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CN112142972A - 修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用 Download PDF

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CN112142972A
CN112142972A CN202010833114.XA CN202010833114A CN112142972A CN 112142972 A CN112142972 A CN 112142972A CN 202010833114 A CN202010833114 A CN 202010833114A CN 112142972 A CN112142972 A CN 112142972A
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汤新景
范馨莉
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Peking University
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Abstract

本发明公开了修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用。本发明将Triton X‑100缀合到聚乙烯亚胺上得到PEI‑Triton‑N载体。体外细胞评价表明，该载体表现出良好的安全性及稳定性；细胞转染效果实验表明，该载体表现出高效、低毒的基因递送能力，能显著提高包括难转染的皮肤永生化细胞HaCaT在内的多种细胞的基因转染效率，是一种优秀的体外转染试剂；体内毒性实验表明，该载体没有明显的全身毒性；小鼠皮肤局部给药的基因递送实验结果表明，该载体具有良好的局部给药基因递送能力，是一种良好的局部给药基因递送载体。

Description

修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及聚乙烯亚胺衍生物，尤其涉及Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法，本发明还涉及该修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为体外转染试剂或体内核酸递送载体的应用，属于聚乙烯亚胺衍生物及其应用领域。
背景技术
核酸治疗是一种通过载体将目的基因递送到靶细胞，用于治疗癌症、艾滋病、心血管病、传染性疾病和遗传性基因突变的罕见病等各种疾病的治疗方法。核酸治疗相对于其它治疗方法有着若干优势，但实际过程中也面临不少亟待解决的问题：(1)高效、安全的递送系统；(2)外源基因表达的可控性；(3)有效的治疗基因。其中，核酸治疗的成功关键与否很大程度上取决能否将核酸分子(包括质粒、小干扰RNA等)高效、安全、无毒害的穿过质膜递送进入靶细胞。细胞内存在着大量的核酸酶，保护核酸免受核酸酶降解也是递送载体必须满足的条件之一。因此，发展高效安全的核酸递送载体是十分必要的。
目前，核酸递送载体主要分为病毒和非病毒介导的递送系统。病毒载体因其具有较高的转染及表达效率而在临床上广泛应用，但是病毒载体也逐渐暴露出不少缺陷，病毒载体可能存在严重的免疫原性，可能引发机体强烈的炎性反应及免疫反应，甚至可能因随机插入导致基因失活或重组、激活癌基因而存在潜在致瘤风险，并且其对基因的装载量也是有限的，这就极大的限制了病毒载体的应用。为了克服病毒载体的诸多不足，近年来非病毒载体得到了迅速发展，这其中就包括阳离子聚合物载体聚乙烯亚胺(PEI)。
聚乙烯亚胺是目前研究最广泛的非天然阳离子聚合物之一，其有直链和支链两种形式，结构中含有可质子化的氨基。与直链PEI相比，多分支的支链PEI能够通过静电作用浓缩并保护DNA，结合形成表面带正电荷的紧密颗粒，以便与细胞表面结合后触发内吞作用，从而将核酸分子递送到细胞质中。PEI 25kDa是评价聚合物类基因转染试剂的“金标准”。
然而，PEI的转染效率通常与其分子量、表面电势、粒径大小与分支度密切相关。市场上销售的PEI分子量范围非常广泛，从600Da到1600kDa，通常最适宜基因递送的分子量在5kDa到25kDa之间。然而，PEI的转染效率随着分子量的增大而显著增强的同时，其细胞毒性也随之增强。因此，为了平衡PEI转染效率与细胞毒性之间的关系，已经发展出了多种PEI的胺基修饰策略。常见的修饰基团包括胆固醇、磷脂和蛋白质、肽等基团。聚乳酸-羟基乙酸聚合物修饰的分子质量为22kDa的线性PEI，govalbumin修饰600Da的支链PEI，发卡结构修饰的1.8kDa的支链PEI，透明质酸修饰的25kDa的支链PEI以及胆固醇、胆烷酸、脂肪酸残基等疏水基团等，均显著提高了基因的递送效率。然而，针对一些细胞膜较厚，难消化，难转染的细胞，在电转法或病毒法效率不高且操作过程比较繁琐的情况下，需要将PEI载体进行修饰以增强难转染细胞对核酸药物的摄取效率。
