CN112094756B - 一株蓝状菌fl15及其介导纳米银生物合成的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物合成技术领域，本发明提供了一株蓝状菌FL15及其介导纳米银生物合成的应用。本发明提供的蓝状菌FL15，拉丁文为Talaromyces sp.，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2019年10月17日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019832。本发明在蛇足石杉内生真菌中发现了蓝状菌FL15，并且发现该真菌具有介导纳米银合成的能力，经过对合成条件的优化，使获得纳米银产量高、具有更小的尺寸，还具有明显的抑菌作用。

Description

一株蓝状菌FL15及其介导纳米银生物合成的应用

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，尤其涉及一株蓝状菌FL15及其介导纳米银生物合成的应用。

背景技术

纳米银颗粒是指尺寸在一维空间上处于1～100nm的银单质。纳米银粒子具有许多宏观材料所不具备的特殊性质，如：小尺寸效应，表面效应，量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应。纳米银作为一种新兴的材料，在离子检测、化学检测、传感等方面具有广泛的应用前景。由于纳米银具有安全的抑菌杀菌作用，所以含有纳米银的生活用品也更加受到大众的欢迎。

传统纳米银的制备方法主要为物理法和化学法。用物理法制备纳米银，设备成本高且产量低。用化学法制备纳米银时，为了防止纳米银团聚通常加入聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、壳聚糖聚合物或十二烷硫酸银等作为保护剂，制备出的纳米银是否安全仍存在很大的争论，同时试剂对环境造成极大的污染。随着绿色化学的发展，利用生物方法合成纳米颗粒不断涌现出来，人们发现细菌、真菌、放线菌均具有合成纳米银的能力。早在1999年就有研究发现从银矿中分离出的细菌具有合成纳米银的能力。酵母菌则多被用以胞内合成纳米银，且相对于细菌的合成有更高的效率。近年来，由于真菌能产生大量且丰富的次生代谢产物且分离相对简单，因此对于真菌合成纳米银的研究越来越受到关注。Bhainsa等首次利用真菌烟曲霉菌快速合成了粒径分布在5～20nm的银纳米晶体。Baiji Xue等人则利用内生真菌粉节皮菌合成了平均粒径在13.5～17.5nm的纳米银。Vigneshwaran等的研究发现黄曲霉可在细胞壁上合成纳米银晶体，且合成的纳米银晶体对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果。Pham Dinh Chuong等研究了壳聚糖(CS)与银(Ag)的组合Ag@CS对稻瘟病菌的抗真菌活性。Sahadevan等发现将波兰青霉发酵液与银离子共同孵育可以得到粒径为10～15nm的纳米银，而且合成的纳米银对鲍曼不动杆菌有良好的抑菌作用。在2009年Sanghi等通过对彩绒革盖菌的研究首次发现微生物能够可控的合成纳米银，并优化了纳米银合成的条件。

微生物合成纳米银的方法分为细胞内和细胞外合成法，胞内合成法由于合成的纳米粒子存在于细胞内，因此需要借助细胞溶解剂或超声降解才可得到纳米粒子。相比较于细胞内合成法，胞外合成法是更优的选择，具有产量高、产物易分离、更适用于工业化生产等优点。纳米银与普通的银离子相比，纳米银的杀菌能力和性能更加优越和持久，因此纳米银被广泛的应用到各个领域行业中。目前很少有细菌对银产生耐药性，因此在医药行业中，纳米银通常被用作抗菌医用敷料或者抗菌药剂，含有纳米银的药剂抗感染效果好，无不良反应。在纺织行业中，一些抗菌的织物也逐渐进入市场，像抗菌防臭的纳米银袜子，而且研究发现添加的纳米银对纺织品的透气性、折皱恢复力、颜色的影响甚小。不仅如此，纳米银在净水系统的水处理中，抗菌涂料以及化妆品行业均有涉及。由此可见，用生物合成法制备纳米银，成本低、操作简单、无毒，不会对环境造成污染，符合绿色发展的原则。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株蓝状菌FL15及其介导纳米银生物合成的应用，目的在于采用成本低、操作简单、安全无毒、绿色环保的生物合成法制备纳米银，符合绿色发展的原则。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株蓝状菌FL15，拉丁文为Talaromyces sp.，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2019年10月17日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019832。

