CN112088002A - 治疗皮肤纤维化的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及局部用或外用组合物，其包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET‑A)受体拮抗剂或抑制剂，优选西他生坦及其药学上可接受的盐。所述组合物用于治疗患有涉及皮肤纤维化或结缔组织疾病等病症的患者。

Description

治疗皮肤纤维化的组合物和方法

技术领域

本发明涉及外用或局部用组合物，所述组合物包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂，优选为西他生坦(sitaxentan)(也称为塞塔生坦(sitaxsentan)及其药学上可接受的盐。所述组合物可用于治疗患有涉及皮肤纤维化或结缔组织疾病等病症的患者。

背景技术

纤维化是指在器官或组织内过多的纤维结缔组织形成。这是常见的病理生理反应，由多种刺激因素诱发，包括持续性感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。修复过程通常包括两个不同的阶段：一个是再生阶段，其中受损细胞被同一类型的细胞替代，不会留下持久性损伤迹象；和一个被称为纤维增生或纤维化的阶段，其中结缔组织取代正常的实质组织(parenchymal tissue)。该过程起初是有益的；但是，如果控制不当，过量的细胞外基质(ECM)成分将永久性地取代正常组织成为疤痕组织，并导致病变状态。纤维化可以在许多不同的器官和组织内产生，并且具有几种不同类型的纤维化疾病，例如特发性肺纤维化、肝硬化、硬皮病或系统性硬化症、进行性肾病和心血管纤维化。在许多情况下，纤维化及其并发症的影响会导致严重的发病率、器官衰竭，甚至死亡。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2693329/。

尽管纤维化存在共性，但每种纤维化疾病的病因和临床表现各不相同，在各种器官中纤维化的机制差异很大。例如，在肝脏纤维化中，原代胶原生成细胞并不是已经证实的像其他器官中那样由成纤维细胞产生，而是源自肝星状细胞，在正常生理学中肝星状细胞具有静息表型并调节维生素A稳态。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18222966。因此，每种纤维化疾病都有不同的治疗目标和方法。例如，治疗肝纤维化或肝硬化将取决于肝损伤的原因和程度。过度饮酒导致肝硬化的人可以通过停止饮酒来减小伤害。然而，患有原发性胆汁性肝硬化(也称为原发性胆汁性胆管炎)的人通过服用药物熊去氧胆酸(天然胆汁酸)，通常可以明显延缓肝硬化的进展。而熊去氧胆酸已经证实对酒精性肝硬化并无有益效果。参见https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cirrhosis/diagnosis-treatment/drc-20351492和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12668982。

皮肤纤维化的一些但不是全部病症例子是硬皮病、瘢痕性脱发(又称疤痕性脱发)和疤痕，例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。皮肤纤维化的病症有许多独特且复杂的特点。例如，硬皮病(皮肤纤维化最显著的病症之一)的发病机制仍然不清楚，而且报道的结论也常常不一致；病毒或细菌感染、遗传因素和自身免疫过程都被认为是潜在的病因。相对于其他类型的纤维化，仍缺乏并亟需对皮肤纤维化病症的治疗和研究。例如，很少有随机和对照治疗研究，也没有FDA批准的治疗硬皮病(最严重的皮肤纤维化病症)皮肤症状的方法。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25672301。

硬皮病可以是局部性的(即只存在于皮肤)或者是全身性的(即除皮肤外其他器官也受到影响)。严重程度因人而异，从轻微到危及生命。一些但不是全部皮肤症状包括雷诺氏现象(Raynaud’s Phenomenon)、手部肿胀或浮肿、关节疼痛和僵硬、皮肤增厚、溃疡、钙质沉着、毛细血管扩张、皮肤干燥、皮肤瘙痒和硬化。此外，皮肤的硬化和紧绷会使容貌受损，并引起极严重的心理压力。一些用于治疗硬皮病的药物例子有钙通道阻滞剂、磷酸二酯酶抑制剂、前列环素类似物、类固醇和免疫抑制剂。但是，这些治疗通常无效和/或带有严重的副作用。此外，患有硬皮病的人的生活质量明显下降，硬皮病给医疗保健系统以及整个社会带来了相当大的经济负担。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28899803。

内皮素(ET-1、ET-2和ET-3)构成了21氨基酸多肽家族，该家族在两种不同的高亲和力受体亚型，内皮素A(ET-A)和内皮素B(ET-B)中发挥作用。在这三种多肽中，ET-1的研究最多且被认为是系统中最具代表性的多肽。其在内皮细胞中可被多种因素诱导产生，包括机械刺激、各种激素和促炎细胞因子。ET-1能够刺激心脏收缩和心肌细胞的生长，调节血管活性物质(强效的血管收缩剂)的释放，刺激平滑肌细胞有丝分裂，并可能通过促进中性粒细胞的粘附和迁移以及刺激促炎性细胞因子的产生来控制炎症反应。它也参与了癌症的发展，调节肿瘤细胞的增殖和迁移，并作为促血管生成因子和基质反应的诱导因子。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27266371。鉴于它们广泛的活性，治疗性控制内皮素已成为许多不同病理病症潜在治疗手段的热门领域。波生坦，一种双重(即非选择性)ET-A/ET-B受体拮抗剂，现已被研发并被FDA批准(以片剂形式)用于治疗肺动脉高压(PAH)。有时在“未被临床试验认可(off-label)”的情况下它被用于硬皮病的治疗医疗设备；然而，它往往无效，并伴随着显著的副作用。值得注意的是，FDA在仔细审查后，没有批准它用于硬皮病。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4474386/。

目前尚没有FDA批准的用于皮肤纤维化诸多病症的治疗方法，尤其是硬皮病。因此，医生必须使用未经证实的试验性方法来尝试控制所述病症。虽然波生坦有时用于口服治疗硬皮病，但通常其效果甚微，而且副作用限制了其效用。例如，波生坦被报道仅有助于防止硬皮病出现新的手指溃疡，但对已有溃疡的愈合没有帮助。例如，波生坦通常会导致肝酶异常，约有10％的患者会受到影响，并导致约5％的患者中止治疗。其他常见的不良反应包括水肿、体液潴留、贫血和胃肠道反应。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4474386/和http://ntag.nhs.uk/docs/app/Bosentan％20for％20digital％20ulcers％20-％20NETAG％20appraisal％20report％20％28Apr10％29.pdf#search＝％22bosentan％2。

