CN112143780A - 一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法。在检测试剂管内加入试剂，将核酸扩增反应管放入核酸扩增反应管架中，盖上密封盖，卡盒主体和密封盖形成密闭空间；再向下按压密封盖形成预密封；再继续向下按压密封盖，刀片与核酸扩增反应管接触，并割破核酸扩增反应管的底部，核酸扩增反应管内液体流出至检测试剂管内并然后发生反应；光源照射观察结果确证检测；装置包括卡盒主体、核酸扩增反应管架和密封盖，卡盒主体包括外壳、刀架和刀片。本发明不改变现有的PCR扩增或是等温核酸扩增操作的任何流程，能对灰区的检测样本确证检测，灰区信号的确证灵敏度高、特异性好，整个确证过程时间短，成本低、操作简单。

Description

一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法

技术领域

本发明涉及了一种核酸扩增的检测方法，尤其是涉及一种核酸扩增后处于灰区样本的确证检测方法，可避免灰区样本重复检测，防止气溶胶污染，适用于核酸检测领域，属于医学检测、分析化学、食品检测等领域。

背景技术

核酸是携带遗传信息的载体，不同生物体的核酸序列具有特异性，因此通过核酸检测可有效鉴别和检测待测物质。当前核酸检测技术已广泛应用于食品安全检测、临床诊断、基因分型、分子克隆等各个方面。由于采集的待测样本核酸浓度较低，常需要对核酸样本进行扩增。根据扩增反应中是否需要热循环，可将常见的核酸扩增技术分为变温扩增技术和恒温扩增技术。变温扩增技术即聚合酶链式反应(PCR)。恒温扩增技术包括核酸序列依赖性扩增(NASBA),环介导的等温扩增(LAMP),滚环扩增(RCA),链置换扩增(SDA),依赖解旋酶的扩增(HAD)等。PCR需要反应的升降温过程，需要精密的控温仪器。恒温扩增不需要反复的升降温过程，但往往需要高温预变性、设计复杂引物、其他酶的辅助作用，且对模板特异性要求高等。

扩增后的核酸产物需要进行检测来判断是否为目标产物，常见的检测方法可分为终点检测法和过程检测法。终点检测法是指扩增反应结束后，对扩增后的产物进行检测，如利用凝胶电泳法观察扩增后核酸的长度，利用浊度法肉眼观察核酸的产量，利用试纸条判断目标核酸的有无等。终点法包括扩增和检测两个过程，耗时较长且检测精度较差，扩增后再开盖检测也容易形成气溶胶污染，造成后续检测的假阳性结果。实时检测法是在核酸扩增的过程中加入DNA荧光染料，如SYBR Green，SYTO 9，Evagreen，或者Taqman探针。核酸在扩增过程中染料会嵌入DNA双链。PCR扩增过程中聚合酶切割Taqman探针，Taqman探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光信号。实时检测法重现性较好，检测过程更加方便，不需扩增后再次检测，避免了扩增后开盖检测可能造成的扩增子污染。

由于实时荧光PCR灵敏度高、检测限低、重现性好，因此常用在食品安全检测、医学诊断等方面，荧光定量PCR结果常根据Ct值来判断样本是否为阳性。以新冠病毒检测为例，根据国家疾控中心推荐的判断标准，若Ct值<37，可报告为阳性，Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。因此，往往将核酸扩增中Ct值处于一定数值的样本称为灰区样本。一般人们将Ct值处于35到40之间的样本称为灰区样本。

在实际中也可以根据具体试剂盒的性能对灰区样本的判断进行调整。但总的来说，处于灰区的样本不能直接进行阴性、阳性的判定，常需要重新进行PCR扩增检测，非常耗费人力、物力、财力，因此开发一种有效检测PCR扩增后Ct值处于灰区的样本将大大缩短判定样本的时间，减轻实验人员的工作量。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，针对荧光定量PCR扩增后Ct值处于灰区的待测样本，本发明提供一种用于荧光PCR扩增、等温扩增后Ct值处于灰区的样本的一种确证方法，可避免二次核酸扩增，提高检测效率，同时，本发明也可用于以扩增时间长短来进行样本阴阳性判断的等温核酸扩增方法。

