CN112048532B

CN112048532B - 一种发酵生产阿卡波糖的方法

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Publication number: CN112048532B
Application number: CN202010985862.XA
Authority: CN
Inventors: 史磊; 杨素娟; 朱维忠; 郑长春; 张开芬
Original assignee: Shandong Lukang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amicogen China Biopharm Co Ltd
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN112048532A

Abstract

本发明提供了一种发酵生产阿卡波糖的方法，属于发酵技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将游动放线菌菌株接种至种子培养基中进行种子培养获得种子液；2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养160～170h获得发酵液；所述发酵培养的温度为27～29℃，所述发酵培养的压力为0.04～0.05MPa；所述发酵培养的溶解氧为25％～35％；在所述发酵培养的40～100h期间，向发酵体系中补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵体系中的葡萄糖含量在10～20g/L之间。本发明所述方法产量高、周期短、产量稳定。

Description

一种发酵生产阿卡波糖的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种发酵生产阿卡波糖的方法。

背景技术

阿卡波糖(Acarbose)为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，是复杂的低聚糖，结构类似寡糖，能够与α-葡萄糖苷酶可逆地结合，抑制各种α-葡萄糖苷酶如麦芽糖酶、异麦芽糖酶、葡萄糖淀粉酶及蔗糖酶的活性，使淀粉分解成寡糖如麦芽糖(双糖)、麦芽三糖及糊精(低聚糖)进而分解成葡萄糖的速度减慢，使蔗糖分解成葡萄糖和果糖的速度减慢，因此造成肠道葡萄糖的吸收减缓，从而缓解餐后高血糖，达到降低血糖的作用。如果长期服用阿卡波糖，能够降低空腹血糖和糖化血红蛋白的浓度。

阿卡波糖可以通过微生物发酵的方法生产，但是存在周期长、产量低和产量不稳定的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵生产阿卡波糖的方法，所述方法产量高、周期短、产量稳定。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种发酵生产阿卡波糖的方法，包括以下步骤：

1)将游动放线菌菌株接种至种子培养基中进行种子培养获得种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养160～170h获得发酵液；

所述发酵培养的温度为27～29℃，所述发酵培养的压力为0.04～0.05MPa；所述发酵培养的溶解氧为25％～35％；在所述发酵培养的40～100h期间，向发酵体系中补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵体系中的葡萄糖含量在10～20g/L之间。

优选的，所述种子液的菌浓度为25～30％。

优选的，所述种子培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组成：葡萄糖70～90g/L，黄豆饼粉60～80g/L，KH₂PO₄0.5～1.5g/L，MgSO₄0.5～1.5g/L；所述种子培养基的pH值为7.0～7.2。

优选的，所述葡萄糖和磷酸二氢钾的混合液中葡萄糖的浓度为450～550g/L，磷酸二氢钾的浓度为4～6g/L。

优选的，所述葡萄糖和磷酸二氢钾的混合液中葡萄糖的浓度为500g/L，磷酸二氢钾的浓度为5g/L。

优选的，所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：葡萄糖90～110g/L，玉米浆8～12g/L，黄豆饼粉15～25g/L，谷氨酸0.8～1.2g/L，CaCl₂1.5～2.5g/L，FeCl₃0.4～0.6g/L，K₂HPO₄0.8～1.2g/L，CaCO₃2～3g/L；所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

优选的，所述发酵过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速为100～400rpm。

优选的，所述发酵过程中进行通气，所述通气的通气量为0.2～1.5m³/h。

本发明的有益效果：本发明所述的发酵生产阿卡波糖的方法，通过对发酵过程中精准控制、葡萄糖与磷酸二氢钾的合理补加，将发酵体系中的葡萄糖水平控制在10～20g/L之间，最终发酵液中的阿卡波糖发酵含量达到7000～8000mg/L，同时具备发酵周期短、发酵产量高、产量稳定等优势。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵生产阿卡波糖的方法，包括以下步骤：1)将游动放线菌菌株接种至种子培养基中进行种子培养获得种子液；2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养160～170h获得发酵液；所述发酵培养的温度为27～29℃，所述发酵培养的压力为0.04～0.05MPa；所述发酵培养的溶解氧为25％～35％；在所述发酵培养的40～100h期间，向发酵体系中补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵体系中的葡萄糖含量在10～20g/L之间。