发明内容
本发明的目的之一是提供Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物；
本发明的目的之二是提供制备所述Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物的方法；
本发明的目的之三是将所述的Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为核酸递送载体的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物，将不同数量的TritonX-100缀合到不同分子量的聚乙烯亚胺而得到；其中，用于修饰聚乙烯亚胺的Triton X-100的数量可以是为1至10的任意数；
所述的聚乙烯亚胺可以是直链或支链聚乙烯亚胺，其分子量范围是600Da～10kDa；优选为支链聚乙烯亚胺，其分子量优选为1.8kDa或10kDa；其中，当支链聚乙烯亚胺的分子量为1.8kDa时，用于修饰的Triton X-100的数量优选为4，6或8，最优选为6；当支链聚乙烯亚胺的分子量为10kDa时，用于修饰的Triton X-100的数量优选为4，6或8。
本发明进一步提供了一种制备所述TritonX-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物的方法，包括：(1)在Triton X-100结构上引入活泼酯基团得到Triton X-100-NHS活化酯；(2)将Triton X-100-NHS活化酯与PEI的氨基反应，分离并纯化反应产物，即得。
其中，所述Triton X-100-NHS活化酯的制备方法包括：在二氯甲烷存在下加入Triton X-100、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和三乙胺，室温搅拌反应，即得。
步骤(2)中通过控制合成过程中的Triton X-100-NHS活泼酯与PEI的投料比来控制每个PEI上修饰的Triton X-100的数目。
体外细胞评价表明，在PEI-Triton-N载体的工作浓度下，该载体表现出良好的安全性及稳定性；PEI-Triton-N/pDNA复合物细胞转染效果评价实验表明，PEI-Triton-N载体表现出高效、低毒的基因递送能力，可以显著提高包括难转染的皮肤永生化细胞HaCaT在内的多种细胞的基因转染效率，是一种优秀的体外转染试剂。PEI-Triton-N/pDNA复合物的体内毒性实验表明，Triton X-100修饰的PEI载体没有明显的全身毒性；小鼠皮肤局部给药的基因递送实验结果表明，Triton X-100修饰的PEI载体具有良好的局部给药基因递送能力，是一种良好的局部给药基因递送载体。
由此，本发明进一步提供了Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物在作为体外转染试剂或体内核酸递送载体中的应用。
本发明整体技术方案概述
本发明用不同数量的Triton X-100分别修饰分子量为1.8kDa或10kDa的PEI得到不同数量Triton X-100修饰的PEI衍生物，1HNMR对所得衍生物进行了表征及验证，确认所得为目标产物。
本发明进一步采用核磁共振波谱(NMR)，粒动态光散射(DLS)，扫描电镜(SEM)对所得PEI衍生物PEI-Triton-N及其包载核酸复合物的形态特征、理化性质进行表征。实验证明，Triton X-100修饰的PEI衍生物的粒径大小在200～300nm之间，表面稳定负载正电荷。随着Triton X-100修饰数目的增加，PEI衍生物结合DNA的能力稍有降低，但这种结合能力的下降有利于复合物进入细胞后DNA的释放。
细胞毒性实验结果表明，在转染用量范围内，PEI-Triton-N载体对细胞活力无明显作用影响。
PEI-Triton-N修饰载体的体内毒性结果表明Triton X-100修饰的PEI载体没有明显的全身毒性。
