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CN112119310A - 通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法 - Google Patents

通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法 Download PDF

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CN112119310A CN201980032267.XA CN201980032267A CN112119310A CN 112119310 A CN112119310 A CN 112119310A CN 201980032267 A CN201980032267 A CN 201980032267A CN 112119310 A CN112119310 A CN 112119310A
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Abstract

提供了通过质谱检测嗜铬粒蛋白A的方法。在另一个方面，本文提供了通过质谱定量嗜铬粒蛋白A的方法。在另一个方面，本文提供了通过质谱用于神经内分泌肿瘤的预后或测量其尺寸的方法。

Description

通过质谱检测嗜铬粒蛋白A的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月16日提交的美国临时申请号62/644,210的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
嗜铬粒蛋白-A(CgA)是在神经内分泌组织的分泌颗粒中表达的50kDa酸性糖蛋白。目前，CgA的血液水平主要使用多种免疫测定测量。然而，与任何基于抗体的测定一样，由非特异性结合和要求样品稀释的动态范围降低所引起的局限性造成在诊断实验室中实施这类测试的障碍。
需要一种精确且灵敏的用于定量嗜铬粒蛋白A的方法。
发明内容
本文提供了通过质谱用于检测或确定样品中嗜铬粒蛋白A(CgA)的量的方法，包括串联质谱。
在某些实施方式中，本文提供的方法是用于检测或确定嗜铬粒蛋白A(CgA)的量，其包括(a)纯化样品中的CgA；(b)通过质谱电离CgA以产生可检测的离子；和(c)通过质谱检测或确定CgA离子(一种或多种)的量；其中CgA离子(一种或多种)的量与样品中CgA的量相关。
在一些实施方式中，本文提供的方法是用于检测或确定嗜铬粒蛋白A(CgA)的量，其包括(a)对样品进行固相萃取；(b)酶消化该CgA；(c)对样品进行液相色谱；(d)通过质谱电离CgA以产生可检测的离子；和(e)通过质谱检测或确定CgA离子(一种或多种)的量；其中CgA离子(一种或多种)的量与样品中CgA的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括选择反应监测(SRM)质谱。
在一些实施方式中，本文提供的方法是完全自动化的。
在一些实施方式中，本文提供的方法是无抗体的方法。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括使用固相萃取(SPE)萃取血清。在一些实施方式中，SPE是阴离子交换固相萃取。在一些实施方式中，SPE是混合模式阴离子交换固相萃取。在一些实施方式中，将萃取的样品浓缩。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱。在一些实施方式中，液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方式中，液相色谱包括高湍流液相色谱(HTLC)。
在一些实施方式中，萃取的样品经过酶消化。在一些实施方式中，萃取的样品被胰蛋白酶酶消化。
在一些实施方式中，电离包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有593.2±0.5的质荷比的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有729.6±0.5的质荷比的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量嗜铬粒蛋白A的碎片的量。在一些实施方式中，测量的CgA碎片包括序列ELQDLALQGA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，测量的CgA碎片包括序列RRPEDQELESLSAIEAELEK(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有516.3±0.5或815.5±0.5或两者的质荷比的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有831.5±0.5或989.5±0.5或两者的质荷比的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法还包括添加内标。在一些实施方式中，该内标是同位素标记的。在一些实施方式中，该内部标记包括C13N15标记的氨基酸。在一些实施方式中，该内标标记在亮氨酸(L)或赖氨酸(K)上。在一些实施方式中，该内标包括序列ILSILRHQNLLKELQDLAL*QGAK*ERAHQQK(SEQ ID NO:2)，其中*是C13N15标记的氨基酸。在一些实施方式中，该内标包括序列RRPEDQELESL*SAIEAELEK*(SEQ ID NO:5)，其中*是C13N15标记的氨基酸。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有600.8±0.5的质荷比的内标前体离子和/或具有602.4±0.5、830.6±0.5或958.7±0.5的质荷比的产物离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量具有600.8±0.5的质荷比的内标前体离子和/或具有734.6±0.5、839.5±0.5或997.6±0.5的质荷比的产物离子的量。
在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于100ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于90ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于80ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于70ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于60ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于50ng/ml。
在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于50ng/ml。在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于40ng/ml。在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于35.5ng/ml。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在50ng/ml至50,000ng/ml之间范围的定量的线性。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括CV≤15％的测定间和测定内重现性。
在一些实施方式中，CgA在质谱之前不被衍生化。
在一些实施方式中，该样品是体液。在一些实施方式中，该样品是脑脊髓液(CSF)。在一些实施方式中，该样品是血浆或血清。在一些实施方式中，该样品是全血。在一些实施方式中，该样品是唾液或尿液。
