CN112063553A

CN112063553A - 一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用

Info

Publication number: CN112063553A
Application number: CN202010918844.XA
Authority: CN
Inventors: 张佳; 谭竹毅
Original assignee: Qingdao Probex Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Probex Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明适用于微生物育种技术领域，提供了一株粪肠球菌，所述粪肠球菌为粪肠球菌PLBS009(Enterococcus faecalis PLBS009)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16949；本发明还提供了一株粪肠球菌在犊牛饲料中的应用。借此，本发明的粪肠球菌PLBS009能够提高犊牛的生产性能，同时能够提高犊牛机体的免疫力，缓解由断奶应激引起的抗病力减弱问题，使犊牛机体的抗病能力增强。

Description

一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用

技术领域

本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用。

背景技术

奶牛集约化养殖要求施行早期断奶。犊牛早期断奶不仅可以降低生产成本，还可以使犊牛更早地适应固态饲料，加快瘤胃的发育，为提高后续生产性能打下良好基础。但犊牛对断奶产生的应激反应极为明显，在断奶过程中犊牛会受到断奶日龄、心理环境和营养应激的影响，产生明显的应激反应，可导致厌食、生长发育延滞、免疫机能降低等现象。这严重影响了犊牛的健康且对其生产性能亦有不良影响，并且，断奶后的犊牛消化器官发育尚不完全，对外界抵抗力低，易受到外界各种细菌、病毒和其他有害微生物的侵袭，引起疾病、引发腹泻、甚至死亡。犊牛饲粮中添加抗生素能在一定程度上缓解断奶应激，但出现抗生素残留、细菌耐药性增加、长期使用导致畜禽免疫力降低以及引起畜禽二次感染等问题。

益生菌是近年出现的新型饲料添加剂，能抑制病原菌的黏附和生长繁殖，保持动物胃肠道的微生态平衡，其代谢产生的益生物质可作为宿主的营养来源或帮助动物消化吸收。

类肠球菌作为益生菌的一种，自1984年就被美国食品和药品管理局明确标定为可直接应用于动物的益生菌之一，是存在于人和动物肠道内的一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，粪肠球菌能够将饲料中的纤维变软，提高饲料的转化率；粪肠球菌能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用；研究表明，粪肠球菌能够产生伏尔加霉素，可以有效抑制李斯特菌和金黄色葡萄球菌和腐败微生物生长繁殖。

但是，粪肠球菌在断奶犊牛饲粮中的应用研究鲜有报道，其添加量及效果也不尽相同，且其能否替代抗生素应用于断奶犊牛饲粮的研究也未见报道。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用，粪肠球菌PLBS009具有良好的耐药性，能够提高犊牛对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高犊牛的生产性能，同时能够提高犊牛机体的免疫力，缓解由断奶应激引起的抗病力减弱问题，使犊牛机体的抗病能力增强，有助于增加犊牛养殖的经济效益。

为了实现上述目的，本发明提供一株粪肠球菌，所述粪肠球菌为粪肠球菌PLBS009(EnterococcusfaecalisPLBS009)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.16949。

根据本发明的粪肠球菌，所述粪肠球菌取自牛粪。

根据本发明的粪肠球菌，所述粪肠球菌在犊牛的基础日粮中的添加量为200～2000mg/kg。

根据本发明的粪肠球菌，所述粪肠球菌在犊牛的基础日粮中的添加量为820～1360mg/kg。

根据本发明的粪肠球菌，本发明还提供一种筛选粪肠球菌的方法，包括以下步骤：

步骤一

采集生长肥育牛的粪便，将所述粪便进行梯度稀释，得到不同浓度梯度的稀释液；

步骤二

分别取所述稀释液，接种于哥伦比亚绵羊血琼脂平板中，培养并观察菌落的形态；

步骤三

挑取单个所述菌落，对具有粪肠球菌菌落特征的单菌落，进行纯培养；

对纯培养菌落进行革兰染色，镜检。

根据本发明的筛选粪肠球菌的方法，所述步骤一中，所述粪便的稀释梯度为10，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷。