体外细胞转染实验结果证明，Triton X-100修饰的PEI载体极大地提高了难转染的永生化皮肤细胞HaCaT细胞的转染效率，特别是PEI-Triton-6和PEI-Triton-8两种衍生物，对质粒的递送效率均远大于PEI 25kDa，甚至较liposome 2000对照组的转染效率提高了1.5～2.0倍。同时，PEI-Triton-6和PEI-Triton-8两种衍生物对其他细胞，包括HEK 293T细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞，均表现出了高效的基因递送能力。
为了考察PEI-Triton-N载体介导的基因递送能力，结合前期实验结果设置了不同梯度N/P比，利用倒置荧光成像及流式细胞术评价PEI-Triton-4、PEI-Triton-6及PEI-Triton-8三种载体包载绿色荧光蛋白GFP质粒转染HaCaT细胞的能力。实验结果表明，三种细胞系中PEI-Triton-N的转染效率均显著优于PEI 25kDa。在HEK 293T细胞转染条件为N/P40时，PEI-Triton-6的转染效率是liposome 2000的1.77±0.20倍(p<0.01)。HeLa细胞中，PEI-Triton-6的转染效率是liposome 2000的1.78±0.44倍(p<0.01)，在MCF-7细胞中，PEI-Triton-6的转染效率也能达到liposome 2000的1.54±0.86倍。由此可见，转染分子量较大的质粒时，PEI-Triton-6在转染比例为N/P 40的条件下，效率最高且稳定。
小鼠皮肤局部给药基因递送结果表明，Triton X-100修饰的PEI载体提高了皮肤基因转染的能力，具有良好的局部给药基因递送能力，为局部给药的基因治疗方法提供了一种良好递送载体。
附图说明
图1 PEI-Triton-N载体的合成路线和PEI-Triton-N载体核磁1HNMR表征。
图2 PEI10-Triton-N载体的核磁1HNMR表征。
图3 PEI-Triton-N载体的理化性质表征。(A)不同N/P条件下，PEI-Triton-N载体对质粒DNA的包载能力。(B)不同肝素/质粒质量比条件下，PEI-Triton-N/pDNA复合物对质粒的释放能力。(C)PEI-Triton-6/pDNA的DNase I及血清稳定性。
图4(A)不同N/P条件下，PEI-Triton-N/GFP纳米颗粒的粒径大小和表面电势。(B)N/P30时，PEI-Triton-N/GFP的扫描电镜表征。
图5不同浓度下，PEI 1.8kDa、PEI 25kDa、PEI-Triton-6和PEI-Triton-8载体对HaCaT细胞活性的影响。
图6不同N/P转染条件下，HaCaT细胞内PEI-Triton-N载体转染GFP质粒后的荧光蛋白表达情况。以Liposome 2000和PEI 25kD(N/P 20)为对照组，倒置荧光成像及流式定量检测GFP阳性细胞数及其平均荧光强度；Scale bar＝500μm。
图7不同N/P转染条件下，HEK-293T细胞内PEI-Triton-N载体转染GFP质粒后的荧光蛋白表达情况。以Liposome 2000和PEI 25kD(N/P 20)为对照组，倒置荧光成像及流式定量检测GFP阳性细胞数及其平均荧光强度；Scale bar＝500μm。
图8不同N/P转染条件下，Hela细胞内PEI-Triton-N载体转染GFP质粒后的荧光蛋白表达情况。以Liposome 2000和PEI 25kD(N/P 20)为对照组，倒置荧光成像及流式定量检测GFP阳性细胞数及其平均荧光强度。Scale bar＝500μm。
图9不同N/P转染条件下，MCF-7细胞内PEI-Triton-N载体转染GFP质粒后的荧光蛋白表达情况。以Liposome 2000和PEI 25kD(N/P 20)为对照组，倒置荧光成像及流式定量检测GFP阳性细胞数及其平均荧光强度；Scale bar＝500μm。
图10PEI-Triton-N载体的体内毒性。Control组(PBS)、PEI 25kD对照组、PEI-Triton-6及PEI-Triton-8实验组腹腔给药后，30天内的小鼠体重变化。
图11PEI-Triton-N/mCherry复合物给药小鼠表皮组织切片图；分别设置Control组(裸质粒)、PEI 25kD/mCherry对照组、PEI-Triton-6/mCherry及PEI-Triton-8/mCherry实验组，七天内连续三次给药后，对小鼠皮肤冰冻切片进行共聚焦成像，共聚焦成像系统的参数保持恒定以进行比较；Scale bar＝20μM。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
数据处理方法
本发明中以下实施例的实验数据全部为三次以上重复结果，采用Mean±SD的表现形式和Two-Way ANOVA Test进行显著性差异分析以及P值计算，P＜0.05视为统计学存在差异显著，其中*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。
