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CN112111449A - 一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液 - Google Patents

一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液 Download PDF

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CN112111449A
CN112111449A CN202010917213.6A CN202010917213A CN112111449A CN 112111449 A CN112111449 A CN 112111449A CN 202010917213 A CN202010917213 A CN 202010917213A CN 112111449 A CN112111449 A CN 112111449A
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Abstract

本发明涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，所述间充质干细胞为预先经过γ‑干扰素IINF‑γ联合肿瘤坏死因子TNF‑α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。本发明首次应用炎症因子γ‑干扰素和肿瘤坏死因子与间充质干细胞MSCs进行预先共培养，经过该共培养过程，启动/激活了MSCs的免疫调节执行能力，使MSCs预先获得了一致性的免疫调节功能，进入体内后便可快速及时地行使免疫功能调节,克服了当前MSCs所共同存在的由于未授权免疫调节功能而导致的治疗效果差的缺点，同时还避免了由于患者个体炎症差异的微环境所导致的MSCs免疫调节功能不一致的缺陷。优选地，所述间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。

Description

一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注 射液
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种免疫预授权型、可立即一致性行使免疫功能调节的间充质干细胞(MSCs)、其制备方法和含有该间充质干细胞的注射液。
背景技术
免疫系统是机体的防御体系，一旦异体物质，如细菌病毒和各种异性蛋白侵入危害机体，免疫细胞就会将它们包围、分解、吞噬予以消灭和清除，免疫球蛋白就会大量制造变成抗体对抗入侵者。然而，免疫系统的这种防御功能是处于微妙的动态平衡调节状态，抵御外来入侵，同时识别自身组织，保护机体组织细胞。一旦打破这种平衡，产生对自身组织产生免疫应答反应，或对外来抗原产生过度免疫反应，即可导致临床常见的多种免疫炎性疾病，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、免疫炎性动脉粥样硬化、免疫性心肌病及肾脏、肝脏病等等。
然而遗憾的是，当前针对发病率、致残率、死亡率日益增加的免疫相关性炎性疾病的治疗尚缺乏安全有效的治疗手段和药物。类固醇类激素及免疫抑制剂虽可部分缓解病情，但长期应用面临感染、肿瘤发生率增加等不良反应。因此，面对自身免疫炎症相关疾病的治疗现状，急需寻找一种替代治疗方案。
近年来，大量研究发现，来自中胚层的间充质干细胞MSCs(Mesnchymal StemCells)有免疫调节功能。在MSCs治疗对类固醇耐药的55例急性移植物抗宿主病(acuteGvHD)患者的2期临床研究发现，2年缓解率达52％，对照组仅10％。然而，在接下来240例相同入选患者的MSCs治疗的3期临床研究中，却发现无疗效差异。同时，国际上针对多种自家免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎等，应用MSCs治疗的1-2期临床硏究结果也显示了不一致的效果报道。为此，引起了医学界对MSCs免疫调节治疗前景的广泛争议与质疑。
最近对MSCs生物学功能的硏究发现，出现上述MSCs免疫调节治疗效果不一致的根本原因是MSCs内在的特殊生物学功能所决定的。硏究发现，MSCs的免疫调节功能不是MSCs本身结构所具有的，而是炎症微环境所赋予MSCs的免疫调节执行“权力”，即生物学上的免疫激活。外源过继输入的MSCs要在体内特有的炎症环境下，即炎症因子作用下能使MSCs具有免疫功能调节能力。激活的MSCs才能通过旁/自分泌功能产生免疫调节因子，及对免疫细胞产生接触调控与抑制，达到有效治疗免疫相关疾病，使其恢复免疫平衡、修复损伤组织、重塑细胞赖以生存的内环境的效果。