在一些实施方式中，该方法可包括以足以去除该样品中的蛋白质的量向该样品中添加试剂。
在一些实施方式中，与参考范围相比，升高的嗜铬粒蛋白A水平指示了神经内分泌肿瘤(NET)的风险增加。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示了神经内分泌肿瘤的尺寸。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示了神经内分泌肿瘤的肿瘤负荷。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示了神经内分泌肿瘤的治疗响应。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示了神经内分泌肿瘤的预后。
如本文所使用的，除非另外描述，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”、“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种蛋白质”包含多种蛋白质分子。
如本文所使用的，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”不是指从该样品中去除目标分析物以外的所有材料。相反，纯化指相比于样品中的可能干扰目标分析物的检测的其他组分，富集一种或多种目标分析物的量的过程。本文中的样品通过多种方法被纯化以允许去除一种或多种干扰物质，例如一种或多种会干扰通过质谱所选的CgA母离子和子离子的检测的物质。
如本文所使用的，术语“测试样品”指可包含CgA的任何样品。如本文所使用的，术语“体液”表示可以从个体的身体中分离的任何液体。例如，“体液”可包含血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪水、汗水等。
如本文所使用的，术语“衍生化”表示使两种分子反应以形成新的分子。衍生化试剂可包含异硫氰酸酯基团、二硝基氟苯基、硝基苯氧基羰基和/或苯二醛基等。
如本文所使用的，术语“色谱”指液体或气体承载的化学混合物流动在固定液相或固相周围或之上时因为化学实体的差别分布被分离成组分。
如本文所使用的，术语“液相色谱”或“LC”表示当流体均匀渗透通过精细分离的物质的柱或穿过毛细管时选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞是在该流体相对于固定相(一个或多个)移动时，由该混合物的组分在一个或多个固定相和体相流体(即流动相)之间的分布引起的。“液相色谱”的实例包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)和高湍流液相色谱(HTLC)。
如本文所使用的，术语“高效液相色谱”或“HPLC”是指其中通过使流动相在压力下通过固定相(通常是致密填充柱)来增加分离度的液相色谱。
如本文所使用的，术语“高湍流液相色谱”或“HTLC”是指利用通过柱填充物的被测试材料的湍流作为进行分离的基础的色谱形式。在质谱分析之前，已经在包含两种未命名药物的样品的制备中应用了HTLC。参见，例如Zimmer et al.,J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；也参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其中进一步解释了HTLC。本领域技术人员理解“湍流”。当流体缓慢且平稳地流动时，该流体被称为“层流”。例如，在低流速下流过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体中颗粒的运动是有序的，颗粒通常沿直线移动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体的摩擦力而产生了湍流。未接触不规则边界的流体“超过”因摩擦而变慢或因不平坦表面而偏转的流体。当流体湍流地流动时，它以涡流和漩涡(或涡旋)的形式流动，比层流时的“阻力”更大。许多参考资料可用于帮助确定何时流体流动是层流或湍流的(例如Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000)；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu&Julian Scott,CambridgeUniversity Press(2001))。
如本文所使用的，术语“气相色谱”或“GC”指这样的色谱，在该色谱中样品混合物被汽化并注入载气(如氮气或氦气)的蒸汽中，该载气的蒸汽流过含有由液体或颗粒固体组成的固定相的柱，并切样品混合物根据化合物与该固定相的亲和力被分离成它的组成化合物。
如本文所使用的，术语“大颗粒柱”或“萃取柱”指包含平均颗粒直径大于约35μm的颗粒的色谱柱。如本文所使用的，术语“约”表示±10％。在优选的实施方式中，柱包含直径约60μm的颗粒。
如本文所使用的，术语“分析柱”指色谱柱，该色谱柱具有足够的色谱板以影响从该柱上洗脱的样品中材料的分离足以允许确定分析物的存在或量。这种柱经常与“萃取柱”区分开，其具有的一般目的是从非保留材料中分离或萃取保留材料，以获得纯化的样品用于进一步分析。如本文所使用的，术语“约”表示±10％。在优选的实施方式中，该分析柱包含直径约4μm的颗粒。
如本文所使用的，术语“线上”或“在线”，例如在“线上自动化方式”或“线上萃取”中使用的，是指无须操作员干预进行的流程。相反，如本文所使用的，术语“离线”指需要操作员干预的流程。因此，如果样品进行沉淀，并且上清液随后被人工上样进自动进样器，该沉淀和上样步骤与随后的步骤离线。在该方法的多个实施方式中，一个或多个步骤可以以线上自动化方式进行。
如本文所使用的，术语“质谱”或“MS”指通过化合物的质量确定化合物的分析技术。MS指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离该化合物以形成带电化合物；和(2)检测该带电化合物的分子量并计算质荷比。该化合物可被电离并通过任何合适的方式检测。“质谱”通常包括电离器和离子检测器。通常，一个或多个目标分子被电离，而且随后将这些离子引入质谱仪中，由于磁场和电场的组合，这些离子沿着空间中的路径运动，该路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。参见，例如美国专利号6,204,500,标题为“Mass Spectrometry From Surfaces；”6,107,623，标题为“Methods andApparatus for Tandem Mass Spectrometry；”6,268,144，标题为“DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry；”6,124,137，标题为“Surface-Enhanced PhotolabileAttachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes；”Wright etal.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76(1999)；和Merchant andWeinberger,Electrophoresis 21:1164-67(2000)。
如本文所使用的，术语“以阴离子模式运行”指在质谱方法中产生阴离子并且检测阴离子的质谱方法。术语“以阳离子模式运行”指在质谱方法中产生阳离子并且检测阳离子的质谱方法。
如本文所使用的，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”指产生分析离子的过程，分析离子具有等于一个或多个电子单位的净电荷。阴离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的分析离子，而阳离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的分析离子。
