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CN112062832B - Galectin-3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒 - Google Patents

Galectin-3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒 Download PDF

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CN112062832B CN202011017231.5A CN202011017231A CN112062832B CN 112062832 B CN112062832 B CN 112062832B CN 202011017231 A CN202011017231 A CN 202011017231A CN 112062832 B CN112062832 B CN 112062832B
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Abstract

本发明涉及Galectin‑3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒。本发明是以NTKLDNNWGREERQS或NTKLDNNWGREERQSVFPF为抗原表位肽，人工合成抗原表位肽并与载体蛋白偶联；并以此作为免疫原免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合技术、间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，最终获得能稳定分泌鼠抗人Galectin‑3单克隆抗体的杂交瘤细胞株C6C10，保藏编号为CCTCC NO:C2020135；通过动物体内诱生制备单抗，并采用免疫组化鉴定抗体特异性。本发明提供的鼠抗人Galectin‑3单克隆抗体具有更好的特异性和灵敏度，可以用于制备Galectin‑3体外免疫检测试剂或试剂盒，从而解决现有Galectin‑3抗体存在的选择性不强、价格昂贵等缺陷。

Description

Galectin-3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒
技术领域
本发明涉及Galectin-3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒，属于免疫学技术领域。
背景技术
人类半乳糖凝集素3(Galectin-3)基因位于染色体14q21～22，由6个外显子和5个内含子组成，Galectin-3主要定位在细胞质，也表达于细胞核、细胞表面和细胞外，通过与其相应配体相互作用发挥多种效应。Galectin-3可与糖基化的细胞外基质蛋白和膜蛋白以凝集素-糖化合物相互作用的方式结合。
Galectin-3是β-半乳糖苷动物凝集素家族成员之一，也是存在于多种生物体内的内源性凝集素，主要表达于上皮细胞、免疫细胞和巨噬细胞中，不仅参与细胞的增殖、黏附、分化、迁移、凋亡和炎症反应等过程，而且在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要的作用。
Galectin-3作为一种强大的促炎症因子，可以促使单核细胞向巨噬细胞的分化及其在血管内膜损害部位的聚集，激发炎症因子如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1等的释放。癌症检测过程中，其在卵巢癌、食管癌和肝癌中具有高表达水平，并加速刺激肿瘤细胞的增殖和侵袭。
目前，Galectin-3常用的体外免疫检测方法为免疫组织化学(IHC)法，在IHC法检测离体组织细胞中Galectin-3表达情况过程中起到关键作用的是特异性结合人Galectin-3的单克隆抗体，其特异性和亲和力决定了检测方法的灵敏度和特异性。而现有Galectin-3体外免疫检测抗体种类较少、灵敏度有待提高且价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种Galectin-3抗原表位肽，由该抗原表位肽与载体蛋白偶联制备的抗原，可以用来免疫动物获得针对该抗原表位肽的单克隆抗体或多克隆抗体。
其次，本发明提供了由上述抗原为免疫原制备获得的Galectin-3单克隆抗体或多克隆抗体。
同时，本发明提供了能够稳定分泌鼠抗人Galectin-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及利用该杂交瘤细胞株制备Galectin-3单克隆抗体的方法。
再次，本发明提供了上述Galectin-3抗体在制备Galectin-3体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
最后，本发明提供了一种Galectin-3免疫组化检测试剂及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面采用一种Galectin-3抗原表位肽，根据Uniprot公布的P17931蛋白序列，选择以氨基酸序列第174-188位，即SEQ ID NO：1为抗原表位肽，或在其C端增加四个氨基酸，依次为：VFPF，即SEQ ID NO：2为抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列如：1)NTKLDNNWGREERQS(SEQ ID NO：1)或2)NTKLDNNWGREERQSVFPF(SEQ ID NO：2)所示。
本发明第二方面提供一种Galectin-3抗原，是将上述Galectin-3抗原表位肽与载体蛋白偶联而成。
所述抗原可通过构建含有所述抗原表位肽以及载体蛋白所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到；也可以直接通过公司合成得到上述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的Galectin-3抗原表位肽，再将其与载体蛋白偶联制备。