根据本发明的筛选粪肠球菌的方法，所述步骤二中，所述菌落的培养条件为37℃培养20～30h。

根据本发明的粪肠球菌，所述粪肠球菌在犊牛饲料中的应用。

本发明的目的在于提供一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用，本发明提供的粪肠球菌PLBS009，没有致病性，具有良好的耐药性，在犊牛日粮中添加适宜水平的粪肠球菌PLBS009，能够提高犊牛对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高犊牛的生产性能，同时能够提高犊牛机体的免疫力，缓解由断奶应激引起的抗病力减弱问题，使犊牛机体的抗病能力增强，有助于增加犊牛养殖的经济效益。

附图说明

图1是本发明粪肠球菌PLBS009的菌落形态图；

图2是本发明粪肠球菌PLBS009的生长曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一株粪肠球菌，拉丁文学名：Enterococcusfaecalis；该粪肠球菌为粪肠球菌PLBS009(EnterococcusfaecalisPLBS009)，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.16949。

本发明的粪肠球菌取自牛粪，本发明提供了粪肠球菌PLBS009的筛选方法，包括以下步骤：

步骤一

从青岛市某牛场采集生长肥育牛粪便，将粪便进行梯度(10，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷)稀释，得到不同浓度梯度的稀释液。

步骤二

分别取上述稀释液，接种于哥伦比亚绵羊血琼脂平板中，37℃培养20～30h，观察菌落形态。

步骤三

挑取单个菌落，对具有粪肠球菌菌落特征的单菌落，进行纯培养，对纯培养菌落进行革兰染色，镜检。

利用光学显微镜和体视镜进行观察，观察菌落形态为：菌落呈灰白色、不透明、表面光滑，直径0.5～1mm。采用普通肉汤进行液体培养，培养液均匀、混浊，底部有菌体沉淀，表明细胞为厌氧或兼性厌氧型。在光学显微镜下观察，菌体为革兰阳性球菌，呈单个、成对或短链状排列。(参见图1)

通过上述方法筛选出菌株后，对菌株进行鉴定，本发明提供了粪肠球菌菌株的鉴定方法：

一生化试验鉴定

按照常规细菌接种法进行生化试验，将分离菌株接种于6.5％NaCl、马尿酸钠、七叶苷、甘露醇、山梨醇、乳糖、菊糖、棉籽糖、海藻糖、水杨苷生化反应管中，37℃厌氧培养24h，观察结果。

分离菌株可在6.5％NaCl中生长，并在40％胆汁存在下水解七叶苷，水解马尿酸钠、甘露糖、山梨醇、精氨酸、乳糖及水杨苷，不分解菊糖、山梨糖、棉籽糖及阿拉伯糖。其生化特征与肠球菌属的特征一致。

二基因序列鉴定

对菌株进行分子生物学鉴定，提取菌株的基因组DNA，设计细菌16SrRNA基因片段PCR扩增通用引物,序列为上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR扩增，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

为了验证本发明的粪肠球菌PLBS009的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、致病性和药敏性试验。

菌株的生长曲线

将菌株接种到灭菌的的MRS琼脂培养基中，35～39℃恒温摇床培养，观察48h菌株的生产情况，前期间隔2h取样，后期间隔4、6h和12h取样，用可见分光光度计在560nm波长处测其吸光度，重复5次，绘制出菌株生长曲线的变化趋势(参见图2)。

由生长曲线可知，菌株在培养0～12h之间生长缓慢，12～40h之间菌量以指数级增加，40～44h菌量下降，44h之后菌量达到稳定状态。

致病性试验

将小白鼠分为试验组和对照组，挑取分离纯化后的单个菌落，接种于THB培养液中，37℃摇床过夜培养，用0.15mol/LPBS稀释至1×10⁸cfu/mL，腹腔注射试验组小白鼠，对照组小白鼠腹腔注射0.15mol/mLPBS，剂量均为0.2mL/只。每2h观察记录一次小白鼠发病情况。死亡小白鼠立即解剖，观察组织/器官病变情况，无菌采集肺脏、肾脏等病料用于病原的分离鉴定。

