CN112121043A - 双香豆素在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双香豆素在抗肿瘤中的应用，涉及天然药物领域。本发明公开双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的研究显示，双香豆素对肿瘤细胞具有抑制迁移、侵袭和粘附的作用，具有抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物；本发明为肿瘤的治疗提供了一种新的思路和选择。

Description

双香豆素在抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体而言，涉及双香豆素在抗肿瘤中的应用。

背景技术

癌症作为世界范围内的主要公共卫生问题之一，严重威胁人类生命健康，并且其发病率和死亡率均呈现持续攀升的趋势。目前癌症死亡占全国死因中的第一位，死亡5人，即有1人死于癌症，而在0～64岁人口中，每死亡4人，即有1人死于癌症。手术、放疗(包括靶向治疗药物等)、化疗是目前肿瘤治疗的三大法宝，但它们对于原发肿瘤有效，一旦患者肿瘤发生转移，很难进行有效治疗。事实上，肿瘤转移是绝大多数肿瘤患者死亡的原因。因此，临床亟待能够有效干预肿瘤转移过程并抑制其进展的新药物。然而，至今尚未有以抑制肿瘤转移为主要用途的药物上市。

发明内容

本发明的目的在于提供双香豆素在抗肿瘤中的应用。本发明提供了双香豆素新用途；本发明的研究显示，双香豆素对肿瘤细胞具有抑制迁移、侵袭和粘附的作用，具有抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物；本发明为肿瘤的治疗提供了一种新的思路和选择。

本发明是这样实现的：

双香豆素(dicoumarol，简称DIC)是从腐败的草木樨中发现的香豆素类化合物。最初用于灭鼠，后来研发成为抗凝剂，在临床上被用于预防及治疗血管内血栓栓塞性疾病，施行手术或受伤后血栓性静脉炎、肺栓塞、心肌梗塞及心房纤颤引起的栓塞等。目前临床已经应用数十年。其分子式为C₁₉H₁₂O₆，分子量为336.295，化学结构如下：

本发明实施例的研究内容首次揭示了双香豆素在肿瘤方面的治疗作用；本发明实施例研究结果显示，双香豆素对肿瘤细胞例如肺癌细胞(再如人非小细胞肺癌细胞)的迁移、侵袭和粘附具有明显的抑制作用；体内实验研究结果显示，双香豆素明显改善了肿瘤(例如乳腺癌)小鼠的生存状态，抑制了小鼠肿瘤细胞转移，降低了肿瘤数量且对小鼠体重无明显影响。在体内外实验中，双香豆素均具有明显的抑制肿瘤转移的作用。

双香豆素抑制肿瘤转移的优点在于疗效确切、剂量低且药效良好。尤其是，双香豆素有着几十年的临床使用历史，其安全性、副作用与毒性作用均已透彻。在用于抑制肿瘤转移的实验过程中，未见明显副作用及毒性反应，这提示了双香豆素是一种安全有效的抗肿瘤转移的药物。

基于此，一方面，本发明提供双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本文使用的术语“药学上可接受的溶剂合物”，是指双香豆素I与有机溶剂形成的稳定溶剂合物。有机溶剂包括常见的醇、酮或水等。有效成分与水形成的溶剂合物，也称为该有效成分的水合物。

本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指给定双香豆素的一种或多种盐，其具有所需的游离化合物的药理学活性并且既不会在生物学上也不会在其它方面产生不良影响。通常，“药学上可接受的盐”是指并且包括适于与人和动物的组织接触且没有过度毒性、刺激、过敏反应等的盐，并且与合理的效益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。

可选的，在一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、基底细胞癌、绒毛膜癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌和甲状腺癌。

可选的，在一些实施方式中，所述肿瘤为肺癌。

可选的，在一些实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

可选的，在一些实施方式中，所述药物的剂型包括但不限于片剂、丸剂、滴丸、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂和乳剂。本领域技术人员可以根据需要选择合适的剂型。

可选的，在一些实施方式中，所述双香豆素通过抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭或粘附发挥抗肿瘤的作用。

另一方面，本发明还提供双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞迁移的抑制剂中的应用。

另一方面，本发明还提供双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用。

另一方面，本发明还提供双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞粘附的抑制剂中的应用。

可选的，在一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、基底细胞癌、绒毛膜癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌和甲状腺癌。

另一方面，本发明还提供一种制备抗肿瘤药物的方法，其包括：将双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

可选的，在一些实施方式中，所述载体包括但不限于溶剂、赋形剂、稀释剂、佐剂和填充剂等。

可选的，在一些实施方式中，所述载体还包括但不限于生理盐水，缓冲剂、糖类、明胶、淀粉、林格氏溶液和纤维素等。所述载体的pH通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。

本领域技术人员可以根据需要选用合适的载体。

除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本文中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本文，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本文和本文提供的文献之间存在冲突，应以本文中的内容为准。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为DIC单独使用或与TGF-β1联用对肺癌A549和H1975细胞存活率的影响。

图2为DIC对TGF-β1诱导肺癌A549和H1975细胞迁移的影响。

图3为DIC对TGF-β1诱导肺癌A549和H1975细胞迁移和侵袭的影响。

图4为DIC对TGF-β1诱导肺癌A549和H1975细胞粘附的影响。

图5为DIC对乳腺癌小鼠肺部肿瘤转移结节数量和体重的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1实验材料

DIC购自百灵威科技(J&K Scientific Ltd.)。人重组转化生长因子(TGF-β1)购自Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州丹佛市)，并根据制造商的说明使用。RPMI1640，胎牛血清(FBS)，青霉素-链霉素溶液(PS)，二甲基亚砜(DMSO)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2、5-二苯基溴化四氮唑(MTT)购自Sigma(美国密苏里州圣路易斯)。基质胶(matrigel)，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原蛋白(type I collagen)购自BDBiosciences(美国马里兰州Sparks Glencoe)。

