的。在另一实施例中，核酸分子是酶促扩增的产物。在另一实施例中，核酸分子选自由DNA、RNA、LNA、PNA、核酸类似物以及DNA、RNA、LNA、PNA和核酸类似物的混合物组成的组。

本发明还提供了一种标记的核酸，其通过上述任何方法进行标记，其中所述方法包括以下步骤：(a)制备氨基修饰的核酸分子，其包括一个或多个氨基修饰；(b)使用DMT-MM活化羧基修饰的标记物；以及(c)将氨基修饰的核酸分子与活化的羧基修饰的标记物反应以产生标记的核酸分子。在一些实施例中，标记的核酸是寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度小于100个核苷酸。在一些实施例中，标记的寡核苷酸是引物寡核苷酸。在其他实施例中，标记的寡核苷酸是探针寡核苷酸。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括通过上述任何方法进行标记的核酸，其中所述方法包括以下步骤：(a)制备氨基修饰的核酸分子，其包括一个或多个氨基修饰；(b)使用DMT-MM活化羧基修饰的标记物；以及(c)将氨基修饰的核酸分子与活化的羧基修饰的标记物反应以产生标记的核酸分子。在一些实施例中，标记的核酸是寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度小于100个核苷酸。在一些实施例中，标记的寡核苷酸是引物寡核苷酸。在其他实施例中，标记的寡核苷酸是探针寡核苷酸。

附图说明

图1显示了4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(DMT-MM)的结构及其反荷阴离子的选择实例。

图2A显示了5′标记反应的UPLC分析。固相DNA合成获得的未纯化寡核苷酸的5′端经Dy380XL或Dy395XL羧酸标记。30mer(162071)和33mer(162073，162074)寡核苷酸均包括3′-BHQ-2淬灭剂。通过比较原料(SM)和产物(P)的峰面积确定反应转化率(％)。

图2B显示了在用Dy380XL(上图)和Dy395XL(下图)标记之前和之后寡核苷酸的重叠吸收光谱。光谱提取自图2A的上两个色谱图(162071A和B)。

图3显示了使用Dy395XL(一种在有机溶剂中溶解度极低的荧光染料)进行5′标记反应的UPLC分析。反应条件与图2A中的样品编号162074B相同，但是在预活化步骤中使用50％的水。反应转化率从69.8％增加至80.4％，其通过比较原料(SM)和产物(P)的峰面积确定。

图4A显示了在两个时间点(1.0h、3.0h)5′标记反应的UPLC色谱图。未纯化的29mer寡核苷酸的5′端经Atto490LS和Chromeo^TM 494羧酸标记。两种寡核苷酸均包含3′-BHQ-2淬灭剂。通过比较原料(SM)和产物(P)的峰面积确定反应转化率(％)。

图4B显示了在用Atto490LS(上图)和Chromeo^TM 494(下图)标记之前和之后寡核苷酸的重叠吸收光谱。光谱提取自图4A中的第一和第三色谱图(162072B和A)。

图5显示了在内部位置标记DNA寡核苷酸序列的代表性实例。显示的是预纯化的使用有5′-BHQ-2淬灭剂的55mer DNA-LNA杂合寡核苷酸(161130)的UPLC色谱图，其用C343羧酸标记。在反应之前(参照)以及反应之后1.0h和3.0h取样。通过比较原料(SM)和产物(P)的峰面积确定反应转化率(％)。

图6显示了DNA寡核苷酸探针的最终UPLC分析，该探针通过使用DMT-MM与荧光染料进行标记反应并随后进行纯化而获得。DNA寡核苷酸序列的长度分别为30mer(162071)、29mer(162072)和33mer(162073，162074)，其各自均包含3′-BHQ-2淬灭剂。

图7显示了由实例2中描述的定量PCR(qPCR)实验产生的生长曲线。

图8是显示从实例2中描述的qPCR实验中推导出的阈值循环(C_t)值、荧光基线、信号幅度和实验速率常数值(K_exp)的表。

图9A显示了如实施例3中所述的使用DMT-MM的大规模标记反应的代表性实例。有3′-BHQ-2淬灭剂的33mer寡核苷酸(171742)从固相DNA合成以15μmol的规模获得，并在5′端用Dy396XL标记而未进行事先纯化。前两个小图显示了反应15min前后DNA的UPLC色谱图。原料和产物峰面积的比较表明～95％转化为产物。第三个小图显示了原料和产物的重叠吸收光谱。

图9B显示了大规模DNA标记反应的重现性。显示的是与图9A中相同的DNA序列和相同的条件下的反应的UPLC色谱图，但是荧光染料的合成批次不同。

图10A显示了纯化的DNA寡核苷酸探针的UPLC色谱图，通过使用实例3中所述的DMT-MM进行的六次独立的大规模标记反应获得。寡核苷酸序列长度为30mer(171742、171743、171744)和33mer(171744、171745、171747)，其各自均包含3′-BHQ-2淬灭剂。

图10B显示了使用实例3中所述的DMT-MM通过大规模标记反应获得的纯化的DNA寡核苷酸探针的质谱分析。

图11是显示从实例3中描述的qPCR实验中推导出的阈值循环(C_t)值、荧光基线、信号幅度和实验速率常数值(K_exp)的表。对于每次qPCR，将两个经Dy396XL标记的探针序列合并，并与靶DNA序列的两个不同区域杂交。

具体实施方式

定义

除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管基本上任何与本文描述的方法和材料相似的方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是仅描述了示例性方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。

除非上下文另外清楚指出，术语“一个”、“一种”、“所述”包含复数指代。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“烷基”是指饱和、单价、直链或支链的烃链。烷基的实例包括但不限于C₁-C₆烷基基团，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2，2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-1-丁基、3，3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基，以及更长的烷基基团，诸如庚基和辛基。烷基可以是未取代的或者被一个或两个合适的取代基取代。