然而长期以来，由于忽视了对MSCs这一生物学特性及决定其免疫调节功能关键因素的认识，并忽视了对患者的各种免疫炎症相关疾病体内炎症微环境动态变化的认识，而采用了相同细胞、相同剂量、相同单一方法过继治疗，结果导致了治疗失败，以及临床研究产生不一致的治疗效果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)或其他来源的间充质干细胞MSCs预先与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养，制备免疫调节功能预授权型PL-MSCs(Pre-licensing MSCs)，再进一步低氧培养加强其免疫调节功能，得到用于制备药物的免疫活性PL-MSCs，该免疫活性PL-MSCs可现用或低温储存以用于制备注射液等药物产品。
本发明还涉及该免疫调节功能预授权型PL-MSCs的制备方法及注射液产品。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素(IINF-γ)联合肿瘤坏死因子(TNF-α)激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。
进一步优选地，该间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。
第二方面，本发明涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，其中，所述注射液含有上述免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。
优选地，所述注射液的规格为2mL，其中含有所述免疫调节功能预授权型间充质干细胞的数量为(1.9-2.1)×107个，人体白蛋白浓度为0.8-1.2％(质量百分浓度)。该注射液密封4-8度保存，可即刻使用，加入含10％DMSO的无血清培养基，超低温在液氮中可长期保存备用。
第三方面，本发明实施例提供一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，是将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)预先与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养，在培养过程中γ-干扰素和肿瘤坏死因子对WJMSCs的免疫功能进行预先激活，以制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs。
根据本发明较佳实施例，其中，所述用于共培养的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)是从新生儿脐带中分离的华通胶，经组织贴壁培养及3D培养扩增的三代脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。
根据本发明较佳实施例，其中，与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养完成后，对脐带华通胶间充质干细胞进一步有采用低氧培养处理加强免疫活性。
根据本发明较佳实施例，其中，所述制备方法包括如下步骤：
S1:从新生儿脐带内分离华通胶组织，经组织贴壁培养及3D培养，得到脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)；
S2:将γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和WJMSCs共培养，在培养过程中，利用γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)激活WJMSCs，制备得到免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs；
S3:将PL-WJMSCs低氧培养处理加强其免疫调节功能。
上述免疫活性PL-WJMSCs可现用或低温储存，以供制备干细胞注射液等药物产品。
根据本发明较佳实施例，其中，步骤S1中，从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液，其具体包括如下步骤：
S11:无菌提取剖腹产产妇脐带，置于PBS缓冲液中，洗去脐带表面的血迹；
S12:将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块；
S13:剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，撕除脐静脉内膜和外膜，撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，收集剥离下来的疏松结缔组织，即得到脐带华通胶组织。
根据本发明较佳实施例，其中，步骤S1中，所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养；具有包括步骤：
S21:组织贴壁培养：将剥离下来的疏松结缔组织，剪成1立方毫米以下的组织块，放入无菌细胞培养瓶中贴壁培养，在细胞培养瓶中加入无血清培养基，把含有疏松结缔组织的细胞培养瓶放入37±1℃、体积分数为4-6％的CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2-4天更换无血清培养基，观察细胞生长情况；