本发明还提供了所述蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的应用。

本发明还提供了所述蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，包括如下步骤：

(1)活化菌株：将所述蓝状菌FL15接种到活化培养基中在28～30℃下活化培养2～5天，得到活化菌种；

(2)制备发酵液：将所述活化菌种接种到发酵培养基中，在28～30℃，150～180rpm下发酵培养4～7天，得到发酵液；

(3)制备二次发酵液：取所述发酵液的菌体，分散到水中，在28～30℃，150～180rpm下二次发酵24～48h，得到二次发酵液；

(4)合成纳米银：取所述二次发酵液的滤液，加入硝酸银溶液进行生物合成反应，即可得到纳米银。

优选的，步骤(3)中所述菌体的含水量为6.07％～10.51％。

优选的，所述菌体与水的质量体积比为5～40g:100mL。

优选的，所述二次发酵液经0.22μm的滤膜过滤后得到滤液。

优选的，所述硝酸银溶液的浓度为1～4mM。

优选的，所述滤液与硝酸银溶液的体积比为1～9:1～9。

优选的，步骤(4)中所述生物合成反应是在28～30℃，pH 4～9，光照强度2120lux～8430lux下反应20～180min。

本发明首次在蛇足石杉内生真菌中发现蓝状菌FL15，并且首次发现蓝状菌FL15具有纳米银合成的能力，经过对合成条件的优化，使获得纳米银的尺寸较小，且纳米银溶液能保持高度稳定。本发明提供的纳米银对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、蜡样芽孢杆菌、伤寒沙门杆菌等病原菌具有明显的抑制作用，可以作为纳米抗菌材料。本发明的合成方法具有简单、绿色、安全，易于生产放大，纳米银合成效率高、产量高的特点。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的菌株FL15形态学观察图，a～f分别为：CYA固体平板培养基(a正面，b反面)、YES固体平板培养基(c正面，d反面)和PDA固体平板培养基(e正面，f反面)；

图2为本发明实施例1提供的菌株显微形态图；

图3为本发明实施例1提供的根据菌株FL15及其相关菌株的ITS rDNA序列建立的系统发育树；

图4为本发明实施例1提供的根据菌株FL15及其相关菌株的18S rDNA序列建立的系统发育树；

图5为本发明实施例1提供的根据菌株FL15及其相关菌株的28S rDNA序列建立的系统发育树；

图6为本发明实施例5中提供的菌株FL15在不同条件下对合成AgNPs的影响(a硝酸银浓度对AgNPs合成的影响；b添加湿菌体量对AgNPs合成的影响；c滤液与硝酸银的比例对AgNPs合成的影响；d溶液pH对于AgNPs合成的影响；e反应时间对AgNPs合成的影响；f光照对于AgNPs合成的影响)；

图7为本发明实施例1提供的菌株FL15的菌液(A右图)和其制备纳米银时的反应液(A左图)，以及使用菌株FL15的菌液(B黑线)和反应液(B红线)的UV-Vis吸光谱图；

图8为本发明实施例1制备的AgNPs的透射电镜图；

图9为本发明实施例1制备的AgNPs的粒径分布图；

图10为本发明实施例1制备的AgNPs的X射线衍射图；

图11为本发明实施例1制备的成AgNPs的FTIR图；

图12为菌株FL15合成的纳米银的抑菌效果图，(A为AgNPs对大肠杆菌的抑菌效果图；B为AgNPs对福氏志贺菌的抑菌效果图；C为AgNPs对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；D为AgNPs对绿脓杆菌的抑菌效果图；E为AgNPs对伤寒沙门氏菌的抑菌效果图；F为AgNPs对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果图)。

保藏说明

蓝状菌FL15，拉丁文为Talaromyces sp.，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2019年10月17日，保藏编号为：CCTCCNO：M2019832。