波生坦在硬皮病中的缺点说明内皮素拮抗剂无望作为一系列病症的潜在治疗手段。在此发现下，人们非常热衷于将靶向内皮素系统(endothelin axis)作为治疗多种不同疾病的机制。在发现内皮素系统的五年内，人们开始使用可口服用的内皮素受体拮抗剂，并在心血管疾病、心脏衰竭、肺动脉高压、顽固性动脉高压、中风、蛛网膜下腔出血、肾脏疾病和多种癌症的临床试验中对其疗效进行评估。除了治疗肺动脉高压外，其他适应症的大多数临床试验结果要么是中性的，要么是阴性的，导致许多制药公司中止了内皮素受体拮抗剂的项目。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27266371。治疗性控制内皮素系统是一项复杂、微妙和富有挑战性的任务。

目前的研究表明，对ET-A vs.ET-B的选择性拮抗没有益处，而双重拮抗更为可取。例如，在肺动脉高压(PAH)中，ET-A选择性和双重ET-A/ET-B拮抗剂都已获得FDA的批准，然而对其临床结果的仔细分析表明，不可能确定其中一类药物相比于其他的在临床上更具优势。然而，据观察，服用ET-A选择性药物的患者发生了更严重的不良事件，尤其是体液潴留。这种观察发现并不是唯一的。在其他例子中，针对两种不同的ET-A选择性拮抗剂(一种用于糖尿病神经病变，另一种用于癌症)的第3阶段临床试验均由于水分潴留或死亡率增加，导致提前终止研究。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27266371。

研究工作正在寻找选择性内皮素抑制剂，特别是选择性抑制ET-A和ET-B的化合物。西他生坦是一种选择性ET-A拮抗剂，被开发作为治疗肺动脉高压(PAH)的口服片剂。西他生坦在欧洲获得了监管部门的批准，但由于新出现的安全问题，特别是与肝脏毒性相关的安全问题，西他生坦在五年内自愿退出市场。因此，塞塔生坦从未在美国获得FDA的批准。在他们2016年题为“内皮素受体拮抗剂在肺动脉高压以外：癌症和纤维化(Endothelin-receptor antagonists beyond pulmonary arterial hypertension:cancer andfibrosi)”的报告中，Aubert和Juillerat-Jeanneret指出，在纤维化相关疾病中，人体临床试验已经明确表明了阻断内皮素受体的有害影响，尤其是体液潴留。

作为进一步的例子，在Shi-wen等人利用人皮肤成纤维细胞的体外研究中，检测内皮素-1对成纤维细胞基质基因表达和结缔组织重塑的作用，结论是抑制ET-A和ET-B两者是阻止胶原蛋白生物合成的必要条件。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11231316。此外，现已证明，在高浓度下，ET-A-选择性拮抗剂本身可能对ET-A/ET-B呈双重拮抗特性，因而又增加了一层复杂性。鉴于这些现有技术的教导，因此，令人惊讶的是，我们发现西他生坦在皮肤纤维化的几个重要机制上优于波生坦，包括胶原蛋白的产生。同样令人惊讶的是，塞塔生坦对人体皮肤细胞的细胞毒性明显低于波生坦。此外，我们还发现了治疗皮肤纤维化的方法，使用内皮素拮抗剂的剂量比以前低得多。例如，使用波生坦治疗硬皮病时，口服剂量通常达到250mg/天，导致不良的系统性副作用。相比之下，本发明的局部用或外用组合物的优点在于ET-A抑制剂的血浆水平显著低于口服ET-A抑制剂所得的血浆水平。此外，新方法通过局部或外部施用该活性成分来治疗皮肤纤维化病症，提供了避免已知和严重系统性副作用的方法，这些副作用阻碍了这些化合物的先前应用。

由以上可以明显看出，目前需要研发安全有效的治疗皮肤纤维化病症的治疗手段。治疗性控制内皮素可能提供重要的治疗机会，但迄今为止的尝试都没有成功。在本发明中已经令人惊讶地发现，局部或外部施用选择性ET-A受体拮抗剂可以安全地用于治疗皮肤纤维化病症或结缔组织疾病。

在本发明中令人惊讶地发现，选择性内皮素A抑制剂，西他生坦，可以安全有效地局部或外部施用以治疗和缓解包括皮肤纤维化或结缔组织疾病等病症的患者。

发明内容

本发明涉及用于治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病的选择性ET-A受体拮抗剂或抑制剂的局部或外部应用的使用方法以及局部用或外用组合物。

本发明基于一个令人惊讶的发现，西他生坦，一种高选择性ET-A受体拮抗剂，在减少胶原生成、降低活力、诱导细胞凋亡方面明显比载体对照和比波生坦(非选择性ET-A/ET-B受体拮抗剂)更加有效，减少了转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人皮肤成纤维细胞迁移以减少刺激促纤维化表型。

附图说明

图1示出了男性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的划痕试验实验结果，在治疗之前，将其暴露于50ng/mL的转化生长因子β1(TGF-β1)中24小时，将西他生坦(SIT，100μM)与波生坦(BOS，100μM，作为对照化合物)和载体对照(VC)进行比较。统计学显著性如下：*p<0.05，n＝6。利用Dunnett事后分析(Dunnett’s post-hoc analysis)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

图2示出了女性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的划痕试验实验结果，在治疗之前，将其暴露于50ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)中48小时，将西他生坦(SIT，100μM)与波生坦(BOS，100μM，作为对照化合物)和载体对照(VC)进行比较。统计学显著性如下：对于对照*p<0.05；实验组之间#p<0.05，n＝3。采用Tukey真实显著性差异(Tukey’s honestsignificant difference)(HSD)事后分析进行单因素方差分析。

图3示出了在50ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)存在下，用载体(VC)、西他生坦(SIT，100μM)或波生坦(BOS，100μM)处理48小时后，男性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)胶原生成的实验结果。此外，图3还示出了这些实验组与未经TGF-β1刺激的男性正常人皮肤成纤维细胞胶原含量的比较。统计学显著性如下：对于载体对照*p<0.05，实验组之间#p<0.05，n＝6。采用Tukey真实显著性差异(HSD)事后分析进行单因素方差分析。

图4示出了用50ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)对男性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)刺激48小时的实验结果。测定比较西他生坦(SIT，100μm)与波生坦(BOS，100μm，作为对照化合物)和载体对照(VC)的存活率，并在y轴上以相对荧光单位(RFU)报告。统计学显著性如下：对于对照*p<0.05，实验组之间#p<0.05，n＝6。采用Tukey真实显著性差异(HSD)事后分析进行单因素方差分析。

