CN112056275A - 一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用，所述构建方法包括：对旧世界猴进行伊立替康给药，得到所述肠粘膜炎动物模型。本发明首次将伊立替康用于旧世界猴，构建肠粘膜动物模型，该模型与人类肠粘膜炎患者类似，同样伴随迟发型腹泻反应、呕吐、流涎、食欲减退、活动降低等症状。该动物模型由于其和人类的高度同源性，具有和针对人类的特异性生物分子更紧密的系统亲和力和交叉反应性的优势。该模型解决了针对伊立替康副作用的药物的安全性、有效性等一系列评价需求，有极高的应用价值。

Description

一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用，尤其涉及一种能够很好地模拟人类肠粘膜炎的动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

伊立替康，或称其为CPT-11，是一种非常常用的抗肿瘤药物，其在体内和体外研究中均体现出非常广谱且有效的抗肿瘤效果。且伊立替康本身及其代谢产物，对表达多种耐药基因的肿瘤仍有较好的效果。其在临床上常被用于效治疗小细胞及非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、转移性结直肠癌、恶性淋巴瘤等。

但是，使用伊立替康作为化疗药物的患者，有较高的发生口腔和胃肠道粘膜炎的副作用。在临床使用中，可能有高达80-90％的患者会出现此类副作用。这是由于伊立替康对快速增殖的细胞有较强的杀伤效果，在其杀死肿瘤细胞的同时，也会对粘膜中快速分裂的正常细胞产生杀伤作用。且胃肠道粘膜和上皮损伤，往往会破坏天然的免疫屏障，多同时并发菌血症，引发各类疼痛性炎症和穿孔性溃疡等不良反应。在严重时可致命。这种严重的粘膜炎，已经成为伊立替康在临床应用中最大的限制因素。为了减轻副作用，患者常常被迫调整伊立替康的用药剂量或者给药频率，甚至停药改为使用别的抗肿瘤药物，严重影响了肿瘤患者的预后。

为了解决这个问题，现在有许多专门针对该副作用的药物在研发当中。经过众多的针对伊立替康副作用的机制的研究，表明只要阻断部分特定的炎症通路，即可很大程度上减轻其引起的胃肠道粘膜炎症，且不影响其抗肿瘤的药效。故当前研究的主要药物均集中在此方向。通过单克隆抗体，靶向特定的炎症因子而阻断炎症通路是目前最通行的做法。为了配合新药的研发，胃肠道粘膜炎症的动物模型也成为了研究的重点，且现有技术大多数为肠粘膜炎的小鼠模型。

例如CN105969883A公开了SNIP1可作为炎症性肠病诊断和治疗靶点，其研究发现SNIP1具有抑制上皮细胞分泌炎症因子的作用，提高DSS诱导的小鼠肠道炎症模型上皮细胞内SNIP1的表达，发现SNIP1具有抑制DSS导致的肠粘膜炎症损伤的作用，提示SNIP1可作为临床治疗炎症性肠病新的靶点。

而由于人类和小鼠在基因特别是蛋白结构的差异，针对人类的抗体往往和小鼠的蛋白不具有结合能力，在传统的大小鼠动物模型上不能体现出药效。故当研究针对机制研究或相关的治疗验证时，需要更能模拟人类肠粘膜炎的动物模型。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用，尤其提供一种能够很好地模拟人类肠粘膜炎的动物模型及其构建方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种肠粘膜炎动物模型的构建方法，所述构建方法包括：对旧世界猴进行伊立替康给药，得到所述肠粘膜炎动物模型。

本发明首次将伊立替康用于旧世界猴，构建肠粘膜动物模型，该模型与人类肠粘膜炎患者类似，同样伴随迟发型腹泻反应、呕吐、流涎、食欲减退、活动降低等症状。该动物模型由于其和人类的高度同源性，具有和针对人类的特异性生物分子更紧密的系统亲和力和交叉反应性的优势。

优选地，所述伊立替康包括伊立替康或其可药用盐；优选盐酸伊立替康。

本发明所涉及的伊立替康可以选择游离伊立替康形式，也可以选择伊立替康的药用盐形式，例如盐酸伊立替康。

优选地，所述旧世界猴包括食蟹猴。

本发明所涉及的肠粘膜炎动物模型优选食蟹猴作为研究对象，与其他旧世界猴品系相比，其对该模型具有最佳的敏感性和最小的个体间差异。

优选地，所述食蟹猴的年龄为3-5岁，体重为2-5kg，例如2kg、2.5kg、3kg、3.5kg、4kg、4.5kg或5kg等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述食蟹猴的体重特定选择为2-5kg，是因为若体重超过5kg则因动物年纪较大，对药物耐受力增强，且个体差异将会更加明显。在需要较大的给药剂量的情况下，个体差异将会进一步放大，难以取得较为一致的数据。若体重低于2kg则因动物耐受力较差，极易因药物毒性引起的迟发型腹泻导致死亡。

