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CN112040957A - 靶向表达cd99的癌症的组合物和方法 - Google Patents

靶向表达cd99的癌症的组合物和方法 Download PDF

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CN112040957A
CN112040957A CN201980016426.7A CN201980016426A CN112040957A CN 112040957 A CN112040957 A CN 112040957A CN 201980016426 A CN201980016426 A CN 201980016426A CN 112040957 A CN112040957 A CN 112040957A
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马可·L·达维拉
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H Lee Moffett Cancer Center And Institute Inc
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H Lee Moffett Cancer Center And Institute Inc
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Abstract

本文公开了用于靶向治疗表达CD99的癌症的组合物和方法。具体地，公开了可以与过继细胞转移一起用于靶向和杀伤表达CD99的癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽。还公开了经工程化以表达这些CAR的免疫效应细胞，诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开了在患有表达CD99的癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法涉及经工程化以表达所公开的CAR的所公开的免疫效应细胞的过继转移。还公开了能够与T细胞结合以破坏表达CD99的恶性细胞的多价抗体。

Description

靶向表达CD99的癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月8日提交的美国临时申请序列号62/614,779、2018年4月9日提交的申请序列号62/654,617、2018年4月9日提交的申请序列号62/654,625、2018年9月12日提交的申请序列号62/730,374、2018年9月12日提交的申请序列号62/730,397、2018年11月15日提交的申请序列号62/767,864、和2018年11月15日提交的申请序列号62/767,867的权益，所有所述申请的全部内容通过引用并入本文中。
序列表
本申请包含2019年1月6日创建的标题为“320103-2030序列表ST25”的以电子格式归档为ASCII.txt文件的序列表。序列表的全部内容通过引用并入本文中。
背景技术
手术、放射疗法和化学疗法已成为治疗包括白血病、实体瘤和转移癌的被接受的标准方法。已将直接或间接利用人体免疫系统来缩小或根除癌症的免疫疗法(有时称为生物学疗法、生物疗法或生物应答调节剂疗法)作为常规癌症疗法的辅助手段进行了多年研究。人们认为，人类免疫系统是用于癌症疗法的未开发资源，一旦正确利用了免疫系统的组成部分，便可以开发出有效的治疗方法。
发明内容
本文公开了用于靶向治疗表达CD99的癌症的组合物和方法。例如，本文提供了来自杂交瘤1H3、4C5、9G12、3C7、2F11、4D5、4F4和6A10的抗CD99单克隆抗体。例如，来自杂交瘤克隆1H3H7、1H3E9、4C5E2、4C5H10、9G12C9和9G12G6的抗体证明与CD99特别好地结合。还公开了重组、人源化和/或嵌合抗体，所述抗体至少包括一种或多种这些抗体的抗原结合区。
本文还公开了能够与T细胞结合以破坏表达CD99的恶性细胞的多特异性、多价抗体。例如，抗体可以是双特异性T细胞衔接器。可以从融合多肽，诸如具有下式的融合多肽对抗体进行工程化：
VLI–VHI–VLT–VHT、
VLT–VHT–VLI–VHI、
VHT–VLT–VHI–VLI、
VHI–VLI–VHT–VLT、
VLI–VHI–VHT–VLT、
VLT–VHT–VHI–VLI，
其中“VLI”是具有免疫细胞抗原特异性的轻链可变结构域；
其中“VHT”是具有CD99特异性的重链可变结构域；
其中“VLT”是具有CD99特异性的轻链可变结构域；
其中“VHI”是具有所述免疫细胞抗原特异性的重链可变结构域；且
其中“–”由肽接头或肽键组成。
免疫细胞抗原可以是在人NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞上表达的细胞表面分子。例如，细胞表面分子可以是抗原CD2、CD3、CD16、CD64、CD89；NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLR-F1)、NKG2C或NKG2D。
还公开了编码所公开的融合多肽的分离的核酸，以及包含与表达控制序列可操作地连接的此分离的核酸的核酸运载体。还公开了用这些运载体转染的细胞以及这些细胞用于产生所公开的融合多肽的用途。
还公开了一种在药学上可接受的载体中包括本文所公开的分子的药物组合物。还公开了一种用于治疗受试者癌症的方法，所述方法涉及向受试者施用治疗有效量的所公开的药物组合物。在一些情况下，癌症可以是任何表达CD99的恶性肿瘤。在一些情况下，癌症包括骨髓增生异常综合征、急性髓细胞白血病或双表型白血病。
还公开了可以与过继细胞转移一起用于靶向和杀伤表达CD99的癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽。所公开的CAR多肽在胞外结构域中包含可以结合表达CD99的癌细胞的抗CD99结合剂。还公开了经基因修饰以表达所公开的CAR多肽的免疫效应细胞。
在一些实施例中，抗CD99结合剂是特异性结合CD99的抗体片段。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合CD99的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，抗CD99结合剂是特异性结合CD99的适配体。例如，抗CD99结合剂可以是基于其结合CD99的能力选自随机序列库的肽适配体。抗CD99结合剂也可以是CD99的天然配体，或者是能够结合CD99的变体和/或片段。
在一些实施例中，所公开的抗体或CAR的抗CD99区源自杂交瘤1H3、4C5、9G12、3C7、2F11、4D5、4F4、6A10或其组合。在一些实施例中，抗CD99区(例如scFv)可以包括具有CDR1、CDR2和CDR3序列的可变重(VH)结构域和具有CDR1、CDR2和CDR3序列的可变轻(VL)结构域。
在一些实施例中，VH结构域的CDR1序列包括氨基酸序列GFDIKDTY(SEQ ID NO:1)、TYAMY(SEQ ID NO:2)、TFWM(SEQ ID NO:3)或TFWMQ(SEQ ID NO:4)；VH结构域的CDR2序列包括氨基酸序列IDPANGDT(SEQ ID NO:5)、RIRSKVNNYATYYADSVKDRFT(SEQ ID NO:6)或TIYPGDDDTRYTQKFKGRAT(SEQ ID NO:7)；VH结构域的CDR3序列包括氨基酸序列ARRGGLS(SEQID NO:8)、DPMDY(SEQ ID NO:9)或SGYERGPYYFDS(SEQ ID NO:10)或SGYERGPYYF(SEQ IDNO:11)；VL的CDR1序列包括氨基酸序列GNIHNY(SEQ ID NO:12)、GSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ IDNO:13)、KSSQSLLCRSNQKNYLA(SEQ ID NO:14)或KSSQSLLYRSNQKNYLA(SEQ ID NO:15)；VL结构域的CDR2序列包括氨基酸序列NAKX(SEQ ID NO:16)、RVSNLAS(SEQ ID NO:17)或WASTRES(SEQ ID NO:18)；并且VL结构域的CDR3序列包括氨基酸序列QHFWSTPWT(SEQ ID NO:19)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:20)或QQYYSYPLT(SEQ ID NO:21)。
因此，在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:22，1H3H7)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列GAGGTTCAACTGCAACAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCGACATTAAAGACACCTATATCCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAGATATGACCCGGAATTCCAGGGCAAGGCCTCTCTAACAGCTGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTACAATTCAGCAACCTGACATCTGAAGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAAGAGGCGGCCTCTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:23，1H3H7)编码。