图5示出了用50ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)对男性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)刺激48小时的实验结果。测定比较西他生坦(SIT，100μm)与波生坦(BOS，100μm，作为对照化合物)和载体对照(VC)的细胞毒性，并在y轴上以相对荧光单位(RFU)报告。统计学显著性如下：实验组之间#p<0.05，n＝6。采用Tukey真实显著性差异(HSD)事后分析进行单因素方差分析。

图6示出了用50ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)对男性正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)刺激48小时的实验结果。测定比较司他生坦(SIT，100μm)与波生坦(BOS，100μm，作为对照化合物)和载体对照(VC)的细胞凋亡，并在y轴上以相对光单位(RLU)报告。统计学显著性如下：对于对照*p<0.05，实验组之间#p<0.05，n＝6。采用Tukey真实显著性差异(HSD)事后分析进行单因素方差分析。

具体实施方式

本发明涉及治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病的方法，所述方法包括：将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

在另一方面，本发明涉及治疗皮肤纤维化的方法，所述方法包括：将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

在另一方面，本发明涉及治疗结缔组织疾病的方法，所述方法包括：将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少两倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少五倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少十倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少100倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少1000倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少5000倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A拮抗剂或抑制剂为西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中所述哺乳动物为人类患者。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中皮肤纤维化或结缔组织疾病选自硬皮病、系统性硬化症、局部性硬皮病、弥漫性系统性硬化症、局限性系统性硬化症、雷诺氏现象、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、指硬皮病、皮肤溃疡、硬斑病、带状硬皮病、瘢痕性脱发、疤痕性脱发(包括但不限于扁平毛发苔癣、额部纤维性脱发、中央离心性瘢痕性脱发(central centrifugal cicatricial alopecia)、秃发性毛囊炎、盘状红斑狼疮和解剖性蜂窝织炎(dissecting cellulitis))、类风湿性关节炎、狼疮、苔癣硬化症、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、烧伤疤痕，及它们的组合。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中药学上可接受的盐选自碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中碱金属盐选自锂盐、钠盐和钾盐。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中碱金属盐为钠盐。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中药学上可接受的盐为西他生坦钠。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少一次。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少两次。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每周施用至少一次。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每周施用至少两次。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少一次直至皮肤纤维化或结缔组织疾病被治疗。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂从药学上可接受的组合物中施加。

在另一方面，本发明涉及治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病的方法，所述方法包括：将包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂的药学上可接受的组合物局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

在另一方面，本发明涉及选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂在制造药物中的用途，所述药物用于将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部递送给有此需要的治疗哺乳动物治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病。

在另一方面，本发明涉及用于局部或外部递送的组合物，所述组合物包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂和药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明涉及组合物，其中选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂对ET-A具有至少两倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

在另一方面，本发明涉及组合物，其中选择性内皮素A拮抗剂或抑制剂为西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及组合物，其中药学上可接受的盐为西他生坦钠。

在另一方面，本发明涉及施用于哺乳动物的组合物。

在另一方面，本发明涉及组合物，其中所述哺乳动物为人类患者。

在另一方面，本发明涉及呈单位剂量组合物形式的组合物。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述单位剂量组合物包含约0.01至约1000mg西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述单位剂量组合物包含约0.001重量％至约25重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述单位剂量组合物包含约0.01重量％至约10重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述单位剂量组合物包含约0.1重量％至约5重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述单位剂量组合物包含约0.2重量％至约3重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明涉及单位剂量组合物，其具有选自以下至少一项的药物动力学参数：C_max小于约13μg/ml，或C_max小于约7μg/ml，或AUC(曲线下面积)小于约40μg hr/ml。

在另一方面，本发明涉及用于制备根据本发明的组合物的方法。

根据本文的公开内容，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。

定义

如本文所用，下列术语和缩略语具有所指出的含义，除非有相反的表述。

对于ET-A拮抗剂或抑制剂，术语“选择性”是指ET-A抑制剂优先抑制ET-A而不是ET-B。对ET-A选择性应为对ET-B选择性的至少两倍，优选至少五倍，更优选至少十倍，更优选至少100倍，更优选至少1000倍，最优选至少5000倍。这样的选择性对于提供本发明的治疗益处很重要。相比于非选择性抑制剂，例如波生坦，这种选择性的基本原理是几乎不会抑制ET-B刺激的有益效果，例如一氧化氮生成和从循环中清除内皮素。

术语“药学上可接受”在本文中用于本发明的组合物(换言之，制剂)，以及用于西他生坦的盐，即药学上可接受的盐。本发明的药物组合物包括治疗有效量的西他生坦和药学上可接受的载体。这些载体可包含多种赋形剂。药学上可接受的载体是指那些具有可接受安全性的周知的载体。所述组合物使用常规制剂技术制成。例如，参见《雷明顿制药科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第17版，编辑Alfonso R.Gennaro，麦克出版社(Mack Publishing Company)，宾夕法尼亚州伊斯顿，第17版，1985年。关于药学上可接受的盐，将在下文描述。

术语“受试者”是指因皮肤纤维化或结缔组织疾病需要治疗或干预的人类患者或动物。

术语“治疗有效”如医务工作者所理解，是指将西他生坦提供给需要治疗的受试者(例如人类患者或动物)而产生有意义或可证实的益处所需的量。意图治疗的病症包括，例如，皮肤纤维化和结缔组织疾病。例如，可以使用各种临床参数评估或量化有意义的或可证实的益处。也可以使用包括模型来提供对益处的证实，包括但不限于体外模型、体内模型和动物模型。这种模型的示例是人I型前胶原C肽(PIP)分析。该模型设计成通过

技术对各种实验状态下人血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解物和组织匀浆中的人前胶原进行检测和量化。可以使用的动物模型例子是博莱霉素诱导的皮肤纤维化模型。参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24706279。

术语“局部”在本文中用于药物组合物是指将组合物施用于受试者(例如人类患者)的皮肤或粘膜。局部用药物组合物旨在在施用部位(即施用部位下方的组织)产生作用，并且不会在血液和其他组织中产生明显的药物浓度。局部用药物组合物与“经皮”或“经粘膜”的药物组合物相反，“经皮”或“经粘膜”的药物组合物通过皮肤或粘膜吸收并旨在对远离施用部位的身体部位产生系统性作用。参见http://corporatepharmacy.ca/health- news/topical-vs-transdermal-meds,(2016)。