优选地，所述伊立替康的给药方式包括静脉滴注。

本发明所涉及的伊立替康的给药方式特定采用静脉滴注，因为该药物不良反应发生概率非常高，若采用静脉注射会则极容易发生急性过敏反应，及胆碱能综合征等副作用，最严重可致死。

优选地，所述伊立替康的静脉滴注时长为25-90min，例如25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、70min、80min或90min等，静脉滴注体积为5-15mL/kg，例如5mL/kg、6mL/kg、8mL/kg、10mL/kg、12mL/kg、13mL/kg或15mL/kg等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

若静脉滴注的时长少于25min会易于发生过敏甚至过敏性休克，或胆碱能综合征。

优选地，所述伊立替康的给药量为每日10-45mg/kg，例如10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg或45mg/kg等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述伊立替康的给药量特定选择为每日10-45mg/kg，因为给药量进一步增加会增加副反应的发生率，或发生无法控制的腹泻，最终致死；给药量进一步减少会无法引起足够严重的肠粘膜炎，达不到造模效果。

优选地，所述伊立替康的给药时长为3-6天，例如3天、4天、5天或6天等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第二方面，本发明提供一种如上所述的构建方法获得的肠粘膜炎动物模型。

第三方面，本发明提供一种如上所述的肠粘膜炎动物模型在筛选肠粘膜炎治疗候选药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明首次将伊立替康用于旧世界猴，构建肠粘膜动物模型，该模型与人类肠粘膜炎患者类似，同样伴随迟发型腹泻反应、呕吐、流涎、食欲减退、活动降低等症状。该动物模型由于其和人类的高度同源性，具有和针对人类的特异性生物分子更紧密的系统亲和力和交叉反应性的优势。该模型解决了针对伊立替康副作用的药物的安全性、有效性等一系列评价需求，有极高的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中对照组和模型组的动物体重下降情况统计图；

图2是实施例1中对照组和模型组的动物腹泻的严重程度统计图；

图3是实施例2中对照组和模型组的动物体重下降情况统计图；

图4是实施例3中对照组和模型组的动物体重下降情况统计图；

图5是实施例4中对照组和模型组的动物体重下降情况统计图；

图6是实施例2中对照组和模型组的动物腹泻的严重程度统计图；

图7是实施例3中对照组和模型组的动物腹泻的严重程度统计图；

图8是实施例4中对照组和模型组的动物腹泻的严重程度统计图；

图9是实施例1中对照组和模型组的动物食欲减退情况统计图；

图10是实施例1中对照组和模型组的动物活动降低情况统计图；

图11是实施例2中对照组和模型组的动物食欲减退情况统计图；

图12是实施例3中对照组和模型组的动物食欲减退情况统计图；

图13是实施例4中对照组和模型组的动物食欲减退情况统计图；

图14是实施例2中对照组和模型组的动物活动降低情况统计图；

图15是实施例3中对照组和模型组的动物活动降低情况统计图；

图16是实施例4中对照组和模型组的动物活动降低情况统计图；

图17是实施例1中对照组和模型组的动物白细胞数量变化情况统计图；

图18是实施例2中对照组和模型组的动物白细胞数量变化情况统计图；

图19是实施例3中对照组和模型组的动物白细胞数量变化情况统计图；

图20是实施例4中对照组和模型组的动物白细胞数量变化情况统计图；

图21是实施例1中对照组和模型组的动物血清中ST-2水平变化情况统计图；

图22是实施例1中对照组和模型组的动物小肠组织中IL-33水平变化情况统计图；

图23是实施例1中对照组和模型组的动物小肠组织中ST-2水平变化情况统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例所涉及的实验用猴食蟹猴来源于海南金港实验动物有限公司，整个实验期间，实验用猴可无限量获取经处理后达到人类饮用水标准的饮水及猴粮。在可预见范围内，动物食物和饮用水中的已知污染物含量将不会对本实验的目的或操作过程造成影响。

下述实施例所涉及的盐酸伊立替康购自于辉瑞制药有限公司。

实施例1

本实施例将10只3-5岁，体重2-5kg的食蟹猴使用Biobook软件，按体重平均分成两组，分别为对照组和模型组、每组5只。将盐酸伊立替康用生理盐水配制成溶液。

从第0天开始，对照组接受生理盐水，作为对照组；模型组接受每日30mg/kg的盐酸伊立替康，连续5天。给药方式为静脉滴注，注射体积为10mL/kg，滴注时长为30min。实验持续时间为14天。

实施例2

本实施例构建一种肠粘膜炎动物模型，其构建方法与实施例1中模型组构建方法的区别仅在于将体重2-5kg的食蟹猴替换成6-8kg的食蟹猴，其他条件均保持不变。

实施例3

本实施例构建一种肠粘膜炎动物模型，其构建方法与实施例1中模型组构建方法的区别仅在于给药剂量为每日50mg/kg的盐酸伊立替康，其他条件均保持不变。

实施例4

本实施例构建一种肠粘膜炎动物模型，其构建方法与实施例1中模型组构建方法的区别仅在于给药剂量为每日10mg/kg的盐酸伊立替康，其他条件均保持不变。

实施例5

本实施例构建一种肠粘膜炎动物模型，其构建方法与实施例1中模型组构建方法的区别仅在于滴注时长为20min，其他条件均保持不变。试验发现在滴注的过程中动物有短暂性休克过程，但对以下评价数据影响不大。