因此，在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:24，4C5E2)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCCGGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGTACTGGGTCTGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGAAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAGTTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAACATGCTCTTTCTGCACATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACTGCCATATATTTCTGTGTGAGAGATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:25，4C5E2)编码。
因此，在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:26，4C5H10)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCCGGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGTACTGGGTCTGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGAAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAGTTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAACATGCTCTTTCTGCACATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACTGCCATATATTTCTGTGTGAGAGATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:27，4C5H10)编码。
因此，在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:28，9G12C9)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTACACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCACCACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:29，9G12C9)编码。
因此，在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:30，9G12G6 HB1)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列GATGTGAAGCTTCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGCGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTACACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCACCACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:31，9G12G6 HB1)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VH结构域包括氨基酸序列QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:32，9G12G6 HB3)。
因此，在一些实施例中，抗CD99重链由核酸序列CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGTGGGCAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTACACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCACCACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:33，9G12G6 HB3)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:34，1H3H9)。
因此，在一些实施例中，抗CD99轻链由核酸序列GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:35，1H3H9)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列GNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:36，1H3H7 LC1)。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列GNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:37，1H3H7 LC2)。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:38，4C5E2)。
因此，在一些实施例中，抗CD99轻链由核酸序列GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGGGAGTCAGTATCCATCTCCTGCGGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGGTGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:39，4C5E2)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:40，4C5H10)。
因此，在一些实施例中，抗CD99轻链由核酸序列GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGGGAGTCAGTATCCATCTCCTGCGGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGGTGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:41，4C5H10)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:42，9G12C9)。
因此，在一些实施例中，抗CD99轻链由核酸序列GACACTGTGATGTCACAGTCCCCATCCTCCCTAGCTGTTTCAGTTGGAGAGAAGATAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTTTATGTCGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACAGCTGATTTACTGGGCATCTACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:43，9G12C9)编码。
在一些实施例中，抗CD99 VL结构域包括氨基酸序列DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:44，9G12G6)。
因此，在一些实施例中，抗CD99轻链由核酸序列GACACTGTGATGTCACAGTCCCCATCCTCCCTAGCTGTTTCAGTTGGAGAGAAGATAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTTTATATCGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACAGCTGATTTACTGGGCATCTACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:45，9G12G6)编码。