此外，美国食品和药物管理局为所有给药途径提供了标准，即“给药途径”。以下是由FDA提供的局部、经皮和经粘膜给药途径的定义。

*美国国家癌症研究所

参见，

https://www.fda.qov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/ FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/ DataStandardsManualmonographs/ucm071667.htm。

术语“局部”在本文中用于药物组合物是指组合物的给药途径，通常在施用位置周围发挥药效作用，并且不会在血液或其他组织中产生明显或快速的浓度。除上述所定义的局部组合物外，其它局部给药途径的一些(但不是全部)例子可包括皮下注射和皮内注射。

本文所使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括缓解、减轻或改善病症(例如皮肤纤维化或结缔组织疾病)，或者预防或减小罹患所述病症或表现出所述病症的症状的风险，预防性和/或治疗性地改善或预防引起症状的根本原因，抑制病情，阻止病情发展，缓解病情，致使病情消退，或停止表现症状。

在各种实施方案中，使用西他生坦或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物的治疗方法还包括，西他生坦或其药学上可接受的盐在制造用于所需治疗(例如用于治疗皮肤纤维化和结缔组织疾病)的药物中的用途。

“T-A”是内皮素A的缩写。

“T-B”是内皮素B的缩写。

“TGF-β1”是转化生长因子β1的缩写。

“NHDF”是正常人皮肤成纤维细胞的缩写。

西他生坦

本发明利用治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂，例如西他生坦或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，用于提供用于治疗诸如皮肤纤维化和结缔组织疾病等病症的局部用或外用组合物。

西他生坦，也称为塞塔生坦，CAS注册号为184036-34-8，IUPAC名称为N-(4-氯-3-甲基-5-异恶唑基)-2-[(2-甲基-4,5-亚甲二氧基苯基)-乙酰]噻吩-3-磺酰胺，代号TBC-11251。西他生坦钠盐是为人类使用而开发的药物形式，其CAS注册号为210421-64-0。西他生坦是用于治疗肺动脉高压(PAH)研发的口服片剂，直至2008年2月恩赛斯夫制药(Encysive Pharmaceuticals)被辉瑞制药(Pfizer)收购之前其商品名为

在2010年，由于新出现的安全隐患，辉瑞公司自愿将塞塔生坦撤出市场。http:// press.pfizer.com/press-release/pfizer-stops-clinical-trials-thelin-and- initiates-voluntary-product-withdrawal-interes。

西他生坦的化学结构如下所示。

西他生坦的化学式为C₁₈H₁₅ClN₂O₂S₂，摩尔质量为454.906g/mol。药物动力学数据如下报告：

口服生物药效率：70至100％

蛋白质结合率：>99％

代谢：肝脏(由CYP2C9和CYP3A4介导)

生物半衰期：10小时

排泄：肾脏(50至60％)，排泄物(40至50％)。

西他生坦描述为选择性阻断或抑制内皮素(ET)对内皮素A(ET-A)受体作用的小分子。据报道，这种选择性是内皮素B(ET-B)的6000倍。参见Girgis,RE；Frost,AE；Hill,NS；Horn,EM；Langleben,D；McLaughlin,VV；Oudiz,RJ；Robbins,IM；et al.(2007).“塞塔生坦选择性拮抗内皮素A受体治疗结缔组织病与肺动脉高压(Selective endothelin-Areceptor antagonism with sitaxsentan for pulmonary arterial hypertensionassociated with connective tissue disease)”.风湿性疾病年报(Annals of therheumatic diseases).66(11):1467-72.doi:10.1136/ard.2007.069609。PMC 2111639免费访问。PMID 17472992。这种选择性对于提供本发明的治疗益处很重要。

西他生坦药学上可接受的盐可用于本发明的方法和组合物。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指通过西他生坦经制备成盐而改性得到的西他生坦衍生物。药学上可接受的盐的例子包括但不限于碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。碱金属盐的例子包括锂盐、钠盐和钾盐。碱土金属盐的例子包括钙盐和镁盐。铵盐，NH4⁺。可以制备成铵盐本身以及各种单烷基、二烷基、三烷基和四烷基铵盐。此外，这种铵盐的一个或多个烷基可进一步用例如羟基等基团取代，以提供烷醇胺的铵盐。本文考虑从二胺(例如1,2-二氨基乙烷)衍生的铵盐。西他生坦钠盐，也称为西他生坦钠，用于本文。《雷明顿制药科学》第18版(麦克出版社，1990年)中列出了合适的盐。

西他生坦药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法由母体化合物制备得到。一般而言，这种盐可以通过将化合物以自由酸形式与化学计量的适当的碱在水中或在有机溶剂中，或在两者的混合物中反应制备得到；一般情况下，优选非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。

剂量

在一个方面，本发明包括治疗有效量的西他生坦或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

基于单位剂量，基于西他生坦活性成分的重量，组合物可以包含约0.1mg至约1000mg西他生坦或其药学上可接受的盐。基于西他生坦活性成分的重量，其他剂量的例子为1mg、10mg、50、mg、100mg和500mg西他生坦或其药学上可接受的盐。

也可以基于重量百分比制备组合物。

在一个实施方案中，基于西他生坦活性成分的重量，本文可用的组合物包含约0.001重量％至约25重量％西他生坦或其药学上的盐。

在一个实施方案中，基于西他生坦活性成分的重量，本文可用的组合物包含约0.01重量％至约10重量％西他生坦或其药学上的盐。

在一个实施方案中，基于西他生坦活性成分的重量，本文可用的组合物包含约0.1重量％至约5重量％西他生坦或其药学上的盐。

在一个实施方案中，基于西他生坦活性成分的重量，本文可用的组合物包含约0.2重量％至约3重量％西他生坦或其药学上的盐。

对于上述包含指定量或重量百分比西他生坦的组合物，西他生坦的量或重量百分比是基于西他生坦部分(其摩尔质量为454.906)的实际量来确定或计算的，不包括当使用西他生坦盐时任何反荷离子提供的额外重量。换言之，所述组合物是基于西他生坦化学部分的量或重量百分比。

此外，由于本发明与局部用或外用组合物相关，并且由于非常需要限制系统性暴露，因此单位剂量可以配制成具有以下至少一项药物动力学参数，所述药物动力学参数选自：C_max小于约13μg/ml，或C_max小于约7μg/ml，或AUC小于约40μg hr/ml。这些药物动力学参数基于欧洲药物管理局就Thelin报告的那些参数。