如本文所用且除非另有说明，否则术语-O-烷基(或烷基-O-)是指“烷氧基”，其中烷基如上定义。烷氧基可以未被取代或者被一个或多个合适的取代基取代。烷氧基的烷基链的长度可以为例如1至6个碳原子。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“金属”是指第I族或第II族金属，包括但不限于Li⁺、Na⁺、Mg²⁺或Mn²⁺。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“连接基团”和“接头”可互换使用，并且是指能够将碱基与标记物共价结合，例如，形成将核苷、核苷酸或核酸与标记物连接的“连接”的可检测标记物的部分。接头的实例包括但不限于O、S或NH。任选地，连接基团或接头是共价键(即，标记物与碱基共价结合)。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“反荷离子”或“反荷阴离子”是指稳定且可合成获得的离子。反荷阴离子的实例如图1所示，并且包括但不限于四氟硼酸根(BF₄ ^-)、六氟磷酸根(PF₆ ^-)、苯磺酸根(CH₅SO₃ ^-)、双(三氟甲磺酰基)酰亚胺((N[SO₂(CF₃)]₂)^-)、溴离子(Br^-)、10-樟脑磺酸根、氯离子(Cl^-)、碘离子(I^-)、甲基磺酸根(甲磺酸根，CH₃SO₃ ^-)、高氯酸根(ClO₄ ^-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、四氯铝酸根(AlCl₄ ^-)、四[3，5-双(三氟甲基)苯基]硼酸根(B[3，5-(CF₃)₂C₆H₃]₄ ^-)、四(六氟异丙基)铝酸根(Al[OC(CF₃)₃]₄ ^-)、四(五氟苯基)硼酸根[B(C₆F₅)₄ ^-]、对甲苯磺酸根(甲苯磺酸根，CH₃C₆H₄SO₃ ^-)和三氟甲烷磺酸根(三氟甲磺酸根，CF₃SO₃ ^-)。反荷阴离子可以是任何弱配位或非配位阴离子。

如本文所用，术语“非配位阴离子”与术语“弱配位阴离子”可互换使用，并且是指不与阳离子配位或仅与阳离子弱配位，从而保持足够的不稳定性以被中性的Lewis碱取代。“相容的”非配位阴离子是当最初形成的复合物分解时未降解为中性的那些离子。此外，阴离子未将阴离子取代基或片段转移至阳离子，从而使其从阴离子形成阴离子的中性过渡金属化合物和中性副产物。根据本发明有用的非配位阴离子是相容的，在平衡其离子电荷为+1的意义上稳定DMT-MM阳离子，但仍保留足够的不稳定性以允许在反应过程中置换。

如本文所用，“生物相容”的物质如所用是无毒的，并且对生物分子没有实质性有害作用。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核碱基”是指腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核碱基类似物”是指能够与互补核碱基或核碱基类似物形成Watson-Crick氢键的取代或未取代的含氮母体杂芳族环。优选地，核碱基类似物是嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶。示例性核碱基类似物包括但不限于，7-脱氮杂腺嘌呤、肌苷、水粉蕈素(nebularine)、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、5-丙炔基胞苷、异胞苷、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫鸟嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、O⁶-甲基鸟嘌呤、N⁶-甲基腺嘌呤、O⁴-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、4-甲基吲哚、乙炔腺嘌呤等。其他示例性核碱基类似物可以见于Fasman，1989，Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，第385-394页，CRC Press，Boca Raton，FL，以及其中引用的参考文献。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核苷”是指由与取代或未取代的核糖的C₁′碳共价连接的核碱基组成的化合物。典型的取代核糖包括但不限于，其中一个或多个碳原子，优选为一个，最优选为3′碳原子，被一个或多个相同或不同的-R、-OR、-NRR或卤素基团取代的那些，其中R各自独立地为-H、(C₁-C₆)烷基或(C₅-C₁₄)芳基。特别优选的核糖(ribose sugar)是核糖(ribose)、2′-脱氧核糖、2′，3′-脱氧核糖、3′-卤核糖、3′-氟核糖、3′-氯核糖、3′-烷基核糖等。当核碱基为A或G时，核糖附着在核碱基的N⁹位置。当核碱基为C、T或U时，戊糖附着在核碱基的N¹位置(见，例如，Kornberg and Baker，1992，DNAReplication，第二版，Freeman and Company，San Francisco)。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核苷类似物”是指其中核碱基、核糖或两者被其各自的类似物替代的核苷。示例性核碱基类似物是先前定义的那些。示例性核糖糖类似物包括但不限于，每个环具有多于或少于五个成员的取代或未取代的呋喃糖，例如，赤藓糖和己糖以及取代或未取代的3-6个碳无环糖。典型的取代的呋喃糖酶和无环糖是其中一个或多个碳原子被一个或多个相同或不同的-R、-OR、NRR或卤素基团取代的那些，其中R各自独立为H、(C₁-C₆)烷基或(C₅-C₁₄)芳基。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核苷酸”是指其中一个或多个(通常一个)核糖碳被具有下式的磷酸酯取代的核苷：

其中a是0至4之间的整数。优选地，a是2并且磷酸酯附着至核糖的3′或5′-碳，例如，核糖3′-三磷酸、2′-脱氧核糖3′-三磷酸、核糖5′-三磷酸、2′-脱氧核糖5′-三磷酸、3′-卤核糖5′-三磷酸、3′-烷基核糖5′-三磷酸、2′，3′-二脱氧核糖5′-三磷酸等。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核苷酸衍生物”和“核苷酸类似物”可以互换使用，并且是指其中核苷酸、核糖和/或一个或多个磷酸酯被其各自的类似物取代的核苷酸。示例性核碱基和核糖类似物是先前描述的与核苷类似物缀合的那些。示例性磷酸酯类似物包括但不限于，烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸亚油酸酯、磷酸二硒代酸酯、磷代苯氨基硫代酸酯、磷代苯胺酸酯、磷代氨基甲酸酯、硼酸代磷酸酯、肽核酸(PNA)单体等，包括任何缔合的反荷剂(如存在)。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核苷或核苷酸”是指核苷和/或核苷酸和/或其混合物。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核酸”是指核苷单体单元的线性聚合物链，其通过磷酸酯核苷酸间键彼此共价连接。除非另有说明，否则本文所用的“核酸”包括任何长度的聚合物，包括寡核苷酸、核酸和本领域中通常使用的术语的核酸。因此，根据本发明的核酸的大小范围可以从几个单体单元(例如，4至40个)，至数百个单体单元，至数千个单体单元，或甚至更多个单体单元。此类核酸还可在本文中以其功能进行描述，诸如引物或探针。每当核酸由字母序列例如“ATGCCTG”表示时，应理解该序列以5′→3′方向呈现。除非另有说明，否则本文描述的序列的核酸是2′-脱氧核糖核酸。

根据本发明的“寡核苷酸”和“经修饰的寡核苷酸”可以如本领域中主要描述的并且为本领域技术人员已知的那样合成。制备具有特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，并且包括例如克隆和限制适当序列以及直接化学合成。化学合成方法可以包括，例如，Narang，S.A.，等人，Methods in Enzymology 68(1979)90-98中所描述的磷酸三酯方法，Brown，E.L.，等人，Methods in Enzymology 68(1979)109-151中所公开的磷酸二酯方法，Beaucage等人，Tetrahedron Letters 22(1981)1859和美国专利号4,415,732中所公开的亚磷酰胺方法，Garegg，等人，Chem.Scr.25(1985)280-282中所公开的H-膦酸酯方法以及美国专利号4,458,066中所公开的固体支持物方法。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“核酸类似物”是指其中至少一个核苷单体单元是“核苷类似物”和/或至少一个磷酸酯核苷酸间键是磷酸酯类似物的核酸，如上文“核苷酸类似物”中所定义。核酸类似物的优选类别是其中糖和核苷酸间键被不带电荷的中性酰胺基团取代的那些，诸如氨基甲酸吗啉代和肽核酸(“PNA”)。优选的PNA是具有N-(2-氨基乙基)甘氨酸酰胺主链的那些(参见，例如，Nielsen等人，1991，Science 254：1497-1500)。