具体实施方式

本发明提供了一种蓝状菌FL15具有介导生物合成纳米银的作用。

本发明提供了所述蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，包括如下步骤：

(1)活化菌株：将所述蓝状菌FL15接种到活化培养基中在28～30℃下活化培养2～5天，得到活化菌种；

(2)制备发酵液：将所述活化菌种接种到发酵培养基中，在28～30℃，150～180rpm下发酵培养4～7天，得到发酵液；

(3)制备二次发酵液：取所述发酵液的菌体，分散到水中，在28～30℃，150～180rpm下二次发酵24～48h，得到二次发酵液；

(4)合成纳米银：取所述二次发酵液的滤液，加入硝酸银溶液进行生物合成反应，即可得到纳米银。

本发明在利用蓝状菌FL15介导生物合成纳米银时，将所述蓝状菌FL15接种到活化培养基中在28～30℃下活化培养2～5天，得到活化菌种。

在本发明中，所述活化培养基优选为马铃薯固体培养基(PDA)。

在本发明中，所述活化培养的温度进一步优选为28℃，时间进一步优选为3～4天。

在本发明中，所述活化培养优选在光照条件下培养，进一步优选在光照培养箱中培养。

在本发明中，所述光照条件优选为2120lux～8430lux，进一步优选为8430lux。

利用制得的活化菌种制备发酵液，将所述活化菌种接种到发酵培养基中，在28～30℃，150～180rpm下发酵培养4～7天，得到发酵液。

在本发明中，所述发酵培养基为马铃薯液体培养基(PDB)。

在本发明中，所述发酵培养的温度进一步优选为28℃，转速进一步优选为160rpm，发酵的时间进一步优选为5～6天。

在本发明中，所述发酵培养优选在摇床中进行。

制得发酵液后，取所述发酵液的菌体，分散到水中，在28～30℃，150～180rpm下二次发酵24～48h，得到二次发酵液；

在本发明中，从所述发酵液中制取菌体的方法优选为过滤，进一步优选采用布氏漏斗过滤。

在本发明中，在分散到水中之前，还优选用水清洗冲洗3～5遍，进一步的优选为冲洗4遍。

在本发明中，所述菌体的含水量优选为6.07％～10.51％，进一步优选为10.51％。

在本发明中，所述菌体与水的质量体积比优选为5～40g:100mL，进一步优选为10～30g:100mL，再进一步优选为20g:100mL。

在本发明中，所述水优选为无菌水、纯净水、去离子水中的一种，进一步优选为去离子水。将湿菌体分散到去离子水中的目的是：让菌体释放次生代谢产物到去离子水中，合成纳米银，这样形成的纳米银溶液才能保持高度的稳定，若直接用发酵液合成纳米银，由于发酵液成分太杂，合成的纳米银容易聚沉。

在本发明中，所述二次发酵的温度进一步优选为28℃，转速进一步优选为160rpm，时间进一步优选为3h。

在本发明中，所述二次发酵优选在摇床中进行。

制得二次发酵液后，取所述二次发酵液的滤液，加入硝酸银溶液进行生物合成反应，即可得到纳米银。

在本发明中，取所述二次发酵液的滤液的方法优选为过滤，进一步优选为采用溶剂过滤器过滤。

在本发明中，所述溶剂过滤器的滤膜孔径优选为0.22μm。

在本发明中，所述硝酸银溶液的浓度优选为1～4mM，进一步优选为1mM或3mM，再进一步优选为1mM。

在本发明中，所述滤液与硝酸银溶液的体积比优选为1～9:1～9，进一步优选为3:7～3:7，再进一步优选为4:6。

在本发明中，所述生物合成反应的温度优选为28～30℃。

在本发明中，所述生物合成反应的pH优选为4～9，进一步优选为5、8或9，再进一步优选为9。

在本发明中，所述生物合成反应优选在光照条件下进行，所述光照条件优选为2120lux～8430lux，进一步优选为8430lux。

在本发明中，所述生物合成反应的时间优选为20～180min，进一步优选为70～140min，再进一步优选为100～120min。

在本发明中，按照上述方法制备的纳米银以纳米银溶胶的形式均匀分布在反应溶液中。

本发明还优选将所述纳米银经过冷冻的干燥处理制得纳米银粉末。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

内生真菌的鉴定：

菌株形态观察：将活化后的FL15菌株分别接种至PDA固体平板培养基、YES固体平板培养基和CYA固体平板培养基中在28℃下培养7d，观察其菌落形态(如图1所示)；并用显微镜观察菌丝体形状(如图2所示)。

由图1可知，菌株FL15在CYA培养基上28℃培养7d，菌落直径可达35～40mm，菌落呈鹅黄色，表面菌丝为白色，有绒毛感，中间略凸起，有黄色小液滴渗出，背面平坦(图1a、1b)。在YES培养基上28℃培养7d，菌落直径可达36～40mm，白色天鹅绒状，表面平坦，中间略凸起，背面菌落中心可见淡黄色边缘为白色(图1c、1d)。在PDA培养基上28℃培养7d，菌落直径可达46～50mm，菌落呈淡黄色天鹅绒状，中间凸起，表面无液滴渗出，随时间延长菌落正面颜色由淡黄色加深至深黄色，背面和正面颜色相同(图1e、1f)。显微观察发现，该菌菌丝细长光滑，菌丝有隔，有分支(图2)。由此可见，本发明提供的菌株FL15具有典型的蓝状菌菌落特征。