本发明的技术方案和情况是：

现有技术具体需要一种检测试剂和配套的密闭混合装置，情况介绍如下：

和核酸扩增产物相对应的特异性核酸探针主要有两大功能区。第一段功能区长度一般为20个碱基左右，并且碱基序列和核酸扩增产物中一段碱基序列互补。将核酸扩增产物称为目标序列。第二段功能区长度约为20个碱基左右，主要和基因编辑CRISPR体系中的Cas蛋白结合。第二段功能区具体碱基序列的排列由对应的Cas蛋白的序列决定。Cas蛋白为CRISPR基因编辑技术中与CRISPR识别相关的蛋白。

本发明虽然以Cas12a蛋白为例进行说明，在实际中也可用其他类似功能的Cas蛋白。

在检测过程中，Cas蛋白将首先识别核酸探针的第二功能区的碱基序列，和核酸探针结合；然后在核酸探针的引导下，Cas蛋白寻找和核酸探针第一功能区的碱基序列互补的核酸序列，即目标序列，并结合上去；结合后，Cas蛋白启动旁路切割效应，开始切割目标序列的DNA单链。

该DNA单链长度约为5-10个碱基，两端分别连有荧光标记和淬灭物。基于荧光共振转移效应，当荧光标记和淬灭物同时连接在单链的两端时，没有荧光产生。而当Cas蛋白启动旁路切割效应后，荧光标记单链被切割，两端的荧光标记和淬灭物分离，发出荧光。

本发明中具体实施采用装置并结合基因编辑的方法来对核酸扩增产物进行特异性检测，能对处于灰区的核酸扩增产物进行高灵敏度和高特异性的检测，对核酸扩增结果进行确证。

CRISPR基因编辑体系和正常PCR扩增体系及等温扩增体系不兼容。若是在PCR或等温扩增开始之前就加入上述的CRISPR检测，就会干扰正常PCR的检测。但是如果在PCR或等温扩增之后再加入CRISPR检测试剂，这样会有一个扩增后的开盖动作，也就是需要在扩增后打开PCR或等温扩增反应管，也会很容易引起扩增产物的污染，对后续的环检测造成干扰。

本发明用于解决这一问题，提出即为与之相配的具有密封功能检测装置和方法。

在不破坏核酸扩增管的前提下，将含有需要确证的核酸扩增溶液的核酸扩增管和扩增子特异性检测试剂均预先放入一密闭容器中；然后，在保持密闭容器内部和外部具有隔离的情况下，也即密闭容器内部的生物大分子没有途径离开密闭容器进入到周围环境的情况下，通过柔性变形密闭容器自身的局部或者密闭容器内的局部将核酸扩增管打开并和事先已经放入密闭容器中的扩增子特异性检测试剂混合以进行确证检测。

首先，在检测试剂管内加入扩增子特异性检测试剂，将带有需要灰区样本确证的核酸扩增反应液体的核酸扩增反应管放入核酸扩增反应管架中，盖上密封盖，卡盒主体和密封盖形成了密闭空间；

然后，再向下按压密封盖，使得密封盖上的柔性密封材料紧密密封接触外壳上端口起到预密封的作用；

再继续向下按压密封盖，柔性密封材料压缩，密封盖上的凸起压力经支撑板传递到核酸扩增反应管架的弹性材料，使得弹性材料压缩，整个核酸扩增反应管架下移，刀片与核酸扩增反应管架中的核酸扩增反应管接触，并割破核酸扩增反应管的底部，核酸扩增反应管内液体流出至检测试剂管内并然后发生反应；

最后，用所需波长的光源从入射窗处向外壳1内照射，并在观察窗观察结果：若有荧光产生，则为阳性样本；反之则为阴性样本，完成灰区样本的确证检测。

所述方法采用以下确证装置，装置包括卡盒主体、核酸扩增反应管架和密封盖；卡盒主体包括外壳、刀架和刀片，外壳底部内固定放置有检测试剂管，检测试剂管上方设有刀片，刀片通过刀架固定于外壳内；刀片上方的外壳内装有核酸扩增反应管架，核酸扩增反应管架包括支撑板、弹性材料和通孔，支撑板盖在弹性材料上面，支撑板和弹性材料的中部开设有通孔，通孔中装有核酸扩增反应管；核酸扩增反应管架上方为外壳上端口，外壳上端口安装密封盖，密封盖包括凸起、盖板和柔性密封材料；盖板底面中间固定有凸起，凸起周围一圈的盖板底面覆盖设有柔性密封材料，凸起装在外壳上端口内，柔性密封材料封盖在外壳上端口外的端面上。