S22:3D培养：当细胞培养瓶中贴壁培养的细胞铺满瓶底80％后，弃细胞培养瓶中的无血清培养基和剩余的组织块，加入PBS缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在细胞培养瓶中加入胰蛋白酶消化30秒-90秒，待贴壁的细胞收缩后加入无血清培养基终止消化，形成细胞悬液；混匀该细胞悬液，将细胞悬液移入离心管中，(100-150)g离心，弃上清，再加入无血清培养基得到细胞悬液；混匀该细胞悬液，细胞计数，(100-200)g离心，弃上清，再加入水凝胶混匀，得到水凝胶细胞悬液，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×105细胞；
准备若干个新的细胞培养瓶，在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液以便在每个细胞培养瓶中接种细胞；向细胞培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在细胞培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基，将细胞培养瓶放置于37±1℃、体积分数为4-6％的CO2、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况。
上述组织贴壁培养是对WJMSCs的分离提取过程，3D培养是对WJMSCs的培养扩增。
根据本发明较佳实施例，其中，步骤S2中，制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs的方法，包括如下步骤：
向盛装了经3D培养的WJMSCs细胞的培养瓶中加入37±0.5℃的PBS缓冲液，并放置于37±0.5℃水浴中，水凝胶分解形成细胞悬液，混匀该细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，750-850g离心，弃上清留取细胞沉淀，将细胞用无血清培养基稀释至密度(0.8-1)×105/ml，接种到新的细胞培养瓶中；将一定量的γ-干扰素(IINF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)加到细胞培养瓶中，共培养20-30h，获得PL-WJMSCs(调节功能预授权型PL-WJMSCs)；此时的PL-WJMSCs可立即一致性行使免疫功能调节，可与生理盐水按照比例混合后注射使用，或者冷冻储存以备需要时使用。
根据本发明较佳实施例，其中，步骤S2中，γ-干扰素浓度为10ng/mL，肿瘤坏死因子(TNF-α)浓度为1ng/mL，共培养24h，获得PL-WJMSCs。
根据本发明较佳实施例，其中，步骤S3中，将PL-WJMSCs低氧培养处理的方法为：将经过步骤S2共培养后生长良好的PL-WJMSCs放置到氧气浓度为4-6％的低氧培养箱中培养8-15h；更优选地，放置到氧气浓度为5％的低氧培养箱中培养12h。
第四方面，本发明还涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，所述注射液含有上述任一实施例所述制备方法制备的免疫调节功能预授权型间充质干细胞PL-WJMSCs，人体白蛋白和生理盐水。
优选地，所述注射液的规格为2mL，其中含有所述PL-WJMSCs的数量为(1.9-2.1)×107个，人体白蛋白浓度为0.8-1.2％。该注射液密封4-8度保存，可即刻使用，加入含10％DMSO的无血清培养基，超低温在液氮中可长期保存备用。
(三)有益效果
(1)本发明是基于MSCs只有在炎症微环境激活下才能赋予MSCs的免疫调节的执行“权力”这一特殊生物学功能特性的认识，首次应用炎症因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子与间充质干细胞MSCs进行预先共培养，经过该共培养过程，启动/激活了MSCs的免疫调节执行能力，使MSCs预先获得了一致性的免疫调节功能,进入体内后便可快速及时地行使免疫功能调节,克服了当前MSCs由于未授权免疫调节功能而导致的治疗效果差的缺点，同时还避免了由于患者个体炎症差异的微环境所导致的MSCs免疫调节功能不一致的缺陷。
(2)进一步地，本发明使用的间充质干细胞MSCs为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)具有促血管再生的旁/自分泌功能，其分泌多种细胞因子如血管内皮生长因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子等，能直接参与构建血管再生基质成分等优点，且脐带华通胶来源的WJMSCs具有低免疫源性，排异反应小等其他间充质干细胞MSCs所不具备的优点。
本发明将分离提取的华通胶源间充质干细胞WJMSCs与炎症因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子联合共培养，制得标准的、统一的免疫预授权型PL-WJMSCs(Pre-licensingWJMSCs，PL-WJMSCs)。免疫功能启动(预授权)型PL-WJMSCs，来源于新生儿脐带华通胶源，克服了当前不同来源的各种MSCs所共同存在的由于未授权免疫调节功能而导致的治疗效果差的缺点，同时还避免了由于患者个体炎症差异的微环境所导致的WJMSCs免疫调节功能不一致的缺陷。本发明免疫启动型(预授权型)WJMSCs产品达到了立即和持续的免疫调节效应。