如本文所使用的，术语“电子电离”或“EI”指气相或蒸汽相的目标分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的冲击产生分析离子，其随后可以被用于质谱技术。
如本文所使用的，术语“化学电离”或“CI”指使反应气体(例如氨气)受到电子冲击，而通过反应气体离子与分析分子的相互作用形成分析离子的方法。
如本文所使用的，术语“快原子轰击”或“FAB”指高能原子束(通常是Xe或Ar)冲击非挥发性样品，使样品中所含分子解吸并电离。测试样品溶解在粘性液体基质中，例如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。为化合物或样品选择合适的基质是一个经验过程。
如本文所使用的，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”指其中使非挥发性样品暴露于激光辐射的方法，该激光辐射通过多种电离途径解吸和电离样品中的分析物，包括光电离、质子化、去质子化和集团衰变。对于MADLI，样品与能量吸收基质混合，该能量吸收基质促进分析分子的解吸。
如本文所使用的，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指其中非挥发性样品被暴露在激光辐射中的另一种方法，该激光辐射通过多种电离途径解吸并电离样品中的分析物，包括光电离、质子化、去质子化和集团衰变。对于SELDI，样品通常与优先保留一种或多种目标分析物的表面结合。如在MALDI中，该过程可采用能量吸收材料来促进电离。
如本文所使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”指其中溶液沿短长度的毛细管通过，到达施加了高正电势或高负电势的末端的方法。到达管的末端的溶液被蒸发(雾化)成在溶剂蒸汽中的溶液小滴的喷流或喷雾。该液滴的雾流经蒸发室，该蒸发室被轻微加热以防止冷凝并蒸发溶剂。随着液滴变小，表面电荷密度增加，直到相同电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放。
如本文所使用的，术语“大气压化学电离”或“APCI”指类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过发生在大气压的等离子体内的离子-分子反应产生离子。该等离子体通过在喷雾毛细管和反电极之间的放电来维持。之后通过使用一系列差分泵送分离器段，离子通常被提取到质量分析器中。干燥和预热的N2气体的逆流可用于改善溶剂的去除。在分析极性较小的物质时，APCI中的气相电离比ESI更有效。
如本文所使用的，术语“大气压光电离”或“APPI”是指其中分子M的光电离的机理是光子吸收和电子喷射以形成分子离子M+的质谱形式。因为通常光能刚好在电离电势之上，因此分子离子不易解离。在许多情况下，无需色谱即可分析样品，从而节省大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂存在时，分子离子可以提取H形成MH+。如果M具有高质子亲和力，则倾向于发生这种情况。这不会影响定量准确度，因为M+和MH+的总和是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常以MH+的形式观察到，而非极性化合物(例如萘或睾酮)通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.and Bruins,A.P.(2000):参见，例如,Robb et al.,Atmosphericpressure photoionization:An ionization method for liquid chromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-3659.
如本文所使用的，术语“感应耦合等离子体”或“ICP”指其中样品与部分电离的气体在足够高的温度相互作用以使大多数元素被原子化和离子化的方法。
如本文所使用的，术语“场解吸”指其中非挥发性测试样品被放置在离子化表面上，并且使用强电场来产生分析离子的方法。
如本文所使用的，术语“解吸”指从表面上去除分析物和/或使分析物进入气相。
如本文所使用的，术语“量化限”、“定量限”或“LOQ”指测量变得定量上有意义的点。在该LOQ的分析物响应是可识别的、离散且可重现的，具有20％的精度和在80％至120％之间的准确度。
如本文所使用的，术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其相关联的不确定性的点。该LOD被任意地定义为与零浓度的2个标准偏差(SD)。
如本文所使用的，体液样品中CgA的“量”一般指反映体液体积中可检测的CgA的质量的绝对值。然而，量也预期相比于另一CgA量的相对量。例如，体液中CgA的量可以是大于或小于正常存在的CgA的对照水平或正常水平。
如本文所使用的，关于定量测定中的术语“约”，该定量测定不包含测量离子的质量，指指示值的正负10％。质谱仪在确定给定分析物的质量方面可能会略有不同。在离子的质量或离子的质量/电荷比的上下文中，术语“约”是指+/-0.5原子质量单位。
上面描述的本发明的发明内容是非限制性的，并且从下面的具体实施方式和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1示出了CgA LC-MS/MS的分析工作流程。带负电的CgA在其他蛋白质被洗掉而它被保留后通过静电相互作用、亲脂性相互作用和亲水性相互作用与混合模式阴离子交换树脂结合。在洗脱后，使用胰蛋白酶消化分离的CgA并通过LC-MS/MS分析定量代表性肽。
图2示出了在独立的三天内的三个校准曲线。线性范围被证明为50至50,000ng/ml。CV小于10％。
图3示出了对应于具有正常(顶部)和高(底部)CgA值的患者样本的色谱图。
图4示出了相比于通过LC-MS/MS获得的值的平均ELISA免疫测定值。
图5示出了CisBio免疫测定法和LC-MS/MS CgA实验(Passing&Bablok曲线拟合，308个样品)之间的比较。
图6示出了通过LC-MS/MS确定的正常和异常CgA水平的峰面积图。
图7示出了嗜铬粒蛋白内标的实例色谱图。
具体实施方式
在存在神经内分泌源性肿瘤(NET)时，CgA的水平增加，使CgA能作为监测患有NET的患者的有用血清标志物。血清CgA的循环水平与肿瘤负荷成正比，提供治疗响应中的预后信息。本文中描述了一种新颖的、完全自动化的、无需抗体的LC-MS/MS测定以定量血清中的嗜铬粒蛋白-A。利用CgA的酸性，在添加内标后使用阴离子交换固相萃取板萃取100μL的血清。萃取的样品之后被浓缩并使用胰蛋白酶进行酶消化。对CgA独特的肽之后被色谱溶解并通过在Sciex 6500+Qtrap上的SRM分析。分析物峰面积与同位素标记的内标峰面积之比被用于实现定量。CgA在宽的范围内显示为线性(50-50000ng/ml，R2≥0.99)，以及测定间和测定内重现性(CV≤15％)。分析了300个患者样品的队列以将通过Cisbio CGA-ELISA-US免疫测定法测量的CgA血清值与LC-MS/MS测定测量的CgA血清值进行比较。当比较该队列中免疫测定法和LC-MS/MS测量的CgA时，观察到R2为0.71，表明两个测定平台之间具有良好的相关性。
在某些实施方式中，本文提供的方法是用于检测或确定嗜铬粒蛋白A(CgA)的方法，其包括(a)纯化样品中的CgA；(b)通过质谱电离CgA以产生可检测的离子；和(c)通过质谱检测或确定CgA离子(一种或多种)的量；其中CgA离子(一种或多种)的量与样品中CgA的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的方法是用于检测或确定嗜铬粒蛋白A(CgA)的方法，其包括(a)对样品进行固相萃取；(b)酶消化CgA；(c)对CgA进行液相色谱；(d)通过质谱电离CgA以产生可检测的离子；和(e)通过质谱检测或确定CgA离子(一种或多种)的量；其中CgA离子(一种或多种)的量与样品中CgA的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括选择反应监测(SRM)质谱。