所述的凸起和盖板采用硬质材料制成；所述的柔性密封材料采用柔性材料制成且厚度使得下压柔性密封材料能带动核酸扩增反应管架下移让核酸扩增反应管被刀片割破。

所述的外壳材料由透明材料组成。

所述的外壳材料由不透光材料组成，外壳的底部两侧面设有透明封闭的入射窗和观察窗，入射窗和观察窗均正对检测试剂管，入射窗外接激发光源，观察窗用于观察检测试剂管内有无荧光产生。

所述的外壳上设有透气密封孔，透气密封孔中嵌有弹性薄膜、滤芯或者硅胶柱。

本发明装置提供了一密闭空间，避免扩增产物特异性检测试剂和扩增产物混合时可能产生的扩增产物污染问题。

本发明装置最主要的特点是具有预封闭功能，先进行预封闭，然后在封闭环境下再次下压使得核酸扩增反应管破坏并流入到检测试剂的检测试剂管中。这样在该装置中，核酸扩增反应管和检测试剂相混合前，均已处于有一密闭空间，之后所有操作都不会破坏装置的密闭性，可防止扩增产物进入到本装置之外的环境空间中，从而避免PCR扩增子的污染。

本发明的技术优势：

1)和现有的核酸扩增检测方法融合度高

本方法不改变现有的PCR扩增或是等温核酸扩增操作的任何流程，只是对Ct大于35等处于灰区的检测样本进行进一步确证。

2)灰区信号的确证灵敏度高、特异性好

所用试剂所含的探针不参与核酸扩增，不会产生任何二聚体及扩增副反应。其所结合的序列，一定来自于检测样本，具有很高的特异性。

同时基因编辑功能酶具有信号放大作用，对低浓度扩增产物亦有很好的确证能力。

3)对处于灰区的样本进行直接确证，整个确证过程小于5分钟。

不但加快了检测进程，而且还避免了重新进核酸扩增时可能存在的样本不均匀性等带来的额外问题。

4)成本低、操作简单。确证试剂成本和正常核酸试剂相当。

附图说明

图1为本发明采用的装置的整体外观图；

其中：1-管壁，2a-入射窗，2b-观察窗，3-透气密封孔，12-盖板，13-柔性密封材料。

图2为本发明采用的装置的内部构造图；

其中：1-管壁，2a-入射窗，2b-观察窗，3-透气密封孔，4a,4b-刀架，5-刀片，6-检测试剂管，7-支撑板，8-弹性材料，9，10-贯穿通孔，11-凸起，12-盖板，13-柔性密封材料，14-核酸扩增反应管。

图3为装置卡盒主体部分的结构图；

其中：1-管壁，2a-入射窗，2b-观察窗，3-透气密封孔，4a,4b-刀架，5-刀片，6-检测试剂管。

图4为装置核酸扩增反应管架部分的结构图；

其中：7-支撑板，8-弹性材料，9，10-贯穿孔。

图5为装置密封盖部分的结构图；

其中：11-凸起，12-盖板，13-柔性密封材料。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图来对本发明做进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，并不用来限定本发明的实施范围。

如图1和图2所示，装置包括卡盒主体、核酸扩增反应管架和密封盖。

如图3所示，卡盒主体包括外壳1、刀架4a，4b和刀片5，外壳1底部内固定放置有检测试剂管6，检测试剂管6上方设有刀片5，刀片5通过两侧的刀架4a，4b固定于外壳1内；刀片5上方的外壳1内装有核酸扩增反应管架，如图4所示，核酸扩增反应管架包括支撑板7、弹性材料8和通孔9，10，支撑板7盖在弹性材料8上面，支撑板7和弹性材料8的中部开设有通孔9，10，通孔9，10中装有核酸扩增反应管14；核酸扩增反应管架上方为外壳1上端口，外壳1上端口安装密封盖，如图5所示，密封盖包括凸起11、盖板12和柔性密封材料13；盖板12底面中间固定有凸起11，凸起11周围一圈的盖板12底面覆盖设有柔性密封材料13，凸起11装在外壳1上端口内，柔性密封材料13封盖在外壳1上端口外的端面上。