优选的，所述载体蛋白为OVA(卵清蛋白)，BSA(牛血清白蛋白)、KLH(蓝钥蛋白)中的任一种。
优选的，所述的抗原表位肽和载体蛋白通过SMCC法进行偶联。
上述Galectin-3抗原可以作为免疫原制备抗人Galectin-3抗体。
本发明第三方面提供了一种抗人Galectin-3抗体，是由上述Galectin-3抗原为免疫原制备获得的单克隆抗体或多克隆抗体。制备方法可采用本领域的常规技术。
本发明第四方面提供了一种鼠抗人Galectin-3单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为：杂交瘤细胞系Galectin-3(Clone：C6C10)，保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2020135，保藏日期：2020年7月29日。采用上述Galectin-3抗原免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆细胞，间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能稳定分泌抗Galectin-3特异性抗体的杂交瘤细胞株。
本发明第五方面提供了一种鼠抗人Galectin-3单克隆抗体的制备方法，将上述抗人Galectin-3单克隆抗体杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经Protein A柱纯化获得Galectin-3单克隆抗体。
上述鼠抗人Galectin-3单克隆抗体可以用于制备Galectin-3体外免疫检测试剂或试剂盒。
本发明第六方面提供了一种Galectin-3免疫组化检测试剂及试剂盒，所述试剂包括鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或多克隆抗体，优选的，还包括BSA蛋白、PBS缓冲液、Proclin-300防腐剂组分。所述试剂盒包括过氧化氢封闭剂、一抗、过氧化物酶标记的羊抗鼠与羊抗兔二抗、DAB底物、DAB缓冲液、苏木素染色液，其中，一抗包括鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或多克隆抗体。上述试剂及试剂盒可用于体外免疫检测组织细胞中Galectin-3的表达情况。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的Galectin-3抗原表位肽，是以Galectin-3体外免疫检测抗体为研发为目标，在IHC层面通过实验验证其能够用于制备Galectin-3抗原，具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生具有高度特异性和灵敏性的Galectin-3抗体。
2.本发明提供了能稳定分泌鼠抗人Galectin-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株：杂交瘤细胞系Galectin-3(Clone：C6C10)，其保藏编号：CCTCC NO:C2020135，保藏日期：2020年7月29日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，是以NTKLDNNWGREERQS、NTKLDNNWGREERQSVFPF偶联KLH蛋白作为抗原通过免疫学方法制备而成；该杂交瘤细胞株能够分泌特异性强、灵敏度高的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体，且表达量高，表达稳定性好。
3.本发明提供的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体，能够用于体外免疫检测离体组织细胞的Galectin-3表达情况，且具有特异性强、灵敏度高、准确性好的特点，相比于价格昂贵的进口抗体，特异性较进口抗体更强，且价格便宜，能够减轻病患负担，降低诊断费用。
附图说明
图1是Galectin-3抗原免疫后小鼠血清的IHC验证结果图；
图2是对照抗体EP412的IHC结果图；
图3是Galectin-3细胞株分泌的C6C10单克隆抗体与对照抗体EP412芯片结果比较图；
图4是鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗免疫组化检测甲状腺滤泡性腺癌组织中Galectin-3表达情况图；
图5是以对照抗体EP412作为一抗免疫组化检测甲状腺滤泡性腺癌组织中Galectin-3表达情况图；
图6是鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗免疫组化检测结肠癌组织中Galectin-3表达情况图；
图7是以对照抗体EP412作为一抗免疫组化检测结肠癌组织中Galectin-3表达情况图；
图8是以鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗免疫组化检测肺癌组织中Galectin-3表达情况结果图；
图9是以对照抗体EP412作为一抗免疫组化检测肺癌组织中Galectin-3表达情况结果图；
图10是以鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗免疫组化检测甲状腺组织中Galectin-3表达情况结果图；
图11是以对照抗体EP412作为一抗免疫组化检测甲状腺组织中Galectin-3表达情况结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
本实施例中的Galectin-3抗原表位肽，氨基酸序列为NTKLDNNWGREERQS(SEQ IDNO：1)，该序列是根据Uniprot公布的P17931蛋白序列，选择以氨基酸序列第174-188位作为抗原表位的核心多肽序列。
实施例2
本实施例中的Galectin-3抗原表位肽，氨基酸序列为NTKLDNNWGREERQSVFPF(SEQID NO：2)，该序列是根据Uniprot公布的P17931蛋白序列，选择以氨基酸序列第174-192位作为抗原表位的核心多肽序列。
