CN112111563A - 一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法，依据实验过程将相关试剂预混后形成预混试剂装入试剂盒，能够有效的简化实验操作步骤，同时通过对预混试剂组分进行针对性调整实现试剂在冷藏条件下的长期有效保存，避免实验使用试剂盒时需要反复冻融的繁琐操作，使实验流程显著简化。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测文库制备技术领域，尤其涉及一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput Sequencing)是一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又称下一代测序技术(Next-Generation Sequencing)、二代测序技术，其使得可对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。
现有用于高通量测序的试剂盒均着眼于实验基本原理，试剂盒除磁珠外均放置于-20度保存，使用时需要对试剂盒成分进行预先的常温解冻后配置组分再进行后续的操作，特别是一些情况下需要进行反复的冻融、配比，试剂盒中独立储存试剂种类多，使用过程涉及不同试剂的融化及混匀离心，操作复杂且对操作环境要求也较高。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提出一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法，依据实验过程将相关试剂预混后形成预混试剂装入试剂盒，能够有效的简化实验操作步骤，同时通过对预混试剂组分进行针对性调整实现试剂在冷藏条件下的长期有效保存，避免实验使用试剂盒时需要反复冻融的繁琐操作，使实验流程显著简化。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
一种冷藏保存预混试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有的预混试剂组分包括末端补平与连接组分、接头组分、连接酶组分和PCR组分；
所述末端补平与连接组分包括末端补平与加A缓冲液、末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述接头组分包括连接缓冲液、接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述连接酶组分包括连接酶、连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述PCR组分包括接头引物、PH8Tris缓冲液和扩增反应液的预混试剂。
进一步地，
所述末端补平与连接组分包括3.5uL的末端补平与加A缓冲液、1.5uL的末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油；
所述接头组分包括10uL的连接缓冲液、2uL浓度为15umol/L的接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油；
所述连接酶组分包括10uL的连接酶、10uL的连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油；
所述PCR组分包括5uL终浓度为400至1000nmol/L的接头引物(P5 index Primer和P7 index Primer)、20uL的PH8Tris缓冲液和25uL的扩增反应液，所述扩增反应液包括DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP，例如可以采用包括2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer和2X dNTP的2X PCR Master Mix扩增反应液。优选的，可以先将5uL接头引物和20uL的PH8Tris缓冲液混合后，再与25uL的扩增反应液混合；扩增反应液中的PCR缓冲液为常规用于PCR扩增的缓冲液，例如可以包括Tris和镁离子。
进一步地，
所述末端补平与连接组分包括占所述末端补平与连接组分整体体积30％的甘油；
所述接头组分包括占所述接头组分整体体积30％的甘油；
所述连接酶组分包括占所述连接酶组分整体体积30％的甘油。
进一步地，所述连接酶为10至30units/uL的T4连接酶。
进一步地，所述甘油全部或部分等体积量替换为DMSO。
本发明还涉及一种冷藏保存预混试剂盒使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
将上述试剂盒保存在4℃冷藏条件下；
使用上述试剂盒进行文库构建，不需要融化试剂过程，试剂盒中各预混试剂组分经过桌面离心机5至10秒的离心操作即可直接使用在文库构建实验操作。
进一步地，所述文库构建实验操作包括：
S1、使用末端补平与连接组分对预先准备的片段化DNA样品进行末端修复与加A；
S2、使用接头组分和连接酶组分对加A后的DNA片段连接接头；
S3、对连接有接头的DNA片段进行纯化操作获得纯化的DNA片段；
S4、使用PCR组分对纯化的DNA片段进行扩增富集；
S5、对扩增富集后的DNA文库进行纯化操作获得纯化后的DNA文库。
进一步地，所述纯化操作包括：
使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化；
使用80％乙醇漂洗；
使用洗脱缓冲液或去离子水洗脱。
本发明的有益效果为：