实施例1 PEI衍生物PEI-Triton-N的合成及表征
由于Triton X-100上的羟基无法与PEI发生缀合反应，为了实现PEI的Triton X-100修饰，首先在Triton X-100结构上引入活泼酯基团，活化酯进一步与PEI的氨基反应可得到Triton X-100修饰的PEI衍生物，不同数目Triton X-100修饰的PEI衍生物通过调节合成过程中的原料比获得，具体的合成路线如图1A所示。
1.PEI衍生物PEI1.8-Triton-N的合成及表征
在50ml二氯甲烷(DCM)中加入Triton X-100(6.56g，1.0eq)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3.84g，1.5eq)和三乙胺(4.16mL，3.0eq)，室温搅拌反应过夜。次日将混合物用二氯甲烷放大后，100mL水分三次萃取，合并有机相并除去溶剂，得到淡黄色油状物质，即为Triton X-100-NHS活化酯。
产率：6.84g(85.2％)。1H NMR(δ/ppm 400MHz,Chloroform-d)7.27(d,J＝9.7Hz,2H),6.88–6.79(d,2H),4.51–4.44(m,2H),4.12(dd,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.86(dd,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.84–3.73(m,2H),3.78–3.68(m,2H),3.73–3.64(m,27H),2.88–2.81(m,4H),1.71(s,2H),1.35(s,6H),0.73(s,9H).
将Triton X-100-NHS活化酯与1.8kDa PEI混合，每个PEI上修饰的Triton X-100的数目通过合成过程中的Triton X-100活泼酯:PEI投料比来控制(表1)。
表1 PEI-Triton-N(N＝4、6、8)的投料比
Figure BDA0002638704740000081
具体来讲，将上一步得到的Triton X-100活泼酯溶于无水重蒸DCM，逐滴滴加到1.8kDa PEI的无水DCM溶液中，室温震荡过夜，旋蒸除去溶剂得到黄色油状残余物。将该残余物溶于蒸馏水，并用30％甲醇溶液透析(MWCO 2000Da)24h纯化，期间换水数次去掉未反应的Triton和PEI。将透析液在冻干机上冷冻干燥得到最终产物，化学式表示为PEI-Triton-N，进一步通过1H NMR对具体组成进行确认。
反应结束后1HNMR谱确认PEI 1.8kDa与Triton X-100的成功缀合，如图1B所示，δ4.21-3.66ppm的峰对应于PEI 1.8kDa的特征峰，δ2.88–2.81ppm(m,4H)是Triton X-100-NHS活化酯的特征峰，δ7.27ppm(d,J＝10.6Hz,2H)、δ6.87–6.80ppm(d,2H)对应于Triton X-100中苯环氢的特征峰。计算Triton X-100特征峰(δ7.27ppm)与PEI 1.8kDa特征峰(δ4.21-3.66ppm)积分比例，进一步确定不同投料比反应后得到的具体N值。
2.PEI衍生物PEI10-Triton-N的合成及表征
在50ml二氯甲烷(DCM)中加入Triton X-100(6.56g，1.0eq)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3.84g，1.5eq)和三乙胺(4.16mL，3.0eq)，室温搅拌反应过夜。次日将混合物用二氯甲烷放大后，100mL水分三次萃取，合并有机相并除去溶剂，得到淡黄色油状物质，即为Triton X-100-NHS活化酯。
产率：6.84g(85.2％)。1H NMR(δ/ppm 400MHz,Chloroform-d)7.27(d,J＝9.7Hz,2H),6.88–6.79(d,2H),4.51–4.44(m,2H),4.12(dd,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.86(dd,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.84–3.73(m,2H),3.78–3.68(m,2H),3.73–3.64(m,27H),2.88–2.81(m,4H),1.71(s,2H),1.35(s,6H),0.73(s,9H).