实施例3
本实施例中的Galectin-3抗原，是将实施例1中的Galectin-3抗原表位肽人工合成后与载体蛋白KLH偶联制备。
1.抗原表位肽的人工合成：由南京金斯瑞生物公司通过氨基酸直接合成法合成。
2.抗原表位肽与载体蛋白的偶联：通过SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)进行KLH-多肽两步合成法。主要反应过程：1)有氨基的KLH与几倍的偶联试剂反应，结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的SMCC。2)再与含有巯基的多肽蛋白反应。KLH蛋白来自南京金斯瑞公司；SMCC、DMF购于Sigma公司。
步骤如下：
1)将20mg SMCC溶于2ml DMF。
2)将0.8ml KLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。
3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。
4)用1L的1×PBS(PH 7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。
5)将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。
6)加入KLH蛋白的量为120mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml。
7)将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。
8)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。
9)将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。
10)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。
实施例4
本实施例中的Galectin-3抗原，是将实施例2中的Galectin-3抗原表位肽人工合成后与载体蛋白KLH偶联制备，具体步骤同实施例3所述。
实施例5
本实施例中的Galectin-3多克隆抗体，由包括如下步骤的方法制得：
按照实施例3或实施例4制备Galectin-3抗原，将制得的抗原通过PBS稀释为2mg/mL浓度，按照100μg剂量(即50μL)与50μL水溶性佐剂快速混匀，再注入小鼠腿部肌肉。分别在第0天、21天免疫两针，第35天采集小鼠尾血，通过常温条件下8000rpm，1min进行离心，吸取上清至于-20℃条件下进行保存，即为多克隆抗体。
实施例6
本实施例中的Galectin-3多克隆抗体，由包括如下步骤的方法制得：
将实施例3及实施例4制得的抗原通过PBS稀释为2mg/mL浓度，按照50μg+50μg蛋白剂量(即25μL+25μL)与50μL水溶性佐剂快速混匀，再注入小鼠腿部肌肉。分别在第0天、21天免疫两针，第35天采集小鼠尾血，通过常温条件下8000rpm，1min进行离心，吸取上清至于-20℃条件下进行保存，即为多克隆抗体。
实施例7
本实施例中的杂交瘤细胞株Galcetin-3(Clone：C6C10)，由包括如下步骤的方法制得：
1.动物免疫：将实施例3及实施例4制得的抗原通过PBS稀释为2mg/mL浓度，按照实施例3与实施例4制得的抗原各50μg，即50μg+50μg蛋白剂量(即25μL+25μL)与50μL水溶性佐剂快速混匀，作为免疫原。采用肌肉注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为40μg/只，间隔三周后进行第二次免疫，免疫剂量同第一次。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价。
2.效价测定：
检测方法：
1、通过PB缓冲液包被抗原至ELISA检测板中，抗原量为200ng/孔。2～8℃条件过夜；
2、弃掉包被液，每孔加入150μL封闭液，至于37℃条件下封闭2h；
3、弃掉封闭液，加入梯度稀释好的尾血100μL，尾血稀释比例分别为：1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000，每个稀释比例下分别重复3孔；
将加过稀释尾血的96孔板置于37℃条件下孵育1h；
4、洗板5次，加入1∶5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗，每孔100μL，置于37℃条件下孵育1h；
5、洗版5次，加入显色液A、B各50μL。置于37℃条件下孵育10min；
6、加入终止液50μL，至于酶标板下读数。
检测结果为：
小鼠1 小鼠1 小鼠1 小鼠2 小鼠2 小鼠2 小鼠3 小鼠3 小鼠3
1/2000 2.145 2.233 2.219 2.112 2.106 2.133 2.234 2.251 2.246
1/4000 1.83 1.863 1.852 1.644 1.606 1.639 1.904 1.885 1.894
1/8000 1.223 1.246 1.206 1.121 1.195 1.173 1.333 1.362 1.394
1/16000 0.783 0.754 0.773 0.431 0.459 0.472 0.803 0.833 0.812
1/32000 0.311 0.344 0.375 0.114 0.121 0.109 0.541 0.533 0.523
1/64000 0.104 0.098 0.085 0.032 0.033 0.031 0.334 0.352 0.341
1/128000 0.028 0.026 0.026 0.026 0.027 0.026 0.121 0.126 0.119
阴性对照 0.026 0.028 0.027 0.027 0.027 0.027 0.026 0.027 0.026
由上表可知，小鼠3的效价水平达到了106，整体效价水平最高，进行冲击免疫与细胞融合操作。