采用本发明所述冷藏保存预混试剂盒及使用方法进行DNA文库制备实验，仅需要常规冷藏条件即可长时间保证试剂有效性，无需进行冷冻保存，简化了试剂盒保存、运输条件，在使用时，无需对试剂盒中试剂进行融化操作，避免因试剂反复冻融影响DNA文库制备实验效率；同时，经过预混操作后装入试剂盒的预混试剂组分不仅更好的支持冷藏保存试剂有效性，也简化了DNA文库制备实验操作步骤，特别是不同试剂之间的混匀过程提前完成，可以大幅提高实验效率。
附图说明
图1为本发明冷藏保存预混试剂盒使用方法流程示意图。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。
现有的试剂盒，由于需要冷冻保存以维持试剂有效性(例如酶的活性)，因此实验时不能直接使用，必须先经过融化过程。
本发明提出的冷藏保存预混试剂盒，通过不同试剂预混以及甘油的加入使试剂可以在冷藏条件下长时间保持有效性，例如存放在4℃环境中保存，使用时无需额外准备步骤，经过简短离心后可以直接用于实验，结合预混的试剂组分，大大简化了DNA文库制备实验流程。
优选的，本发明所述冷藏保存预混试剂盒包括有四种预混试剂组分，特别是将末端补平与加A试剂预混、接头连接试剂预混以及引物预混，并针对性的加入一定量的甘油(或DMSO)以提高试剂冷藏保存性，从整体上提供了一种能够有效提高DNA文库制备实验效率的试剂盒。其中甘油(或DMSO)的加入能够显著提升试剂在冷藏条件下保持有效性的能力，特别是有助于保持试剂中酶的活性，甘油(或DMSO)的加入量以占试剂总体积比计算可取10％至30％，优选的取30％，能够实现较佳的冷藏保存效果。
如图1所示为一种应用上述冷藏保存预混试剂盒在进行DNA文库构建时使用方法的优选实施例流程示意图，主要包括以下步骤：
S1、使用末端补平与连接组分对预先准备的片段化DNA样品进行末端修复与加A；
S2、使用接头组分和连接酶组分对加A后的DNA片段连接接头；
S3、对连接有接头的DNA片段进行纯化操作获得纯化的DNA片段；
S4、使用PCR组分对纯化的DNA片段进行扩增富集；
S5、对扩增富集后的DNA文库进行纯化操作获得纯化后的DNA文库。
相较使用现有技术试剂盒的实验操作，使用本发明所述冷藏保存预混试剂盒可以至少节省试剂融化解冻、不同试剂混合等操作步骤，具有更高的实验效率。
以下通过本发明所述冷藏保存预混试剂盒在基于Illumina测序平台的文库构建中的具体应用为例，进一步说明本发明能够取得的技术效果。
采用冷藏保存预混试剂盒的基于Illumina测序平台的文库构建，包括如下步骤：
1.样品准备：提取后的细胞培养DNA，后采用Covaris进行物理打断，打断后的DNA序列为200bp左右的小片段DNA。打断后的DNA片段经Ampure XP磁珠纯化，使用TE缓冲液稀释到10ng/uL的浓度，OD260/OD280＝2.0。
2.片段化DNA(DNA Fragment)末端修复与加A：经步1打断的片段化DNA稀释到合适的浓度，用末端修复与加A试剂进行末端修复并在片段化的DNA插入序列3’端加一个腺苷(A碱基)。反应体系如表1所示。
表1片段化DNA末端修复与加A反应体系
| 反应组分 | 体积(ul) |
| 末端补平与加A组分 | 10 |
| 片段化DNA样品+H2O | 20 |
| 总计 | 30 |
3.体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置20℃孵育30分钟；65℃孵育30分钟。取出反应管进行下一步反应。
4.DNA片段与接头进行连接：向经步骤(2)处理过的DNA片段及所在反应液中加入连接试剂，将接头与DNA片段连接起来。这一步骤中使用的试剂包括连接酶(Ligase)和连接反应缓冲液(Ligation缓冲液)。反应体系如表2所示。
表2接头连接反应体系
| 反应组分 | 体积(ul) |
| 上一步产物 | 30 |
| 接头组分 | 15 |
| 连接酶组分 | 10 |
| 总计 | 55 |
5.体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置20℃15min。反应结束后取出反应管进行下一步纯化过程。
6.该步骤中使用的接头序列为部分区域互补的Y字形接头，接头序列参照Illumina平台不同测序仪的接头序列：
接头1：5’-ACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATC*T
接头2：5’-pGATCGGAAGAGC ACACGTCTGAACTCCAGTC
其中，*代表硫代修饰，p代表5端磷酸化
7.DNA片段纯化：连接完成后的反应体系使用1.8×Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)进行纯化，分离出DNA文库。然后分别经过80％乙醇漂洗、EB(洗脱缓冲液)或去离子水洗脱得到纯化后的DNA文库。
8.DNA文库PCR扩增富集：纯化过的DNA文库，使用PCR扩增体系,进行洗脱，所采用的反应体系如表3所示。
表3DNA文库PCR扩增富集反应体系
| 反应组分 | 体积(ul) |
| 磁珠 | |
| PCR组分 | 50 |
| 总计 | 50 |
使用的接头引物序列为：
Primer1:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGT
Primer2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCG
其中[i5]、[i7]表示接头引物序列中的index序列，长度为8个碱基。引物序列中的部分index序列如表4所示。
表4引物序列中的index序列
| 接头名称 | i5 index | i7 index |
| IDT_Dual_Index_Adapter 81 | ATCCAGAG | CGACGTTA |