2实验方法

2.1细胞培养

人肺癌细胞系A549和H1975来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)，置于37℃，5％CO₂的培养箱中，使用含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素溶液(PS)的RPMI1640培养。用胰蛋白酶-EDTA消化传代。

2.2细胞活力测定

通过MTT测定评估细胞活力。将A549和H1975细胞(5×10³细胞/孔)接种在96孔板中并培养过夜。然后在含1％FBS的RPMI1640培养基中，用DIC(1-8μM)以及TGF-β1(5ng/ml)处理细胞48小时。加入20μl/孔MTT共培养4h。用100μl/DMSO溶解甲臢结晶，并通过Multilabel计数器(Perkin Elmer，新加坡)测定570nm处的吸光度。

2.3划痕实验

将A549和H1975细胞以1×10⁵个/孔的浓度接种在6孔板中，并培养过夜。使用新的移液器吸头轻而缓慢地划过孔的中心。用PBS洗涤两次后，将TGF-β1(5ng/ml)和DIC(1-4μM)加入不同的孔中，然后孵育48小时。在0小时和48小时通过Olympus IX73显微镜捕获图像。

2.4Transwell分析

用Transwell法检测迁移和侵袭。为了进行侵袭分析，将预先涂有Matrigel(1：8)的Transwell插入孔以2×10⁵个/孔接种。每孔用补充有10％FBS，TGF-β1(5ng/ml)和DIC(1-4μM)的300μl新鲜培养基稀释细胞。同时将500μl含10％FBS，TGF-β1(5ng/ml)和DIC(1-4μM)的培养基添加到transwell板下腔室的每个孔中。然后，将带有transwell插入物的transwell板孵育48小时。迁移测定中Transwell插入孔不涂Matrigel。除去残留在膜上表面的细胞。然后将通过该膜迁移并粘附在Transwell插入膜下表面的细胞用4％PFA固定，并用结晶紫染色。通过Olympus IX73显微镜获取图像。

2.5粘附实验

在6孔板中以2×10⁵个/孔的密度培养细胞过夜。然后将细胞与TGF-β1(5ng/ml)和DIC(1-4μM)共同处理48小时。将type I collagen、fibronectin和matrigel在96孔板中预涂至少30分钟。其中将fibronectin和matrigel与培养基混合，type I collagen直接添加到孔中。收集总共1×10⁴个处理过的细胞，接种到96孔板中，孵育2小时。用PBS轻轻洗涤除去未贴壁细胞，加入结晶紫染色15分钟后，用PBS洗涤两次，然后在孔中保持100μl PBS。使用Olympus IX73显微镜捕获图像。

2.6动物实验

从澳门大学健康科学学院获得的雌性BALB/c小鼠(6至8周龄)在左第二乳房脂肪垫中注射4T1细胞(1×10⁵/只)。3天后，灌胃给予DIC(1.0mg/kg和2.5mg/kg)处理22天。实验终止后解剖小鼠完整取出肺部并使用40％的甲醛水溶液固定，观察并统计肺部转移结节数量。

3实验结果

3.1 DIC对A549细胞和H1975细胞活力的影响

在A549细胞和H1975细胞中，DIC在4μM时均无明显细胞毒性，但在8μM时，细胞活力则略有下降。此外，将DIC与TGF-β1联合使用对细胞活力没有明显影响(图1)。

3.2 DIC抑制TGF-β1诱导肺癌A549和H1975细胞迁移

在伤口愈合迁移试验中，TGF-β1显着诱导了A549细胞和H1975细胞的迁移。DIC协同治疗可以明显减少划痕内迁移细胞的数量并抑制划痕的愈合(图2)。

为了证实DIC对TGF-β1诱导的迁移的可逆作用，在A549细胞中进行了Transwell实验。结果表明，TGF-β1也显着增加了A549细胞的迁移，而DIC协同处理则显着逆转了A549细胞的迁移，且TGF-β1明显增加了可被DIC协同抑制的侵袭细胞数量(图3)。这些结果表明DIC抑制了A549和H1975细胞的迁移和侵袭活性。

3.3 DIC抑制TGF-β1诱导的对type I collagen、fibronectin和matrigel的粘附

如图4所示，与对照组相比，TGF-β1显著增强了A549细胞和H1975细胞对type Icollagen、fibronectin和matrigel的粘附作用。在A549细胞和H1975细胞中，DIC能以浓度依赖性方式显着逆转TGF-β1诱导的粘附。因此，这些结果表明DIC抑制了A549和H1975细胞的粘附活性(图4)。

3.4 DIC抑制乳腺癌小鼠的肺部肿瘤转移

为了评估DIC在体内抑制转移作用的表现，向小鼠的第二脂肪垫中注入了鼠乳腺癌4T1细胞。浓度为2.5mg/kg的DIC显着减少了肺转移结节的数量。但是，这三组的体重没有显着差异。因此DIC可以抑制乳腺肿瘤转移到肺部且对小鼠无明显毒性(图5)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、乳腺癌、基底细胞癌、绒毛膜癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌和甲状腺癌中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、丸剂、滴丸、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂和乳剂中的任意一种。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述双香豆素通过抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭或粘附发挥抗肿瘤的作用。

5.双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞迁移的抑制剂中的应用。

6.双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用。

7.双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐在制备用于抑制肿瘤细胞粘附的抑制剂中的应用。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、乳腺癌、基底细胞癌、绒毛膜癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌和甲状腺癌。

9.一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征在于，其包括：将双香豆素、其药学上可接受的溶剂合物、或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体选自溶剂、赋形剂、稀释剂、佐剂和填充剂中的至少一种。

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