密封盖盖板12下有凸起11部分，柔性密封材料13由海绵等组成，柔性密封材料的厚度可根据选用的柔性密封材料及弹性材料进行调整。

具体实施中，刀架4a，4b上架安装有刀片5，刀片5刀背部边缘磨尖，刀片5刀背部靠近边缘处有一定的厚度，在切割PCR反应管后尽可能地将PCR反应管撑开为两部分，保证能将核酸扩增反应管14割开并使管内液体顺利流出。刀片5正下方有一检测试剂管6，检测试剂管6容纳检测试剂。检测试剂管6由卡盒内的固定支架支撑，不妨碍激发光照射到检测试剂管6和结果观察即可。

卡盒主体内的刀座起固定刀片的作用，可用胶水等使刀片进一步固定，也可在刀片插入在刀座上后，将刀座上的小槽堵住，彻底固定刀片。刀片刀刃部分尽量地薄，且硬度较好，如可使用钨钢刀片。

凸起11和盖板12采用硬质材料制成，如聚甲基丙烯酸甲酯；柔性密封材料13采用柔性材料制成且厚度使得下压柔性密封材料13能带动核酸扩增反应管架下移让核酸扩增反应管被刀片5割破。凸起的高度可根据密封盖边缘柔性密封材料、PCR试管核酸扩增反应管架上弹性材料的可压缩程度优化。柔性密封材料的厚度可根据选用的材料而进行调整，保证密封效果即可。

一种外壳1采用硬质材料制成。外壳1材料由透明材料组成，以便于观察荧光信号。

另一种外壳1材料由不透光材料组成，如图1-图3所示，外壳1的底部两侧面设有透明封闭的入射窗2a和观察窗2b，入射窗2a和观察窗2b均正对检测试剂管6，入射窗2a外接激发光源，观察窗2b用于观察检测试剂管6内有无荧光产生。卡盒主体上入射窗和观察窗均正对检测试剂管的管身，可保证入射光照射到检测试剂管内的液体上，并保证可观察到检测试剂管的荧光。

外壳1上设有透气密封孔3，透气密封孔3中嵌有弹性薄膜、滤芯或者硅胶柱，在保持卡盒主体内外气压平衡的条件下，通过弹性薄膜、滤芯或者硅胶柱隔离卡盒的内外空间，防止气溶胶污染。

具体实施的支撑板7由硬质材料组成，如聚甲基丙烯酸甲酯。支撑板7下面附有弹性材料8，如海绵。核酸扩增反应管采用橡胶材料，检测试剂管6装有CRISPR基因编辑的扩增子特异性检测试剂。

核酸扩增反应管架中心的支撑板7和弹性材料8上有贯穿的通孔9,10，核酸扩增反应管上端边缘向外的突出部分刚好卡在支撑板7的通孔9上，核酸扩增反应管下部管身全部放入通孔9,10内并整个贯穿通孔孔道，核酸扩增反应管架底部的弹性材料可起到固定PCR反应管的作用，使PCR反应管中心正对刀刃，保证切割时PCR反应管割开的程度最大。整个核酸扩增反应管架可刚好放入卡盒主体中。

如PCR扩增后样本Ct值处于灰区，无法判定其为阳性样本或阴性样本，则启动本装置。

如图2所示，本发明方法的使用操作过程是：

首先，在检测试剂管6内加入扩增子特异性检测试剂，将带有需要灰区样本确证的核酸扩增反应液体的核酸扩增反应管放入核酸扩增反应管架中，整个核酸扩增反应管架放入卡盒中，盖上密封盖，卡盒主体和密封盖形成了密闭空间；

然后，再向下按压密封盖，使得密封盖上的柔性密封材料13紧密密封接触外壳1上端口起到预密封的作用；此时根据透气密封孔3的设置和嵌有弹性薄膜、滤芯，保持卡盒内部和外部气压平衡，利于下压操作，同时避免卡盒内的气溶胶进入到周围环境，从而可避免扩增子气溶胶的污染。