局部给药制剂

在一个实施方案中，本发明的组合物或制剂包括选择性ET-A受体拮抗剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。这些制剂可以使用药物和制剂领域普通技术人员所熟悉的标准配制和混合技术来制造。

在一个实施方案中，本发明的组合物或制剂包括西他生坦或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。这些制剂可以使用药物和制剂领域普通技术人员所熟悉的标准配制和混合技术来制造。

在一个方面，药物组合物选自由以下项组成的组：凝胶、软膏、乳液、乳剂、霜、泡沫、摩丝、液体、糊剂、啫喱、胶带、喷雾剂、悬浮液、分散液或气雾剂。

本文使用的组合物，其中药学上可接受的载体选自以下一种或多种物质：芝麻油、矿物油、橄榄油、凡士林、水、乙醇、乙醇/水混合物、异丙醇、异丙醇/水混合物、二甲基亚砜和二甲基异山梨醇。药物载体的其他例子(但并非全部例子)包括选自衍生自水果或蔬菜或花卉或坚果或种子的油(包括但不限于芝麻油、花生油和蓖麻油)、醇(包括但不限于乙醇、苯甲醇和异丙醇)、二丙二醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、二甲基亚砜、棕榈酸异丙酯、中链甘油三酯、矿物油、聚乙二醇、丙二醇、三辛酸甘油酯和水。药学上可接受的载体的一个具体例子是乙醇。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90重量％，或甚至超过99重量％。

本发明的组合物中可使用各种附加组分。所述组合物可包含选自以下项的一种或多种附加组分：渗透促进剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、表面活性剂或润湿剂、润肤剂、成膜剂或粘度调节剂的。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90％，或甚至超过99重量％。

在一个方面，可包括渗透促进剂。在另一方面，可包括防腐剂。在另一方面，可包括抗氧化剂。在另一方面，可包括乳化剂。在另一方面，可包括润肤剂。在另一方面，可包括粘度调节剂。在另一方面，可包括表面活性剂或润湿剂。在另一方面，可包括成膜剂。在另一方面，药物组合物为选自以下项的形式：凝胶、软膏、乳液、乳剂、霜、液体、喷雾剂、悬浮液、啫喱、泡沫、摩丝、糊剂、胶带、分散液、气雾剂。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。

在另一方面，药学上可接受的载体可包括选自由以下物质组成的组：醇(包括但不限于乙醇、苯甲醇或异丙醇)、丙酮、白蛋白、衍生自水果或蔬菜或花卉或坚果或种子的油(包括但不限于杏仁油、玉米油、棉籽油、椰子油、芝麻油、橄榄油、花生油、红花油、大豆油或葵花籽油)、苯甲酸苄酯、丁二醇、二氧化碳、蓖麻油、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、二甘醇、二甘醇单乙醚、二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二丙二醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、四甘醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、轻质矿物油、矿物油、中链甘油三酯、乳酸甲酯、单乙醇胺、辛基十二醇、聚乙二醇、聚氧乙烯35蓖麻油、碳酸丙烯酯、丙二醇、吡咯烷酮、三醋酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三油酸甘油酯和水，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90重量％，甚至超过99重量％。

在另一方面，至少一种渗透促进剂可选自由以下项组成的组：醇(包括但不限于乙醇、苯甲醇、油醇或异丙醇)、癸二酸二乙酯、二甘醇、二甲基亚砜、甘油单油酸酯、四甘醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、轻质矿物油、月桂酸、亚油酸、薄荷醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、聚氧乙烯烷基醚、聚氧甘油酯、丙二醇单月桂酸酯、吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、角鲨烷、百里草酚、三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯和乙二醇单乙基醚(transcutol)，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90重量％。

在另一方面，至少一种防腐剂可选自由以下项组成的组：对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、丙酮亚硫酸氢钠、乙醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、硼酸、溴硝醇、丁基羟基茴香醚、丁二醇、醋酸钙、氯化钙、乳酸钙、溴棕三甲铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙二胺四乙酸、甘油、海克替啶、咪脲、异丙醇、硫代甘油、戊二酸、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、乙酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、焦亚硫酸钾、硝酸钾、山梨酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、丙二醇、对羟基苯甲酸丙酯钠、醋酸钠、苯甲酸钠、硼酸钠、乳酸钠、焦亚硫酸钠、丙酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、二氧化硫、硫柳汞、氧化锌和N-乙酰半胱氨酸，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达30重量％。

在另一方面，至少一种抗氧化剂可选自可选自由以下项组成的组：丙酮亚硫酸氢钠、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、一水柠檬酸、没食子酸十二酯、赤藓酸、富马酸、苹果酸、甘露醇、山梨醇、硫代甘油、没食子酸辛酯、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、甲醛亚砜钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、百里草酚、维生素E聚乙二醇琥珀酸和N-乙酰半胱氨酸，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达30重量％。

在另一方面，至少一种乳化剂可选自由以下项组成的组：阿拉伯胶、琼脂、海藻酸铵、海藻酸钙、卡波姆胶、羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、甘油单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、硅酸镁锂、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、羟丙甲纤维素、羊毛脂、羊毛脂醇、月桂酸、卵磷脂、亚油酸、氧化镁、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油、单乙醇胺、肉豆蔻酸、辛基十二醇、油酸、油醇、棕榈油、棕榈酸、果胶、磷脂、泊洛沙姆、聚卡波菲、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧辛基山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙二醇15羟基硬脂酸、聚氧甘油酯、海藻酸钾、丙二醇海藻酸钾、丙二醇二月桂酸酯、丙二醇单月桂酸酯、皂土、硼酸钠、脱水柠檬酸钠、乳酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨醇酯、淀粉、硬脂酸、硬脂酸蔗糖、黄蓍胶、三乙醇胺、氨丁三醇、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、蜡和黄原胶，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达30重量％。

在另一方面，至少一种润肤剂可选自由以下项组成的组：杏仁油、单硬脂酸铝、硬脂酸丁酯、菜籽油、蓖麻油、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、棕榈酸鲸腊酯、胆固醇、椰子油、环甲基硅酮、油酸癸酯、癸二酸二乙酯、二甲基硅酮、乙二醇硬脂酸酯、甘油、甘油单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、异硬脂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、羊毛脂醇、卵磷脂、矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、油醇、棕榈仁油、棕榈油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、丙二醇二月桂酸酯、丙二醇单月桂酸酯、红花油、角鲨烯、葵花籽油、三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯、蜡、木糖醇、醋酸锌，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达60重量％。