本发明对所述游动放线菌菌株来源于没有特殊限定，采用本领域常规的游动放线菌均可。在本发明中，将游动放线菌菌株接种至种子培养基中进行种子培养获得种子液。在本发明中，所述种子培养基以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组成：葡萄糖70～90g/L，黄豆饼粉60～80g/L，KH₂PO₄0.5～1.5g/L，MgSO₄0.5～1.5g/L；更优选的包括以下组分：葡萄糖80g/L，黄豆饼粉70g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄1.0g/L；所述种子培养基的pH值优选为7.0～7.2。在本发明中，所述游动放线菌菌株优选的保藏于斜面固体培养基上；本发明优选的用无菌水将所述菌株从斜面固体培养基中冲下来制备菌悬液后，进行接种。在本发明中，所述种子培养优选的在摇床进行，所述种子培养的温度优选为27～29℃，更优选为28℃；所述种子培养的转速优选为100～150rpm，更优选为120rpm；所述种子培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述种子液的菌浓度优选为25～30％，更优选为26～29％。本发明在获得所述种子液后，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养160～170h获得发酵液。在本发明中，所述种子液的接种量(种子液的体积/发酵培养基的体积)优选为12％～18％，更优选为14％～16％，最优选为15％。在本发明中，所述发酵培养基以水为溶剂，优选的包括以下组分：葡萄糖90～110g/L，玉米浆8～12g/L，黄豆饼粉15～25g/L，谷氨酸0.8～1.2g/L，CaCl₂1.5～2.5g/L，FeCl₃0.4～0.6g/L，K₂HPO₄0.8～1.2g/L，CaCO₃2～3g/L，更优选的包括葡萄糖100g/L，玉米浆10g/L，黄豆饼粉20g/L，谷氨酸1.0g/L，CaCl₂2.0g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L，CaCO₃2.5g/L，所述发酵培养基的pH值优选为7.0～7.2。

在本发明中，所述发酵优选的在自动控制发酵罐中进行；在本发明中，所述发酵培养的温度优选为27～29℃，更优选为28℃；所述发酵培养的压力优选为0.04～0.05MPa；所述发酵培养的溶解氧优选为25％～35％，更优选为28％～32％，最优选为30％。所述发酵过程中优选的伴随搅拌和通气；本发明通过控制搅拌转速和通气量来控制发酵体系中的溶解氧，根据发酵体系中的溶解氧，实时调整搅拌的转速和通气量，所述搅拌的转速优选为100～400rpm；所述通气的通气量优选为0.2～1.5m³/h。

在本发明中，所述发酵培养的时间优选为162～168h；在所述发酵培养的40～100h期间，向发酵体系中补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵体系中的葡萄糖含量在10～20g/L之间。在本发明中，所述补加葡萄糖和磷酸二氢钾的混合液中葡萄糖的浓度优选为450～550g/L，更优选为480～520g/L；所述磷酸二氢钾的浓度优选为4～6g/L，更优选为5g/L。在本发明中，所述发酵体系中的葡萄糖含量优选的通过HPLC-UV检测。在本发明中，所述葡萄糖和磷酸二氢钾混合液的补加优选为间歇性补加，当所述发酵体系中的葡萄糖含量低于10g/L时，开始补加；当所述发酵体系中的葡萄糖含量高于20g/L时，停止补加。在本发明中，所述葡萄糖和磷酸二氢钾混合液补加的流速优选为0.5～1.5g/L/h，更优选为0.9g/L/h。在本发明中，通过补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，混合液通过高温灭菌，葡萄糖与磷酸二氢钾反应形成6-磷酸葡萄糖，游动放线菌可以更快的利用6-磷酸葡萄糖，达到快速利用营养，产生目标产物的目的。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以10mL无菌水洗下4支斜面上的游动放线菌，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为20％的1000mL三角瓶中，28℃摇床振荡(120rpm)培养48h；将摇瓶种子液(3000mL)接种至装量为20L/30L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温28℃、罐压0.04～0.05MPa，通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在32％，在发酵过程中，40～100h流加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵液葡萄糖含量在10～20g/L之间，160h发酵结束，发酵液剩余葡萄糖控制在10g/L以内，阿卡波糖含量在7560mg/L。

种子培养基配方：葡萄糖80g/L，黄豆饼粉70g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄1.0g/L，pH7.0～7.2。

发酵培养基配方：葡萄糖100g/L，玉米浆10g/L，黄豆饼粉20g/L，谷氨酸1.0g/L，CaCl₂2.0g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L，CaCO₃2.5g/L，pH值7.0～7.2。

补料培养基配方：葡萄糖500g/L，KH₂PO₄5.0g/L。

实施例2

以10mL无菌水洗下4支斜面上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为20％的1000mL三角瓶中，28℃摇床振荡(120rpm)培养48h；将摇瓶种子液(3000mL)接种至装量为20L/30L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温28℃、罐压0.04～0.05MPa，通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在28％，在发酵过程中，40～100h流加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵液葡萄糖含量在10～20g/L之间，165h发酵结束，发酵液剩余葡萄糖控制在10g/L以内，阿卡波糖含量在7400mg/L。