2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5混合，滴加37℃的50％PEG(PH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，定容到50mL，滴加到96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用Galectin-3多肽进行间接ELISA检测，步骤如下：
1)以Galectin-3多肽抗原(偶联KLH)为包被用抗原，TBS缓冲液为包被液，按照100ng/孔浓度至于2～8℃条件下进行过夜孵育，每孔上清体积为100μL；
2)第二日弃去上清，每孔加入150μL封闭液，至于37℃培养箱中孵育2h；
3)弃去上清，每孔加入100μL细胞融合上清，至于37℃条件下孵育30min，随后利用洗板机进行洗板，每次5遍；
4)加入按照1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，每孔100μL，至于37℃条件下孵育30min，随后利用洗板机进行洗板，每次5遍；
5)依次加入显色液A、显色液B各50μL，至于37℃条件下孵育3～5min。显色后加入50μL终止液进行终止；
6)酶标仪读数。
对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆确定细胞株。
通过3次亚克隆筛选，最终挑选出分泌抗体稳定、且细胞株状态较好的细胞株C6C10，并将获得的Galectin-3细胞株进行保藏，杂交瘤细胞株为：杂交瘤细胞系Galectin-3(Clone：C6C10)，保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2020135，保藏日期：2020年7月29日。
实施例8
本实施例中的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体，采用小鼠腹腔诱生法制备，包括如下步骤：
8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的Galectin-3(Clone：C6C10)单克隆细胞悬液，细胞用量为5×106个/只。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，Protein A柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。经紫外分光光度计法测定，制备得到的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体的浓度为3.4mg/mL。
ProteinA层析柱纯化条件：
1、首先用PBS平衡柱子；
2、利用PBS稀释腹水，稀释体积按照9∶1进行，稀释后上样流经层析柱；
3、上样结束后待PBS平衡柱子；
4、利用pH3.0的柠檬酸洗脱液进行洗涤层析柱，将峰值处抗体收集在已含有pH8.0的Tris缓冲液中，中和酸条件下对抗体的破坏；
5、再用脱盐柱进行抗体缓冲体系置换，得到抗体经离心浓缩后收集。
实施例9
本实施例为用于体外检测人Galectin-3的免疫组化试剂，所述试剂包括鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或多克隆抗体，还包括BSA蛋白、PBS缓冲液、Proclin-300防腐剂组分，该试剂能够用于检测离体组织细胞中Galectin-3的表达情况。
实施例10
本实施例为用于检测人Galectin-3的免疫组化试剂盒，包括过氧化氢封闭剂、一抗、过氧化物酶标记的羊抗鼠与羊抗兔二抗、DAB底物、DAB缓冲液、苏木素染色液，其中，一抗包括鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或多克隆抗体。
试验例1
本试验例中在IHC层面对抗原表位肽的抗原特异性进行了验证，步骤如下：
1、将石蜡组织进行切片，切片厚度为3μm，置于65℃条件下进行烤片2h。
2、按照二甲苯15min、二甲苯15min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、95％乙醇5min、80％乙醇5min、70％乙醇5min、50％乙醇5min进行梯度脱蜡。
3、将脱蜡后的切片置于纯水中浸泡5min。
4、将切片置于pH9.0的ETDA修复液中，高压条件下修复3min。
5、自然冷却后，置于PBST洗液中浸泡5min。
6、加入过氧化氢封闭剂，室温条件下封闭5min。
7、分别加入一抗，以对照抗体EP412为阳性对照，37℃条件下1h。所述一抗为实施例6制备获得的Galectin-3多克隆抗体(是以SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2所示的抗原表位肽分别与载体蛋白KLH偶联所得的融合蛋白为免疫原，按照50μg+50μg蛋白总量免疫小鼠获得的)。
8、PBST洗液洗涤2次，每次浸泡5min。
9、加入二抗，37℃条件下30min。
10、PBST洗液洗涤2次，每次浸泡5min。
11、加入DAB显色液，室温孵育10min。
12、纯水洗涤2次，每次浸泡5min。
13、加入苏木素复染5min。纯水冲洗干净。
14、按照50％乙醇2min、70％乙醇2min、80％乙醇2min、95％乙醇2min、无水乙醇I、II各2min、二甲苯I、II各2min过片后加中性树胶封片。
15、阅片拍照。
以SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2所示的抗原表位肽分别与载体蛋白KLH偶联所得的融合蛋白为免疫原，按照50μg+50μg蛋白总量免疫小鼠，免疫后小鼠的血清IHC检测结果如图1所示，对照抗体EP412的IHC结果如图2所示。由图可知，由以SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2所示的抗原表位肽偶联载体蛋白作为免疫原制备出的多抗用作IHC一抗试剂时，比对照抗体EP412的特异性更强，因此，本申请提供的Galectin-3抗原表位肽(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2)能够用于制备Galectin-3抗原，具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生具有高度特异性和灵敏性的Galectin-3抗体。