如本文所用，术语“氨基修饰的寡核苷酸”是指经一个氨基或多个氨基修饰的能够与羧基部分(例如，标记物上的羧基部分)反应的寡核苷酸。相反，术语“羧基修饰的寡核苷酸”是指经一个羧基或多个羧基修饰的能够与氨基部分(例如，标记物上的氨基部分)反应的寡核苷酸。因此，根据本发明的目的，出于标记的目的，氨基和羧基官能团可以颠倒。

氨基修饰可包括添加包括一个或多个伯胺或仲胺的各种部分，或修饰可以包括添加一个或多个伯胺或仲胺。因此，氨基修饰可以包括通式[O]-Z_n，其中[O]是寡核苷酸；Z在每次出现时均选自NH₂、NHR、RNH₂或RNHR；n是非零整数；以及R独立地且每次出现时均选自烃基或取代的烃基基团。为了清楚起见，应当理解，当R为二价基团时，该二价R基团可以为亚烃基或取代的亚烃基基团，包括但不限于亚烷基或取代的亚烷基基团。当R是单价基团时，R可以是任何数目的烃基或取代的烃基基团，包括但不限于烷基和取代的烷基基团。当为单价基团时，R还可以是本领域中通常已知的任何数量的保护基，诸如如在有机合成中的保护基(Green，Wuts；第3版，1999，John Wiley&Sons，Inc.)中描述的那些。寡核苷酸可以在寡核苷酸内的任何位置经氨基修饰。在一些实施例中，氨基修饰在5′末端或3′末端。在其他实施例中，氨基修饰在寡核苷酸内的一个或多个内部位置。可以使用本领域通常使用的方法和试剂来制备包括氨基修饰的末端的寡核苷酸。例如，可以使用各种接头(在本领域中也称为修饰物)制备在5′末端具有氨基修饰的寡核苷酸，该接头包括但不限C₂-C₁₂氨基接头或其氨基保护的衍生物。C₂-C₁₂氨基接头或其氨基保护的衍生物的实例包括但不限于，2-[2-(4-单甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基(2-氰基乙基)-N，N-二异丙基-)亚磷酰胺(C₅ MMT氨基接头)、6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基[(2-氰己基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(C₆MMT氨基接头)、6-(三氟乙酰氨基)己基[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(C₆TFA氨基接头)、7-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)庚基[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(C₇MMT氨基接头)、12-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)十二烷基[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(C₁₂ MMT氨基接头)。在其他实施例中，寡核苷酸在3′或5′末端以外的位置包括一个或多个氨基修饰。例如，寡核苷酸可以包括直接附着或以其他方式拴接到寡核苷酸的一个或多个碱基的氨基修饰基团。可以使用本领域通常已知的任何数量的亚磷酰胺制备此类氨基修饰的寡核苷酸，包括但不限于：氨基C₆ dT(例如，5′-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰氨基己基)-3-丙烯酸亚氨基]-2′-脱氧尿苷、3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺、5′-二甲氧基三苯甲基-5-[N-((9-芴基-甲氧基羰基)-氨基己基)-3-丙烯酸-亚氨基]-2′-脱氧尿苷、3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺等)；氨基C₆ dA(例如，5′-二甲氧基三苯甲基-N⁶-苯甲酰基-N⁸-[6-(三氟乙酰氨基)-己-1-基]-8-氨基-2′-脱氧腺苷-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺)；氨基C₆ dG(例如，5′-二甲氧基三苯甲基-N2-(N，N-二甲基氨基亚甲基)-N⁸-[6-(三氟乙酰氨基)-己-1-基]-8-氨基-2′-脱氧鸟苷-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺)，氨基C₆ dC(例如，5′-二甲氧基三苯甲基-N-二甲基甲脒-5-[N-(三氟乙酰氨基己基)-3-丙烯酰亚胺]-2′-脱氧胞苷、3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺)，和/或氨基C₂dT(例如，5′-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰氨基乙基)-3-丙烯酰亚胺]-2′-脱氧尿苷、3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺)。为了清楚起见，应理解的是，在合成氨基修饰的寡核苷酸之后，可以使用本领域已知的脱保护方法任选地将包括受保护的氨基的任何亚磷酰胺(包括但不限于上述那些)进行脱保护。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“保护基”是指可逆地附着至羟基或胺部分的基团，其使得羟基或胺部分在随后的反应中不反应，并且一旦达到保护目的，就可以将其选择性地裂解以再生羟基或胺部分。保护基的实例可见于Greene，T.W.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第三版(1999)。在一个实施例中，保护基在碱性反应培养基中具有稳定性，但是可以被酸裂解。适用于本发明的碱稳定的、酸不稳定的保护基的实例包括但不限于，醚类，诸如甲基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、甲氧基乙氧基甲基、双(2氯乙氧基)甲基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢呋喃基、四氢硫呋喃基、1-乙氧基乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、叔丁基、烯丙基、苄基、邻硝基苄基、三苯甲基、α-萘基二苯甲基、对甲氧基苯基-二苯甲基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、三甲基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基；和酯类，诸如新戊酸酯、金刚烷酸酯和2，4，6-三甲基苯甲酸酯。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“标记物”是指可检测的分子或原子，其共价或非共价附着至核苷或核苷酸、核苷或核苷酸类似物、核酸、核酸类似物或终止子。在一个实施例中，核苷或核苷酸、核苷或核苷酸类似物、核酸、核酸类似物或终止子具有共价附着至核碱基的可检测标记物。术语“标记物”还可以指调节另一种可检测标记物(诸如淬灭剂)的检测的分子。如本文所用，术语“可检测的标记物”旨在不仅包括“直接”检测到的分子或标记物(例如，生色团或荧光团)，还包括“间接”检测到的部分(例如，生物素)，其通过与第二、第三或更高级的结合配偶体(例如，亲和素或链霉亲和素)结合，其中一个带有“直接”标记物。

标记物的其他实例包括荧光化合物，当暴露于适当波长的光时，该荧光化合物由于荧光而变得可检测，并通过显微镜或荧光法检测和/或测量。常用的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、γ-苯甲醛和荧光胺。可检测的标记物可以是发射荧光的金属，诸如¹⁵²Eu，或可以使用金属螯合基团，诸如二亚乙基三胺五乙酸或乙二胺四乙酸，附着至寡核苷酸的镧系元素的其他金属。