在一些实施方式中，本文提供的方法是完全自动化的。
在一些实施方式中，本文提供的方法是无抗体的方法。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括使用固相萃取(SPE)萃取血清。在一些实施方式中，SPE是阴离子交换固相萃取。在一些实施方式中，SPE是混合模式阴离子交换固相萃取。在一些实施方式中，萃取样品被浓缩。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱。在一些实施方式中，液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方式中，该液相色谱包括高湍流液相色谱(HTLC)。
在一些实施方式中，萃取的样品是酶消化的。在一些实施方式中，萃取的样品通过胰蛋白酶进行酶消化。
在一些实施方式中，电离包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为593.2±0.5的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为729.6±0.5的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量嗜铬粒蛋白A碎片的量。在一些实施方式中，测量的CgA碎片包括序列ELQDLALQGA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，测量的CgA碎片包括序列RRPEDQELESLSAIEAELEK(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为516.3±0.5或815.5±0.5或两者的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为831.5±0.5或989.5±0.5或两者的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法还包括添加内标。在一些实施方式中，该内标是同位素标记。在一些实施方式中，该内标包括C13N15标记的氨基酸。在一些实施方式中，该内标标记在亮氨酸(L)或赖氨酸(K)上。在一些实施方式中，该内标包括序列ILSILRHQNLLKELQDLAL*QGAK*ERAHQQK(SEQ ID NO:2)，其中*是C13N15标记的氨基酸。在一些实施方式中，该内标包括序列RRPEDQELESL*SAIEAELEK*(SEQ ID NO:5)，其中*是C13N15标记的氨基酸。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为600.8±0.5的内标前体离子和/或质荷比为602.4±0.5、830.6±0.5、或958.7±0.5的产物离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为600.8±0.5的内标前体离子和/或质荷比为734.6±0.5、839.5±0.5、或997.6±0.5的产物离子的量。
在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于100ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于90ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于80ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于70ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于60ng/ml。在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于50ng/ml。
在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于50ng/ml。在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于40ng/ml。在一些实施方式中，该方法的检测限小于或等于35.5ng/ml。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在50ng/ml至50,000ng/ml之间的范围内的定量线性。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括CV≤15％的测定间和测定内重现性。
在一些实施方式中，在质谱之前CgA不被衍生化。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是脑脊髓液(CSF)。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿液。
在一些实施方式中，该方法可包含以足以去除样品中的蛋白的量向样品中添加试剂。
在一些实施方式中，相比于对照范围升高的嗜铬粒蛋白A的水平指示神经内分泌肿瘤(NET)的风险增加。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示神经内分泌肿瘤的尺寸。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示了神经内分泌肿瘤的肿瘤负荷。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示对神经内分泌肿瘤的治疗响应。在一些实施方式中，嗜铬粒蛋白A的定量水平指示神经内分泌肿瘤的预后。
合适的测试样品包括任何可包含目标分析物的测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；即从任何生物来源获得的样品，例如动物、细胞培养、器官培养等。在某些优选的实施方式中，从例如狗、猫、马等哺乳动物中获得样品。特别优选的哺乳动物是灵长类动物，最优选的是男性或女性人类。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、头发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液或其他组织样品。这些样品可以获得自，例如患者；即在临床环境中出现以诊断、预后或治疗疾病或病症的男性或女性活人。测试样品优选地从患者获得，例如血清。
用于质谱的样品制备
可用于相对于样品中的其他组分(例如蛋白质)富集CgA的方法包括例如过滤、离心、薄层色谱(TLC)、电泳，电泳包括毛细管电泳、亲和分离，亲和分离包括免疫亲和分离、萃取方法，萃取方法包括乙酸乙酯萃取和甲醇萃取以及使用离液剂或以上等的任何组合。
蛋白质沉淀是制备测试样品的一个优选方法。这种蛋白质纯化方法是本领域众所周知的，例如，Polson et al.,Journal of Chromatography B 785:263-275(2003)描述了适合用于该方法中的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可用于从样品中去除大多数蛋白质，使CgA留在上清液中。该样品可被离心以从沉淀的蛋白质分离液体上清液。得到的上清液之后可用于液相色谱和随后的质谱分析。在某些实施方式中，使用蛋白质沉淀例如乙腈蛋白质沉淀，避免了在HPLC和质谱法之前对高湍流液相色谱(HTLC)或其他线上提取的需要。因此在这种实施方式中，该方法包括(1)对目标样品进行蛋白质沉淀；和(2)将上清液直接上样到HPLC-质谱仪上，而无需使用线上萃取或高湍流液相色谱(HTLC)。
