CN112063720B

CN112063720B - 骨肉瘤预后标志物及预后评估模型

Info

Publication number: CN112063720B
Application number: CN202011004518.4A
Authority: CN
Inventors: 杨孟恺; 华莹奇; 蔡郑东
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112063720A

Abstract

本发明涉及骨肉瘤预后标志物及预后评估模型。本发明整合了TARGET和GSE21257两个独立数据库骨肉瘤患者的总体生存期数据，筛选并证实糖酵解相关基因P4HA1、ABCB6和STC2为骨肉瘤预后标志物，并基于P4HA1、ABCB6和STC2构建了预后的风险评估模型，通过训练集和验证集验证了该模型具有较高的准确性，且进一步分析发现模型的风险评分还与转移以及肿瘤免疫微环境显著相关。本发明有助于更好地预测骨肉瘤患者的预后情况，可为指导该疾病临床治疗带来巨大帮助。

Description

骨肉瘤预后标志物及预后评估模型

技术领域

本发明涉及疾病的预后评估，具体地说，涉及骨肉瘤预后标志物及预后评估模型。

背景技术

骨肉瘤是一种常见于儿童和青少年的原发于骨组织的恶性肿瘤，具有易复发和易转移的特点，其中肺转移是骨肉瘤患者最主要的死因。目前骨肉瘤患者首选的治疗方案是新辅助化疗联合手术治疗，这一治疗方案使患者5年生存率有了很大提高，但一旦患者出现肺转移5年生存率仍低于20％。所以从分子水平探索骨肉瘤发生和转移的机制，为骨肉瘤的早期诊断和预后评估奠定基础，具有重要的科学和社会意义。寻找有效的骨肉瘤患者预后标志物，能够为骨肉瘤患者进一步诊治提供依据。

肿瘤细胞的代谢重编程能力为其快速增殖提供了足够的能量，而有氧糖酵解增加是具有较强迁移能力的肿瘤细胞很重要的代谢重编程特征之一。糖酵解不仅为癌细胞提供能量，而且为癌细胞的生物合成提供必要的前体。糖酵解的代谢产物，如葡萄糖-6-磷酸、磷酸二羟丙酮等分别参与磷酸戊糖途径和细胞内脂质合成，对癌细胞生长具有重要意义。不少研究发现有氧糖酵解增加同样与骨肉瘤患者发生转移密切相关。随着基因测序在骨肉瘤中的应用，不少生物标志物被用来构建预测骨肉瘤患者预后的风险评估模型，但是糖酵解相关基因能否预测骨肉瘤患者的预后还有待研究。

ABCB6：ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白是一大类跨膜蛋白超家族，具有特殊的氨基酸序列和ATP结合域，可通过ATP依赖途径促进多种生物化合物，如多肽、药物、类固醇、胆酸、磷脂和离子等的跨膜转运。人类基因组编码48种ABC转运蛋白，根据蛋白的功能和同源性不同而分为7个亚家族：ABCA到ABCG。ABCB6是ABCB亚家族的一员，长842个氨基酸，通过与自身形成同源二聚体发挥功能。ABCB6在细胞中分布广泛，可定位于线粒体、溶酶体和高尔基体等多种细胞器，并发挥不同的作用。研究表明，ABCB6基因突变可导致Lan血型阴性，还与眼部缺损、家族性假性高血钾症相关。

P4HA1：脯氨酰4-羟化酶亚基α1(prolyl 4-hydroxylase subunitα1，P4HA1)是脯氨酰4-羟化酶的限速亚基，为合成各种类型胶原所必需。有研究表明P4HA1可以调节成纤维细胞中胶原合成分泌，从而改变细胞外基质组成成分，起到影响肿瘤黏附、迁移等生物学行为的作用。但目前P4HA1在肿瘤中的研究仍较少。