标记物可以是化学发光化合物，其存在通过测量在化学反应过程中产生的发光进行检测。有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶翁酯(theromaticacridinium ester)、咪唑、吖啶翁盐和草酸酯。同样，生物发光化合物可用于标记寡核苷酸，并通过测量发光进行检测。在这种情况下，催化蛋白增加化学发光反应的效率。生物发光标记化合物的实例包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“荧光染料”是指当暴露于光时以荧光形式发射能量的荧光化合物。“报告染料的生色团”是报告染料的原子的网络，当其暴露于光时，其发射的辐射水平可通过常规光谱学手段检测到。

绝大多数荧光染料(例如，包含磺酸盐部分的染料)与固相寡核苷酸合成过程中使用的亚磷酰胺化学本质上不相容。这主要是由于这些染料对核酸脱保护和从固相裂解过程中存在的化学条件的不稳定性所致，固相中最常使用强碱(例如氨水)或伯胺(例如甲胺)。例如，磺化的荧光染料诸如Atto490LS(ATTO-TEC，Inc.，Siegen，Germany)、CF640R、CF680R(Bio-Techne，Inc.，U.S.A.)和Dy380XL，以及Dy395XL、Dy396XL(Dyomics，GmbH，Jena，Germany)和JA286(Roche Molecular Systems，Pleasanton，CA)，与固相支持物上基于亚磷酰胺的DNA合成不相容。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“非荧光的”是指当暴露于辐射时不以常规光谱学手段可检测的水平发射辐射的化合物。

如本文所用且除非另有说明，术语“弱荧光”是指当暴露于辐射时以常规光谱学手段可检测的低水平发射辐射的化合物。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“光”是指具有使报告染料发出荧光的波长的电磁能，其中该波长可以在190-800nm的范围内。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“特异性”是指反应中使用的核酸，诸如杂交反应中使用的探针、PCR中使用的引物或组合物中存在的核酸，在正常检测环境中，仅与预期靶标杂交而不与检测样品中的其他核酸分子杂交。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“选择性”是指反应中使用的核酸，诸如杂交反应中使用的探针、PCR中使用的引物或药物制剂中存在的核酸，与正常检测环境中与检测样品中其他核酸的杂交相比，与目标靶标杂交的频率更高、更快或更持久。

如本文所用，术语“在严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件，在该条件下，彼此具有至少60％(65％、70％、75％或更高)相同的核苷酸序列通常保持彼此杂交。严格条件取决于核酸的性质(例如，长度、GC含量等)和方法本身(杂交、扩增等)。此类方法是本领域熟知的，可见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。在一个实施例中，严格的杂交条件是在约45℃下，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在约68℃下，在0.1×SSC，0.2％SDS中洗涤一或多次。在另一实施方式中，严格的杂交条件是在约45℃下，在6×SSC中杂交，然后在50-65℃下，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次(即，在50℃、55℃、60℃或65℃下洗涤一次或多次)。应当理解，本发明的核酸不包括在这些条件下仅与仅由A或T核苷酸组成的核苷酸序列杂交的核酸分子。例如，可以在以下条件下在聚合酶链反应(PCR)中将约15-40个碱基的寡核苷酸与互补序列进行严格杂交：盐浓度为50mM KCl，缓冲液浓度为10mM Tris·HCl，Mg²⁺浓度为1.5mM，pH为7-7.5，退火温度为55-60℃。聚合酶链反应(PCR)中约15-40个碱基的寡核苷酸与互补序列的中等严格杂交可以在以下条件下进行：盐浓度为50mM KCl，缓冲液浓度为10mM Tris·HCl，Mg²⁺浓度为1.5mM，pH为7-7.5，退火温度为48-54℃。聚合酶链反应(PCR)中约15-40个碱基的寡核苷酸与互补序列的低严格杂交可以在以下条件下进行：盐浓度为50mM KCl，缓冲液浓度为10mM Tris·HCl，Mg²⁺浓度为1.5mM，pH为7-7.5，退火温度为37-47℃。

如本文所用且除非另有说明，否则术语“立体异构纯的”是指包括化合物的一种立体异构体并且基本上不含该化合物的其他立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的立体异构纯组合物将基本上不含该化合物的相反对映体。具有两个手性中心的化合物的立体异构纯组合物将基本上不含该化合物的其他非对映异构体。典型的立体异构纯化合物包括大于约80重量％的化合物的立体异构体和小于约20重量％的化合物的其他立体异构体，更优选大于约90重量％的化合物的一种立体异构体和小于约10重量％的化合物的其他立体异构体，甚至更优选大于约95重量％的化合物的一种立体异构体和小于约5重量％的化合物的其他立体异构体，最优选大于约97重量％的化合物的一种立体异构体和小于约3重量％的化合物的其他立体异构体。

如本文所用且除非另有说明，否则“纯”或“基本上纯”的化合物是指包括一种化合物并且不含可检测的或大量的其他化合物的组合物。典型的基本上纯的组合物包括大于约80重量％的目标化合物和小于约20重量％的一种或多种其他化合物，更优选大于约90重量％的目标化合物和小于约10重量％的一种或多种其他化合物，甚至更优选大于约95％重量的目标化合物和小于约5％重量的一种或多种其他化合物，最优选大于约97％重量的目标化合物和少于约3重量％的一种或多种其他化合物。

核酸扩增的方法是聚合酶链式反应(PCR)，其公开于美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188以及其他参考文献。PCR通常采用两个或更多个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。用于核酸分析的引物包括能够充当在靶核酸的核酸序列内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物可以是单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性(即处理)以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方式。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它多数变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围在约90℃至约105℃，持续取决于反应特征(诸如温度和核酸长度)的一段时间。变性通常进行约5秒至9分钟。为了不使相应的聚合酶(例如，Z05 DNA聚合酶)暴露于此类高温太长时间并因此处于损失功能性酶的风险，可以优选使用短的变性步骤。

如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至其在靶核酸上的靶标序列的温度。

用于退火的温度可以是约35℃至约70℃，或约45℃至约65℃；或约50℃至约60℃，或约55℃至约58℃。退火时间可以是约10秒至约1分钟(例如约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。在此上下文中，使用不同的退火温度以增加相应测定的包容性可以是有利的。简而言之，这意味着在相对低的退火温度下，引物也可以结合具有单一错配的靶标，因此也可以扩增某些序列的变体。如果例如某种生物体具有已知或未知的遗传变体(其也应当检测)，则这也是合乎需要的。另一方面，相对高的退火温度具有提供更高特异性的优点，因为朝向更高的温度，引物结合不完全匹配的靶序列的概率连续降低。为了受益于两种现象，在本发明的一些实施例中，上述方法包括在不同温度下退火，例如首先在较低温度下退火，然后在较高温度下退火。如果例如第一孵育在55℃下进行约5个循环，则可以(预)扩增非精确匹配的靶序列。这可以随后例如在58℃下进行约45个循环，在整个实验的主要部分提供更高的特异性。这样，不丢失潜在重要的遗传变体，而保持高度特异性。