在另一方面，至少一种粘度调节剂可选自由以下项组成的组：阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、海藻酸铵、凹凸棒石、膨润土、海藻酸钙、乳酸钙、卡波姆、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、卡拉胶、纤维素、角豆胶、纯地蜡(ceresin)、鲸蜡硬脂醇、棕榈酸鲸腊酯、壳聚糖、胶体二氧化硅、玉米糖浆固体(corn syrup solids)、环甲基硅酮、乙基纤维素、明胶、二十二酸甘油酯、瓜尔胶、硅酸镁锂、疏水胶体二氧化硅、羟乙基纤维素、羟乙甲纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、羟丙甲纤维素、硅酸铝镁、麦芽糊精、甲基纤维素、肉豆蔻醇、辛基十二醇、棕榈油、果胶、聚卡波菲、聚葡萄糖、聚氧化乙烯、聚氧乙烯烷基醚、聚乙烯醇、海藻酸钾、丙二醇海藻酸钠、普鲁兰多糖、皂土、海藻酸钠、淀粉、蔗糖、白糖、亚砜醚β-环糊精、黄蓍胶、海藻糖和黄原胶，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达60重量％。

在另一方面，至少一种成膜剂可选自由以下项组成的组：海藻酸铵、壳聚糖、松脂、共聚维酮、乙二醇与乙烯醇接枝共聚物、明胶、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、醋酸琥珀羟丙甲纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基乙烯基醚/马来酸酐)、聚醋酸乙烯酯分散体、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚维酮、普鲁兰多糖、硝酸纤维素和虫胶，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90重量％，或甚至超过99重量％。

在另一方面，至少一种表面活性剂或润湿剂可选自由以下项组成的组：多库酯钠、磷脂、十二烷基硫酸钠、苯扎氯铵、溴棕三甲铵、氯化十六烷基吡啶、α-生育酚、甘油单油酸酯、肉豆蔻醇、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙二醇15羟基硬脂酸、聚氧甘油酯、丙二醇二月桂酸酯、丙二醇单月桂酸酯、山梨醇酯、硬脂酸蔗糖、三辛酸甘油酯和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯，或它们的组合。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达30重量％。

在另一方面，可包括缓冲剂。在另一方面，可包括润肤剂。在另一方面，可包括乳化剂。在另一方面，可包括乳液稳定剂。在另一方面，可包括胶凝剂。在另一方面，可包括保湿剂。在另一方面，可包括软膏基质或油性载体。在另一方面，可包括悬浮剂。在另一方面，可包括酸化剂。在另一方面，可包括碱化剂。另一方面，可包括生物粘附材料。在另一方面，可包括着色剂。在另一方面，可包括微胶囊剂。在另一方面，可包括硬化剂。这些组分可以基于药学和制剂领域普通技术人员的知识，在适合制剂的水平上采用和使用。含量可在1重量％以下至高达90重量％，或甚至超过99重量％。

药学和制剂技术领域的普通技术人员可以确定本发明组合物的必要和可选组分的适当水平。

制备西他生坦组合物的方法也意图作为本发明的一部分，并且对于制药和制剂技术领域的普通技术人员而言，使用标准的配制和混合技术是显而易见的。

治疗方法

本发明利用治疗有效量的西他生坦或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，用于提供用于治疗诸如皮肤纤维化和结缔组织疾病等病症的局部用或外用组合物。这些病症包括硬皮病(包括但不限于系统性硬化症和局部性硬皮病)、雷诺氏现象、佩罗尼氏病、指硬皮病、皮肤溃疡、硬斑病、带状硬皮病、瘢痕性脱发、疤痕性脱发(包括但不限于扁平毛发苔癣、额部纤维性脱发、中央离心性瘢痕性脱发、秃发性毛囊炎、盘状红斑狼疮、解剖性蜂窝织炎)、类风湿性关节炎、狼疮、苔癣硬化症、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、烧伤疤痕，及它们的组合。

所述方法包括将治疗有效量的西他生坦或其药学上可接受的盐局部或外部施用于有此需要的哺乳动物(例如人类患者)。当治疗人类患者时，将组合物施用于所述患者的皮肤上。

根据医生或其他医务工作者的技能和知识，可以制定和使用多种剂量方案。在一些实施方案中，如本文所述，单位剂量的组合物可每日施用至少一次。在其他实施方案中，单位剂量的组合物可每日施用至少两次、或每周至少一次或每周至少两次。

在医生或医务工作者的判断下，可以继续局部或外部施用所述组合物直至达到期望的治疗益处，即直到皮肤纤维化或结缔组织疾病得以治疗。在某些情况下，继续长期或慢性治疗是可取的。

实施例

以下实施例进一步描述和演示本发明范围内的实施方案。所给出的实施例仅用于举例说明，不应被解释为对本发明的限制，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，其可能具有许多变体。

实施例1：西他生坦对TGF-β1诱导的男性成纤维细胞的影响

在伤口闭合试验中测定西他生坦的影响，用TGF-β1将男性正常人皮肤成纤维细胞诱导成促纤维化表型。在划痕试验中，硬皮病成纤维细胞“愈合(close)”伤口的速度明显快于对照组，并且这些诱导的成纤维细胞的行为类似于二维划痕试验中的硬皮病成纤维细胞。在这项试验中，当细胞生长到融合时，划出划痕/消融，即“伤口”，跟踪细胞迁移穿过清除区域的情况。参见http://journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0007438，以及Wu,M.et al.罗格列酮可消除博莱霉素诱导的硬皮病并通过过氧化物酶体增殖剂激活受体γ阻断促纤维化反应(Rosiglitazone abrogatesbleomycin-induced scleroderma and blocks profibrotic responses throughperoxisome proliferator-activated receptor-gamma).Am J Pathol 174,519-533，doi:10.2353/ajpath.2009.080574(2009)。

将男性正常人皮肤成纤维细胞(LLCT FC0024 lot 03869_男性成纤维细胞，23岁)接种于96孔板，用含10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodified eagle medium，DMEM)进行培养，培养至融合。