评价试验：

(1)从造模当天起，每天观察动物体重下降情况和腹泻的严重程度，腹泻的严重程度评分如下：0-正常，粪便正常或无粪便；1-轻度，轻微湿润的软便；2-中度，潮湿且不成型的粪便，肛门周围有粪便沾染；3-严重，水状便，肛周被毛被粪便染色。

(2)每天观察各组动物的健康情况和对盐酸伊立替康的反应。所有非正常表现和行为，包括呕吐，流涎，食欲减退，活动降低等等都会被记录在案，并按严重程度分为0-3分。

(3)采集各组动物的血样，用于白细胞计数并使用ELISA检测血清中ST-2水平的测定。

(4)实验结束时，使用过量的戊巴比妥将动物麻醉后，放血安乐死。将小肠的肠内容物洗净后拍照，将病变部分分为3份，分别固定于福尔马林中保存。此前固定在福尔马林中的小肠样本将被用于病理分析，使用ELISA检测小肠组织中IL-33和ST-2的水平，并将其制作成4μm厚的石蜡切片，进行H&E和periodic acid–Schiff(PAS)染色。随后对切片进行盲性评分，评分系统如下：

结果如下：

(1)实施例1中对照组和模型组的动物体重下降情况如图1所示，由图1可知：给予伊立替康后，模型组动物出现典型的迟发型腹泻反应，其体重随之迅速降低。腹泻的严重程度统计情况如图2所示，由图2可知：给予伊立替康后，模型组动物出现典型的水样便腹泻，与临床病患的副作用反应高度一致。

实施例2-4中对照组和模型组的动物体重下降情况依次如图3-5所示。

实施例2-4中对照组和模型组的动物腹泻严重程度统计情况如图6-8所示。

(2)实施例1中对照组和模型组的动物食欲减退情况如图9所示，由图9可知：给予伊立替康后，动物食欲迅速下降，且一直维持到实验结束，该症状和临床病患的副作用反应一致。活动降低情况如图10所示，由图10可知：给予伊立替康后，动物活动程度持续降低，且一直维持到实验结束，该症状和临床病患的副作用反应一致。

实施例2-4中对照组和模型组的动物体重下降情况如图11-13所示。

实施例2-4中对照组和模型组的动物活动降低情况如图14-16所示。

(3)实施例1中对照组和模型组的动物白细胞数量变化情况如图17所示，由图17可知：给予伊立替康后，动物体内白细胞计数迅速下降，符合伊立替康常见的降低人体内白细胞特别是粒细胞数量的副作用。

实施例2-4中对照组和模型组的白细胞数量变化情况如图18-20所示。

(4)实施例1中对照组和模型组的动物血清中ST-2水平变化情况如图21所示，由图21可知：给予伊立替康后，动物外周血中可溶性ST2水平迅速升高，与其作用机制相符，证明该模型可用于IL-33/ST2通路相关的药物筛选。

(5)实施例1中对照组和模型组的动物小肠组织中IL-33水平变化情况如图22所示，ST-2水平变化情况如图23所示，由图22和图23可知：给予伊立替康后，食蟹猴的小肠中IL33水平显著升高，而可溶性ST2因大部分循环至外周，所以水平变化不大，符合该药物的作用机制及临床病患用药后出现的副反应特征。

(6)对实施例1-5各组切片的盲性评分结果如表1所示：

表1

炎性细胞浸润的得分越高代表疾病越严重，PAS染色的评分越低代表疾病越严重。由表1数据可知：实施例1能够引起足够严重的肠粘膜炎，达到了很好的造模效果；实施例3由于给药量过大可能导致副反应的发生率增加或发生无法控制的腹泻，动物最终致死；实施例2和4与实施例1相比没有能够引起足够严重的肠粘膜炎，造模效果稍差；实施例5的造模效果与实施例1相差不大。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种肠粘膜炎动物模型及其构建方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种肠粘膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：对旧世界猴进行伊立替康给药，得到所述肠粘膜炎动物模型。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述伊立替康包括伊立替康或其可药用盐；优选盐酸伊立替康。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述旧世界猴包括食蟹猴。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述食蟹猴的年龄为3-5岁，体重为2-5kg。

5.如权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述伊立替康的给药方式包括静脉滴注。

6.如权利要求1-5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述伊立替康的静脉滴注时长为25-90min，静脉滴注体积为5-15mL/kg。

7.如权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述伊立替康的给药量为每日10-45mg/kg。

8.如权利要求1-7中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述伊立替康的给药时长为3-6天。

9.如权利要求1-8中任一项所述的构建方法获得的肠粘膜炎动物模型。

10.如权利要求9所述的肠粘膜炎动物模型在筛选肠粘膜炎治疗候选药物中的应用。

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