再继续向下按压密封盖，柔性密封材料13压缩，密封盖上的凸起11压力经支撑板7传递到核酸扩增反应管架的弹性材料8，使得弹性材料8压缩，整个核酸扩增反应管架下移，刀片5与核酸扩增反应管架中的核酸扩增反应管接触，并割破核酸扩增反应管的底部，核酸扩增反应管内液体流出至检测试剂管6内并然后发生反应；

最后，用所需波长的光源从入射窗2a处向外壳1内照射，并在观察窗2b观察结果：若有荧光产生，则为阳性样本；反之则为阴性样本，完成灰区样本的确证检测。

本发明灰区介于阴性和阳性之间。即是核酸扩增的Ct值介于阴性和阳性之间。

在设计操作中，可以根据需要，当密封盖下压后，使用卡扣、螺丝等装置固定其和卡盒主体的相对位置，进一步确保整个装置的密封性。

可以配置相应的荧光检测仪器对荧光信号进行读取分析。

亦可根据需要对检测试剂管的温度进行控制，以促进反应速度，提高检测效率。

本发明装置所用的材料，及装置的形状和结构主要为说明而用，而并不局限于说明书中。只要装置具有预封闭功能，在核酸扩增反应管和检测试剂相混合之前，它们已经处于有一密闭空间，而之后所有操作都不会破坏装置的密闭性，这样的装置都在本发明的保护范围之内。

利用本发明进行实际核酸检测的流程如下：

1)对于实际检测样本，进行正常荧光PCR扩增检测或等温扩增检测。

2)所得Ct值小于35(或者可以根据实际需要调整相应阳性判断依据)，判定为阳性，结束检测。对于等温核酸扩增，可根据试剂盒实际情况，设置相应的反应时间值作为判定标准。

3)所得Ct值大于35或者根据其他标准，检测结果处于灰区，则启动本发明所研发的检测方法。

a)在密闭装置中先加入相应的特异性核酸检测试剂。

b)将灰区结果所对应的核酸扩增反应管中核酸扩增仪中取出，直接放入已加好试剂的密闭装置中，启动密闭和混合过程，在密闭装置中混合核酸扩增产物和检测试剂。

c)将密闭装置放入相应的荧光检测仪器中，待1-5分钟，读取荧光结果，完成确证。

这里所要求的荧光检测仪器只需要有和荧光探针波长相配套的激发光源和发射波长相配套的观察和记录功能即可。为了促进确证检测的速度，该荧光检测仪器也可以具有加热功能。一般可将温度控制于37摄氏度即可。

本发明方法的实施例如下：

实施例1：

以新冠病毒样本的检测为例来介绍具体实施例，具体步骤如下。

1)根据中国CDC的推荐，新冠检测的基因位点可选ORF或N基因片段。以CDC推荐的ORF基因PCR检测为例。

如PCR扩增结束后，该样本的Ct值处于灰区，难以判定其为阳性样本或阴性样本，则启用本装置。首先配制扩增产物特异性检测试剂，其组分包括0.2微摩每升的和PCR扩增产物相对应的特异性核酸探针，0.2微摩每升的Cas蛋白，2.5微摩每升的荧光标记的单链探针，为了保证反应更好地进行，体系中还包括1×NEB缓冲液，1U每微升的RNA抑制剂。配制好后取25微升扩增产物特异性检测试剂加至检测试剂管中。

2)将新冠病毒PCR检测后Ct值处于灰区的PCR样本管放入PCR试管核酸扩增反应管架，使PCR样本管管口边缘刚好卡在支撑板上，整个管身容纳在贯穿孔中。将整个PCR试管核酸扩增反应管架放入卡盒主体中。

3)盖上密封盖，向下按压至最大限度。如需要，按压结束后可离心或甩动卡盒以确保PCR样本管内液体完全流至检测试剂管中，若为促进反应速度，可将整个装置放入37℃的恒温箱中。

4)用相应的荧光检测仪器在入射窗透过入射光，并在观察窗对荧光信号进行读取并分析。

实施例2：

以转基因大豆中转基因启动子CaMV335基因的检测为例来介绍具体实施例。

1)对转基因大豆启动子CaMV335进行荧光定量PCR检测。

如PCR扩增结束后，该样本的Ct值处于灰区，难以判定其是否为转基因大豆，则启用本装置。首先配制扩增产物特异性检测试剂。Cas蛋白，荧光标记的单链探针，NEB缓冲液，RNA抑制剂的使用均同实施例1。和转基因大豆PCR扩增产物相对应的特异性核酸探针浓度同实施例1。