在一些优选的实施方式中，HPLC，单独或与一种或多种纯化方法组合，可用于在质谱之前纯化CgA。在这些实施方式中，可使用捕获分析物的HPLC萃取柱萃取样品，然后在电离之前，在第二HPLC柱上或在分析HPLC柱上洗脱和色谱分析。因为这些色谱流程包含的步骤可以以自动化方式连接，样品纯化期间所需的相关操作员可以被最小化。该特征可以产生时间和成本的节约，并消除操作员失误的机会。
应该相信，湍流，例如HTLC柱和方法提供的，可促进质量传递的速率，改善分离特性。HTLC柱通过穿过包含刚性颗粒的填充柱的高色谱流动速率来分离组分。通过应用高流动速率(例如3-5ml/min)，湍流在该柱中发生，其使固定相和目标分析物之间几乎完成相互作用。使用HTLC柱的优点在于避免了与生物流体基质相关的大分子堆积，因为在湍流条件下不会保留高分子量物质。在一个流程中组合多种分离的HTLC方法减少了冗长的样品制备需求并以更大的速度操作。这种方法也实现了优于层流(HPLC)色谱的分离性能。HTLC允许生物样品(血清、尿液等)的直接注射。直接注射在传统形式的色谱中难以实现，因为变性的蛋白质和其他生物碎片会快速堵住分离柱。HTLC也允许小于1ml、优选地小于0.5ml、优选地小于0.2ml、优选地0.1ml的非常低的样品体积进行。
在别处已描述了在质谱分析之前HTLC应用于样品制备的实施例。参见，例如Zimmer et al.,J.Chromatogr.A854:23-35(1999)；也参见，美国专利号5,968,367；5,919,368；5,795,469；和5,772,874。在该方法的某些实施方式中，在将样品上样到HTLC柱之前如上文对样品进行蛋白质沉淀；在可选的优选实施方式中，样品可以无需进行蛋白质沉淀直接上样到HTLC上。该HTLC萃取柱优选的是大颗粒柱。在多种实施方式中，该方法的一个或多个步骤可以以线上、自动化的方式进行。例如，在一个实施方式中，步骤(i)-(v)以线上、自动化的方式进行。在另一个实施方式中，电离和检测的步骤在步骤(i)-(v)之后线上进行。
液相色谱(LC)包括依赖于相对慢的层流技术的高效液相色谱(HPLC)。传统的HPLC分析依赖于柱填料，其中样品穿过柱的层流是从样品中分离目标分析物的基础。技术人员将理解，在这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已经成功地应用于分离生物样品中的化合物，但是在分离和随后的质谱分析之前需要大量的样品制备，使该技术劳动密集。另外，大多数HPLC系统没有利用质谱到其最大潜力，仅将一个HPLC系统连接到单个MS设备上，导致执行大量测定所需的时间很长。
已经描述了用于在质谱分析之前使用HPLC进行样品清洗的各种方法。参见，例如Taylor et al.,Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12(2000)；和Salm et al.,Clin.Therapeutics 22Supl.B:B71-B85(2000)。
本领域技术人员可选择适合与CgA使用的HPLC仪器和柱。该色谱柱通常包括介质(即填料)以促进化学部分的分离(即分级)。该介质可包括微小的颗粒。该颗粒包括与多种化学部分相互作用的键合表面以促进该化学部分的分离。一种合适的键合表面是疏水键合表面，例如烷基键合表面。烷基键合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18键合的烷基基团，优选的是C-18键合基团。该色谱柱包括用于接受样品的入口和用于排出包括分级后的样品的洗脱物的出口。在一个实施方式中，将该样品(或预纯化样品)应用于柱的入口，使用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口排出。为了洗脱目标分析物(一种或多种)可选择不同的溶剂模式。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多度模式(即混合)进行液相色谱。在色谱期间，材料的分离受到例如洗脱剂(也被称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等变量的影响。
在某些实施方式中，在目标分析物被柱填料可逆的保留，而一种或多种其他材料不被保留的条件下可以将样品施加于柱内来纯化分析物。在这些实施方式中，可以应用第一流动相条件，其中柱保留目标分析物，一旦非保留材料被洗涤后可应用第二流动相条件以去除由该柱保留的物质。可选地，通过在其中目标分析物以相比于一种或多种其他材料不同的速率洗脱的流动相条件下，施加样品于柱内可以纯化分析物。这样的流程可以相对于一种或多种其他样品组分富集一种或多种目标分析物的量。
在一个优选的实施方式中，在疏水柱色谱系统中HTLC之后可以是HPLC。在某些优选的实施方式中，使用了来自Cohesive Technologies的TurboFlow Cyclone
Figure BDA0002776579050000101
聚合物基柱(粒径60μm、柱尺寸50x 1.0mm、孔径
Figure BDA0002776579050000102
)。在相关的优选实施方式中，使用来自Phenomenex Inc.的具有亲水性封端的Synergi
Figure BDA0002776579050000103
醚连接的苯基分析柱(粒径4μm、柱尺寸150x 2.0mm、孔径
Figure BDA0002776579050000104
)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100％甲醇作为流动相进行HTLC和HPLC。
通过小心选择阀门和连接器管道，根据需要可以连接两个或多个色谱柱，使得该材料通过一个色谱柱到下一个色谱柱无需任何人工步骤。在优选的实施方式中，阀门和管道的选择受到电脑控制，该电脑被预编程以进行必要的步骤。最优选的，该色谱系统也以这种在线方式连接到检测系统，例如MS系统。因此，操作员可以将一托盘样品放在自动进样器内，且剩下的操作可在电脑控制下进行，从而纯化和分析所选的所有样品。
在某些优选的实施方式中，样品中的CgA或其碎片可以在电离前被纯化。在特别优选的实施方式中，该色谱不是气相色谱。
通过质谱检测和定量
在多种实施方式中，CgA或其碎片可以通过技术人员已知的任何方法电离。使用质谱仪进行质谱，该质谱仪包括离子源，其用于电离分级的样品并形成用于进一步分析的带电分子。例如，可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离来进行样品的电离。技术人员将理解可基于被测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正负模式的选择来确定电离方法的选择。
在优选的实施方式中，CgA或其碎片通过正模式或负模式的电喷雾电离被电离。
在样品被电离后，可以分析由此产生的带正电的离子或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的合适分析器包括四极分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。该离子可以使用几种检测模式检测。例如，可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测所选的离子、或可选地可以使用扫描模式检测离子，例如多重反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。优选地，使用四极分析仪确定质荷比。例如，在“四极杆”或“四极离子阱”仪器中，振荡的射频场中的离子会受到与施加在电极之间的DC电势、RF信号的振幅以及质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅使得只有具有特定质/荷比的离子才能通过四极杆的长度，而所有其他离子都将发生偏转。因此，四极杆仪器可用作注射进仪器中的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”。
