CN1121223C - 含有神经鞘糖脂的冷冻干燥组合物及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提高一种水溶性低的神经鞘糖脂的溶解性，为此，制备一种由其组成的冷冻干燥组合物。这种冷冻干燥组合物包含一种通式(A)代表的α-糖基神经酰胺或其盐，一种聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯，和一种二糖或单糖，且较好进一步含有脱氧胆酸或组氨酸。在所述通式上，R1是H或OH；X是7～25的整数；R2是-CH2(CH2)yCH3，-CH(OH)(CH2)yCH3，-CH(OH)(CH2)yCH(CH3)2，-CH＝CH(CH2)yCH3，或-CH(OH)(CH2)yCH(CH3)CH2CH3(式中Y是5～17的整数)；R3和R4之一是H，且另一个是H、OH、NH2、或NHCOCH3；R5和R6之一是H，且另一个是OH；R7和R8之一是H，且另一个是OH；且R9是H、CH3、或CH2OH。
Description
技术领域
本发明涉及含有神经鞘糖脂的冷冻干燥组合物，更详细地说，涉及提高了本来对水溶解性低或者难溶性的神经鞘糖脂在水中的溶解性的、含有神经鞘糖脂的冷冻干燥组合物及其制造方法。
背景技术
α-神经鞘糖脂在生物体内显示各种有用的生理活性，因而可用于抗肿瘤剂、免疫赋活性、骨髓细胞增殖促进剂等许多医药中。
神经鞘糖脂中，糖部分由单糖类组成的神经鞘糖脂对水溶解性低或者难溶性者居多。为了提高这样的糖脂的溶解性，已经有人探讨了种种方法，但不能得到令人满意的溶解性，而且即使曾经溶解也会在保存时析出沉淀，有溶解性随着时间推移而下降这样的问题。
发明公开
鉴于以上情况，本发明的目的是要提供一种含有糖部分由单糖类构成的溶解性低或难溶性的神经鞘糖脂、长期保存后也能维持高再溶解性的冷冻干燥组合物。
本发明者等人发现，当在有糖部分由单糖类组成的α-糖基键结构、对水溶解性低的神经鞘糖脂(α-糖基神经酰胺)中配入聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖、甘露糖醇或葡萄糖、或者进一步配入脱氧胆酸钠或组氨酸，并在溶剂中溶解之后冷冻干燥时，即使在长期保存后其再溶解性也是极高的，终于完成以这一发现为基础的本发明。
即，本发明涉及一种冷冻干燥组合物，其中包含作为下式(A)所示活性成分的α-糖基神经酰胺或其盐、聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖、甘露糖醇或葡萄糖，或者进一步包含脱氧胆酸钠或组氨酸：〔式中，R1～R9和X分别表示后述的特定基团和特定范围的整数〕。
此外，本发明也涉及冷冻干燥组合物的制造方法，其特征在于把上述组合物的配合成分溶解在加温的水基溶剂中，冷却后进行冷冻干燥步骤。
附图简单说明
第1图是一幅显示本发明中使用的α-糖基神经酰胺化合物的代表例(KRN 7000)的合成反应路线的说明图。
反应路线中，pyr表示吡啶，BrPPh3(CH2)12CH3表示溴化十三烷三苯鏻，n-BuLi表示正丁基锂，MsCl表示甲磺酰氯，BnBr表示苄基溴，1-PrOH表示丙醇。
第2图是一幅显示图1后续的合成反应路线的说明图。
反应路线中，WSC-HCl是1-乙基-3-(3′-二甲胺基丙基)碳化二亚胺·盐酸盐，MS4A是分子筛4A，Hex4NBr是溴化四己铵。
发明实施的最佳形态
〔式(A)所示的化合物〕
本发明组合物中使用的化合物，如上所述，是有式(A)所示α-糖基神经酰胺结构的化合物，上述式(A)中的X和R1～R9有如下所述的定义：〔式中，R1是H或OH；
X是7～25中任何一个整数；
R2是下列(a)～(e)定义的取代基中任何一个(其中，Y是5～17中任何一个整数)，
(a)-CH2(CH2)YCH3
(b)-CH(OH)(CH2)YCH3
(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2
(d)-CH＝CH(CH2)YCH3
(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；R3和R4中任意一个是H，另一个是H、OH、NH2或NHCOCH3；R5和R6中任意一个是H，另一个是OH；R7和R8中任意一个是H，另一个是OH；R9是H、CH3、或CH2OH〕。上述化合物的较好形态是下式(A′)所示的α-糖基神经酰胺：〔式中，R1、R2和X同上述定义，
R3～R9是下列i)～v)定义的取代基：
i)R3、R6和R8是H时，
R4是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R7是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
ii)R3、R6和R7是H时，
R4是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
iii)R4、R6和R7是H时，
R3是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
iv)R4、R5和R7是H时，
R3、R6和R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
v)R3、R5和R7是H时，
R4、R6和R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH〕。
本发明中可以使用的较好的α-糖基神经酰胺化合物，是式(A)的糖部分中R3、R6和R8表示H，R4、R5和R7表示OH，R9表示CH2OH的化合物，而且是神经酰胺部分中R2表示有OH的取代基(b)、(c)或(e)、尤其(b)的化合物。在上述的较好化合物中，神经酰胺部分的R1是H、R2是(b)的化合物是更好的。进而，神经酰胺部分的烷基中亚甲基的X较好的是11～25的整数、更好的是21～25，基团R2中的Y较好的是9～17的整数、更好的是11～15。
本发明中可以使用的α-糖基神经酰胺中，(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖氧基)-2-二十六烷酰胺基-3，4-十八烷二醇是特别好的化合物，这种化合物以下称KRN7000(其结构式请参照图2)。
式(A)所示的化合物可以是酸加成盐。本发明中可以使用的化合物也包含这些加成盐。
作为能形成酸加成盐的酸，可以列举诸如无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或有机酸，例如乙酸、丙酸、马来酸、油酸、棕榈酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸、谷氨酸、泛酸、月桂基磺酸、甲磺酸和邻苯二甲酸等。
要说明的是，在酸加成盐作为医药使用的情况下，当然必须是医药上可接受的。
本发明中可以使用的活性成分化合物，可以用适合于合成的α-糖基神经酰胺之目的的任意方法制备。
上述α-糖基神经酰胺化合物中有一部分连同其合成方法一起记载于WO93/5055号、WO94/2168号和WO94/9020号等各公报中，按照这些方法就可以制备。而且，作为较好的方法，可以列举后述实施例中化合物KRN7000的合成方法，即以来苏糖为起始物质合成神经酰胺部分，并在这个神经酰胺上结合糖部分的半乳糖的方法(细节请参照后述实施例和图1～2)，按照这种方法就可以合成目的化合物。此外，关于α-糖基神经酰胺的一般合成方法，可以参照诸如J.Med.Chem.，38，2176(1995)。
〔冷冻干燥组合物及其制造方法〕
按照本发明的冷冻干燥组合物可以用于以水、缓冲液等水基介质为溶剂的注射用和细胞医疗用培养基等用途。
作为本发明组合物中可以使用的活性成分的α-糖基神经酰胺化合物有种种生理活性，而且本发明组合物可以作为抗肿瘤剂、免疫赋活剂(参照WO93/5055号公报)、骨髓细胞增殖促进剂(参照特开昭WO94/2168号公报)、自免疫疾病治疗剂和末梢血干细胞增加剂等医药用于注射用(含点滴用)。