将Triton X-100-NHS活化酯与10kDa PEI混合，每个PEI分子上修饰的Triton X-100的数目通过合成过程中的Triton X-100活泼酯:PEI投料比来控制(表2)。
表2 PEI10-Triton-N(N＝4,6,8)的投料比
Figure BDA0002638704740000091
具体来讲，将上一步得到的Triton X-100活泼酯溶于无水重蒸DCM，逐滴滴加到10kDa PEI的无水DCM溶液中，室温震荡过夜，旋蒸除去溶剂得到黄色油状残余物。将该残余物溶于蒸馏水，并用30％甲醇溶液透析(MWCO 6000Da)24h纯化，期间换水6次。将透析液在冻干机上冷冻干燥得到最终产物，化学式表示为PEI10-Triton-N，进一步通过1H NMR对具体组成进行确认(图2)。
实施例2 PEI-Triton-N/pDNA复合物的制备、表征以及性能测定
1、实验方法
1.1 PEI-Triton-N/pDNA复合物的制备
PEI-Triton-N/pDNA复合物的比例是根据PEI-Triton-N：pDNA的质量比(w/wratio)投料，最终换算为氮/磷比(N/P ratio)，将适量的PEI-Triton-N逐滴加入一定量的pDNA溶液中，涡旋10s混匀，室温孵育15min即得混合物溶液。类似地，制备了1.8kDa及25kDaPEI/pDNA复合物作为对照。
1.2 PEI-Triton-N/pDNA复合物包载、释放能力及稳定性评价
为了研究PEI-Triton-N与DNA结合能力，本实验制备不同N/P比(含200ng pDNA)的PEI-Triton-N/pDNA复合物，终体积为10μL。配置2％的琼脂糖凝胶，在Tris-醋酸盐缓冲液中80V恒压跑45min，ChemiDoc XRS凝胶成像系统显影成像。
为了研究Triton X-100修饰对DNA从复合物中释放效率的影响，用肝素钠竞争性置换复合物中的DNA。制备N/P比为7的稳定的PEI-Triton-N/pDNA复合物，向复合物体系中加入不同量的肝素(肝素/pDNA质量比0～10)，37℃孵育30min后，琼脂糖凝胶电泳验证并成像。同时，制备PEI 1.8kDa/pDNA作为对照。
本实验还对PEI-Triton-N/pDNA复合物包载pDNA的血清及DNase I稳定性做了评价，具体方法包括：制备N/P比为7时的PEI-Triton-N/pDNA复合物，在体系中加入10％血清或适量的DNase I(6U/μg DNA)分别孵育0～36h和0.5h～12h，pDNA作为对照组处理同样时间，按照与上述相同的电泳条件凝胶成像。
1.3 PEI-Triton-N/pDNA复合物粒径及电势的测定
PEI-Triton-N/pDNA复合物的粒径大小及表面电荷是评价其递送能力的两个重要指标，能够显著影响复合物在不同细胞和组织中的摄取和分布情况以及细胞毒性、生物组织相容性、被动靶向作用。复合物颗粒的粒径和表面电势对转染效率有重要影响，粒径大小可以直接影响复合物在不同组织与器官中的分布，电势会影响复合物进入细胞的难易程度及入胞后的行为。因此，本实验制备不同N/P比的PEI-Triton-N/pDNA复合物溶液，稀释1000倍后用Zetasizer Nano ZS粒度仪在25℃下测定。
1.4 PEI-Triton-N/pDNA复合物形态的表征
利用扫描电镜对PEI-Triton-N/pDNA复合物的形态进行表征，在100曲向的硅片上滴加20μl PEI-Triton-N/pDNA复合物溶液(N/P 30)使溶液在硅片上均匀散开并自然风干后，电镜观察成像。
2实验结果
2.1 PEI-Triton-N载体包载、释放能力及稳定性测定结果
在不同N/P条件下用PEI-Triton-6和PEI-Triton-8包载质粒形成复合物后，利用琼脂糖凝胶阻滞实验考察PEI-Triton-N载体与DNA的结合能力。实验结果如图3A所示，PEI25kDa在N/P比为0.5就可完全抑制DNA的迁移，而PEI1.8 kDa完全抑制DNA迁移的N/P比是2。Triton X-100的修饰对PEI 1.8kDa与DNA结合能力有一定的减弱，其中PEI-Triton-6和PEI-Triton-8分别在N/P比为4和5时完全抑制DNA迁移。PEI-Triton-N/pDNA结合能力的降低可能是PEI 1.8kDa修饰Triton X-100后，中和了部分正电荷,使其结合DNA的能力有一定程度降低。