STC2：斯钙素(stanniocalcin，STC)是一类具有多种生物学功能的糖蛋白激素。人类STC包含STC1和STC2两个成员，均和肿瘤有关。研究表明，STC2主要通过对肿瘤细胞的缺氧保护，促进肿瘤细胞新生血管的生成，促进肿瘤细胞的增殖，侵袭和转移，抑制免疫反应等方式促进肿瘤的生长，使之避免凋亡。STC2能否作为一种新的肿瘤标志物，尚需进一步研究。

以上ABCB6、P4HA1和STC2均属于糖酵解相关基因。

专利文献CN108410986A，公开日2018.08.17，公开了CDH6和骨肉瘤患者总体生存及预后密切相关，有可能成为骨肉瘤预后的生物标志物。专利文献CN109628593A，公开日2019.04.16，公开了CD24的表达与临床骨肉瘤患者预后相关，CD24表达高的病例将来会有更高的复发或转移的风险，可用于骨肉瘤评估预后。而目前未见糖酵解相关基因ABCB6、P4HA1和STC2用于骨肉瘤预后的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供新的骨肉瘤预后标志物及预后评估模型。

第一方面，本发明提供了糖酵解相关基因或蛋白ABCB6、P4HA1和STC2中的一种或几种作为标志物在制备骨肉瘤预后试剂或试剂盒中的应用。

作为本发明的一个优选例，所述预后选自下列中任一种或几种：

a)预测骨肉瘤患病个体的一定时间长度的生存率；

b)预测骨肉瘤患病个体的生存时间；

c)预测骨肉瘤患病个体出现转移的可能性；

d)预测骨肉瘤患病个体的肿瘤微环境。

更优选地，所述预测骨肉瘤患病个体的肿瘤微环境选自预测免疫评分和肿瘤免疫微环境中幼稚B细胞的数量。

作为本发明的另一优选例，将ABCB6、P4HA1和STC2联用用于骨肉瘤的预后。

更优选地，具体方法为：检测个体ABCB6、P4HA1和STC2基因在肿瘤组织表达量，然后代入风险评分公式：风险评分＝(0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量)+(0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量)+(0.435×STC2基因肿瘤组织表达量)，计算得到风险评分。

作为本发明的另一优选例，通过检测基因或蛋白的表达量用于预后。

更优选地，所述表达量其检测方法选自RT-PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片、高通量测序或免疫学检测。

第二方面，本发明提供了一种用于骨肉瘤预后评估的试剂盒，所述试剂盒含有检测ABCB6、P4HA1和STC2中至少一种基因的表达量的试剂。

作为本发明的一个优选例，所述试剂盒含有检测ABCB6、P4HA1和STC2的表达量的试剂。

更优选地，所述试剂盒含有操作说明书，所述操作说明书记载：检测肿瘤组织中特定基因的表达量，代入风险评分公式：风险评分＝(0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量)+(0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量)+(0.435×STC2基因肿瘤组织表达量)，计算得到风险评分。

本发明优点在于：

1、本发明整合了TARGET和GSE21257两个独立数据库的骨肉瘤患者的总体生存期数据，筛选和证实糖酵解相关基因P4HA1、ABCB6和STC2为骨肉瘤预后标志物，并构建了基于P4HA1、ABCB6和STC2的风险评估模型，通过训练集和验证集验证了该模型的准确性，且进一步分析发现模型的风险评分与转移以及肿瘤免疫微环境显著相关。本发明有助于更好地预测骨肉瘤患者的预后情况，有效评估不同患者的预后风险，提前发现患者转移倾向，提早干预，为指导该疾病的临床治疗带来巨大帮助，从而提高骨肉瘤患者的5年生存率。

2、本发明的风险评估模型预测准确度高，具有普适性，显著优于现有技术中其他骨肉瘤预后方法，也显著优于研究过程中构建的其他模型。

附图说明

图1：通过GSEA富集分析发现糖酵解基因集在转移组样本中富集。

图2：在测试集中构建糖酵解相关基因的预测模型。A：转移与非转移组差异基因热图；B：单因素COX分析森林图；C：多因素COX分析模型构建；D：风险评分的分布；E：不同风险评分患者的生存状态；F：预测模型中3种基因的表达谱。