(3)本发明的PL-WJMSCs高表达靶向炎症病变受体CXCR4、TLR-3，使之产生靶向归巢效应，脱靶效应显著减少。PL-WJMSCs分泌高浓度免疫调节因子，小剂量PL-WJMSCs即可达到高剂量WJMSCs治疗效果。
(4)本发明免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，是在间充质干细胞与IINF-γ和TNF-α共培养结束后，再利用低氧环境培养加强其免疫活性，得到可用于治疗使用或制备药物的新鲜免疫活性PL-WJMSCs。
附图说明
图1为本发明预授权免疫调节功能PL-WJMSCs与WJMSCs分别培养细胞图。
图2为PL-WJMSCs与WJMSCs两种细胞分泌的免疫调节因子水平(细胞上清液中10种调节因子的浓度)的柱状统计比较图。
图3为MTT法检测PL-WJMSCs与WJMSCs在体外对B细胞抑制效果比较；证明PL-WJMSCs对B细胞抑制优于WJMSCs。
图4为MTT法检测PL-WJMSCs与WJMSCs在体外对T细胞抑制效果比较；证明PL-WJMSCs对B细胞抑制优于WJMSCs。
图5为AMI小鼠模型在AMI后24h时，CD14+炎性单核细胞荧光强度，及与假手术组(sham组)的比较。
图6为AMI小鼠模型在AMI后24h时，CD14+炎性单核细胞的数量化统计柱状图，及与假手术组(sham组)的比较。
图7为AMI小鼠模型在AMI后24h时，鼠尾静脉注入1×106/kg PL-WJMSCs或未激活的WJMSCs后，小鼠AMI模型炎症型单核细胞CD14+于48h水平柱状统计示意图，及与假手术组(sham组)的比较。
图8为AMI小鼠模型在AMI后24h时，鼠尾静脉注入1×106/kg PL-WJMSCs或未激活的WJMSCs后，小鼠AMI模型抗炎症型CD14+CD16+于48h水平柱状统计示意图，及与假手术组(sham组)的比较。
图9为PL-WJMSCs在AMI小鼠模型体内对心肌炎症巨噬细胞M1抑制及极化M1向抗炎症M2转化的免疫组化共聚焦显微镜检测图，DAPI为细胞核染色，F4/80为巨噬细胞的表面标志，CD86为炎症M1的表面标志，CD206为抗炎症M2的表面标志，Merged为细胞荧光的重合；PL-WJMSCs移植组CD86细胞明显低于WJMSCs移植组，PL-WJMSCs移植组CD206细胞明显高于WJMSCs移植组，说明PL-WJMSCs在AMI小鼠体内对心肌炎症巨噬细胞M1抑制优于WJMSCs，PL-WJMSCs在AMI小鼠体内对心肌炎症巨噬细胞M1向抗炎症M2转化优于WJMSCs。
图10为图9的免疫组化共聚焦显微镜检测图CD86和CD206阳性细胞数统计结果图。
图11为在AMI小鼠模型经鼠尾静脉注射PL-WJMSCs和WJMSCs后，Sham组为正常对照组，可见正常的心肌组织，AMI+生理盐水组为心梗对照组，可见心肌组织大量的瘢痕组织形成，AMI+WJMSCs组可见心肌组织有大量的瘢痕组织形成，未有明显好转，AMI+PL-WJMSCs组可见心肌梗死组织明显减少，形成的瘢痕组织明显少于对照组；证明PL-WJMSCs治疗AMI小鼠的效果明显优于WJMSCs。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明的主要技术方案是：提供一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，将分离提取的间充质干细胞MSCs(特别是脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs)预先与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养预定时间，通过这个共培养期，利用INF-γ和TNF-a激活/启动间充质干细胞MSCs的免疫调节执行能力，使制备的免疫调节功能预授权型间充质干细胞PL-MSCs在进入体内之前，已具备了高度一致性的免疫调节功能，该免疫调节功能预授权型间充质干细胞PL-MSCs可用于制备注射液等药物产品。本发明免疫启动型(预授权型)MSCs产品具有立即和持续的免疫调节效应，避免了由于患者个体炎症差异的微环境所导致的MSCs免疫调节功能不一致的缺陷。
以下以间充质干细胞MSCs为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs为例，说明本发明的方案特点并验证PL-WJMSCs的技术效果。
本实施例釆用完全不同以往的MSCs制备方法，是将从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分胶样粘液组织(WJ华通胶)，分别经组织及3D培养，获得三代生长良好的WJMSCs，应用炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)与该WJMSCs共培养，制备成免疫功能启动型PL-WJMSCs，最后进一步低氧培养，制备成新鲜免疫活性PL-WJMSCs注射液，可现用，或低温储存，以备制成产品。
本实施例包括四个步骤，分别为：