洗涤细胞除去FBS，并加入无血清培养基过夜培养(O/N)16小时。

在每一融合的单细胞层上进行划痕试验。

样品可选地用绿色细胞示踪剂(CellTracker Green)(5μm)染色以产生荧光计时起点图像。

用50ng/mL TGF-β1诱导纤维化，用递增浓度(1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)的载体对照、西他生坦和波生坦(作为对照化合物)处理细胞。每个浓度运行6个平行样品。

拍摄计时起点图像，并记录划痕/消融的初始距离。

将样品在37℃下孵育24小时，然后移除培养基并加入0.5μg/mL钙黄绿素乙酰氧基甲酯(钙黄绿素AM)。

将样品孵育30分钟。

拍摄图像并记录划痕/消融的距离。

距离减小表示“伤口”闭合。

使用GraphPad Prism 7计算和分析距离。

表1中的数据(μm，微米)表示距离变化。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图1所示。

结果表明，西他生坦显著地减少了TGF-β1诱导的男性正常人皮肤成纤维细胞的迁移，而波生坦对其并没有明显影响。

实施例2：西他生坦对TGF-β1诱导的女性细胞成纤维细胞的影响

在伤口闭合试验中测定西他生坦的影响，利用TGF-β1将女性正常人皮肤成纤维细胞诱导成促纤维化表型。在划痕试验中，硬皮病成纤维细胞“愈合”伤口的速度明显快于对照组，并且这些诱导的成纤维细胞的行为类似于二维划痕试验中的硬皮病成纤维细胞。在这项试验中，当细胞生长到融合时，划出划痕/消融，即“伤口”，跟踪细胞迁移穿过清除区域的情况。参见http://journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0007438，以及Wu,M.et al.罗格列酮可消除博莱霉素诱导的硬皮病并通过过氧化物酶体增殖剂激活受体γ阻断促纤维化反应(Rosiglitazone abrogatesbleomycin-induced scleroderma and blocks profibrotic responses throughperoxisome proliferator-activated receptor-gamma).Am J Pathol 174,519-533，doi:10.2353/ajpath.2009.080574(2009)。

将女性正常人皮肤成纤维细胞(LLCT FC0024 lot 00703_女性成纤维细胞，45岁)接种于96孔板，用含10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)进行培养，培养至融合。

洗涤细胞除去FBS，并加入无血清培养基过夜培养(O/N)16小时。

在每一融合的单细胞层上进行划痕试验。

样品可选地用绿色细胞示踪剂(5μm)染色以产生荧光计时起点图像。

用50ng/mL TGF-β1诱导纤维化，用递增浓度(3μM、10μM、30μM和100μM)的载体对照、西他生坦和波生坦(作为对照化合物)处理细胞。每个浓度运行3个平行样品。

拍摄计时起点图像，记录划痕/消融的初始距离。

将样品在37℃下孵育48小时，然后移除培养基并加入0.5μg/mL钙黄绿素乙酰氧基甲酯(钙黄绿素AM)。

将样品孵育30分钟。

拍摄图像并记录划痕/消融的距离。

距离减小表示“伤口”闭合。

使用GraphPad Prism 7计算和分析距离。

表2中的数据(μm，微米)表示距离变化。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图2所示。

结果表明，与对照组相比，西他生坦和波生坦均显著地减少了TGF-β1诱导的女性正常人皮肤成纤维细胞的迁移，其中西他生坦减少迁移的作用明显大于波生坦。

实施例3：西他生坦对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞中胶原生成的影响

在AlphaLISA试验中测定西他生坦对胶原生成的影响，利用TGF-β1将男性正常人皮肤成纤维细胞诱导成促纤维化表型。在这项试验中，细胞在含载体对照、西他生坦和波生坦的培养基中生长48小时。参见http://www.perkinelmer.com/product/alphalisa-hpip-collagen-kit-100pts-al353hv。

使用AlphaLISA试验，它是FRET(荧光共振能量转移)技术的一种变形，无需洗涤即可高灵敏度、定量分析以检测目标分子。在AlphaLISA试验中，生物素化的抗分析物抗体与链霉亲和素包被的供体微珠结合，而另一个抗分析物抗体与AlphaLISA受体微珠结合。在分析物存在的情况下，微珠会靠近。供体微珠的激发导致单线态氧分子的释放，从而在受体微珠中引发一系列能量转移，产生一个尖峰在615nm处的发射光。

将男性正常人皮肤成纤维细胞(LLCT FC0024 lot 03869_男性成纤维细胞，23岁)接种于96孔板，用含10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)进行培养，培养至融合。

洗涤细胞除去FBS，并加入无血清培养基过夜培养(O/N)。

用50ng/mL TGF-β1刺激细胞，并处理。

收集细胞上方的上清液，用无血清DMEM培养基稀释1:20。

每孔加入5μL hPIP分析物标准品或5μL样品。

加入10μL 5×AlphaLISA抗hPIP受体微珠(终浓度10μg/mL)。

细胞板在23℃下孵育30分钟。

加入10μL 5×生物素化抗hPIP抗体(1nM)。

细胞板在23℃下孵育60分钟。

加入25μL 2×链霉亲和素供体微珠(终浓度40μg/mL)。

将细胞板在23℃下避光孵育30分钟。

使用Perkin Elmer EnVision Alpha阅读器(615nm)对细胞板进行读数。

使用GraphPad Prism 7分析数据。

每个样品运行三至四个平行。

表3中的数据(ng/mL，纳克/毫升)表示人I型前胶原C肽(FIPIP)水平。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

VC-NT＝无TGF-β1处理载体对照

载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图3所示。

结果表明，与对照组相比，西他生坦和波生坦均显著降低了TGF-β1诱导的男性正常人皮肤成纤维细胞中升高的胶原水平，其中西他生坦明显比波生坦更有效，能够将胶原水平恢复到未处理/未诱导的水平。

实施例4：西他生坦对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞的细胞活力、细胞毒性和细 胞凋亡的影响

在该试验中测定西他生坦对细胞活力、细胞毒性和细胞凋亡的影响，利用TGF-β1将男性正常人皮肤成纤维细胞诱导成促纤维化表型。在这项试验中，细胞在含载体对照、西他生坦和波生坦的培养基中生长48小时。如本文所示，使用了适当的试验试剂和测定技术。

将男性正常人皮肤成纤维细胞(LLCT FC0024 lot 03869_男性成纤维细胞，23岁)接种于96孔板，用含10％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)进行培养，培养至融合。