人们可以通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”来增强MS技术的分辨率。在该技术中，在MS仪器中可以过滤由目标分子产生的前体离子(也被称为母离子)，且该前体离子随后被破碎以产生一个或多个碎片离子(也被称为子离子或产物离子)，之后在第二MS流程中分析该碎片离子。通过仔细选择前体离子，仅有某些分析物产生的离子会进入碎片室，在该碎片室中与惰性气体原子碰撞产生碎片离子。因为在给定的一系列电离/破碎条件下前体离子和碎片离子二者都以可再生的方式产生，MS/MS技术可以提供十分强大的分析工具。例如，过滤/破碎的组合可用于消除干扰物质，并且在复杂样品例如生物样品中特别有用。
质谱仪通常为使用者提供离子扫描；即在给定范围(例如100至1000amu)内具有特定质荷比的每个离子的相对丰度。该分析测试的结果，即质谱，可以与原始样品通过本领域已知的许多方法的分析物的量相关。例如，假设给定的上样和分析参数被仔细控制，可以将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转换为该原始分子的绝对量的表格进行比较。可选地，可以将分子标准品与样品一起运行，并且基于从这些标准品产生的离子构建标准曲线。使用该标准曲线，给定离子的相对丰度可以被转换为该原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于产生用于计算CgA含量的标准曲线。产生并使用这种标准曲线的方法在本领域是众所周知的并且普通技术人员能选择合适的内标。例如，CgA的同位素可用作内标。用于关联离子的量和原始分子的量的许多其他方法对于本领域普通技术人员是显而易见的。
该方法的一个或多个步骤可使用自动化机器进行。在某些实施方式中，一个或多个纯化步骤线上进行，并且更优选的所有纯化和质谱步骤以线上方式进行。
在某些实施方式中，例如MS/MS，其中前体离子被分离用于进一步破碎，碰撞活化解离通常被用于产生碎片离子以用于进一步的检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程破碎。必须在前体离子中沉积足够的能量，使得离子中的某些键因为增加的振动能量而断裂。
在特定优选的实施方式中，如下文使用MS/MS检测和定量CgA。使用液相色谱处理样品，优选的用HPLC，来自色谱柱的液体溶剂流动进入蒸发MS/MS分析器的加热雾化器接口并且该溶剂/分析物混合物在接口的加热管内被转换成蒸汽。通过选择的电离器，将分析物电离。离子，例如前体离子，通过仪器的孔进入第一四级杆。四级杆1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，可以根据它们的质量与电荷的比值(m/z)来选择离子(即“前体”和“碎片”离子)。四级杆2(Q2)是碰撞室，在此离子被破碎。该质谱仪的第一四级杆(Q1)选择具有CgA的质荷比的分子。允许具有CgA的正确的质/荷比的前体离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其他质/荷比的不需要的离子碰撞四级杆的侧面而被消除。进入Q2的前体离子与中性氩气分子碰撞并破碎。该过程被称为碰撞激活解离(CAD)。产生的碎片离子进入四级杆3(Q3)，在此处CgA的碎片离子被选择而其他离子被消除。
该方法可涉及以阳离子模式或阴离子模式进行MS/MS。使用本领域已知的标准方法，普通技术人员能鉴定可用于选择四级杆3(Q3)中的CgA的特定前体离子的一个或多个碎片离子。
当离子与检测器碰撞时，它们产生电子脉冲，电子脉冲被转换成数字信号。得到的数据传输到计算机中，该计算机绘制收集的离子数与时间的关系图。得到的质谱图类似于传统HPLC方法产生的色谱图。测量与特定的离子对应的峰下面积或该峰的幅度，并且将该面积或幅度与目标分析物的量相关。在某些实施方式中，碎片离子和/或前体离子的曲线下的面积或该峰的幅度被测量以确定CgA的量。如上文所述，使用基于内标分子的一种或多种离子峰校准标准曲线，可以将给定离子的相对丰度转换成原始分析物的绝对量。
以下实施例用于说明本发明。这些实施例绝不旨在限制本方法的范围。
实施例
实施例1：通过质谱定量CgA
试剂概括
Figure BDA0002776579050000121
使用Sciex 6500+QTrap质谱、具有Agilent泵的Thermo Fisher Aria CohesiveTLX4、Hamilton Microlab Star、SPEware IP8来检测CgA。
将患者血清(100μL)添加进600μL的120mM碳酸氢铵中，并且使用混合模式的阴离子交换板(Waters
Figure BDA0002776579050000131
MAX 30mg)来萃取整个体积。之后用3％氢氧化铵和水分别洗涤样品两次。接下来，洗脱CgA、添加内标(IS)并且在加热的氮气中蒸发该样品。
在干燥后，样品在快速酶消化微波系统(Hudson Technology)中重构、还原、烷基化并通常消化两小时。
在消化后，酸化样品并通过在Aria TLX-4Transcend UPLC上的LC-MS/MS分析样品。使用Thermo Accucore C18 100×2.1mm，2.6微米HPLC柱，使用水/乙腈/0.1％甲酸梯度来溶解肽段。MS检测器是Sciex 6500+QTrap。CgA的定量基于MS/MS期间产生的碎片离子的色谱峰，该碎片离子对应于代表性的胰蛋白酶肽及其相应的重标记IS。在图1中总结分析工作流程。
使用多重反应监测来检测分析物和内标(IS)。
使用峰面积比值和校准曲线来确定嗜铬粒蛋白A(CgA)的浓度。
在检测ELQDLALQGAK(SEQ ID NO：1)的测定中，使用了标记的翼状肽内标：ILSILRHQNLLKELQDLAL＊QGAK＊ERAHQQK(SEQ ID NO：2)：*C13N15标记的氨基酸。在消化后，得到的肽是ELQDLAL*QGAK*(SEQ ID NO：3)。
在检测RRPEDQELESLSAIEAELEK(SEQ ID NO：4)的测试中，使用了标记的翼状肽内标：EGSANRRPEDQELESL＊SAIEAELEK*VAHQL(SEQ ID NO：5)；*C13N15标记的氨基酸。在消化后，得到的肽是RRPEDQELESL*SAIEAELEK*(SEQ ID NO：6)。
表1：用于量化样品和前体离子和产物离子中的CgA水平的CgA碎片(质荷比m/z)
分析物 前体离子(m/z) 产物离子(m/z)
CgA：ELQDLALQGAK 593.2 516.3，815.5
CgA IS：ELQDLAL*QGAK* 600.8 602.4，830.6，958.7
表2：用于量化样品和前体离子和产物离子中的CgA水平的CgA碎片(质荷比m/z比例)
分析物 前体离子(m/z) 产物离子(m/z)
CgA：ELQDLALQGAK 729.6 831.5，989.5
CgA IS：ELQDLAL*QGAK* 734.6 839.5，997.6
表3：将获得的值与通过ELISA免疫测定定量的值比较。也参见图4。
Figure BDA0002776579050000141
分析来自308例患者的样品以比较Cisbio CGA-ELISA-US免疫测定法(Codolet,France)测量的CgA血清值和来自我们的LC-MS/MS测定的值。
在对测量值进行自然对数转换后，在308例患者中观察到正态分布。对这些数据进行配对的t检验，并通过Pearson相关系数和Passing&Bablok曲线拟合来测量分析之间的一致性。所有分析均在Analyse-it v2.30中进行。
验证该测定。在表4中示出性能特征。
Figure BDA0002776579050000142
Figure BDA0002776579050000151
图3示出了具有低浓度和高浓度的循环CgA的患者样品的典型结果。
尽管存在很大的散布(Pearson相关系数为0.76)，LC-MS/MS测量的CgA水平与Cisbio测试平均相当。