此外，按照本发明的冷冻干燥组合物也可以用作细胞医疗用，例如在抗原提示细胞或癌细胞等离体培养、活化后再返回生物体内的抗原提示细胞疗法(Yamaguchi，Y.等，Oncol，Res.，8，399(1997))或肿瘤疗法等中用作细胞大容量悬浮液或培养介质用。
按照本发明的冷冻干燥组合物配合了上述α-糖基神经酰胺或其盐、聚氧缩水山梨糖醇脂肪酸酯和二糖或单糖(含并用)，冷冻干燥后和长期保存后对水的溶解性优异。而且在上述配合中，通过进一步配合脱氧胆酸钠或组氨酸(含并用)，还可以进一步提高长期保存后的再溶解性。
作为聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯，可以列举吐温-20(缩聚山梨糖醇油酸酯二十)、吐温-40、吐温-60、吐温-80等，较好的是吐温-20。其配合量，相对于活性化合物1重量份而言，较好的是10～1000重量份，更好的是20～100重量份。作为二糖，可以列举蔗糖、乳糖、麦芽糖等，特别好的是蔗糖；而作为单糖，可以列举葡萄糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇等，特别是葡萄糖或甘露糖醇。这些糖的配合量(在并用的情况下为总量)，相对于活性化合物1重量份而言，较好的是100～10000重量份，更好的是200～2000重量份。此外，脱氧胆酸钠和组氨酸的配合量(在并用的情况下为总量)较好的是10～1000重量份，更好的是20～400重量份。
关于配合成分，除上述基本成分外，必要时还可以适量添加溶解助剂(例如聚氧乙烯硬化蓖麻油60)、缓冲剂(例如磷酸盐)、等渗剂(例如氯化钠)、无痛剂(例如苄醇)等添加剂。
为了制备按照本发明的冷冻干燥组合物，基本上，可以通过使上述各配合成分在适当溶剂(例如蒸馏水等)中加热混合搅拌溶解后冷却再进行冷冻干燥。即，按照本发明的冷冻干燥组合物的制备方法，其特征在于使上述配合成分在加温的水基溶剂中溶解、冷却后，进行冷冻干燥步骤。
作为水基溶剂，可以列举蒸馏水、生理食盐水、缓冲液等。
在上述制备方法中，配合成分通常在溶剂中在65～90℃、较好在70～85℃加温溶解。若加温温度过高，则配合成分的保存稳定性下降，而若过低，则成分溶解困难。所得到的溶液通常以0.5℃～1.0℃/min以上的降温速度冷却，较好以1.5℃/min以上、更好地以2.0℃/min以上，最好地以4.0℃/min以上的速度急速冷却。溶液的冷却通常用恒温循环装置进行，直至达到50～40℃以下、较好达到20～30℃左右的温度，然后溶液用过滤器过滤，进行冷冻干燥步骤。冷却时间越短，长期保存后的再溶解性就越稳定。
冷冻干燥步骤可以按照通常的方法，用安瓿或药瓶等容器和冷冻干燥装置进行，但较好的是在冷冻温度为-20℃以下、真空度为0.1Torr以下的条件下进行。
像上述这样制备的本发明组合物，在注射用用途上使用时，可以再溶解于适量的注射用溶剂、通常蒸馏水、生理食盐水等中(通常使α-糖基神经酰胺的浓度为0.1～1000μg/ml)，作为注射用药剂对生物体给药。
本发明组合物可以通过符合目的的任意给药途径给药，具体地说，在动物的情况下可以用经腹腔内给药、经皮下给药、经静脉或动脉等血管内给药、局部给药等方法给药，而在人的情况下可以用经静脉内给药、经动脉内给药、局部给药、经腹腔或胸腔内给药、经皮下给药、经肌肉内给药等方法给药。
本发明组合物作为注射用的给药量要考虑各种具体情况，决定连续给药或间歇式给药时不超过一定量的总给药量。具体的给药量当然要因给药方法、患者等的状况例如年龄、体重、性别、敏感性、饮食(饵料)供给时间、并用药剂、患者或其疾病的程度而异，而且在一定条件下的适用量和给药次数必须遵照上述指导原则由专门医生的适量决定试验确定。本发明组合物中有效成分的活性表达所需的给药量，诸如在经静脉内给药的情况下对成人来说，是每日0.001～10mg左右。
此外，在非注射用用途上，例如在抗原提示细胞疗法、肿瘤疗法等中，在以水基介质(蒸馏水、生理食盐水、缓冲液等)为溶剂的培养基中再溶解本发明组合物，在此溶液中培养抗原提示细胞(例如树状细胞等)或旨在增强免疫原性的细胞(例如肿瘤细胞等)，从而使细胞与本发明组合物发生离体接触，增强其抗原提示活性或免疫原性。例如，向细胞培养基中添加按照本发明的组合物，使α-糖基神经酰胺的最终浓度达到0.1～10000ng/ml(较好的是10～1000ng/ml)，将该细胞培养12小时～14天，就能增强细胞的抗原提示活性或免疫原性。提高了抗原提示活性或免疫原性的细胞，可以采用常法，以注射剂、悬浮剂、乳液剂等形态，经通常各种给药途径(静脉、动脉、皮下给药等)给药。
实施例
以下显示本发明的实施例，但本发明不限于此。
作为本发明的冷冻干燥组合物中使用的活性成分的α-糖基神经酰胺，如上所述，有抗肿瘤活性、免疫赋活活性、骨髓细胞增殖促进活性或抗原提示活性增强作用等种种生理活性。
〔化合物制备例〕
α-糖基神经酰胺的制备
以下显示作为α-糖基神经酰胺的代表例的KRN7000的合成例(请参照图1和2)。
(1)化合物G1的合成
向D-来苏糖(200g，1.33mol)在用氯化钙干燥的丙酮(3.0L)中的溶液中添加硫酸(0.5mL)，在室温搅拌18小时。加分子筛4A的粉末(100g)，使反应液中和后，用硅藻土过滤，残渣用丙酮洗涤。合并滤液与洗液，减压浓缩，得到G1的粗生成物。产率240g(95％)。不进行进一步精制就用于下一个步骤。分析用样品以己烷∶丙酮(9∶1)为洗脱溶剂进行硅胶柱色谱法精制。 mp76-78℃；FDMS m/z 191(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.45(1H，d，J＝1.8Hz)，4.83(1H，dd，J＝3.7，5.5Hz)，4.64(1H，d，J＝6.1Hz)，4.27-4.30(1H，m)，3.90-3.99(2H，m)，1.48(3H，s)，1.32(3H，s)。
(2)化合物G2的合成
向化合物G1(239g，约1.26mmol)的二氯甲烷溶液(168mL)中添加吡啶(10ml)、三苯甲基氯(39.0g)，在32℃搅拌4小时。滴加乙醇(8mL)，在室温搅拌2小时。用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、食盐水洗涤后，减压浓缩。残渣溶解于乙酸乙酯中，冷却到0℃、结晶。产率501g(从D-来苏糖计算为87％)。mp174-176℃；FDMS m/z 432M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.49(15H，m)，5.38(1H，d，J＝2.4Hz)，4.75(1H，dd，J＝3.7，6.1Hz)，4.59(1H，d，J＝6.1Hz)，4.31-4.35(1H，m)，3.43(1H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.39(1H，da，J＝6.7，9.8Hz)，1. 29(3H，s)，1.28(3H，s)。
(3)化合物G3的合成
向溴化十三烷三苯鏻(962g，1.16mol；是用1-溴十三烷、三苯鏻在140℃加热4.5小时制备的)的THF溶液(1500mL)中，在氩气氛围下，在0℃滴加正丁基锂的2.5M己烷溶液(462mL；366mmol)。滴加结束后搅拌15分钟，滴加化合物G2(250g，579mmol)的THF溶液(450mL)。使温度边徐徐上升边搅拌18小时，直至到达室温。反应液减压浓缩，向残渣中添加己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3，100mL)的混合液，用饱和氯化铵水溶液洗涤。水层用己烷(500ml)萃取，合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，得到G3的粗生成物。不进行进一步精制就用于下一个步骤。产率339g(98％)。分析用样品以己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱溶剂进行硅胶柱色谱法精制。