然后将反应混合物调整至聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与待分析的核酸互补的产物的温度。温度应足以从退火至核酸模板的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以使延伸产物变性脱离其互补模板(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃至80℃(例如约50℃至约70℃；约65℃))。延伸时间可以是约10秒至约5分钟，或约15秒至2分钟，或约20秒至约1分钟，或约25秒至约35秒。新近合成的链形成可以在反应的以后步骤中使用的双链分子。链分离、退火和延长步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于靶核酸的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)可以重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

可以实施PCR，其中退火和延伸的步骤在同一步骤中进行(一步PCR)，或者如上所述，在分开的步骤中进行(两步PCR)。一起进行退火和延伸，且因此在相同的物理和化学条件下进行退火和延伸，用合适的酶(诸如例如Z05 DNA聚合酶)，具有节省每个循环中额外步骤的时间并且还消除退火与延伸之间的额外温度调节的需求的优点。因此，一步PCR降低相应测定的总体复杂性。

通常，总体扩增的较短时间可以是优选的，因为至结果的时间减少并且导致可能的较早诊断。

待使用的其他核酸扩增方法包括连接酶链式反应[LCR；Wu D.Y.和Wallace R.B.，Genomics 4(1989)560-69；以及Barany F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193]；聚合酶连接酶链式反应(Barany F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO90/01069)；修复链式反应(EP 0439182 A2)，3SR(Kwoh D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08808)，以及NASBA(US 5,130,238)。此外，还有链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qb-扩增(综述参见，例如，Whelen A.C.and Persing D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson R.D.和Myers T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)。

术语“Cp值”或“交叉点”值是指允许对输入的目标核酸进行定量的值。可以根据二阶导数最大法(the second-derivative maximum method)确定Cp值(Van Luu-The等人，“Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements usingsecond derivative calculation and double correction”，BioTechniques，第38卷，第2期，2005年2月，第287-293页)。在二阶导数法中，Cp对应二阶导数曲线的第一峰。此峰对应对数线性相的开始。二阶导数法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，且仅获得一个值。初始Cp方法基于强度值的局部定义的可微分的近似值，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小的根。还可以使用拟合点法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉确定Cp。Roche提供的LightCycler仪器通过根据二阶导数最大法计算而提供Cp值。

术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率：PCR效率％＝(10^(-斜率)-1)×100，其中通过y轴上绘制的对数拷贝数和x轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完全匹配或错配的引物模板测量PCR效率。

术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“共振能量转移”是指至少两个发色团，供体发色团和受体发色团(被称为淬灭剂)之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。当受体是“黑暗”淬灭剂时，它以除光以外的形式耗散转移的能量。特定的荧光团充当供体还是受体起作用取决于FRET对的其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的淬灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗淬灭剂包括BlackHoleQuenchers^TM(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)和BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。

上文所述的方法可以基于供体荧光部分与受体荧光部分之间的FRET。代表性的供体荧光部分是荧光素，且代表性的对应的受体荧光部分包括LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5。通常，检测包括在由供体荧光部分吸收的波长处激发样品并且显现和/或测量由对应的受体荧光部分发射的波长。在根据本发明的方法中，检测之后可以定量FRET。例如，在每个循环步骤之后进行检测。例如，实时进行检测。通过使用商购可得的实时PCR仪器(例如，LightCycler^TM或)，可以以显著减少的循环时间在单个封闭的小杯中组合PCR扩增和扩增产物的检测。由于检测与扩增同时发生，所以实时PCR方法消除了操作扩增产物的需要，并且减少了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR大大减少周转时间并且是临床实验室中常规PCR技术的有吸引力的替代方案。

以下专利申请描述了如技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO97/46714和WO 97/46712。仪器是一种与利用高质量光学器件的微体积荧光计组合的快速热循环仪。此快速热循环技术使用薄玻璃小杯作为反应容器。通过交替加热的和环境的空气来控制反应室的加热和冷却。由于空气的低质量和小杯的高表面积与体积比率，可以在热室内实现非常快速的温度交换速率。

技术利用由两个荧光部分标记的单链杂交探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是淬灭剂分子。以此形式使用的典型荧光染料例如尤其是FAM、HEX、Cy5、JA270、Cyan和Cy5.5。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶核酸(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中，通过Taq或如技术人员已知的另一合适的聚合酶(诸如突变Z05聚合酶)的5′至3′外切核酸酶活性来降解。因此，荧光部分和淬灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在淬灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。

在上述两种检测形式中，发射的信号的强度可以与原始的靶核酸分子的数量相关。

最近，在美国专利公开号2018/0073056和美国专利公开号2018/0073064中描述了使用“加标签的”探针进行多重PCR测定的方法。

作为FRET的替换物，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料[例如，或(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)]，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用本公开内容的实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是淬灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与扩增产物杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

因而，根据本发明的方法是上述使用FRET的方法，其中所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。

只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。

因而，在一个实施例中，所述供体和受体荧光部分在所述探针上在彼此的不多于5个核苷酸内。在进一步的实施例中，所述受体荧光部分是淬灭剂。

如上所述，在形式中，在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶核酸(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中，通过Taq或如技术人员已知的另一合适的聚合酶(诸如突变Z05聚合酶)的5′至3′外切核酸酶活性来降解。因而，在一个实施例中，在上述的方法中，扩增采用具有5′至3′外切核酸酶活性的聚合酶。

进一步有利的是，仔细地选择由于上述方法产生的扩增子的长度。通常，相对短的扩增子增加扩增反应的效率。因而，本发明的一个方面是上述的方法，其中扩增的片段包含最多450个碱基、最多300个碱基、最多200个碱基或最多150个碱基。

“序列”是核酸的一级结构，即组成各个核酸的单个核碱基的特定排列。必须理解，术语“序列”不表示特定类型的核酸如RNA或DNA，而是适用于这两者以及其他类型的核酸，诸如例如PNA或其他。如相关领域中众所周知的，在核碱基彼此对应的场合，特别是在尿嘧啶(存在于RNA中)和胸腺嘧啶(存在于DNA中)的情况下，可以认为这些碱基在RNA与DNA序列之间是等同的。

临床上有关的核酸经常是DNA，其可以源自DNA病毒，如例如乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)等，或细菌，如例如砂眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏球菌(NG)等。在这样的情况下，为了反映靶核酸性质，使用由DNA组成的内部对照核酸可以是有利的。术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，且所有这样的名称都包括后代。因而，词语“转化体”或“转化的细胞”包括原代转化的细胞和不考虑转移的数目从该细胞衍生出的培养物。由于故意的或非故意的突变，所有后代可能在DNA含量上不是精确地相同的。在转化体的定义中包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能相同的功能的突变后代。细胞可以是原核的或真核的。