第一步：从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液(华通胶)组织，经组织培养及3D培养，得到华通胶源MSCs(WJMSCs)。
第二步：采用γ-干扰素(INF-γ)联合肿瘤坏死因子(TNF)-α共同培养激活WJMSCs，制备得到PL-WJMSCs(Pre-licensing WJMSCs)。
第三步：将PL-WJMSCs低氧处理加强免疫活性。
第四步：制备PL-WJMSCs产品，可现用，或低温储存，货架备用产品。
以下分别上述四个步骤的详细处理过程说明如下：
第一步中，从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液(华通胶)组织的方法如下：
(1)应用组织剝离技术，无菌提取剖腹产产妇脐带，置于磷酸盐缓冲液中，洗去脐带表面的血迹。
(2)手术剪将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或磷酸盐缓冲液洗涤血凝块。
(3)用手术剪剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，用眼科镊撕除脐静脉内膜和外膜，再用眼科摄撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织(即华通胶组织)，放入无菌平皿中。
第一步中，对华通胶组织进行组织培养和3D培养的方法如下：
组织(贴壁)培养：将剥离下来的疏松结缔组织，放入无菌平皿中，使用眼科剪将分离胶样粘液组织剪成1立方毫米以下块状，放入底面积是75平方厘米无菌细胞培养瓶中贴壁培养，在细胞培养瓶中加入15ml无血清培养基，把含有疏松结缔组织的细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，每三天更换半量无血清培养基，观察细胞生长情况。
3D培养：待第一步中贴壁培养的细胞铺满瓶底80％后，弃细胞培养瓶中的培养基剩余的组织块，加入磷酸盐缓冲液5ml清洗细胞细胞培养瓶底，弃清洗液，在细胞培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml消化1分钟，待贴壁的细胞收缩后加入无血清培养基3ml终止消化，形成细胞悬液，并用移液管抽吸混匀，把细胞悬液移入50ml离心管中，100g离心力离心10min，弃上清，再加入无血清培养基用移液管抽吸混匀，细胞计数，(100-200)g离心力离心10min，弃上清，再加入水凝胶混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×105细胞，在新的底面积是75cm2细胞培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个细胞培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在细胞培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在细胞培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全培养基，将含水凝胶细胞悬液的细胞培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况。
第二步，制备PL-WJMSCs(Pre-licensing WJMSCs)的方法如下：
将3D培养的WJMSCs加入37℃PBS 10ml并放置于37℃水浴中,1小时后水凝胶分解形成细胞悬液，并用移液管抽吸混匀，把细胞悬液移入50ml离心管中，800g离心力离心10min，弃上清取细胞沉淀，将细胞用培养基稀释至密度(0.8-1)×105/ml，接种到75cm2细胞培养瓶中。γ-干扰素(IINF-γ)10ng/mL+肿瘤坏死因子(TNF-α)1ng/mL与WJMSCs共培养24h，获得PL-WJMSCs。
第三步，PL-WJMSCs低氧培养的方法为：将经上述激活后生长良好的PL-WJMSCs放置到氧气浓度为5％的低氧培养箱中培养12小时。
以下对第三步得到的PL-WJMSCs进行生物性特征检测，包括：
(1)采用流式细胞仪检测对第三步得到的PL-WJMSCs进行标志物检测，共同标志表达CD73、CD90、CD44、CD105、HLA-ABC，不表达CD34、CD45、CD80、CD86、HLA-DR。
(2)采用流式细胞仪检测高表达CXCR4、TLR-3
(3)ELISA方法检测PL-WJMSCs及WJMSCs培养上清中细胞分泌因子，为了突出本发明的技术效果，设置对照样本和实验样本。
对照样本：取WJMSCs培养第2代培养3天细胞融合90％后的细胞，留取细胞上清为对照样本。
实验样本：PL-WJMSCs：INF-γ(10ng/mL)+TNF-α(1ng/mL)与WJMSCs共培养24h；后将PL-WJMSCs放置于氧气浓度为5％的低氧培养箱中，低氧培养12h后，留取细胞上清为待检测实验样本。实验样本和对照样本的细胞培养如图1所示。
分别检测对照样本和实验样本中，肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)等因子的分泌水平。