FDMS m/z 598M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.45(15H，m)，5.48-5.59(2H，m)，4.91(0.7H，t，J＝7.3Hz)，4.44(0.3H，t，J＝7.3Hz)，4.26(0.3H，dd，J＝4.3，7.3Hz)，4.21(0.7H，dd，J＝4.3，6.7Hz)，3.75(0.7H，m)，3.69(0.3H，m)，3.24(0.3H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.17(0.7H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.09-3.14[1H，(3.11，dd，J＝4.9，9.2Hz)，H1bE重叠]，1.75-2.03(2H，m)，1.49(3H，s)，1.39and1.38(3H，eachs)，1.21-1.34(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(4)化合物G4的合成
向化合物G3(338g，约565mmol)的二氯甲烷溶液(1500mL)中添加吡啶(500mL)，滴加甲磺酰氯(49mL，633mmol)，在31℃搅拌24小时。滴加乙醇(40ml)，在室温搅拌1小时。减压浓缩后，向残渣中添加己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3，1000mL)的混合液，分液。水层用己烷(200mL)萃取3次，合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，得到G4的粗生成物。不进行进一步精制就用于下一个步骤。产率363g(95％)。分析用的样品以己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制。
FDMS m/z 676M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.47(15H，m)，5.41(0.7H，ddd，J＝5.5，9.2，11.0Hz)，5.32(0.7H，bt，J＝11.0Hz)，5.22(0.3H，bdd，J＝9.2，15.0Hz)，5.02(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝15.0Hz)，4.8(0.7H，ddd，J＝3.1，5.5，7.9Hz)，4.73(0.7H，dd，J＝5.5，9.8Hz)，4.64-4.67(0.3H，m)，4.61(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，4.48(0.7H，dd，J＝5.5，7.9Hz)，4.22(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，3.55(0.3H，dd，J＝2.4，11.6Hz)，3.45(0.7H，dd，J＝3.2，11.0Hz)，3.06-3.12[4H，(3.12，s)，(3.11，s)，(3.09，dd，J＝3.1，11.0Hz)]，1.66-1.82(2H，m)，1.47and1.46(3H，each s)，1.39(3H，s)，1.13-1.35(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.8Hz)。
(5)化合物G5的合成
向化合物G4(362g，约536mmol)的二氯甲烷溶液(1500mL)中加甲醇(350mL)，再向其中滴加浓盐酸(200mL)，在室温搅拌5小时。向反应液中加碳酸氢钠中和后过滤。滤液减压浓缩，向残渣中加乙酸乙酯，用食盐水洗涤。水层用乙酸乙酯萃取，合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩。用己烷结晶，产率为161g(从G2计算产率为70％)。
mp66-67℃；FDMS m/z 377(M-H2O)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5.86(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝14.7Hz)，5.77(0.7H，dt，Jt＝7.3，Jd＝10.4Hz)，5.55(0.3H，br.dd，J＝7.3，14.7Hz)，5.49(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，4.51(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.11(0.3H，bt，J＝7.3Hz)，3.94-4.03(2H，m)，3.67-3.73[1H，(3.70，dd，J＝3.1，6.7Hz)，(3.69，dd，J＝3.1，7.3Hz)]，3.20and3.19(3H，eachs)，2.05-2.22(2H，m)，1.22-1.43(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(6)化合物G6的合成
向化合物G5(160g，405mmol)的THF溶液(780mL)中添加5％钯-硫酸钡(16g)，反应容器用氢气置换后，在室温搅拌20小时。反应液用硅藻土过滤后，用氯仿∶甲醇的混合液(1∶1)洗涤。合并滤液与洗液、减压浓缩。残渣用乙酸乙酯结晶，产率146g(91％)。
[α]23 D+12°(c1，CHCl3/MeOH＝1∶1)；mp124-126℃；FDMS m/z 397(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD＝1∶1)δ4.93-4.96(1H，m，H2)，3.91(1H，dd，J＝6.7，12.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，12.2Hz)，3.54-3.60(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝1.8，8.5Hz)，3.19(3H，s)，1.75-1.83(1H，m)，1.53-1.62(1H，m)，1.21-1.45(24H，m)，0.89(3H，t，J＝6.7Hz)。
(7)化合物G7的合成
向化合物G6(145g，365mmol)的DMF溶液(1000mL)中添加叠氮化钠(47g，730mmol)，在95℃搅拌4小时。反应液浓缩，向残渣中添加乙酸乙酯(450mL)，水洗。水层用乙酸乙酯再萃取。合并全部有机层，用食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥、减压浓缩，得到G7的粗生成物。产率122g(97％)。不进行进一步精制就用于下一个步骤。产率126g(95％)。分析用样品以己烷∶乙酸乙酯(9∶1)为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制。
[α]23 D+16.5°(c0.5，CHCl3-MeOH，1∶1)；mp92-93℃；FDMS m/z 344(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ3.91(1H，dd，J＝3.7，11.6Hz)，3.75(1H，dd，J＝7.9，11.6Hz)，3.49-3.61(3H，m)，1.50-1.71(2H，m)，1.22-1.46(24H，m)，0.90(3H，t，J＝6.7Hz)。
(8)化合物G8的合成
向化合物G7(121g，约352mmol)的二氯甲烷溶液(750mL)中添加吡啶(250mL)、三苯甲基氯(124g，445mmol)，在室温搅拌16小时。滴加乙醇(30ml)，在室温搅拌30分钟后，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化铵水溶液、食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥、减压浓缩。残渣以己烷∶乙酸乙酯(10∶1)为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制。产率34.4g(从G6计算为52％)。