结论：我们开发并验证了完全自动化的用于血清中的LC-MS/MS测试。
本文所提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文件和电子可用信息的全文以引用的方式并入本文，其程度与每个单独的出版物被具体地和个别地指示通过引用并入一样。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文档的所有材料和信息以物理方式并入本申请的权利。
本文说明性地描述的方法可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“包含”等应被广泛地且不受限制地理解。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且不旨在使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式。应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所体现的本发明进行修改和变型，并且这种修改和变型是被认为在本发明的范围内。
已经在本文中广泛和概括地描述了本发明。落入一般公开内的每个较窄的种类和亚类分组也形成所述方法的一部分。这包括所述方法的一般性描述，所述方法具有从属中删除任何主题的附带条件或负面限制，而不管本文中是否具体叙述了离体材料。
其他实施方式在以下权利要求书之内。另外，在本方法的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域普通技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。
序列表
<110> 奎斯特诊断投资有限公司
<120> 通过质谱检测嗜铬粒蛋白A的方法
<130> 095275-0206
<140>
<141>
<150>
<151>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Glu Leu Gln Asp Leu Ala Leu Gln Gly Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ile Leu Ser Ile Leu Arg His Gln Asn Leu Leu Lys Glu Leu Gln Asp
1 5 10 15
Leu Ala Leu Gln Gly Ala Lys Glu Arg Ala His Gln Gln Lys
20 25 30
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Glu Leu Gln Asp Leu Ala Leu Gln Gly Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Glu Gly Ser Ala Asn Arg Arg Pro Glu Asp Gln Glu Leu Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ile Glu Ala Glu Leu Glu Lys Val Ala His Gln Leu
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Arg Arg Pro Glu Asp Gln Glu Leu Glu Ser Leu Ser Ala Ile Glu Ala
1 5 10 15
Glu Leu Glu Lys
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Arg Arg Pro Glu Asp Gln Glu Leu Glu Ser Leu Ser Ala Ile Glu Ala
1 5 10 15
Glu Leu Glu Lys
20

Claims (31)

1.一种用于确定样品中嗜铬粒蛋白A(CgA)的量的方法，所述方法包括：
(a)纯化样品中的CgA；
(b)电离CgA以产生可通过质谱检测的CgA的一种或多种离子；
(c)通过质谱确定来自步骤(b)的所述离子的量，其中离子的量与样品中CgA的量有关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括通过固相萃取(SPE)进行萃取。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述SPE是阴离子交换固相萃取。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述SPE是混合模式阴离子交换固相萃取。
5.根据权利要求2所述的方法，其中萃取的样品被酶消化。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述消化包括胰蛋白酶消化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括液相色谱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述液相色谱包括高湍流液相色谱(HTLC)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离包括电喷雾电离(ESI)。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括添加内标。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述内标是同位素标记的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是脑脊髓液(CSF)。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测量具有729.6±0.5的质荷比的前体离子的量。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测量CgA碎片的量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中测量的CgA碎片包括序列RRPEDQELESLSAIEAELEK(SEQ ID NO:4)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测量具有831.5±0.5或989.5±0.5的质荷比的碎片离子的量。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括添加内标。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述内标是同位素标记的。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述内标包括C13N15标记的氨基酸。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述内标被标记在亮氨酸(L)或赖氨酸(K)上。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述内标包括序列EGSANRRPEDQELESL*SAIEAELEK*VAHQL(SEQ ID NO:5)，其中L*和K*各自为C13N15标记的氨基酸。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法包括测量具有734.6±0.5的质荷比的内标前体离子或具有839.5±0.5或997.6±0.5的质荷比的产物离子的量。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法的定量限小于或等于50ng/mL。