试验结果表明，试验组小白鼠和对照组小白鼠1周内均未见任何症状，剖检后也未见任何病理变化，未从各脏器培养出该菌。说明粪肠球菌PLBS009菌株没有致病性。

药敏试验

选取苯唑西林、四环素、青霉素G、万古霉素、红霉素、氯霉素、左氟沙星等临床常用的16种抗阳性球菌药物的药敏纸片，贴附于已均匀涂抹菌液的平板培养基中，35℃培养16～18h，测量抑菌圈直径，判断药物敏感情况。药敏试验结果见表一。

试验结果表明，粪肠球菌PLBS009菌株对β-内酰胺类抗生素苯唑西林，大环内酯类抗生素红霉素、克拉霉素，多肽类抗生素多黏菌素B，林克酰胺类抗生素克林霉素，磺胺类抗生素复方新诺明，喹诺酮类抗生素诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星，四环素类抗生素四环素，氨基糖苷类抗生素大观霉素等具有耐药性；粪肠球菌PLBS009菌株对β-内酰胺类抗生素青霉素G，合成类抗生素呋喃妥因敏感；粪肠球菌PLBS009菌株对多肽类抗生素万古霉素，四环素类抗生素米诺环素具有中等耐药性。

表一药敏试验结果

“－”表示无抑菌圈，“S”表示敏感，“I”表示中等敏感，“R”表示耐药。

为了验证本发明的粪肠球菌PLBS009在犊牛饲料中的应用价值，本发明还提供一株粪肠球菌在犊牛饲料中的应用方法。

一、试验动物及饲养管理

试验采用完全随机分组设计，选用体重相近、健康状况良好的50日龄荷斯坦公犊牛，随机分为4组(对照组和三个试验组)。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮基础上添加粪肠球菌PLBS009，粪肠球菌PLBS009的活菌数为2×10⁸CFU/kg。犊牛自由采食和饮水，试验期共20d，断奶前10d和断奶后10d。

基础饲粮参照NRC(2012)营养需要，按照荷斯坦公犊牛养殖场的配方配制。

二、饲料配方

在犊牛的基础日粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，添加量为200～2000mg/kg。

三、测定指标

分别在试验期第10天(断奶当天)和第20天(断奶后10d)，晨饲前以真空采血管颈静脉采血20～25mL。将采集的血样离心，分离血清，测定血清免疫指标。

于试验期每天记录犊牛的饲料投料量和剩料量，计算日采食量；分别于试验期第1天、第10天和第20天晨饲前用地秤测定所有犊牛的体重，计算犊牛平均日增重。

于试验期每天观察犊牛袁记录其是否腹泻。

为了进一步验证本发明的粪肠球菌PLBS009在犊牛饲料中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养犊牛，设置如下若干实施例，并对各实施例中犊牛的相关指标进行测定。各实施例中犊牛的饲养管理方法相同，仅改变实施例中粪肠球菌PLBS009的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。

各实施例中犊牛的相关指标结果见表二、表三；各实施例中粪肠球菌PLBS009的添加量见表四。

对比例

在犊牛的基础饲粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，添加量为0。

养殖完成后，测得犊牛的平均日增重为0.86kg、平均日采食量为2.04kg、料重比为2.37，腹泻率为10.87％；测得犊牛的血清中免疫球蛋白A含量为0.75g/L、免疫球蛋白M含量为2.55g/L、免疫球蛋白G含量为9.83g/L。

实施例1

在犊牛的基础饲粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，添加量为820mg/kg。

养殖完成后，测得犊牛的平均日增重为1.29kg、平均日采食量为2.42kg、料重比为2.01，腹泻率为％；测得犊牛的血清中免疫球蛋白A含量为0.91g/L、免疫球蛋白M含量为2.89g/L、免疫球蛋白G含量为12.83g/L。