[α]24 D+11.9°(c0.9，CHCl3)，FDMS m/z 585M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.24-7.61(15H，m)，3.62-3.66(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.0，10.4Hz)，1.23-1.56(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(9)化合物G9的合成
向化合物G8(33.5g，57.3mmol)的DMF溶液(300mL)中添加60％氢化钠(5.5g，以NaH计约138mmol)，在室温搅拌40分钟。将反应液冷却到0℃，滴加苄基溴(15ml，120mmol)。边徐徐升温边搅拌18小时，直至达到室温。向反应液中加冰水(100mL)，反应停止后用乙酸乙酯萃取。萃取液用食盐水洗涤3次，合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得到G9的粗生成物。不进行进一步精制就用于下一个步骤。产率42.2g(96％)。分析用样品以己烷∶乙酸乙酯(100∶1)为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制。
[α]24 D+9.8°(c1.0，CHCl3)，FDMS m/z 738(M-N2)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.07-7.48(25H，m)，4.57(1H，d，J＝11.6Hz)，4.44(1H，d，J＝11.6Hz)，4.41(2H，s)，3.73-3.79(1H，m)，3.46-3.56(2H，m)，3.37(1H，dd，J＝8.6，10.4Hz)，1.20-1.64(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(10)化合物G10和G11的合成
向化合物G9(41.2g，约54mmol)的1-丙醇溶液(250mL)中添加甲醇(30mL)，再添加5％钯炭(4.1g)、甲酸铵(27.1g，4.3mol)，在室温搅拌16小时后，用乙酸乙酯稀释、硅藻土过滤。滤液减压浓缩，用乙酸乙酯溶解后，用饱和碳酸氢钠水溶液、食盐水洗涤3次，合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，得到G10的粗生成物。产率为38.9g(98％)。所得到的G10不进行进一步精制就用于下一个步骤。
向化合物G10的二氯甲烷溶液(300mL)中添加二十六烷酸(22.4g，56.5mmol)、WSC盐酸盐(12.6g，64.6mmol)，加热回流2小时。冷却至室温后，减压浓缩。向残渣中加乙酸乙酯(500mL)，用0.5M盐酸水溶液、食盐水、饱和碳酸氢钠水溶液、再用食盐水洗涤。合并全部有机层，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，得到G11的粗生成物。产率53.2g(88％)。所得到的G11不进行进一步精制就用于下一个步骤。分析用的样品以己烷∶乙酸乙酯(100∶1)为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制。
[α]24 D+5.3°(c0.4，CHCl3)；FDMS m/z 1118M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.20-7.38(25H，m)，5.57(1H，d，J＝9.1Hz)，4.80(1H，d，J＝11.6Hz)，4.48-4.50(3H，m)，4.24-4.32(1H，m)，3.83(1H，dd，J＝3.0，6.7Hz)，3.43-3.51(2H，m，H1a)，3.29(1H，dd，J＝4.3，9.8Hz)，1.92(2H，t，J＝7.3Hz)，1.28-1.60(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)。
(11)化合物G12的合成
向化合物G11(52.2g，约47mmol)的二氯甲烷溶液(180mL)中添加甲醇(36mL)，然后滴加10％盐酸甲醇溶液(3.0mL)，在室温搅拌2小时。反应液用粉末状碳酸氢钠(18g)中和，用硅藻土过滤。残渣用二氯甲烷洗涤。合并滤液与洗液，用食盐水洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩。残渣用丙酮加热溶解，使之冷却到0℃沉淀精制。产率38.6％(从G9计算为77％)。
[α]24 D-29.7°(c0.7，CHCl3)；mp75-76.5℃；FDMS m/z 876M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.30-7.47(10H，m)，6.03(1H，d，J＝7.9Hz)，4.72(1H，d，J＝11.6Hz)，4.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.61(1H，d，J＝11.6Hz)，4.45(1H，d，J＝11.6Hz)，4.12-4.17(1H，m)，4.00(1H，dt，J+＝4.3，Jd＝7.3Hz)，3.67-3.72(2H，m)，3.61(1H，ddd，J＝4.3，8.6，11.6Hz)，1.94-2.05(2H，m)，1.15-1.69(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.1Hz)。
(12)化合物G13的合成
1)乙酸2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖酯(79.8g)溶解于甲苯(160mL)与异丙醚(520mL)的混合液中，冷却至-10～0℃。向其中添加含有2.0当量HBr的异丙醚溶液(2.8mmol/ml，约100mL)。在-10～0℃搅拌约90分钟后，向反应液中倾入5％碳酸氢钠水溶液，搅拌，使过剩的HBr中和。全部转移到分液漏斗中，分液后废弃水层，用10％氯化钠水溶液洗涤2次。减压浓缩，得到2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基溴(GalBr)的糖浆状物。
2)向化合物G12(60.0g，68.6mmol)、溴化四己铵(89.4g，206mmol)，分子筛4A(60g)的甲苯溶液(420mL)中添加DMF(140mL)、然后添加GalBr(约137mmol)的甲苯溶液(250mL)，在室温搅拌72小时。向反应液中添加甲醇(12ml)，搅拌2小时。用硅藻土过滤后，用饱和碳酸氢钠水溶液、食盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥、减压浓缩。向残渣中添加乙腈、搅拌2小时，得到沉淀。所得到的沉淀减压干燥、得到干燥粉末。此物以己烷∶乙酸乙酯(8∶1)为洗脱溶剂用硅胶柱色谱法精制，产率为70.9g％(74％)。
[α]24 D+18.8°(c0.9，CHCl3)；mp74-75℃；FDMS m/z 1399(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.37(30H，m)，6.12(1H，d，J＝9.0Hz)，4.91(1H，d，J＝11.6Hz)，4.84(1H，d，J＝3.7Hz)，4.72-4.80(4H，m)，4.35-4.65(7H，m)，4.12-4.18(1H，m)，3.99-4.05(2H，m)，3.84-3.93(4H，m)，3.73(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.47-3.51(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.1，9.1Hz)，1.87-1.99(2H，m)，1.18-1.70(72H，m)，0.88(6H，t，J＝7.4Hz)。