为了研究PEI-Triton-N载体对DNA释放的影响，用富含阴离子的肝素钠聚合物竞争性置换PEI-Triton-N/pDNA复合物中的DNA。实验结果如图3B所示，PEI-Triton-6包载的复合物在肝素钠/pDNA质量比为2时开始解离释放，而PEI-Triton-8在肝素钠/pDNA质量比为1即可解离释放，相对而言，PEI 1.8kDa在肝素钠/pDNA质量比为6时才开始释放，这表明更多的Triton X-100修饰有助于DNA的释放。
PEI-Triton-N载体的DNase I和血清稳定性的实验结果如图3C所示，当用6UDNase I/μg pDNA与PEI-Triton-6/pDNA复合物分别孵育30min到12h后发现，PEI-Triton-6包载的pDNA可以稳定存在12h，而裸pDNA在2h左右就很快被DNase I降解。当使用10％血清分别孵育裸pDNA及PEI-Triton-6/pDNA 0～36h后，裸pDNA在12h时完全降解，而PEI-Triton-6包载的pDNA在36h时仍然稳定存在，这可能是由于聚合物与DNA的相互作用保护其免受血清及核酸酶降解，维持了良好的稳定性。
2.2 PEI-Triton-N/pDNA复合物形态及粒径电势大小
基于凝胶阻滞实验的结果，本实验配制了不同N/P比PEI-Triton-N/pDNA复合物，用Malvern纳米粒度电位仪检测复合物的粒径大小及ζ-电位等特性，实验结果如图4A所示，各种N/P比的PEI-Triton-N/pDNA复合物都可以有效地将DNA凝聚成纳米粒，粒径大小随着N/P比的增加而增大，这可能与Triton修饰基团上聚乙二醇聚合物有关，Triton修饰PEI载体的用量越多，纳米颗粒的粒径越大。
为了观察复合物纳米粒的实际大小，本实验使用扫描电镜对N/P比30的PEI-Triton-N/pDNA复合物形态进行了表征。结果如图4B所示，PEI-Triton-6和PEI-Triton-8可以将质粒DNA包裹凝聚成直径约为200nm左右的球形纳米粒，远小于其水化状态下测得的大小(358.23±3.18nm和326.23±17.50nm)。表面ζ-电位的结果显示，随着N/P比的增加，PEI-Triton-N/pDNA复合物的表面电荷稳定增加。
实施例3 PEI-Triton-N载体对细胞活性、细胞摄取实验
1、实验方法
1.1细胞培养
人正常皮肤角质形成细胞HaCaT细胞由北京大学第一医院林志淼课题组馈赠，HEK-293T、Hela、MCF-7细胞来自本发明人实验室，以上细胞均使用含10％胎牛血清、100IU青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液进行培养，置于恒定5％的CO2，37℃的二氧化碳培养箱中培养。待细胞生长至80％-90％左右时吸去培养基，PBS冲洗2-3次，加入适量0.25％胰酶37℃消化适当时间，加入含血清的培养基终止消化，小心吹打混匀移入1.5mLEP管，1000rpm离心5min，弃上清，重悬制成单细胞悬液，进行传代培养。
1.2 MTT法检测PEI-Triton-N对细胞活性的影响
待生长状态良好的HaCaT细胞汇合至80％左右时，胰蛋白酶消化离心，用1mL含血清的细胞培养基重悬为单细胞悬液。血球计数板计数(总细胞计数/4×104)后，以每孔8000个细胞接种到96孔培养板。每孔加入100μL细胞培养基，设6个复孔，96孔板外围加100μLPBS，避免因培养基蒸发影响结果。于37℃、5％的CO2培养箱中过夜培养至少16h。待细胞贴壁后，每孔加入含不同浓度的PEI-Triton-N溶液100μL。将96孔板放置于培养箱中培养48h后，每孔加入5mg/mL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液20μL，放入培养箱继续培养4h，小心弃去培养孔内的培养基上清液。每孔再加入150μL的DMSO溶液，振荡10min使结晶物充分溶解，在多功能酶标仪490nm激发光波长处测定各孔的光吸收值(OD值)，记录结果进行分析。
1.3细胞转染