菌株分子生物学鉴定：本实施例分别扩增了ITS rDNA、18S rDNA和28S rDNA序列，进行FL15菌株的分子生物学鉴定。ITS rDNA序列的扩增引物为ITS1和ITS4，18S rDNA序列的扩增引物为NS1和NS8，28S rDNA序列的扩增引物为LR0R和LR5，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。通过PCR扩增得到长度为589bp的ITS rDNA序列，1670bp的18S rDNA序列，940bp的28S rDNA序列。

本实施例采用CTNB法提取DNA模板，具体步骤如下：

1.将FL15菌株的菌体加入液氮，研磨成粉，保存于-80℃待用。取25mg的菌体置于1.5mL的离心管中，加入600μL Buffer SFG1，4μL RNaseA溶液，高速振荡15～30s重悬，得到重悬菌体。

2.将重悬菌体在65℃水浴15min，在此期间进行了3次摇匀操作。

3.然后在重悬菌体中加210μL SFG2摇晃混匀，高速振荡15s，冰浴5min，10000×g离心10min，取上清液移入匀浆柱内，在移取上清液的过程中小心不要碰到沉淀。

4.将上清液移入匀浆柱中后，立即在10000×g下离心2min，将滤液转移至新的1.5mL的离心管中，转移过程中小心不要碰到沉淀。

5.转移后，加1.5倍体积的Buffer SFG3/无水乙醇，得到650μL溶液，混匀高速振荡15s。

6.把HiBind DNA柱套放在2mL收集管中，将上述650μL溶液过柱，室温10000×g离心1min，去滤液。

7.将上述650μL未过滤完的剩余溶液过柱，室温10000×g离心1min，去滤液。

8.更换新的2mL收集管，加650μL SPWWash Buffer(含乙醇)，室温10000×g离心1min，去滤液。

9.重复步骤8一次。

10.对HiBind DNA柱进行离心，室温10000×g离心2min，去除HiBind柱中残留的溶液，保留HiBind柱待处理。

11.更换新的1.5mL离心管，向HiBind柱中加入50μL Elution buffer，65℃放置4min，室温10000×g离心1min洗脱DNA，重复两次，得到模板DNA。

PCR反应体系为：模板DNA2μL、10×PCRbuffer 5μL、Taq DNA聚合酶2.5U、Dntp(2.5mM)4μL、引物3μL，补充去离子水至50μL。反应程序94℃40s，60℃40s，72℃40s，34个循环；72℃延伸5min。

PCR产物经1％凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

将测得的ITS rDNA、18S rDNA和28S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST比对。下载相关菌株的ITS rDNA、18S rDNA及28S rDNA等序列，使用MEGA7.0.14软件Clustal X方法进行系统发育分析，以Neighbour-Joining法构建分子系统发育树，在分枝上标记1000次重复获得的自展检验Bootstrap值，以评估系统发育树的置信度，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位，如图3～5所示。

根据菌株FL15及其相关菌株的ITS rDNA(图3)、18S rDNA(图4)和28S rDNA(图5)序列建立系统发育树，分别在NCBI上进行了BLAST比对。FL15与Talaromycespinophilus同源性达到99％。本发明使用join-neighbour和MEGA 7.0.14构建了分子系统发育树。结合菌株的形态学观察结果与ITS rDNA、18S rDNA及28S rDNA分析结果，最终将FL15鉴定为蓝状菌Talaromyces sp.。

实施例2

生物合成纳米银

(1)菌株的活化：于超净台中将保存于斜面上的FL15接种于PDA固体培养基上，置于28℃光照培养箱中，培养4天，此时菌落直径达到60mm；

(2)发酵液的制备：将活化好的菌株FL15于超净台中接种到500mL的含有200mLPDB液体培养基的三角瓶中，放置于28℃，160rpm摇床中培养7d，得到发酵液；

(3)二次发酵液的制备：将步骤(2)培养好的发酵液，用布氏漏斗过滤得到菌体，并用去离子水冲洗菌体4次，获得湿菌体，测得湿菌体含水量为10.51％，将得到的湿菌体，以每20g菌体的量分散于100mL去离子水中，放入28℃，160rpm摇床中培养24h，得到二次发酵液。