(13)化合物KRN7000的合成
化合物G13(60.0g，42.9mmol)添加悬浮于乙醇(960mL)中，向其中添加20％氢氧化钯(6.0g)的乙醇悬浮液。进一步添加成为氢源的4-甲基环己烯(120mL，93.5mmol)，加热回流4小时后过滤除去催化剂。残渣用加温的乙醇洗涤。滤液在室温放置得到的白色沉淀滤出、减压干燥。得到的粉末悬浮于乙醇∶水(92∶8，3.5L)中，边搅拌边加热溶解后，通过在室温下放置使之再次沉淀。沉淀液过滤，滤取的滤饼减压干燥，得到白色粉末。产率35.0g(95％)。
[α]23 D+43.6°(c1.0，吡啶)；mp189.5-190.5℃；负FABMS m/z 857(M-H)-；IR(cm-1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，1070；1H-NMR(500MHz，C5D5N)δ8.47(1H，d，J＝8.5 Hz)，5.58(1H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，m)，4.63-4.70(2H，m)，4.56(1H，m)，4.52(1H，t，J＝6.1Hz)，4.37-4.47(4H，m)，4.33(2H，m)，2.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25-2.34(1H，m)，1.87-1.97(2H，m)，1.78-1.85(2H，m)，1.62-1.72(1H，m)，1.26-1.45(66H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)，13C-NMR(125MHz，C5D5N)δ173.2(s)，101.5(d)，76.7(d)，73.0(d)，72.5(d)，71.6(d)，71.0(d)，70.3(d)，68.7(t)，62.7(t)，51.4(d)，36.8(t)，34.4(t)，32.1(t)，30.4(t)，30.2(t)，30.03(t)，30.00(t)，29.93(t)，29.87(t)，29.81(t)，29.76(t)，29.6(t)，26.5(t)，26.4(t)，22.9(t)，14.3(q)。
〔冷冻干燥组合物〕
(1)活性成分的溶剂选择
实验条件
首先，称取活性成分(KRN7000)1mg，尝试着用100mL的各种溶剂(表3)在80℃温浴中搅拌溶解20分钟，以使之达到浓度为10μg/mL。判定能溶解成10μg/mL的溶剂，用同样的方法尝试着溶解成100μg/mL。判定也能溶解成100μg/mL的溶剂，再尝试着溶解成200μg/mL，判定用流水冷却后的溶解性。
溶解性的判定是进行以下所示的试验来判定的。首先，把各样品约1.5mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中、密封。把容器外部擦净，放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的，确认为无析出物时，就判定为溶解。
结果列于表3中。
表3
活性成分(KRN7000)的浓度溶剂名 10μg/mL 100μg/mL 200μg/mL蒸馏水 +1N HCl +1N NaOH +丙二醇 - +Macrogol 400 - +甘油 - +乙醇 - - -0.5％吐温-20 - - -0.5％吐温-80 - +0.5％Cremophor +0.5％HCO 50 +0.5％HCO 60 +0.5％Polyoxamer 188 +注)溶解性的判断(目视)：+不溶(或析出)
-溶解
从以上结果可以看出，乙醇或0.5％吐温20作为溶剂是可以预期的，但100％乙醇在实用上不相称，因而选择0.5％吐温水溶液作为溶剂。
(2)溶剂最佳添加量的探讨
实验条件
首先，吐温20溶解在蒸馏水中，配成表4中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN7000)各20mg，用各浓度的吐温溶液100mL，在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后，用0.22μm的过滤器过滤，得到的各种溶液各2mL分别灌装于5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中、密封。
此样品于25℃保存，2周后判定溶解性，判定为溶解的再继续保存，1个月后再一次判定溶解性。
溶解性的判定是将容器外部擦净，放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的、确认无析出物时，就判定为溶解。
结果列于表4中。表中保存后随时间变化系指溶液原样保存的情况下的溶解性。
表4
KRN7000 吐温20 保存后随时间变化(目视)
(μg/ml) (％) 25℃，2周 25℃，1个月
200 0.1 +
200 0.2 +
200 0.3 - +
200 0.5 - +
200 1.0 - +
200 2.0 - +
200 4.0 - +
200 8.0 - +
从以上结果判明吐温20的添加量必须达到0.3％以上，但从25℃、1个月的数据也已判明，仅吐温20本身在实用上还不足以作为制剂。因此，进行了能在保存下维持溶解性的冷冻干燥制剂的探讨。
(3)冷冻干燥制剂化的探讨
实验条件
首先，将吐温20溶解在蒸馏水中，配成表5中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN7000)各20mg，用各浓度的吐温溶液100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm的过滤器过滤，得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟，再溶解时的泡消失后，判定溶解性。
溶解性的判定，是将容器外部擦净、放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的、确认无析出物时，判定为溶解。
结果列于表5中。
表5
活性成分(KRN7000) 吐温20 刚冷冻干燥后的
(μg/mL) (％) 再溶解性(目视)
200 0.5 +
200 1.0 +
200 2.0 +
从以上结果判明，只用吐温20，不能相应地制成冷冻干燥制剂。
(4)适合于冷冻干燥的赋形剂探讨之1。
实验条件
作为冷冻干燥制剂的赋形剂，用种种单糖和二糖进行探讨。要说明的是，在以后的探讨中，活性成分(KRN 7000)固定于浓度200μg/mL，此外，吐温20出于安全上的考虑不能添加太多，因而浓度固定于0.5％。
首先，吐温20和糖类两者均溶解于蒸馏水中，使吐温20浓度为0.5％，糖类达到表6中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN 7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟，再溶解时的泡消失后，判定溶解性。
溶解性的判定，是将容器外部擦净、放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的、确认无析出物时，判定为溶解。
结果列于表6中。
表6
刚冷冻后的 刚冷冻后的
赋形剂 再溶解性 赋形剂 再溶解性
果糖5％ + 乳糖5％ +
果糖10％ + 乳糖10％ +
木糖醇4.3％ + 葡萄糖5％ -
木糖醇8.6％ + 葡萄糖10％ +
山梨糖醇5％ + 甘露糖醇5％ +
山梨糖醇10％ + 甘露糖醇10％ -
麦芽糖1.5％ + 蔗糖4.8％ -
麦芽糖3％ + 蔗糖9.6％ -
从以上结果可以认为，蔗糖、甘露糖醇、葡萄糖适合于作为冷冻干燥赋形剂。
(5)适合于冷冻干燥的赋形剂探讨之2
实验条件