检测方法如下：包被孔板，用0.05M PH9牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。加样：在孔板中加细胞上清液0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔和阳性对照孔。加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟，于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml终止反应，在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，通过OD值计算细胞上清分泌细胞因子浓度。
结果如图2所示，实验样本中肝细胞生长因子(HGF)，肿瘤坏死因子激活基因-6蛋白(TSG-6)，前列腺素E-2(PGE-2)，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，转化生长因子-β(TGF-β，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM1)的分泌水平显著高于对照样本，有些甚至是对照样本的2倍分泌浓度。
(4)分析体外PL-WJMSCs对免疫细胞的调节作用，包括对B淋巴细胞的抑制作用和对T淋巴细胞的抑制作用。
①检测PL-WJMSCs对B淋巴细胞的抑制作用，按照如下实验步骤：
a、通过Ficoll—Hypaque梯度密度离心法分离出脐带血的单个核细胞(PBMC)：脐带血用生理盐水适当稀释后加入到等量人淋巴细胞分离液离心管内，使脐带血置于淋巴细胞分离液面上面，室温2000rpm，20min，吸取中间白膜层，PBS洗涤2次，使用无血清培养基调整细胞浓度1×107/ml备用。
b、采用贴壁黏附法分离单核细胞和淋巴细胞：将PBMC在37℃培养1h，悬浮细胞为淋巴细胞，取淋巴细胞备用。
c、每1×107个淋巴细胞中加入2ml灭活的FBS和1ml4％AET-SRBC悬液，三者比例1：2：1.混匀37℃水浴10min，在4℃下，以800rpm离心10min，置冰浴1h，使细胞聚集成团，促进花环形成。
d、将3-5ml的分层液置于10ml离心管中，40C 2000rpm离心20min，吸取界面云雾状的细胞层，置于10ml离心管中，用PBS稀释离心后，室温1300rpm离心10min，弃上清，重复洗涤。此即所获B细胞。
e、将所获B淋巴细胞悬液重复步骤c)-d)，提高B细胞收集效率。
f、将细胞分成二组：第一组，复苏培养PL-WJMSCs；第二组，复苏培养WJMSCs。
g、用羊抗人IgM单克隆抗体(Anti-IgM)刺激分别与PL-WJMSCs、WJMSCs培养上清共培养3天的B淋巴细胞，应用MTT法测B淋巴细胞的增殖，ELISA法测培养上清中免疫球蛋白IgG、IgM的产生，应用流式细胞仪分别检测与PL-WJMSCs共培养24h、48h后B淋巴细胞的凋亡。
②检测PL-WJMSCs对T淋巴细胞的抑制作用，按照如下实验步骤：
a、上述①中a-e的处理方法操作，以获得淋巴细胞，吸弃剩余的分层液，观察E花环形成情况，用低渗法裂解花环中的SRBC，获得T淋巴细胞。
b、复苏培养WJMSCs，将细胞分成二组：
第一组，γ-干扰素(INF-γ)10ng/mL+肿瘤坏死因子(TNF-a)1ng/mL共同培养WJMSCs 24h，获得PL-WJMSCs；第二组：未处理的WJMSCs对照组。
c、上述刺激后PL-WJMSC及WJMSCs，将其按照不同的比例加入T淋巴细胞悬液中，在第1，3，5天，采用MTT比色法检测各组的T淋巴细胞的增殖情况，再用流式细胞术分析各组T细胞亚群。
如图3所示，为体外PL-WJMSCs与WJMSCs对B淋巴细胞的抑制结果比较，显示PL-WJMSCs比WJMSCs对B淋巴细胞具有更强的抑制效果。
如图4所示，为体外PL-WJMSCs与WJMSCs对T淋巴细胞的抑制结果比较，显示PL-WJMSCs比WJMSCs对B淋巴细胞具有更强的抑制效果。
(5)分析研究PL-WJMSCs在小鼠急性心肌梗死模型(AMI模型)体内对CD14+炎症型单个核细胞抑制效果：
为了分析PL-WJMSCs在小鼠AMI模型体内的作用效果，需要首先建立小鼠AMI模型，其建立方法如下：
小鼠急性心肌梗死模型建立：取20g的BALB/c小鼠，气管插管后，经皮左胸三四肋间开胸结扎心脏前降支，制作小鼠心肌梗死模型，术中心电图可见ST段明显抬高为心梗表现，术后7天，小鼠心脏超声较术前左室收缩末面积(LVESA)、左室舒张末面积(LVEDA)、左室收缩末内径(LVEDS)增加、左室舒张末内径(LVEDD)，左心室壁厚度、左心室射血分数(LVEF％)、左室短轴缩短率(LVFS％)明显减低，心梗模型制作成功。
研究分析设置四组，分别为：Sham组(假手术组)；WJMSCs组(心梗后48h鼠尾静脉注入WJMSCs 1×106/kg)；PL-WJMSCs组(心梗后48h鼠尾静脉注入PL-WJMSCs 1×106/kg)和生理盐水注射对照组。
本分析实验及下文所用的PL-WJMSCs注射液的制备方法为：
将经低氧培养处理的PL-WJMSCs经过安全性检测后的加入含1％浓度人体白蛋白的生理盐水中，制备成每2ml白蛋白/生理盐水中含有2×107细胞数量为一个包装单位的注射液；密封，4-8度保存，即刻应用，或者加入含10％DMSO的无血清培养基，超低温在液氮中可长期保存备用。