(4)纳米银的制备：将二次发酵液用溶剂过滤器(滤膜孔径为0.22μm)过滤，收集滤液，将滤液与1mM的硝酸银溶液按4:6的体积比混合，得到反应液(pH为9)，放入光照培养箱，在28℃下反应120min，即可在反应液中得到均匀分布的纳米银溶胶，再进行冷冻干燥即获得纳米银粉末。

实施例3

生物合成纳米银

(1)菌株的活化：于超净台中将保存于斜面上的FL15接种于PDA固体培养基上，置于30℃光照培养箱中，培养3天，菌落直径达到60mm；

(2)发酵液的制备：将活化好的菌株FL15于超净台中接种到500mL的含有200mLPDB液体培养基的三角瓶中，放置于28℃，180rpm摇床中培养5d，得到发酵液；

(3)二次发酵液的制备：将步骤(2)中培养好的发酵液，用布氏漏斗过滤得到菌体，并用去离子水冲洗菌体5次，获得湿菌体，湿菌体含水量为10.51％，将得到的湿菌体，以每20g菌体的量分散于100mL去离子水中，放入28℃，160rpm摇床中培养24h，得到二次发酵液；

(4)纳米银的制备：将二次发酵液用溶剂过滤器(滤膜孔径为0.22μm)过滤，收集滤液，将滤液与3mM的硝酸银溶液按5:5的体积比混合，得到反应液(pH为5)，放入光照培养箱，在28℃下反应180min，即可在反应液中得到均匀分布的纳米银溶胶，再进行冷冻干燥即获得纳米银粉末。

实施例4

生物合成纳米银

(1)菌株的活化：于超净台中将保存于斜面上的FL15接种于PDA固体培养基上，置于28℃光照培养箱中，培养5天，菌落直径达到60mm；

(2)发酵液的制备：将活化好的菌株FL15于超净台中接种到500mL的含有200mLPDB液体培养基的三角瓶中，放置于28℃，160rpm摇床中培养6d，得到发酵液；

(3)二次发酵液的制备：将步骤(2)中培养好的发酵液，用布氏漏斗过滤得到菌体，并用去离子水冲洗菌体5次，获得湿菌体，湿菌体含水量为10.51％，将得到的湿菌体，以每10g菌体的量分散于100mL去离子水中，放入28℃，160rpm摇床中培养24h，得到二次发酵液；

(4)纳米银的制备：将二次发酵液用溶剂过滤器(滤膜孔径为0.22μm)过滤，收集滤液，将滤液与4mM的硝酸银溶液按7:3的体积比混合，得到反应液(pH为7)，放入光照培养箱，在28℃下反应70min，即可在反应液中得到均匀分布的纳米银溶胶，再进行冷冻干燥即获得纳米银粉末。

实施例5

在纳米银合成过程中多种因素都会对纳米银的产量产生影响，在分析了纳米银生物合成过程中的条件因素后，对以下的参数进行了优化：硝酸银的浓度(1mM，2mM，3mM，和4mM)、添加湿菌体的量(5g，10g，20g，30g，和40g)，硝酸银与真菌滤液的比例(9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，和1:9)，pH值(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，和10.0)，反应时间(20min、40min、60min、80min、100min、140min、和180min)，光的影响(光照，黑暗)，均通过紫外可见分光光度计检测纳米银的合成情况，结果如图6所示(其中，图6a中由上自下依次为1mM、2mM、3mM、4mM的硝酸银浓度，图6f中线条粗且颜色深的曲线为黑暗条件下纳米银的合成情况)。

通过对上述条件进行优化后，收集所制备的AgNPs，通过计算可知，浓度为3.2mg/ml的二次发酵液可将1.7mg的AgNO₃(含m_Ag＝1.1mg)还原为1.0±0.21mg的AgNPs，即转化率达到90.9％，提高了蓝状菌FL15介导生物合成纳米银的产量。

实施例6

图7A为菌株FL15的菌液(A右图)和其制备纳米银时的反应液(A左图)。通过观察图7A(左图)可以看出，蓝状菌FL15的二次发酵液在合成纳米银时，纳米银在反应液中均匀分布，形成了纳米银溶胶。