观察添加了甘露糖醇和蔗糖的冷冻干燥制剂的随时间变化。
首先，吐温-20和糖类两者均溶解于蒸馏水中，使吐温浓度为0.5％、糖类为表7中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在25℃保存。保存1个月后，冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟，再溶解时的泡消失后判定溶解性。判定为溶解的就再继续保存，4个月再一次判定溶解性。
溶解性的判定是将容器外部擦净，放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的并确认无析出物时，就判定为溶解。
结果列于表7中。
表7
赋形剂 保存后的再溶解性(目视)
25℃，1个月 25℃，4个月
甘露糖醇10％ - +
蔗糖 9.6％ - +
从以上结果可以看出，添加了甘露糖醇或蔗糖的冷冻干燥制剂比0.5％吐温-20溶液制剂更稳定，而且即使25℃，1个月后也能溶解。
为了探讨能更长期保存的处方，以下进行了添加剂探讨。
(6)添加剂的探讨：能改善保存时的再溶解性的添加剂的探讨
(i)选择甘露糖醇作为赋形剂的情况
实验条件
首先，在蒸馏水中分别溶解吐温-20、甘露糖醇和各种添加剂，使吐温-20浓度为0.5％，甘露糖醇和各种添加剂达到表8中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在25℃保存。保存1个月后，冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟，再溶解时的泡消失后判定溶解性。判定为溶解的就再继续保存，4个月再一次判定溶解性。
溶解性的判定是将容器外部擦净，放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的并确认无析出物时，就判定为溶解。
结果列于表8中。
表8甘露糖醇 添加剂 保存后的再溶解性(目视)
25℃，1个月 25℃，4个月10％ —— - +10％ 脱氧胆酸钠1％ - -15％ —— + +15％ 脱氧胆酸钠1％ + +15％ 甘油 1％ + +15％ 甘油 0.1％ + +15％ PEG400 1％ + +
从以上结果判明，以甘露糖醇10％作为赋形剂时，添加脱氧胆酸钠1％能改善保存下的再溶解性。
(ii)选择蔗糖作为赋形剂的情况
实验条件
首先，在蒸馏水中分别溶解吐温-20，蔗糖和各种添加剂，使吐温-20浓度为0.5％，蔗糖和各种添加剂达到表9中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN 7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在25℃或50℃或者在这两种温度下保存。在25℃保存1个月或在50℃保存3日后，冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟使再溶解时的泡消失后，判定溶解性。判定为溶解的再继续保存，在25℃保存4个月后、在50℃保存2周后，再一次判定溶解性。
溶解性的判定是将容器外部擦净、放在暗室中白色光源正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的并确认无析出物时，判定为溶解。
结果列于表9中。
表9
保存后的再溶解性(目视)
25℃ 25℃ 50℃ 50℃蔗糖 添加剂 1个月 4个月 3日 2周9.6％ —— - + +9.6％ 脱氧胆酸钠 1％ - - - -9.6％ 脱氧胆酸钠 0.1％ - +9.6％ 普郎尼克F68 1％ - +9.0％ 普郎尼克F68 0.1％ - +9.6％ 丙二醇 1％ +9.6％ 甘油 1％ +9.6％ 精氨酸 0.1％ +9.6％ 甘氨酸 0.1％ +9.6％ 甘氨酸 1％ +9.6％ 组氨酸 2％ - -
从以上结果判明，以蔗糖为赋形剂时，添加脱氧胆酸钠或组氨酸能改善保存下的再溶解性。
(iii)脱氧胆酸钠以及组氨酸的添加效果。
实验条件
考察不含糖作为赋形剂的情况下脱氧胆酸钠和组氨酸的添加效果。
首先，在蒸馏水中分别溶解吐温-20以及组氨酸或脱氧胆酸钠，使吐温-20为0.5％，组氨酸或脱氧胆酸钠为1.0％。然后，称取活性成分(KRN 7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在50℃保存。保存3天或2周后，冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟使再溶解时的泡消失后，判定溶解性。
溶解性的判定是将容器外部擦净，放在暗室中白色光源的正下方亮度约5000勒克司的位置，用肉眼观察时是澄清的并确认无析出物时，判定为溶解。
结果列于表10中。
表10
添加剂 保存后的再溶解性(目视)
50℃，3日 50℃，2周
组氨酸 1％ +
脱氧胆酸钠 1％ +
从以上结果表明，只用组氨酸或脱氧胆酸钠是没有效果的。
(7)最佳处方的探讨
实验条件
首先，在蒸馏水中分别溶解吐温-20、蔗糖和组氨酸或脱氧胆酸钠，使吐温-20为0.5％，蔗糖、组氨酸或脱氧胆酸钠达到表11中所列各浓度。然后，称取活性成分(KRN 7000)各20mg，用各溶剂100mL在80℃温浴中搅拌20分钟，进行溶解试验。用流水冷却后用0.22μm过滤器过滤，所得到的各种溶液各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-40℃进行2小时预冷冻、然后在-20℃进行24小时、在10℃进行12小时、最后在25℃进行5小时干燥，得到冷冻干燥物。在此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在25℃或50℃的温度保存。在25℃保存2个月或50℃保存2周后，冷冻干燥组合物用注射用蒸馏水1mL再溶解，放置30分钟使再溶解时的泡消失后，判定溶解性。25℃保存2个月判定为溶解者再继续保存，4个月后再一次判定溶解性。
溶解性的判定，是将容器外擦净，放在暗室中白色光源正下方约5000勒克司亮度的位置，用肉眼观察时是澄清的并确认无析出物时，判定为溶解。
结果列于表11中。
表11蔗糖 添加剂 保存后的再溶解性(目视)
25℃， 25℃， 50℃，
2个月 4个月 2周19.2％ 脱氧胆酸钠 0.1％ +19.2％ 脱氧胆酸钠 0.2％ +19.2％ 脱氧胆酸钠 0.5％ +19.2％ 脱氧胆酸钠 1％ +19.2％ 脱氧胆酸钠 2％ +9.6％ 脱氧胆酸钠 0.2％ +9.6％ 脱氧胆酸钠 0.5％ - -9.6％ 脱氧胆酸钠 1％ - -9.6％ 脱氧胆酸钠 2％ - -4.8％ 脱氧胆酸钠 0.2％ +4.8％ 脱氧胆酸钠 0.5％ - -4.8％ 脱氧胆酸钠 1％ - -4.8％ 脱氧胆酸钠 2％ - -9.6％ 组氨酸 2％ -7.9％ 组氨酸 0.5％ +6.9％ 组氨酸 1％ -5.0％ 组氨酸 2％ -3.1％ 组氨酸 3％ -1.1％ 组氨酸 4％ +5.1％ 组氨酸 1％ -3.2％ 组氨酸 2％ -
从以上结果判断，在聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖中进一步配合适量胆氧胆酸钠或组氨酸，可以提高活性成分冷冻保存后随时间推移的再溶解性。
(8)加热溶解后的冷冻条件探讨之1
实验条件
首先，在蒸馏水中溶解吐温-20(0.5％)、组氨酸(0.75％)和蔗糖(5.6％)。然后，称取活性成分(KRN7000)800mg，在以上溶剂4L中于73℃加热下搅拌30分钟，进行溶解试验。溶解后，均分成各约500mL，在搅拌下进行73℃→30℃(6分)、73℃→30℃(23分)、73℃→30℃(120分)的冷却。冷却后各种溶液用0.22μl过滤器过滤，各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-50℃进行5小时预冷冻后，在-15℃进行48小时、10℃进行12小时、最后在25℃进行7小时干燥，得到冷冻干燥物。此期间的真空度为0.1Torr以下。