洗涤细胞除去FBS，并加入无血清培养基过夜培养(O/N)。

用50ng/mL TGF-β1刺激细胞，并处理48小时。

以下试剂用于不同试验：

对于细胞活力/细胞毒性试验：

通过将10μL每种底物(GF-AFC和bis-AAF-R110)与2mL的试验缓冲液(Promega，Cat#G6320)结合，制成细胞活力/细胞毒性试剂的反应混合物。然后将20μL这种细胞活力/细胞毒性试剂加至每个孔中并短暂混合。将细胞板在37℃下孵育30分钟，然后在荧光强度为400Ex/505Em(细胞活力)和485Ex/520Em(细胞毒性)下进行测定。

对于细胞凋亡试验：

对于细胞凋亡试验，在细胞活力/细胞毒性荧光读数后，随后加入100μL Caspase

3/7试剂(Promega，Cat#G6320)，并短暂混合。

将细胞板在室温下孵育30分钟，然后测定荧光值以检测细胞凋亡。

使用GraphPad Prism 7分析数据。

每个样品运行6至9个平行。

对于细胞活力：

表4A中的数据以相对荧光单位(RFU)表示细胞活力的测量值。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

表4A中载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图4所示。

结果表明，在浓度达到100μM下，未观察到西他生坦对TGF-β1诱导的男性正常人皮肤成纤维细胞具有明显毒性。

对于细胞毒性：

表4B中的数据以相对荧光单位(RFU)表示细胞毒性的测量值。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

表4B中载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图5所示。

结果表明，与载体对照相比，无论是波生坦还是西他生坦都没有明显的细胞毒性；然而，在TGF-β1诱导的男性正常人皮肤成纤维细胞中，波生坦的细胞毒性明显强于西他生坦。

对于细胞凋亡：

表4C中的数据以相对荧光单位(RFU)表示细胞凋亡的测量值。

VC＝载体对照，SIT＝西他生坦，BOS＝波生坦

表4C中载体对照、西他生坦和波生坦在100μM浓度下的数据柱状图以及统计学分析如图6所示。

结果表明，经西他生坦和波生坦处理后，TGF-β1诱导的男性正常人皮肤成纤维细胞的细胞凋亡均有所升高，但是西他生坦具有比波生坦明显更强的效果。

实施例5：局部给药组合物的制备

将西他生坦钠与乙醇混合，得到基于西他生坦活性成分重量的1％溶液。

该组合物可用于局部施用于人类患者或动物以治疗例如皮肤纤维化或结缔组织疾病等病症。

通过引用并入

所有专利文件的完整公开，包括证书更正、专利申请文件、科学文章、政府报告、网站和本文提及的其他参考文献，均以引用的方式将其完整地并入本文。如果术语有冲突，以本说明书为准。

等价物

本发明可以在不脱离其精神和本质特征的情况下以其他具体形式呈现。前述实施方案的所有方面应被理解为用于举例说明而不是限制本文所述的发明。在本发明的方法和系统的各种实施方案中，其中术语“包括”是针对所述方法的步骤或所述组合物的组分来使用的，还可以考虑所述方法和组合物基本上由所述步骤或所述组分组成，或者由所述步骤或所述组分组成。此外，应当理解的是，只要保持本发明的可操作性，步骤的顺序或用于执行某些操作的顺序是不重要的。此外，可以同时执行两个或多个步骤或操作。

在说明书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如有冲突，以本说明书为准。

此外，应当理解，在某些情况下，可以将组合物描述为在混合之前由所述组分组成，因为在混合之后，某些组分可以进一步反应或转化为额外的物质。

除非另有说明，否则本文所使用的所有百分比和比率均按重量计算。

Claims (36)

1.治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病的方法，包括将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少两倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少五倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少十倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少100倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少1000倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少5000倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素-A拮抗剂或抑制剂为西他生坦或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人类患者。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述皮肤纤维化或结缔组织疾病选自硬皮病、系统性硬化症、局部性硬皮病、弥漫性系统性硬化症、局限性系统性硬化症、雷诺氏现象、佩罗尼氏病、指硬皮病、皮肤溃疡、硬斑病、带状硬皮病、瘢痕性脱发、疤痕性脱发、扁平毛发苔癣、额部纤维性脱发、中央离心性瘢痕性脱发、秃发性毛囊炎、盘状红斑狼疮、解剖性蜂窝织炎、类风湿性关节炎、狼疮、苔癣硬化症、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、烧伤疤痕，及它们的组合。

11.根据权利要求8中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的盐选自碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述碱金属盐选自锂盐、钠盐和钾盐。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述碱金属盐为钠盐。

14.根据权利要求8中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的盐为西他生坦钠。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少一次。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少两次。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每周施用至少一次。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每周施用至少两次。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂每日施用至少一次直至皮肤纤维化或结缔组织疾病得以治疗。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂通过药学上可接受的组合物来施用。

21.治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病的方法，包括将包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂的药学上可接受的组合物局部或外部施用于有此需要的哺乳动物。

22.选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂在制造药物中的用途，所述药物用于将治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂局部或外部递送给有此需要的哺乳动物治疗皮肤纤维化或结缔组织疾病。

23.用于局部或外部递送的组合物，所述组合物包含治疗有效量的选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂和药学上可接受的载体。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述选择性内皮素A(ET-A)受体拮抗剂或抑制剂具有至少两倍于对内皮素B(ET-B)的选择性。

25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述选择性内皮素A拮抗剂或抑制为西他生坦或其药学上可接受的盐。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述药学上可接受的盐为西他生坦钠。

27.根据权利要求23所述的组合物，所述组合物施用于哺乳动物。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述哺乳动物为人类患者。

29.根据权利要求28所述的组合物，所述组合物呈单位剂量组合物形式。

30.根据权利要求29所述的组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述组合物包含约0.01至约1000mg西他生坦或其药学上可接受的盐。

31.根据权利要求29所述的组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述组合物包含约0.001重量％至约25重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

32.根据权利要求29所述的组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述组合物包含约0.01重量％至约10重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

33.根据权利要求29所述的组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述组合物包含约0.1重量％至约5重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

34.根据权利要求29所述的组合物，基于西他生坦活性成分的重量，所述组合物包含约0.2重量％至约3重量％西他生坦或其药学上可接受的盐。

35.根据权利要求29所述的组合物，所述组合物证实具有选自以下至少一项的药物动力学参数：C_max小于约13μg/ml，或C_max小于约7μg/ml，或AUC小于约40μg hr/ml。

36.制备根据权利要求23所述的组合物的方法。

Images