本实施例以实施例1制备的AgNPs固体粉末为实验对象。

使用紫外分光光度计在300nm～700nm波长范围内，间隔1nm测定吸光度，结果显示在435nm处出现最大吸收峰，为纳米银的特征吸收峰，如图7B所示。

本实施例还使用透射电镜观察了颗粒的粒度分布，将AgNPs粉体用去离子水洗涤2次后，分散在10mL去离子水中，得到混悬液，将混悬液滴在铜丝上，干燥后在TEM下观察，结果如图8，图9所示，所合成的纳米银为球形或近球形且分散性良好，最小粒径为3.494nm(图9最小粒径在2～4nm之间，所测最小粒径落在上述范围内)，平均粒径为9.101nm。

使用X射线衍射仪测定了AgNPs的晶型，结果如图10所示，根据对纳米银的XRD图谱分析，在与JCPDS标准卡的对照后，发现2θ在37.30°、44.60°、64.61°、77.78°处，出现的四个衍射峰均为银的特征衍射峰，说明纳米银晶体有4个晶面，对应的晶面指数依次为(111)、(200)、(220)、(311)，属于多晶结构。

使用傅里叶变换红外预测与AgNPs合成过程相关的生物分子，AgNPs粉末用KBr压片法制成透明的薄片，并在450～4000cm^-1范围内分析，分辨率为1cm^-1，结果如图11所示，根据FTIR图谱分析，推测制备所得的纳米银表面吸附有多酚类化合物。

按照上述方法，对实施例2和实施例3制备的纳米银进行同样的实验，它们与实施例1的纳米银具有相同的特征吸收峰和晶体结构，同时也吸附有多酚类化合物，并且具有相近的粒径分布特点。

实施例7

本实施例对本发明提供的纳米银的抑菌作用进行试验。

采用牛津杯抑菌法测试纳米银对于致病菌的抑菌活性。将6株致病菌于超净台分别接种于100mL LB液体培养基中，37℃160rpm摇床培养24h后，分别移取100μL的菌液均匀涂布于LB固体培养基上，将已灭菌的牛津杯放置于培养基上，每个牛津杯中加入200μL的300μg/mL浓度的纳米银溶液，阳性对照为：400μg/mL的氯霉素溶液，阴性对照为：FL15真菌二次发酵液。试验重复3次，测量抑菌圈，计算平均值，如表1。

表1 FL15-AgNPs对致病菌的抑菌活性(n＝3)

注：抑菌圈直径大小(单位：mm)

由图12和表1可知，制备所得的纳米银对于多种致病菌均有抑制作用，并表现出良好的抑菌效果，其中对于革兰氏阴性菌(伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、福氏志贺菌)的抑菌作用要优于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)。

由以上实施例可知，本发明提供了一种蓝状菌FL15及其介导纳米银生物合成的应用。本发明首次发现从蛇足石杉中分离的内生真菌FL15具备生物合成纳米银的能力，经过对合成条件进行优化后获得的纳米银的产量较高、尺寸较小。且该纳米银对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、蜡样芽孢杆菌、伤寒沙门杆菌等病原菌具有明显的抑制作用，采用牛津杯抑菌法测得抑菌圈分别为17.5mm，17.5mm，10.2mm，11.0mm，14.5mm，12.5mm，表明制备所得的纳米银对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用，可以作为纳米抗菌材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一株蓝状菌(Talaromyces sp.)FL15，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2019年10月17日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019832。

2.权利要求1所述蓝状菌FL15在体外介导纳米银生物合成中的应用。

3.权利要求1所述蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)活化菌株：将所述蓝状菌FL15接种到马铃薯固体培养基中在28～30℃下活化培养2～5天，得到活化菌种；

(2)制备发酵液：将所述活化菌种接种到马铃薯液体培养基中，在28～30℃，150～180rpm下发酵培养4～7天，得到发酵液；

(3)制备二次发酵液：取所述发酵液的菌体，分散到水中，在28～30℃，150～180rpm下二次发酵24～48h，得到二次发酵液；

(4)合成纳米银：取所述二次发酵液的滤液，加入硝酸银溶液进行生物合成反应，即可得到纳米银。

4.如权利要求3所述的蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，所述菌体与水的质量体积比为5～40g:100mL。

5.如权利要求3所述的蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，步骤(4)中所述二次发酵液经0.22μm的滤膜过滤后得到滤液。

6.如权利要求3所述的蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，所述硝酸银溶液的浓度为1～4mM。

7.如权利要求3或6所述的蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，所述滤液与硝酸银溶液的体积比为1～9:1～9。

8.如权利要求3所述的蓝状菌FL15介导纳米银生物合成的方法，其特征在于，步骤(4)中所述生物合成反应是在28～30℃，pH 4～9，光照强度为2120lux～8430lux下反应20～180min。

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