待生长状态良好的人正常皮肤角质形成细胞HaCaT细胞汇合至70％左右时，用0.25％胰酶消化重悬，以适量浓度接种到24孔培养板，置于37℃培养箱，静置培养至细胞密度约60％。为了考察PEI-Triton-N对绿色荧光蛋白GFP的转染效果，配制不同N/P比的PEI-Triton-N/GFP复合物，在不含FBS的Opti-MEM培养基中孵育细胞5h，随后弃去培养基换成新鲜完全培养基继续孵育48h。同时，制备PEI 1.8kDa/GFP、PEI 25kDa/GFP、lipo 2000/GFP复合物作为对照，同样条件转染并孵育细胞48h。待完成细胞孵育后，用倒置荧光显微镜(Olympus IX83)观察细胞中绿色荧光蛋白GFP的表达情况，并通过流式细胞仪(BectonDickinson)定量分析绿色荧光蛋白GFP的表达量。
同样地，本实验又选择了其他三种不同的细胞系HEK-283T、Hela、MCF-7，对PEI-Triton-N的细胞转染效率做了定性及定量评价。
2.实验结果
2.1 PEI-Triton-N载体对细胞活性的影响
对PEI-Triton-N的理化性质进行了充分的表征后，选择了稳定性较好的PEI-Triton-6、PEI-Triton-8两种载体，评价其对HaCaT细胞活性的作用影响。实验中设置对照组PEI 25kDa和PEI 1.8kDa，结果如图5所示，对照组PEI 1.8kDa对HacaT细胞无明显细胞毒性作用。PEI 25kDa则显示较大的细胞毒性，与其相比，PEI-Triton-6及PEI-Triton-8的细胞毒性有一定程度的减弱。在转染浓度范围内(<10μg/ml)，PEI-Triton-6和PEI-Triton-8载体对细胞活力没有显著影响。
2.2 PEI-Triton-N/pDNA复合物细胞转染效果评价及最佳条件的筛选
为了考察PEI-Triton-N载体介导的基因递送能力，本实验结合前期实验结果设置了不同梯度N/P比，利用倒置荧光成像及流式细胞术评价PEI-Triton-4、PEI-Triton-6及PEI-Triton-8三种载体包载绿色荧光蛋白GFP质粒转染HaCaT细胞的能力。考虑到细胞毒性较大，选择PEI 25kD N/P比20作为对照，liposome 2000转染浓度为1μg/μl。实验结果如图6所示，PEI-Triton-4与PEI 25k处理组中GFP荧光蛋白的表达量极低，而对比PEI-Triton-6及PEI-Triton-8两种复合物，GFP荧光蛋白的表达量随着N/P比的升高而显著增强，当N/P比达到30～40时，转染效率明显优于liposome 2000，特别是N/P 40时，PEI-Triton-6与PEI-Triton-8处理组GFP基因表达水平分别是liposome 2000的1.49±0.18倍(p<0.01)、1.95±0.28倍(p<0.001)。同样地，本实验又选择了人胚胎肾细胞HEK 293T、人宫颈癌细胞Hela以及人乳腺癌细胞MCF-7，分别评价PEI-Triton-N载体的转染效率。实验结果分别如图7、图8和图9所示，三种细胞系中PEI-Triton-N的转染效率均显著优于PEI 25kDa。在HEK 293T细胞转染条件为N/P 40时，PEI-Triton-6的转染效率是liposome 2000的1.77±0.20倍(p<0.01)。Hela细胞中，PEI-Triton-6的转染效率是liposome 2000的1.78±0.44倍(p<0.01)，在MCF-7细胞中，PEI-Triton-6的转染效率也能达到liposome 2000的1.54±0.86倍。
综上所述实验结果可见，转染分子量较大的质粒时，PEI-Triton-6在转染比例为N/P 40的条件下，效率最高且稳定。
实施例4.PEI-Triton-N/pDNA复合物的体内毒性实验
1实验方法
为了考察PEI-Triton-N修饰载体的体内毒性情况，将周龄为6-8周的Balb/c小鼠随机分为四组(每组3只)，设置空白对照组，PEI 25kDa对照组，PEI-Triton-6和PEI-Triton-8组，分别腹腔注射400μL PBS和8mg/kg PEI 25kDa及8mg/kg PEI-Triton-6和PEI-Triton-8。30天内连续观察并监测记录每组小鼠的生理行为及体重变化。
2实验结果
实验结果如图10所示，PEI 25kDa给药组小鼠表现出明显的嗜睡现象，观察期间内体重逐渐下降并最终死亡。与空白对照组的结果一致，30天内PEI-Triton-6给药组和PEI-Triton-8给药组的小鼠生理活动行为正常，小鼠体重没有显著波动，表明Triton X-100修饰的PEI载体没有明显的全身毒性。