试验例2
本试验例中，利用组织芯片在IHC层面对由实施例7中杂交瘤细胞株Galectin-3(Clone：C6C10)分泌的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体的特异性进行了鉴定，并以国外进口抗体作为对照(图3)。
Galectin-3对照克隆号为EP412，购买厂家为：Cellmarque
IHC实验步骤同试验例1，其中，一抗为杂交瘤细胞株Galectin-3(Clone：C6C10)分泌的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或对照进口抗体EP412。
组织芯片布局如下：
Figure BDA0002699462680000091
Figure BDA0002699462680000101
本芯片IHC检测结果统计如下：
对照抗体 C6C10
阳性例数 45 45
阴性例数 29 29
二者IHC层面，特异性相比(利用组织芯片)结果如下：共74个组织，其中阳性定位一致率达到100％，准确性极好。由图4、5可知，在甲状腺乳头状癌组织染色过程中，自研抗体C6C10在滤泡染色中的质染与核染较对照抗体EP412清晰，且核染较对照实，周围验证细胞无着色。由图6、7可知，在结肠癌组织染色过程中，自研抗体C6C10在结肠癌组织中的染色可以与对照EP412染色效果达到一致。综合分析组织芯片染色结果，本发明提供的杂交瘤细胞株Galectin-3(Clone：C6C10)分泌的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体比进口抗体的特异性更高。
试验例3
本试验例中，将由杂交瘤细胞株Galectin-3(Clone：C6C10)分泌的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗试剂进行免疫组化检测，包括如下步骤：
1.分别取甲状腺、肺癌组织的蜡块，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为3～4μm，65℃干烤2h。
2.使用Leica Bond Max免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液(Leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(ER2，Leica)，100℃孵育30min。一抗使用杂交瘤细胞株Galectin-3(Clone：C6C10)分泌的鼠抗人Galectin-3单克隆抗体或对照抗体EP412，采用抗体稀释液(Leica)稀释到终浓度为0.5μg/ml，150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(Leica)150μl，室温孵育8min。使用多聚物检测液(Leica)150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用DAB显色液(Leica)150μl，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min。
3.脱水和透明：去离子水清洗3min；85％乙醇1min；95％乙醇1min；100％乙醇2min,2次；二甲苯2min,3次；中性树胶封片。
4.镜检。
图8和图10分别为以鼠抗人Galectin-3单克隆抗体作为一抗免疫组化检测肺癌组织和甲状腺组织中Galectin-3表达情况结果图；图9和图11分别为以对照抗体EP412作为一抗免疫组化检测肺癌组织和甲状腺组织中Galectin-3表达情况结果图，由图8-11可知，细胞内Galectin-3蛋白定位于细胞膜、细胞质，在甲状腺滤泡性腺癌、乳头状癌中呈现特异性表达，且特异性和灵敏度较进口抗体更强。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南赛诺特生物技术有限公司
<120> Galectin-3抗原表位肽、抗原、抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> Galectin-3 抗原表位肽1
<400> 1
Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> Galectin-3 抗原表位肽2
<400> 2
Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val
1 5 10 15
Phe Pro Phe

Claims (5)

1.一种鼠抗人Galectin-3单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2020135。
2.抗人Galectin-3抗体，其特征在于，所述抗体是由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗人Galectin-3抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的抗人Galectin-3单克隆抗体杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经纯化获得单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的抗人Galectin-3抗体在制备Galectin-3体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
5.一种Galectin-3免疫组化检测试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求2所述的抗人Galectin-3抗体。
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