图3：在测试集中验证预测模型与患者总生存率以及转移性状的关系。A：Kaplan-Meier生存曲线显示高低风险组之间的生存率差异；B、C：ROC曲线分别显示风险模型和模型中的单基因预测1年以及3年生存率的准确性；D：风险评分与患者转移性状之间的关系。

图4：在验证集中验证预测模型与患者总生存率以及转移性状之间的关系。A：Kaplan-Meier生存曲线显示高低风险组之间的生存率差异；B：ROC曲线显示预测模型预测预后的可靠性；C：风险评分与患者转移性状之间的关系；D：风险评分的分布；E：不同风险评分患者的生存状态；F：预测模型中3种基因的表达谱。

图5：风险预测模型与骨肉瘤肿瘤免疫微环境的关系。A、B：测试集和验证集中分别比较高低风险组之间免疫评分差异；C、D：测试集和验证集中分别比较高低免疫评分组之间病人生存率差异；E、F：测试集和验证集中分别比较风险评分与肿瘤免疫微环境中幼稚B细胞比例之间的关系；G、H：Kaplan-Meier生存曲线显示测试集和验证集中B细胞与患者总体生存率的差异。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、方法

1、数据采集

分别从TARGET数据库中下载骨肉瘤患者mRNA表达谱数据和临床信息，作为训练集，从GEO数据库GSE21257中下载骨肉瘤患者mRNA表达谱数据和临床信息，作为验证集。

2、预后标志物的筛选

在训练集中根据患者临床信息将患者分成转移和非转移两组，通过GSEA基因富集分析发现转移组患者糖酵解相关基因集富集明显(P<0.05)(图1)。于是我们选择该基因集中198个糖酵解相关基因进行后续研究，通过对比转移和非转移组基因表达，使用P<0.05为筛选差异表达基因的阈值，发现198个基因中有23个基因在转移和非转移组中差异表达，紧接着通过Kaplan-Meier生存分析进一步筛选发现以上23个基因中有10个基因表达与骨肉瘤患者的总体生存率有关。然后我们进行单因素COX回归分析发现6个基因与骨肉瘤预后有关(P<0.05)，最后通过多因素COX回归模型筛出与骨肉瘤患者预后相关的3个基因作为风险标志物(图2中A，B和C)。

3、模型建立

基于多因素COX回归模型产生的回归系数coef与风险标志物基因的线性相关性建立预后相关的三个糖酵解相关基因的预测模型。

4、风险评分公式

风险评分＝(0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量)+(0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量)+(0.435×STC2基因肿瘤组织表达量)，根据风险评分的中位数将样本分成两组，高于中位数为高风险组，低于中位数为低风险组。

5、在测试集中评估风险模型与总体生存率的关系以及验证模型的准确性

通过绘制Kaplan-Meier曲线比较高低风险组生存率差异，通过R包“survivalROC”绘制患者的ROC曲线，计算曲线下面积，验证模型的准确性。

6、在验证集中验证模型准确性

首先使用R包“sva”对测试集和验证集中的mRNA表达谱数据进行批次矫正，再根据测试集中的风险评分中位数，将验证集中的样本分成高风险组和低风险组，通过绘制Kaplan-Meier曲线比较高低风险组生存率差异，通过R包“survivalROC”绘制患者的ROC曲线，计算曲线下面积，进一步验证模型在验证集中的准确性。

7、风险评分与其他因素的关系分析

首先确定风险评分与预后显著相关，然后比较风险评分与转移以及肿瘤免疫微环境的关系。

二、结果

1、根据多因素Cox回归分析得出预测风险模型

从多因素Cox回归分析中得到3个基因构建的风险模型以及风险评分公式。计算如下：风险评分＝(0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量)+(0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量)+(0.435×STC2基因肿瘤组织表达量)。3个基因皆与存活率呈负相关，在风险增加中发挥作用见表1。

表1.模型中3个基因的系数

Gene	coef	HR	HR.95L	HR.95H	p-value
						ABCB6	0.946	2.575	1.345	4.931	0.004
P4HA1	0.413	1.512	1.074	2.123	0.018
						STC2	0.435	1.545	1.137	2.097	0.005