各冷却条件下配制的、过滤器过滤前后的溶液，以及冷冻干燥步骤结束后所得到的冷冻干燥组合物在室温(25℃)静置3小时后再溶解，分别测定浊度。要说明的是，冷冻干燥组合物的浊度采用的是用注射用蒸馏水1mL再溶解、放置30分钟而使再溶解时的泡消失者。
浊度测定是先用蒸馏水配制使浊度标准液(高岭土0.1mg/mL)稀释50倍(高岭土2μg/mL，浊度2.00)、稀释100倍(高岭土1μg/mL，浊度1.00)、稀释200倍(高岭土0.5μg/mL，浊度0.50)的各种稀释液，以蒸馏水作为对照，用分光光度计(日立U-3210)测定660nm波长的吸光度，作出校准曲线。然后，在相同条件下测定各种溶液的吸光度，从所作的校准曲线算出各种溶液的浊度。
结果列于表12中。
表12
| 冷却条件 | 浊度 |
| 过滤前 过滤后 冷冻干燥物 | |
| 73℃→30℃、6分73℃→30℃、23分73℃→30℃、120分 | 0.23 0.13 0.240.58 0.15 0.360.64 0.16 0.36 |
从以上结果判明，通过使冷却条件为急冷，提高了活性成分冷冻干燥后的再溶解性。
(9)加热溶解后的冷却条件探讨之2
实验条件
首先，在蒸馏水中溶解吐温-20(0.5％)、组氨酸(0.75％)和蔗糖(5.6％)。然后，称取活性成分(KRN7000)800mg，在所配制的溶剂4L中于73℃加热下搅拌30分钟，进行溶解试验。溶解后均分成各约500mL，在搅拌下以如下所示6个速度进行急冷～缓冷。
冷却条件 降温时间(平均降温速度)①73℃→30℃、 4分钟 (10.75℃/min)②73℃→30℃、 6分钟 (7.17℃/min)③73℃→30℃、 7分钟 (6.14℃/min)④73℃→30℃、 10分钟 (4.30℃/min)⑤73℃→30℃、 23分钟 (1.87℃/min)⑥73℃→30℃、 120分钟(0.36℃/min)
冷却后各种溶液用0.22μl过滤器过滤，各1mL灌装到5mL容量的无色透明玻璃管形瓶中，冷冻干燥。冷冻干燥条件是在-50℃进行5小时预冷冻后，在-15℃进行48小时、10℃进行12小时、最后在25℃进行7小时干燥，得到冷冻干燥物。此期间的真空度为0.1Torr以下。
冷冻干燥步骤结束后，所得到的冷冻干燥组合物在50℃保存1周，测定再溶解液的浊度。要说明的是，冷冻干燥组合物的浊度采用的是用注射用蒸馏水1mL再溶解、放置30分钟而使再溶解时的泡消失者。
浊度测定是先用蒸馏水配制使浊度标准液(高岭土0.1mg/mL)稀释50倍(高岭土2μg/mL，浊度2.00)、稀释100倍(高岭土1μg/mL，浊度1.00)、稀释200倍(高岭土0.5μg/mL，浊度0.50)的各种稀释液，以蒸馏水作为对照，用分光光度计(日立U-3210)测定660nm波长的吸光度，作出校准曲线。然后，在相同条件下测定各种溶液的吸光度，从所作的校准曲线算出各种溶液的浊度。
结果列于表13中。
表13
冷却条件 浊度
① 2.08
② 2.67
③ 3.31
④ 3.80
⑤ 6.44
⑥ 18.84
从以上结果判明，通过使冷却条件为急冷，进一步提高了保存后活性成分随时间推移的再溶解性。
〔注射用冷冻干燥组合物〕
组合物1
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·甘露糖醇 100mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物2
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·甘露糖醇 100mg
·脱氧胆酸钠 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物3
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 100mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物4
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 96mg
·脱氧胆酸钠 5mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物5
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 96mg
·脱氧胆酸钠 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物6
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 96mg
·脱氧胆酸钠 20mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物7
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 48mg
·脱氧胆酸钠 5mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物8
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 48mg
·脱氧胆酸钠 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物9
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 48mg
·脱氧胆酸钠 20mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物10
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 75.2mg
·脱氧胆酸钠 5mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物11
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 72.9mg
·脱氧胆酸钠 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物12
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 96mg
·组氨酸 20mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物13
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 69mg
·组氨酸 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物14
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 51mg
·组氨酸 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物15
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 50mg
·组氨酸 20mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物16
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 32mg
·组氨酸 20mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物17
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 31mg
·组氨酸 30mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物18
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 68.8mg