术语“控制序列”指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点、正反向调控元件(参见美国专利号4,666,848)和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

术语“可操作连接”指编码序列的定位，使得控制序列将起作用以驱动由编码序列编码的蛋白的表达。因而，与控制序列“可操作连接”的编码序列表示这样的构型：其中编码序列可以在控制序列的指导下表达。

术语“限制性内切核酸酶”和“限制性内切酶”是指通常在细菌中起源的酶，其在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。

在本文中定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“试剂溶液”是包含至少一种用于PCR目的需要或使用的试剂的任何溶液。大多数典型成分是聚合酶、核苷酸、引物、离子、镁、盐、pH缓冲剂、核苷酸三磷酸(NTP)或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、探针、荧光染料(可以连接至探针)、核酸结合剂、核酸模板。试剂还可以是另外的聚合酶反应添加剂，其对聚合酶反应或其监测具有影响。

术语“主混合物”指PCR发生所需的所有或大部分成分或因子的混合物，且在一些情况下，指除了样品和扩增子特异性的模板和引物以外的全部。商购可得的主混合物通常是浓缩的溶液。主混合物可以含有多种样品共用的所有试剂，但其也可以仅为一种样品构建。使用主混合物有助于减小由移液的体积之间的差异引起的样品之间的移液错误和变动。

术语“热稳定的聚合酶”指这样的酶：其对热稳定，耐热，并且当遭受升高的温度持续双链核酸变性所需的时间之后保留足够的活性以实现随后的引物延伸反应。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板链以5′至3′方向前进。核酸变性所需的加热条件是本领域中众所周知的，并且在美国专利号4,965,188和4,889,818中举例说明。如本文所用，热稳定的聚合酶适合用在温度循环反应(诸如PCR)中。热稳定的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。然而，非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。

“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。一旦RNA已经被逆转录为单链cDNA，其还能够复制单链或双链DNA。在本发明的一个实施例中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。

在通过DNA聚合酶的RNA分子扩增中，第一延伸反应是使用RNA模板的逆转录，并且产生DNA链。使用DNA模板的第二延伸反应产生双链DNA分子。因此，通过DNA聚合酶从RNA模板合成互补DNA链为扩增提供原料。

热稳定的DNA聚合酶可以在偶联的单酶逆转录/扩增反应中使用。在此上下文中，术语“同质”是指用于RNA靶标的逆转录和扩增的两步单一加成反应。同质意味着在逆转录(RT)步骤之后，在扩增步骤前不需要打开反应容器或在其他方面调整反应组分。在非同质RT/PCR反应中，在逆转录后且在扩增前，例如调节、添加或稀释一种或多种反应组分(诸如扩增试剂)，对此必须打开反应容器，或至少必须操作其内容物。本发明的范围均包含同质和非同质的实施例。

逆转录是RT-PCR中的基本步骤。例如，在本领域中已知RNA模板表现出形成二级结构的倾向，所述二级结构可以妨碍引物结合和/或通过相应的逆转录酶的cDNA链延伸。因而，RT反应的相对高温度就转录的效率而言是有利的。另一方面，提高孵育温度也意味着更高的特异性，即RT引物将不退火至表现出与预期的一个或多个序列的错配的序列。特别是在多个不同靶RNA的情况下，可以期望其也转录并且随后扩增和检测具有单一错配的序列，例如，在流体样品中可能存在未知的或罕见的生物体的亚株或亚种的情况下。

为了受益于上述的两个优点，即二级结构的减少和具有错配的模板的逆转录，可以在多于一个不同的温度实施RT孵育。

因此，本发明的一个方面是上文所述的方法，其中具有逆转录酶活性的聚合酶的所述孵育在30℃至75℃、或45℃至70℃、或55℃至65℃的不同温度下实施。

作为逆转录的一个进一步的重要方面，长RT步骤可以破坏可能存在于流体样品中的DNA模板。如果流体样品同时含有RNA和DNA种类，则因而有利的是保持RT步骤的持续时间尽可能短，但同时确保为随后的扩增和任选的扩增产物检测合成足够量的eDNA。

因而，本发明的一个方面是上文所述的方法，其中用于孵育具有逆转录酶活性的聚合酶的时间段是长达30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。

本发明的一个进一步方面是上文所述的方法，其中具有逆转录酶活性并且包含突变的聚合酶选自：

a)CS5 DNA聚合酶；

b)CS6 DNA聚合酶；

c)海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶；

d)水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶；

e)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶；

f)黄栖热菌(Thermus flavus)DNA聚合酶；

g)丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶；

h)栖热菌属物种sps17(Thermus sp.sps17)DNA聚合酶；

i)栖热菌属物种(Thermus sp.)Z05 DNA聚合酶；

j)那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶；

k)非洲栖热腔菌(Termosipho africanus)DNA聚合酶；

l)Thermus caldophilus DNA聚合酶。

特别适用于这些要求的是在聚合酶结构域中携带在更快的延伸速率方面增强其逆转录效率的突变的酶。

因此，在上述方法中，其中具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，该突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。

在一个实施例中，在上述方法中，具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，该突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的逆转录酶活性。

WO 2008/046612中公开了携带点突变的聚合酶，所述点突变使得它们特别有用。具体而言，待使用的聚合酶可以是在聚合酶结构域中至少包含以下基序的突变DNA聚合酶：

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N；其中Xb7是选自S或T的氨基酸，且其中Xb8是选自G、T、R、K或L的氨基酸，其中聚合酶包含3′至5′外切核酸酶活性并且具有相对于野生型DNA聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中，Xb8是选自D、E或N的氨基酸。

一个实例是来自栖热菌属物种Z05(例如在US 5,455,170中描述)的热稳定性DNA聚合酶的突变体，所述变异包含与相应的野生型酶Z05相比在聚合酶结构域中的突变。根据本发明的方法的一个实施例是突变体Z05 DNA聚合酶，其中580位的氨基酸选自由G、T、R、K和L组成的组。具有改善的逆转录效率的突变体Z05 DNA聚合酶的其他实例包括但不限于U.S.9,090,883中描述的D580G、E522G突变体；U.S.9,017,979中描述的D580G、I709K突变体；U.S.8,759,063中描述的D580G、I709K、I640F突变体；U.S.8,945,882中描述的D580G、I709K、I616M突变体；以及U.S.9,080,156中描述的D580G、I709K、Y698F突变体。