小鼠急性心肌梗死模型制备后24h，鼠尾采血检测CD14+和CD14+CD16+水平，如图5-6所示，在小鼠AMI模型上，发现AMI后24h CD14+炎性单核细胞明显增高，而抗炎症型CD14+CD16+水平较低，与对照Sham组(假手术组)比较呈明显差异，由此表示：急性心肌梗死引起了炎症型细胞的高表达。
小鼠急性心肌梗死后24h鼠尾静脉注入1×106/kg PL-WJMSCs或未激活的WJMSCs后，观察外周血CD14+(如图7)、CD14+CD16+(如图8)48h水平变化。结果如图7-8所示，PL-WJMSCs移植组明显降低了炎症型单核细胞CD14+水平，而增加了抗炎症型CD14+CD16+水平。上述实验结果证明，PL-WJMSCs(相比WJMSCs)在小鼠AMI模型体内确具有更好的免疫活性，可快速行使免疫功能调节。
(6)分析PL-WJMSCs在小鼠AMI模型体内对巨噬细胞作用，分析方法如下：
在小鼠AMI模型上，AMI后24h鼠尾静脉内注入1×106/kg PL-WJMSCs或未激活WJMSCs，一个月处死后，免疫荧光共聚焦显微镜检测。检测指标包括：
巨噬细胞亚群：F4/80与CD86共染，F4/80与CD206共染，定量测定M1、M2细胞水平，M1/M2比值；
免疫荧光共聚焦显微镜检测结果如图9所示，PL-WJMSCs组小鼠心肌内炎症型M1型巨噬细胞明显減少，而M2型巨噬细胞明显增多。
由图10的梗死心肌免疫组化共聚焦显微镜分析的量化统计结果可知，PL-WJMSCs注射组与WJMSCs注射对照组相比：使炎症型巨噬细胞M1(标志物为CD86+)减少，抗炎症的M2巨噬细胞(标志物为CD206+)明显为多。
(7)超声心动图：2维超声检测小鼠心梗模型移植PL-WJMSCs及WJMSCs后小鼠左心室收缩末面积(LVESA)、左心室舒张末面积(LVEDA)、左心室收缩末内径(LVEDS)、左心室舒张末内径(LVEDD)、左心室短轴缩短率(LVFS％)、左心室壁厚度、左心室射血分数(LVEF％)心功能的变化比较，
超声心动图检测：小鼠心梗模型制备后分两组，分别经鼠尾静脉注射PL-WJMSCs及WJMSCs，一个月后经2维超声心动图检查小鼠心功能，一致性显示了：AMI小鼠在注射PL-WJMSCs后心脏左心室收缩末面积、舒张末面积、收缩末内径、舒张末内径均明显比WJMSCs组减低，左心室短轴缩短率(LVFS％)比WJMSCs组增加，PL-WJMSCs组左心室壁厚度、左心室射血分数(LVEF％)比WJMSCs组明显增加，PL-WJMSCs明显限制了AMI小鼠的心室重构，保护了心脏功能。
2维超声心动图对比结果
Figure BDA0002665431980000161
注：LVESA:左心室收缩末面积；LVEDA:左心室舒张末面积；LVFS:左心室短轴缩短率；LVESD:左心室收缩末内径；LVEDD:左心室舒张末内径(*P<0.05AMI+PL-WJMSCs vs AMI+WJMSCs)
(10)、TTC染色测量梗死面积：
迅速取下心脏，清洁并挤压心脏蘸干血渍，4℃生理盐水冲洗干净后蘸干，于-20℃冰箱冷冻15min至心脏变硬，取出并用刀片自心尖向心底沿房室沟方向切成1mm厚切片，共切5片，迅速将切片置于5ml37℃ 1％PH为7.4的TTC磷酸缓冲液中，水浴15min，TTC染色后梗死区为白色，梗死边缘区为砖红色，正常区为红色。
病理学检测：取出心脏，剔除血管、脂肪等杂质，称重后放入4％多聚甲醛溶液中保存，24h后行脱水、包埋、石蜡切片，各个标本选择固定位置(乳头肌水平)切片，做HE染色。
如图11示：Sham组(假手术组)；生理盐水注射；PL-WJMSCs注射组；未激活WJMSC注射组四组的梗死面积的病理组织学检测。
检测结果显示：PL-WJMSCs组梗死面积明显小于生理盐水组和未激活的WJMSCs移植组。由此说明，PL-WJMSCs移植组相较于未激活的WJMSCs移植组，前者更有利于减小梗死面积。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素IINF-γ联合肿瘤坏死因子TNF-α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。
2.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，其特征在于，所述注射液含有权利要求1所述免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。
3.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs预先与炎性因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子共培养，在培养过程中，γ-干扰素和肿瘤坏死因子对WJMSCs的免疫功能进行预先激活，以制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述用于共培养的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs是从新生儿脐带中分离的华通胶，经组织贴壁培养及3D培养扩增的三代脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；