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法的检测限小于或等于35.5ng/mL。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有在50ng/mL至50,000ng/mL之间的范围内的定量线性。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有CV≤15％的测定间和测定内重现性。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱是选择反应监测(SRM)质谱。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是完全自动化的。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是无抗体的。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178562A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for detecting chromogranin a by mass spectrometry

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120128646A1 (en) * 2009-02-17 2012-05-24 Kathryn Haskins Methods and compositions for the treatment of autoimmune disease
US20140370614A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Xiaodong Liu Hilic / anion-exchange / cation-exchange multimodal media
CN104797715A (zh) * 2012-09-20 2015-07-22 奎斯特诊断投资公司 通过质谱法定量甲状腺球蛋白
CN106461673A (zh) * 2014-04-15 2017-02-22 塞尚公司 用于检测嗜铬粒蛋白a的免疫测定与抗体

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1604210A2 (en) * 2003-03-18 2005-12-14 BioVisioN AG Method for detecting alzheimer's disease and corresponding peptides and detection reagents
EP2369348A1 (en) 2003-11-07 2011-09-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for Alzheimer's disease
US20060073528A1 (en) * 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
US20070003190A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-04 Costas Saravanos Optical planar splitter
CA2654319C (en) * 2006-05-26 2014-08-12 Laboratory Corporation Of America Holdings Liquid chromatography with tandem mass spectrometry of estrone, estradiol and free thyroxine
US8916385B2 (en) 2007-12-13 2014-12-23 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting estrone by mass spectrometry
EP2656081B1 (en) 2010-12-20 2017-09-06 Cambridge Enterprise Ltd. Method and biomarkers for differentially diagnosing psychotic disorders
GB201322800D0 (en) * 2013-12-20 2014-02-05 Univ Dublin Prostate cancer biomarkers
GB201404189D0 (en) 2014-03-10 2014-04-23 Cambridge Entpr Ltd Novel biomarkers
US20180003723A1 (en) 2014-09-15 2018-01-04 Oasis Diagnostics Corporation Methods and systems for diagnosing sleep disorders
EP4033223B1 (en) 2014-10-30 2025-06-18 Waters Technologies Corporation Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines and for the analysis of glycosylated biomolecules producing the same
US10324082B2 (en) * 2015-03-03 2019-06-18 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for quantitation of insulin levels by mass spectrometry
WO2019178562A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for detecting chromogranin a by mass spectrometry

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120128646A1 (en) * 2009-02-17 2012-05-24 Kathryn Haskins Methods and compositions for the treatment of autoimmune disease
CN104797715A (zh) * 2012-09-20 2015-07-22 奎斯特诊断投资公司 通过质谱法定量甲状腺球蛋白
US20140370614A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Xiaodong Liu Hilic / anion-exchange / cation-exchange multimodal media
CN106461673A (zh) * 2014-04-15 2017-02-22 塞尚公司 用于检测嗜铬粒蛋白a的免疫测定与抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUNNAR BRINKMALM等: "A Parallel Reaction Monitoring Mass Spectrometric Method for Analysis of Potential CSF Biomarkers for Alzheimer\'s Disease", 《PROTEOMICS CLINICAL APPLICATIONS》, vol. 12, no. 1, pages 1 - 13, XP055736333, DOI: 10.1002/prca.201700131 *

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