对于使用热稳定性聚合酶的逆转录，通常以盐形式包括二价阳离子(诸如Mn²⁺或Mg²⁺)，例如氯化锰(MnCl₂)、乙酸锰[Mn(OAc)₂]或硫酸锰(MnSO₄)或氯化镁(MgCl₂)，乙酸镁[Mg(OAc)₂]或硫酸镁(MgSO₄)。如果在含有50mM Tricine缓冲液的反应中包括MnCl₂，则例如MnCl₂通常以0.5-7.0mM的浓度存在；当使用各200μM的dGTP、dATP、dUTP和dCTP时，通常存在2.5-3.5mM。

“经修饰的”热稳定的聚合酶是指其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶，诸如天然或野生型形式的聚合酶或另一种修饰形式的聚合酶。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如，结构或功能结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的热稳定的聚合酶的进一步实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46EL329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。

术语“热活性的聚合酶”是指在确保特异性的引发和引物延伸所必需的高温(例如，55-80℃)有活性的酶。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”互换使用。术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换使用。除非另外指出，否则从氨基末端至羧基末端书写氨基酸序列。除非另外指出，否则从5′至3′书写单链核酸序列。除非另外指出，否则从5′至3′书写双链核酸序列的上链，且从3′至5′书写下链。

给出以下实例来举例说明本发明的实施例，如其目前优选所实行的。应当理解，所述实例是说明性的，并且除了在所附权利要求中指示以外，本发明不应视作受到限制。

实例

缩写：dATP＝2′-脱氧腺苷5′-三磷酸，dCTP＝2′-脱氧胞苷5′-三磷酸，DEPC＝焦碳酸二乙酯，dGTP＝2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸，DIPEA＝N，N-二异丙基乙胺，DMF＝N，N′-二甲基甲酰胺，DMSO＝二甲基亚砜，DMT-MM＝4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐，dUTP＝2′-脱氧尿苷5′-三磷酸，eq.＝当量，HEPBS＝N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)，HEPPS＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸，LNA＝锁定核酸，MeCN＝乙腈，NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺，NMP＝1-甲基-2-吡咯烷酮，qPCR＝实时聚合酶链反应，RT＝室温，TEAA＝乙酸三乙铵，TEAB＝碳酸氢三乙铵，Tris·HCl＝三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，UPLC-MS＝质谱联用的超高效液相色谱仪。

一般材料和方法：使用氨基修饰剂亚磷酰胺通过固相DNA合成来合成具有一级氨基修饰的DNA寡核苷酸和DNA/LNA杂合寡核苷酸。对于5′末端修饰，使用6-(三氟乙酰氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺。对于进行内部修饰，使用5′-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰氨基己基)-3-丙烯酰亚胺基]-2′-脱氧尿苷、3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺。如果BHQ-2位于5′末端，则所有DNA序列均包含3′-或5′-BHQ-2(Black Hole)和3′-磷酸。水为超高纯水，在25℃下的电阻率至少为18.2MΩcm。定量PCR(qPCR)的所有组分均用经DEPC处理的水制备。

实例1：用荧光染料标记DNA

DNA预处理：从标准固相DNA合成中获得的未纯化的DNA寡核苷酸(粗制物)被脱保护并用标准方法脱盐以除去任何痕量的残留胺。将寡核苷酸(1μmol的合成规模)冻干，并借助温水浴将其重新溶于水(100μL)中。加入氯化锂水溶液(80μL，10M)，并将混合物剧烈振摇10min。加入冰冷的乙醇(3.3mL)，并将试管轻轻倒置几次。将混合物在-20℃下冷却20min，并在预冷的离心机中在7℃下离心(2500rpm)30min。将无色上清液小心倾析并丢弃。剩余的固体用无水乙醇洗涤，在高真空下干燥，并且重新溶解在含水缓冲液(1mL，50mM，pH 8.0-9.0)。缓冲液选自硼酸盐、碳酸盐、HEPBS、HEPPS或TEAB。用UPLC分析分析量的DNA，以确定氨基修饰的靶序列的量。使用分光光度计，使用计算出的靶DNA序列在260nm处的消光系数，确定总核酸浓度。

预活化：荧光染料Atto490LS(ATTO-TEC，Inc.，Siegen，Germany)、CF640R、CF680R、(Bio-Techne，Inc.，U.S.A.)、Chromeo^TM 494(Active Motif，Inc.，Carlsbad，CA)、Coumarin343(C343)、Dy380XL，Dy395XL、Dy396XL(Dyomics GmbH，Jena，Germany)和JA286(RocheMolecular Systems，Pleasanton，CA)以羧酸获得，无需进一步操作即可使用。在玻璃小瓶中，将荧光染料(1.0当量的羧酸)溶解在干燥的有机溶剂(20mM)中。根据标记物的溶解度，溶剂选自DMSO、NMP、DMF或其与水的50％混合物。对于需要少于1mg羧酸的标记反应，使用发色团的消光系数通过吸收光谱法调节浓度。加入DIPEA(1.2当量)或另一种弱的非亲核碱，并将溶液短暂混合。在另外的反应小瓶中，称量DMT-MM的四氟硼酸盐(2.0当量)，加入羧酸溶液，然后剧烈混合直至所有固体溶解。预活化在RT下在Thermoshaker上进行15min。

标记反应：将预活化溶液(75μL，3.0 eq.)与DNA溶液(100μL，1.0 eq.伯胺)快速混合，并在RT下在Thermoshaker上进行标记反应。通过UPLC分析监测反应进程，在注入UPLC(7μL)之前，将反应混合物样品(1μL)用水(19μL)稀释。当UPLC分析表明反应完成时，将溶液用TEAA缓冲液(100mM，pH 7.0)或Tris·HCl缓冲液(50mM，pH 7.5)稀释十倍，冷冻保存直至纯化。UPLC分析的结果如图2-5所示。

纯化：使用Tris·HCl(50mM，pH 7.5)或TEAA(0.1mM，pH 7.0)和MeCN，通过反相液相色谱法纯化标记的DNA，结果如图6所示。将合并的产物级分在离心真空浓缩器上浓缩，并通过尺寸排阻色谱法脱盐。将纯化的DNA探针(0.1mM)冻干，然后重新溶解在TE缓冲液(10mMTris·HCl，1mM EDTA)中进行qPCR。

实例2：DNA探针的qPCR性能

通过直接比较使用DMT-MM试剂制备的探针和使用传统NHS酯化学方法制备的探针的qPCR性能，可以解决DNA探针的质量和功能问题。qPCR在Roche系统上进行。靶DNA序列基于阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和生殖器支原体(Mycoplasmagenitalium)病原体。