| IDT_Dual_Index_Adapter 82 | AGAGTAGC | TACGCCTT |
| IDT_Dual_Index_Adapter 83 | TGGACTCT | CCGTAAGA |
| IDT_Dual_Index_Adapter 84 | TACGCTAC | ATCACACG |
9.体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，程序设置如表5所示。
表5反应程序设置
10.DNA文库扩增产物纯化：扩增后的文库使用1×Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)进行纯化，分离出DNA文库。然后分别经过80％乙醇漂洗、EB或去离子水洗脱得到纯化后的DNA文库。
为了验证本发明所述冷藏保存预混试剂盒能够支持在较长时间内冷藏(例如4℃条件下)保持试剂有效性，采用如上所述DNA文库扩增方法对同一来源的相同类型样本分别采用不同保存期限的试剂盒进行文库扩增实验，所得结果如表6所示。作为对比的，未进行预混的现有技术建库试剂盒(如商品化建库试剂盒)在冷藏条件下(如4℃)放置较长时间后进行文库构建，所得结果如表7所示。
表6预混试剂盒文库构建实验结果
表7现有技术建库试剂盒文库构建实验结果
由表6结果可知，采用本发明的冷藏保存预混试剂盒在保存1个月至12个月之间相比，其制备得到的文库浓度差异均在可接受的误差范围内，可以得知冷藏保存12个月后的试剂盒仍然保持了可用的试剂有效性，能够被正常应用于文库制备实验。而对比表7所得结果，没有采用预混试剂的现有技术试剂盒在冷藏保存1个月后建库效率即开始有明显降低，3个月后构建文库的效率已经大大降低，冷藏保存6个月后基本不再具备构建文库的能力，因此可以证明本发明所述冷藏保存预混试剂盒相较现有技术具备了非常好的冷藏保存特性。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种冷藏保存预混试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有的预混试剂组分包括末端补平与连接组分、接头组分、连接酶组分和PCR组分；
所述末端补平与连接组分包括末端补平与加A缓冲液、末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述接头组分包括连接缓冲液、接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述连接酶组分包括连接酶、连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述PCR组分包括接头引物、PH8Tris缓冲液和扩增反应液的预混试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述末端补平与连接组分包括3.5uL的末端补平与加A缓冲液、1.5uL的末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油；
所述接头组分包括10uL的连接缓冲液、2uL浓度为15umol/L的接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油；
所述连接酶组分包括10uL的连接酶、10uL的连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油；
所述PCR组分包括5uL的接头引物、20uL的PH8Tris缓冲液和25uL的扩增反应液，所述扩增反应液包括DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述末端补平与连接组分包括占所述末端补平与连接组分整体体积30％的甘油；
所述接头组分包括占所述接头组分整体体积30％的甘油；
所述连接酶组分包括占所述连接酶组分整体体积30％的甘油。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述连接酶为10至30units/uL的T4连接酶。
5.如权利要求1至4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述甘油的全部或部分等体积量替换为DMSO。
6.一种冷藏保存预混试剂盒使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
将权利要求1至5任一项所述试剂盒保存在4℃冷藏条件下；
使用权利要求1至5任一项所述试剂盒进行文库构建，不需要融化试剂过程，试剂盒中各预混试剂组分经过离心操作即可直接使用在文库构建实验操作。
7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述文库构建实验操作包括：
S1、使用末端补平与连接组分对预先准备的片段化DNA样品进行末端修复与加A；
S2、使用接头组分和连接酶组分对加A后的DNA片段连接接头；
S3、对连接有接头的DNA片段进行纯化操作获得纯化的DNA片段；
S4、使用PCR组分对纯化的DNA片段进行扩增富集；
S5、对扩增富集后的DNA文库进行纯化操作获得纯化后的DNA文库。
8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述纯化操作包括：
使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化；
使用80％乙醇漂洗；
使用洗脱缓冲液或去离子水洗脱。
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