实施例5 PEI-Triton-N/pDNA复合物的局部给药基因递送效率实验
1.实验方法
为了考察PEI-Triton-N修饰载体针对小鼠皮肤的质粒转染情况，将周龄6-8周的Balb/c小鼠背部皮肤做脱毛处理，使用水合氯醛(4％)麻醉Balb/c小鼠后，用
Figure BDA0002638704740000151
胶将截面积为1.8cm2的圆柱体黏附在裸露的小鼠背部皮肤表面。制备分别含60μg mCherry质粒的PEI-Triton-6/mCherry(N/P 40)、PEI-Triton-8/mCherry(N/P 40)和PEI25kDa/mCherry复合物(N/P 20)加入到附着的圆柱体内，均匀分布于整个皮肤暴露区域。将复合物溶液孵育皮肤6小时后，移去圆柱体，每两天给药一次，3次给药后处死小鼠，剥离皮肤制备冰冻切片，共聚焦成像观察荧光mCherry的蛋白表达量。
2.实验结果
实验结果如图11所示，在小鼠表皮局部给药7天后，相较于PEI-Triton-8给药组和PEI 25kDa对照组的荧光蛋白表达量，PEI-Triton-6处理组的小鼠表皮层和真皮层内荧光蛋白mCherry的表达量显著增强，证明PEI-Triton-6/pDNA复合物具有良好的局部给药基因递送能力。

Claims (10)

1.一种Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述聚乙烯亚胺衍生物由不同数量的Triton X-100缀合到不同分子量的聚乙烯亚胺上而得到。
2.按照权利要求1所述的Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，用于修饰聚乙烯亚胺的Triton X-100的数量是1至10的任意数。
3.按照权利要求1所述的Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺的分子量是600Da～10kDa，所述的聚乙烯亚胺是直链或支链聚乙烯亚胺。
4.按照权利要求1所述的Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺是支链聚乙烯亚胺；其中，当支链聚乙烯亚胺的分子量为1.8kDa或10kDa时，用于修饰的Triton X-100的数量为4，6或8；优选的，支链聚乙烯亚胺的分子量为1.8kDa，用于修饰的Triton X-100的数量为6。
5.一种制备权利要求1-4任何一项所述Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物的方法，其特征在于，包括：(1)在Triton X-100结构上引入活泼酯基团得到Triton X-100-NHS活化酯；(2)将Triton X-100-NHS活化酯与PEI的氨基进行反应，即得。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述Triton X-100-NHS活化酯的制备方法包括：在二氯甲烷存在下加入Triton X-100、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和三乙胺，室温搅拌反应，即得。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中通过控制合成过程中的TritonX-100-NHS活泼酯与PEI的投料比来控制每个PEI上修饰的Triton X-100的数目。
8.由权利要求1-4任何一项所述Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物包载核酸所得到的复合物。
9.权利要求8所述的复合物作为体外转染试剂或体内核酸递送载体的应用。
10.权利要求1-4任何一项所述Triton X-100修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为体外转染试剂或体内核酸递送载体的应用。
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