以多倍体积制备以下qPCR混合物，以进行单次重复反应。主混合物包含三辛胺缓冲液(30mM，pH 8.7)、乙酸钾(40mM)、DMSO[1.08％(v/v)]、EDTA(20μM)、20[0.02％(w/v)]、叠氮化钠[0.09％(w/v)]、dATP(0.4mM)、dCTP(0.4mM)、dGTP(0.4mM)和dUTP(0.4mM)，正向和反向引物(各1μM)和DNA探针(0.1μM)。辅因子混合物包含硫酸镁(1M)和叠氮化钠[10％(w/v)]。酶混合物包含三辛胺缓冲液(0.28M，pH 8.75)、乙酸钾(0.28M)、叠氮化钠[0.09％(w/v)]、EDTA(155μM)、DMSO[7.56％(v/v)]、甘油[7.015％(v/v)]、适体NTQ-46A(2.8μM)、聚合酶(5.4U/μL)和尿嘧啶DNA糖基化酶(1.3U/μL)。洗脱缓冲液包含Tris·HCl、牛血清白蛋白[1.25mg/mL(w/v)]和叠氮化钠[0.09％(w/v)]。

样品管中填充主混合物(10μL，片段10)、辅因子混合物(10μL，片段9)、酶混合物(10μL，片段8)和含qPCR的洗脱缓冲液(40μL，片段7)。将靶DNA添加至片段7。qPCR进行五个循环，在(95℃，3s)下变性，在(61℃，1s)下退火和在(62℃，3s)下延伸。连续循环通过(93℃，2s)下变性，在(61℃，1s)下退火，在(62℃，3s)下延伸来执行。对于每个DNA探针，在五个系统单元上运行五次重复。

结果：如图7和8所示，通过用DMT-MM原位活化标记的DNA探针显示出更高的基线荧光强度和改进的K_exp系数，表明qPCR更加可靠。总之，通过用DMT-MM原位活化制备的DNA探针显示出相当或更好的性能。

实例3：用荧光染料大规模标记DNA

DNA寡核苷酸原料从标准固相合成中以15μmol规模获得，无需纯化即可用于标记反应。

DNA预处理：将粗制的DNA寡核苷酸脱盐，冻干，然后借助温水浴将其重新溶解在水(1mL)中。加入干燥的碘化钠至终浓度为10M，确保盐完全溶解。将该混合物用乙醇(200标准液，30mL)稀释，短暂涡旋，然后在室温(RT)下保持15min。通过在RT下离心(4000rpm，5min)分离形成的沉淀。倒出上清液后，将固体沉淀物用乙醇(2×10mL)彻底洗涤，然后在高真空下干燥。对于标记反应，将DNA寡核苷酸重新溶解在TEAB缓冲液(0.1M，pH 8.5)中，并用UPLC分析分析量，以确定氨基修饰的靶序列的量。使用分光光度计，使用计算出的靶序列在260nm处的消光系数，确定总核酸浓度。

预活化：将荧光染料(1.0当量的羧酸)溶解在干DMSO(6mM)中。加入DIPEA(1.1当量)，并将溶液短暂混合。在玻璃小瓶中，称量DMT-MM四氟硼酸酯(2.0当量)并立即加入到羧酸溶液中，随后混合直至所有固体溶解。预活化在RT下在Thermoshaker上进行15min。

标记反应：将预活化溶液(3.0当量的羧酸)快速加入到锥形反应瓶中的DNA原料(1.0当量的伯胺)的搅拌溶液中。有机溶剂的浓度为40％，靶序列的最终DNA浓度在1.5至1.7mM之间，取决于粗DNA的纯度。将标记反应在RT下搅拌20min，通过UPLC分析，并用TEAA缓冲液(100mM，pH 7.0)稀释十倍以进行后续纯化。

纯化：标记的DNA用TEAA(0.1mM，pH 7.0)和MeCN进行反相液相色谱纯化。合并的产物馏分通过固相萃取(C₁₈)脱盐，冻干至干，然后重新溶解在TE缓冲液(10mM Tris·HCl，1mMEDTA)中进行qPCR。

结果：使用UPLC测量两个代表性的大规模标记反应的标记效率，每个标记反应均使用不同合成批次的荧光染料(Dy396XL)，如图9A和9B所示。用UPLC-MS测定纯化产物的纯度和完整性。从六个大规模标记反应获得的DNA探针的最终纯度分析及其测得的分子量如图10A和图10B所示。如实例2所述对标记的DNA探针进行功能分析，如图11所示。

Claims

1.一种用于使用可检测标记物对核酸进行合成后修饰的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备氨基修饰的核酸分子，其包括一个或多个氨基修饰；

(b)在反荷阴离子存在下使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(DMT-MM)阳离子活化羧基修饰的标记物，所述反荷阴离子是弱配位或非配位阴离子，其中所述弱配位或非配位阴离子不是羧酸；以及

(c)使所述氨基修饰的核酸分子与活化的羧基修饰的标记物反应以产生标记的核酸分子，

其中所述可检测标记物选自由发光染料、淬灭染料和亲和标签组成的组；并且

其中所述弱配位或非配位阴离子选自由以下项组成的组：四氟硼酸根(BF₄ ^-)、六氟磷酸根(PF₆ ^-)、苯磺酸根(C₆H₅SO₃ ^-)、双(三氟甲磺酰基)酰亚胺((N[SO₂(CF₃)]₂)^-)、溴离子(Br^-)、10-樟脑磺酸根、碘离子(I^-)、甲基磺酸根(甲磺酸根，CH₃SO₃ ^-)、高氯酸根(ClO₄ ^-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、四氯铝酸根(AlCl₄ ^-)、四[3,5-双(三氟-甲基)苯基]硼酸根(B[3,5-(CF₃)₂C₆H₃]₄ ^-)、四(六氟异丙基)铝酸根

(Al[OC(CF₃)₃]₄ ^-)、四(五氟苯基)硼酸根[B(C₆F₅)₄ ^-]、对甲苯磺酸根(甲苯磺酸根，CH₃C₆H₄SO₃ ^-)和三氟甲烷磺酸根(三氟甲磺酸根，CF₃SO₃ ^-)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述弱配位或非配位阴离子是四氟硼酸根(BF₄ ^-)或六氟磷酸根(PF₆ ^-)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述发光染料是荧光染料或磷光染料。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是寡核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端经氨基修饰。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸经内部氨基修饰。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸使用基于亚磷酰胺的DNA合成进行合成。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸在合成后被纯化。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸在合成后未被纯化。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述标记物是荧光染料。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述荧光染料与基于亚磷酰胺的DNA合成本质上不相容。

12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中所述荧光染料包含磺酸盐部分。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述步骤在寡核苷酸合成过程中进行，并且其中所述寡核苷酸结合在固体支持物上。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是酶促扩增的产物。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是单链的。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是双链的。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述核酸分子选自由DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、核酸类似物以及DNA、RNA、LNA、PNA和核酸类似物的杂合混合物组成的组。