·组氨酸 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物19
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 56mg
·组氨酸 7.5mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
组合物20
·α-糖基神经酰胺(KRN7000) 0.2mg
·聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温-20) 5mg
·蔗糖 51.2mg
·组氨酸 10mg
·溶剂(注射用蒸馏水) 适量
合计1mL
按照上述处方，在80℃加温20分钟使α-糖基神经酰胺(KRN7000)完全溶解，然后用流水冷却15分钟后，用0.22μm的过滤器过滤，进行冷冻干燥，制成注射用冷冻干燥制剂。
冷冻干燥制剂的溶解性评价
对于组合物1～20的冷冻干燥制剂，进行了刚冷冻干燥后和不同时间保存后的溶解性评价，如以下表14中所示，全部获得良好的溶解性。
表14
保存后的再溶解性(目视)组合物号 25℃ 40℃ 50℃
1个月 2个月 4个月 1个月 2个月 4个月 2周
1 -
2 - -
3 -
4 - -
5 - - - - - -
6 - - - -
7 - - -
8 - - - -
9 - - - -
10 - - - - - -
11 - - - - - -
12 -
13 -
14 -
15 -
16 -
17 -
18 - - -
19 - - - - -
20 - - - -
-：澄清，未发现析出物
产业上的适用性
按照本发明，在对水溶解性低的作为活性成分的神经鞘糖脂(糖部分由单糖组成的α-糖基神经酰胺)中配合聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯和二糖(蔗糖等)或单糖(葡萄糖或甘露糖醇等)并冷冻干燥，显著提高了活性成分对溶剂的溶解性。而且，在这种配合中进一步配合脱氧胆酸钠或组氨酸，还能进一步提高长期保存后的再溶解性。因此，按照本发明的组合物，作为溶解性优异的注射用冷冻干燥制剂是有用的。
Claims (18)
1.一种冷冻干燥组合物，其中包含下式(A)所示的α-糖基神经酰胺或其盐，聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯、和二糖或单糖，式中，R1是H或OH；
X是7～25中任何一个整数；
R2是下列(a)～(e)定义的取代基中任何一个，其中Y是5～17中任何一个整数：
(a)-CH2(CH2)YCH3
(b)-CH(OH)(CH2)YCH3
(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2
(d)-CH＝CH(CH2)YCH3
(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；
R3和R4中任意一个是H，另一个是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5和R6中任意一个是H，另一个是OH；
R7和R8中任意一个是H，另一个是OH；
R9是H、CH3、或CH2OH。
2.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，其中包含下式(A′)所示的α-糖基神经酰胺或其盐，聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯、和二糖或单糖，
式中，R1是H或OH；
X是7～25中任何一个整数；
R2是下列(a)～(e)定义的取代基中任何一个，其中Y是5～17中任何一个整数：
(a)-CH2(CH2)YCH3
(b)-CH(OH)(CH2)YCH3
(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2
(d)-CH＝CH(CH2)YCH3
(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；
R3～R9是下列i)～v)定义的取代基：
i)R3、R6和R8是H时，
R4是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R7是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
ii)R3、R6和R7是H时，
R4是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
iii)R4、R6和R7是H时，
R3是H、OH、NH2或NHCOCH3；
R5是OH；
R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
iv)R4、R5和R7是H时，
R3、R6和R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH；
v)R3、R5和R7是H时，
R4、R6和R8是OH；
R9是H、CH3或CH2OH。
3.权利要求1或2记载的冷冻干燥组合物，其中α-糖基神经酰胺的R3、R6和R8是H，R4、R5和R7是OH，且R9是CH2OH。
4.权利要求1～3中任何一项记载的冷冻干燥组合物，其中α-糖基神经酰胺的R2是取代基(b)、(c)或(e)。
5.权利要求4记载的冷冻干燥组合物，其中α-糖基神经酰胺的R1是H，且R2是取代基(b)。
6.权利要求5记载的冷冻干燥组合物，其中，烷基中亚甲基的X是21～25的整数，基团R2中的Y是11～15。
7.权利要求6记载的冷冻干燥组合物，其中，α-糖基神经酰胺是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖氧基)-2-二十六烷酰胺基-3，4-十八烷二醇。
8.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，其中，二糖或单糖是蔗糖、甘露糖醇或葡萄糖。
9.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，其中，二糖或单糖是蔗糖。
10.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，进一步含有脱氧胆酸钠或组氨酸。
11.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，其中，相对于α-糖基神经酰胺1重量份而言，含有聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯10～1000重量份，二糖或单糖100～10000重量份。
12.权利要求10记载的冷冻干燥组合物，其中，相对于α-糖基神经酰胺1重量份而言，含有聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯10～1000重量份，二糖或单糖100～10000重量份，脱氧胆酸钠或组氨酸10～1000重量份。
13.权利要求1记载的冷冻干燥组合物，它是注射用组合物。
14.冷冻干燥组合物的制备方法，其特征在于权利要求1～13中任何一项记载的组合物的配合成分在加温的水基溶剂中溶解、冷却后，进行冷冻干燥步骤。
15.权利要求14记载的方法，其特征在于各配合成分在65～90℃溶解后，此溶液以1.0℃/min以上的降温速度冷却。
16.权利要求15记载的方法，其特征在于溶液以1.5℃/min以上的降温速度急冷。
17.权利要求15记载的方法，其特征在于溶液以2.0℃/min以上的降温速度急冷。
18.权利要求15记载的方法，其特征在于溶液以4.0℃/min以上的降温速度急冷。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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