与炎性因子γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-a共培养完成后，对脐带华通胶间充质干细胞进一步有采用低氧培养处理加强免疫活性。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1:从新生儿脐带内分离华通胶组织，经组织贴壁培养及3D培养，得到脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；
S2:将γ-干扰素INF-γ、肿瘤坏死因子TNF-α和WJMSCs共培养，在培养过程中，利用γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-α联合激活WJMSCs，制得免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs；
S3:将PL-WJMSCs低氧培养处理加强其免疫调节功能。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液，其具体包括如下步骤：
S11:无菌提取剖腹产产妇脐带，置于PBS缓冲液中，洗去脐带表面的血迹；
S12:将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块；
S13:剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，撕除脐静脉内膜和外膜，撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织收集，即得到脐带华通胶组织。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养；具有包括步骤：
S21:组织贴壁培养：将剥离下来的疏松结缔组织，剪成1立方毫米以下的组织块，放入无菌细胞培养瓶中贴壁培养，在细胞培养瓶中加入无血清培养基，把含有疏松结缔组织的细胞培养瓶放入37±1℃、体积分数为4-6％的CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2-4天半量更换无血清培养基，观察细胞生长情况；
S22:3D培养：当细胞培养瓶中贴壁培养的细胞铺满瓶底80％后，弃细胞培养瓶中的无血清培养基和剩余的组织块，加入PBS缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在细胞培养瓶中加入胰蛋白酶消化30-90秒，待贴壁的细胞收缩后加入无血清培养基终止消化，形成细胞悬液；混匀该细胞悬液，将细胞悬液移入离心管中，(100-150)g离心，弃上清，再加入无血清培养基得到细胞悬液；混匀该细胞悬液，细胞计数，(100-200)g离心，弃上清，再加入水凝胶混匀，得到水凝胶细胞悬液，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×105细胞；
准备若干个新的细胞培养瓶，在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液以便在每个细胞培养瓶中接种细胞；向细胞培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在细胞培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基，将细胞培养瓶放置于37±1℃、体积分数为4-6％的CO2、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs的方法，包括如下步骤：
向盛装有经3D培养的WJMSCs细胞的培养瓶中加入37±0.5℃的PBS缓冲液，并将细胞培养瓶放置于37±0.5℃水浴中，水凝胶分解形成细胞悬液，混匀该细胞悬液，把细胞悬液移入离心管中，750-850g离心，弃上清留取细胞沉淀，将细胞用培养基稀释至密度(0.8-1)×105/ml，接种到新的细胞培养瓶中；将一定量的γ-干扰素(IINF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)加到细胞培养瓶中，共培养20-30h，获得调节功能预授权型PL-WJMSCs。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将PL-WJMSCs低氧培养处理的方法为：将经过步骤S2共培养后生长良好的PL-WJMSCs放置到氧气浓度为4-6％的低氧培养箱中培养8-15h。
10.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的注射液，其特征在于，所述注射液含有权利要求3-9任一项所述制备方法制备的免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。
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