2)将转基因大豆PCR检测后Ct值处于灰区的PCR样本管放入PCR试管核酸扩增反应管架，使PCR样本管管口边缘刚好卡在支撑板上，整个管身容纳在贯穿孔中。将整个PCR试管核酸扩增反应管架放入卡盒主体中。

其余步骤均同实施例1。

Claims (7)

1.一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：在不破坏核酸扩增管的前提下，将含有需要确证的核酸扩增溶液的核酸扩增管和扩增子特异性检测试剂均预先放入一密闭容器中；然后，在保持密闭容器内部和外部具有隔离的情况下，也即密闭容器内部的生物大分子没有途径离开密闭容器进入到周围环境的情况下，将核酸扩增管打开并和事先已经放入密闭容器中的扩增子特异性检测试剂混合以进行确证检测。

2.根据权利要求1所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：

首先，在检测试剂管(6)内加入扩增子特异性检测试剂，将带有需要灰区样本确证的核酸扩增反应液体的核酸扩增反应管放入核酸扩增反应管架中，盖上密封盖，卡盒主体和密封盖形成了密闭空间；

然后，再向下按压密封盖，使得密封盖上的柔性密封材料(13)紧密密封接触外壳(1)上端口起到预密封的作用；

再继续向下按压密封盖，柔性密封材料(13)压缩，密封盖上的凸起(11)压力经支撑板(7)传递到核酸扩增反应管架的弹性材料(8)，使得弹性材料(8)压缩，整个核酸扩增反应管架下移，刀片(5)与核酸扩增反应管架中的核酸扩增反应管接触，并割破核酸扩增反应管的底部，核酸扩增反应管内液体流出至检测试剂管(6)内并然后发生反应；

最后，用所需波长的光源从入射窗(2a)处向外壳(1)内照射，并在观察窗(2b)观察结果：若有荧光产生，则为阳性样本；反之则为阴性样本，完成灰区样本的确证检测。

3.根据权利要求2所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：方法采用以下确证装置，装置包括卡盒主体、核酸扩增反应管架和密封盖；

卡盒主体包括外壳(1)、刀架(4a，4b)和刀片(5)，外壳(1)底部内固定放置有检测试剂管(6)，检测试剂管(6)上方设有刀片(5)，刀片(5)通过刀架(4a，4b)固定于外壳(1)内；

刀片(5)上方的外壳(1)内装有核酸扩增反应管架，核酸扩增反应管架包括支撑板(7)、弹性材料(8)和通孔(9，10)，支撑板(7)盖在弹性材料(8)上面，支撑板(7)和弹性材料(8)的中部开设有通孔(9，10)，通孔(9，10)中装有核酸扩增反应管(14)；

核酸扩增反应管架上方为外壳(1)上端口，外壳(1)上端口安装密封盖，密封盖包括凸起(11)、盖板(12)和柔性密封材料(13)；盖板(12)底面中间固定有凸起(11)，凸起(11)周围一圈的盖板(12)底面覆盖设有柔性密封材料(13)，凸起(11)装在外壳(1)上端口内，柔性密封材料(13)封盖在外壳(1)上端口外的端面上。

4.根据权利要求3所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：所述的凸起(11)和盖板(12)采用硬质材料制成；所述的柔性密封材料(13)采用柔性材料制成且厚度使得下压柔性密封材料(13)能带动核酸扩增反应管架下移让核酸扩增反应管被刀片(5)割破。

5.根据权利要求3所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：所述的外壳(1)材料由透明材料组成。

6.根据权利要求3所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：所述的外壳(1)材料由不透光材料组成，外壳(1)的底部两侧面设有透明封闭的入射窗(2a)和观察窗(2b)，入射窗(2a)和观察窗(2b)均正对检测试剂管(6)，入射窗(2a)外接激发光源，观察窗(2b)用于观察检测试剂管(6)内有无荧光产生。

7.根据权利要求3所述的一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法，其特征在于：所述的外壳(1)上设有透气密封孔(3)，透气密封孔(3)中嵌有弹性薄膜、滤芯或者硅胶柱。

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