2、训练集风险评分

通过计算出的风险评分中位数(1.03)作为阈值，将训练集中骨肉瘤样本分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier曲线分析发现高风险组患者较低风险组存活率更低(P<0.001)(图3中A)。预测1年和3年生存率的ROC曲线下面积分别为0.884和0.790，进一步说明该模型具有很好的预测能力(图3中B和C)。同时我们还验证了训练集中的风险评分，生存信息和基因表达热图的分布(图2中D，E和F)，发现高风险组病人风险评分更高，存活数更低，3个风险标志物的表达含量更高。

3、在验证集中验证风险模型

为验证风险模型的普适性，使用训练集中风险评分的中位数作为验证集的阈值，将验证集分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier曲线分析发现高风险组患者较低风险组存活率更低(P＝0.018)，与在训练集中发现的一致(图4中A)。预测1年和3年生存率的ROC曲线下面积分别为0.740和0.759，说明该模型在验证集中也具有很好的预测能力(图4中B)。接下来同样验证了验证集中风险评分，生存信息和基因表达热图之间的关系(图4中D，E和F)，同样发现了高风险组病人风险评分更高，存活数更低，3个风险标志物的表达含量更高。

4、风险评分与转移的关系

我们发现无论在测试集(图3中D)还是验证集(图4中C)中，高风险组患者中转移率更高。证实这一风险模型能够很好的预测骨肉瘤患者出现转移的能力，为早期诊断骨肉瘤转移提供可能。

5、风险评分与肿瘤微环境的关系

在R软件中通过ESTIMATE算法计算每个样本的免疫评分，发现无论在测试集还是验证集中高风险组免疫评分更低(图5中A和B)。在R软件中通过CIBERSORT算法计算每个样本的肿瘤浸润免疫细胞的比例，相关性分析表明无论在测试集还是验证集中风险评分与幼稚B细胞的比例成正相关(图5中E和F)。

实施例2

本实施例提供一种用于骨肉瘤预后的试剂盒，所述试剂盒含有检测ABCB6、P4HA1和STC2基因表达量的试剂。所述试剂盒包含操作说明书，记载如下：按照常规，用高通量测序方法检测ABCB6、P4HA1和STC2基因的肿瘤组织表达量，再代入风险评分公式：风险评分＝(0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量)+(0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量)+(0.435×STC2基因肿瘤组织表达量)，计算得到风险评分，风险评分越高，表明：生存期越短，在一定时间长度内的生存率越低，发生转移的风险越高，肿瘤微环境的免疫评分越低，肿瘤免疫微环境中幼稚B细胞的数量越多。

实施例3

本实施例提供一种用于骨肉瘤预后的试剂盒，所述试剂盒含有检测ABCB6、P4HA1和STC2中至少一种基因表达量的试剂，具体为检测基因表达量的基因芯片。所测基因的表达量越高，则表明：生存期越短，在一定时间长度内的生存率越低，发生转移的风险越高，肿瘤微环境的免疫评分越低，肿瘤免疫微环境中幼稚B细胞的数量越多。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.检测ABCB6、P4HA1和STC2基因表达量的试剂在制备骨肉瘤预后试剂或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预后选自下列中任一种或几种：

a）预测骨肉瘤患病个体的一定时间长度的生存率；

b）预测骨肉瘤患病个体的生存时间；

c）预测骨肉瘤患病个体出现转移的可能性；

d）预测骨肉瘤患病个体的肿瘤微环境；

所述预测骨肉瘤患病个体的肿瘤微环境选自预测免疫评分和肿瘤免疫微环境中幼稚B细胞的数量。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒含有操作说明书，所述操作说明书记载：检测肿瘤组织中特定基因的表达量，代入风险评分公式：风险评分=（0.946×ABCB6基因肿瘤组织表达量）+（0.413×P4HA1基因肿瘤组织表达量）+（0.435×STC2基因肿瘤组织表达量），计算得到风险评分。