种子培养基配方：葡萄糖80g/L，黄豆饼粉70g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄1.0g/L，pH值为7.0～7.2。

发酵培养基配方：葡萄糖100g/L，玉米浆10g/L，黄豆饼粉20g/L，谷氨酸1.0g/L，CaCl₂2.0g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L，CaCO₃2.5g/L，pH值为7.0～7.2。

补料培养基配方：葡萄糖500g/L，K₂HPO₄5.0g/L。

实施例3

以10mL无菌水洗下4支斜面上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为20％的1000mL三角瓶中，28℃摇床振荡(120rpm)培养48h；将摇瓶种子液(3000mL)接种至装量为20L/30L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温28℃、罐压0.04～0.05MPa，通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在30％，在发酵过程中，40h-100h流加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵液葡萄糖含量在10～20g/L之间，162h发酵结束，发酵液剩余葡萄糖控制在10g/L以内，阿卡波糖含量在7880mg/L。

补料培养基配方：葡萄糖500g/L，K₂HPO₄5.0g/L。

实施例1～3中阿卡波糖含量的测定采用HPLC-UV检测，具体步骤如下：

波长：210nm流速：1.0mL/min进样量：10μL

色谱柱：TOSOH TSKgel Amide-80(5μm,2.0*150mm)/依利特NH2(5μm,4.6*250nm)

柱温：35度

检测器类型：UV

流动相：0.6g KH₂PO₄+0.45g K₂HPO₄+1000mL水+2500mL乙腈(先配制盐溶液，后加入有机相)

检测时间：15min

阿卡波糖标准品配制：

取0.205g 95％的阿卡波糖粉末，溶于974μL甲醇中，配制为浓度20mg/mL的母液，之后稀释成2000ppm、1500ppm、1000ppm、500ppm、250ppm、125ppm。

在本发明中，所述菌浓度的测定方法如下：10ml离心管装入10ml待测样品，放入离心机，2500rpm,离心10min，取出盛有样品的10ml离心管，把上层清液倒入另一只10ml离心管，读数(以凹液面的最低处为X)，菌丝浓度＝(10-X)/10*100％。

实施例1～3的发酵结果参数见表1。

表1实施例1～3的发酵结果参数

	发酵周期(h)	放罐体积(L)	菌浓％	补料体积(L)	含量(mg/L)
						实施例1	160	23	43	3.5	7560
实施例2	165	22	41	3.4	7400
						实施例3	162	22	46	3.5	7880

对比例1

现有发酵方法

30L自控罐发酵

以10mL无菌水洗下4支斜面上的菌体，制成菌悬液，将菌悬液接至种子培养基装量为20％的1000mL三角瓶中，28℃摇床振荡(120rpm)培养48h；将摇瓶种子液(3000mL)接种至装量为60L/100L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温28℃、罐压0.04～0.05MPa，通过搅拌转速和通气量的调节，将发酵过程的溶氧控制在30％，在发酵过程中，40～100h流加葡萄糖，控制发酵液葡萄糖含量在10～20g/L之间，160h发酵结束，发酵液剩余葡萄糖控制在10g/L以内，阿卡波糖含量在3000～4000mg/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵生产阿卡波糖的方法，包括以下步骤：

2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行160～170h的发酵培养获得发酵液；

所述发酵培养的温度为27～29℃，所述发酵培养的压力为0.04～0.05MPa；所述发酵培养的溶解氧为25％～35％；在所述发酵培养的40～100h期间，向发酵体系中补加葡萄糖和磷酸二氢钾混合液，控制发酵体系中的葡萄糖含量在10～20g/L之间；

所述葡萄糖和磷酸二氢钾混合液中葡萄糖的浓度为450～550g/L，磷酸二氢钾的浓度为4～6g/L；

所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：葡萄糖90～110g/L，玉米浆8～12g/L，黄豆饼粉15～25g/L，谷氨酸0.8～1.2g/L，CaCl₂1.5～2.5g/L，FeCl₃0.4～0.6g/L，K₂HPO₄0.8～1.2g/L，CaCO₃2～3g/L；所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液的菌浓度为25～30％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组成：葡萄糖70～90g/L，黄豆饼粉60～80g/L，KH₂PO₄0.5～1.5g/L，MgSO₄

0.5～1.5g/L；所述种子培养基的pH值为7.0～7.2。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：葡萄糖100g/L，玉米浆10g/L，黄豆饼粉20g/L，谷氨酸1.0g/L，CaCl₂2.0g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L，CaCO₃2.5g/L；所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖和磷酸二氢钾混合液中葡萄糖的浓度为500g/L，磷酸二氢钾的浓度为5g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速为100～400rpm。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中进行通气，所述通气的通气量为0.2～1.5m³/h。