实施例2

在犊牛的基础饲粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，添加量为1000mg/kg。

养殖完成后，测得犊牛的平均日增重为1.16kg、平均日采食量为2.45kg、料重比为2.07，腹泻率为％；测得犊牛的血清中免疫球蛋白A含量为0.94g/L、免疫球蛋白M含量为2.91g/L、免疫球蛋白G含量为12.59g/L。

实施例3

在犊牛的基础饲粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，添加量为1360mg/kg。

养殖完成后，测得犊牛的平均日增重为1.16kg、平均日采食量为2.48kg、料重比为2.02，腹泻率为％；测得犊牛的血清中免疫球蛋白A含量为0.95g/L、免疫球蛋白M含量为2.90g/L、免疫球蛋白G含量为12.64g/L。

由于各实施例的实施过程均相同，因此，其他实施例的具体过程不再列出，仅列出上述三个效果较好的实施例。

表二犊牛的生长性能

表三犊牛的血清免疫指标g/L

表四各实施例中粪肠球菌PLBS009的添加量mg/kg

由上述实施例可以看出，在犊牛的基础日粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，能够提高犊牛的平均日增重和平均日采食量，降低犊牛的料重比和腹泻率，说明粪肠球菌PLBS009促进了犊牛断奶期的生长发育，缓解了犊牛断奶导致的营养应激；同时能够有效降解饲粮中的抗营养因子，消除其抗营养作用，促进机体对养分的消化分解，从而提高饲料利用率。粪肠球菌PLBS009用作饲料添加剂加入到畜禽饲粮中，可以调节肠道菌群、增强胃肠道的消化吸收功能，进而提升动物的生长性能和饲料转化率。

在犊牛的基础日粮中添加本发明的粪肠球菌PLBS009，能够提高犊牛血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G的含量，说明粪肠球菌PLBS009能够提高犊牛机体中免疫球蛋白的分泌，由于免疫球蛋白的抗菌、抗病毒等功能，使犊牛机体的抗病能力增强，从而缓解由断奶应激引起的抗病力减弱问题。粪肠球菌PLBS009用作饲料添加剂加入到畜禽饲粮中，能够作为非特异免疫因子，激活机体免疫系统，调节机体免疫功能，进而维持动物健康。

另外，通过上述实施例可以看出，在犊牛的基础饲粮中添加本的粪肠球菌PLBS009的添加量为820～1360mg/kg时，犊牛的生产性能最好，机体的免疫球蛋白含量最高，因此，在犊牛的基础饲粮中，粪肠球菌PLBS009的最适添加量为820～1360mg/kg。

综上所述，本发明提供的粪肠球菌PLBS009，没有致病性，具有良好的耐药性，在犊牛日粮中添加适宜水平的粪肠球菌PLBS009，能够提高犊牛对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高犊牛的生产性能，同时能够提高犊牛机体的免疫力，缓解由断奶应激引起的抗病力减弱问题，使犊牛机体的抗病能力增强，有助于增加犊牛养殖的经济效益。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110>青岛普罗百世生物科技有限公司

<120>一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用

<130>WF

<160>2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

agagtttgat cctggctcag 20

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<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

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序列表

<110> 青岛普罗百世生物科技有限公司

<120> 一种粪肠球菌及其在犊牛饲料中的应用

<130> WF

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

acggttacct tgttacgact t 21

Claims

1.一株粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌为粪肠球菌PLBS009(Enterococcusfaecalis PLBS009)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16949。

2.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌取自牛粪。

3.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌在犊牛的基础日粮中的添加量为200～2000mg/kg。

4.根据权利要求3所述的粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌在犊牛的基础日粮中的添加量为820～1360mg/kg。

5.一种筛选权利要求1所述的粪肠球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一

步骤二

步骤三

对纯培养菌落进行革兰染色，镜检。

6.根据权利要求5所述的筛选所述粪肠球菌的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述粪便的稀释梯度为10，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷。

7.根据权利要求5所述的筛选所述粪肠球菌的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述菌落的培养条件为37℃培养20～30h。

8.一种根据权利要求1所述的粪肠球菌在犊牛饲料中的应用。