重链和轻链优选地被接头分开。scFv抗体的合适接头是本领域已知的。在一些实施例中，接头包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)。scFv可以具有式NH3-VH-接头-VL-COOH或NH3-VL-接头-VH-COOH。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:47)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:48)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:49)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:50)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:51)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:52)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:53)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:54)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:55)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:56)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:57)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:58)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:59)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:60)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:61)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:62)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:63)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:64)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:65)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:66)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:67)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ IDNO:68)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:69)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:70)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:71)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:72)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:73)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ IDNO:74)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ IDNO:75)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:76)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:77)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:78)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:79)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:80)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ IDNO:81)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK(SEQ IDNO:82)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:83)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ IDNO:84)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:85)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:86)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:87)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:88)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:89)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:90)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:91)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:92)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS(SEQ ID NO:93)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:94)。
在一些实施例中，抗CD99 scFv包括氨基酸序列：DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:95)。
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与其他CAR一样，所公开的多肽也可以包含跨膜结构域和能够激活免疫效应细胞的内结构域。例如，内结构域可以包含信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导区。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域是CD3 zeta(CD3ζ)信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区包括CD28、4-1BB或其组合的细胞质结构域。在一些情况下，共刺激信号传导区包含一个或多个细胞内信号传导和/或共刺激分子的1、2、3或4个细胞质结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区在CD28和/或4-1BB的细胞质结构域中包含增强信号传导的一个或多个突变。
在一些实施例中，CAR多肽包含不完整的内结构域。例如，CAR多肽可以仅包含细胞内信号传导结构域或共刺激结构域，但不能同时包含两者。在这些实施例中，除非免疫效应细胞和包含缺失结构域的第二CAR多肽(或内源性T细胞受体)两者都结合其各自的抗原，否则免疫效应细胞不会被激活。因此，在一些实施例中，CAR多肽包含CD3 Zeta(CD3ζ)信号传导结构域，但不包含共刺激信号传导区(CSR)。在其他实施例中，CAR多肽包含CD28、4-1BB或其组合的细胞质结构域，但不包含CD3 Zeta(CD3ζ)信号传导结构域(SD)。
还公开了编码所公开的CAR多肽的分离的核酸序列、包括这些分离的核酸的运载体以及包含这些运载体的细胞。例如，细胞可以是免疫效应细胞，其选自由α-βT细胞、γ-δT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、固有淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、调节性T细胞或其组合组成的组。
在一些实施例中，当CAR的抗原结合结构域与CD99结合时，细胞表现出抗肿瘤免疫。
还公开了一种在患有表达CD99的癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法涉及向受试者施用有效量的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞用所公开的CD99特异性CAR进行基因修饰。
附图和下面的说明书中陈述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据说明书和图示并且根据权利要求书将显而易见本发明的其他特征、目标和优点。
附图简单说明
图1包含示出CD99-PE分析中用于活细胞的门的流式细胞图。
图2包含示出用于CD99-PE分析的阳性(右)和阴性(左)对照的流式细胞图。
图3包含示出CD99阳性的杂交瘤的流式细胞图。
图4包含描绘针对每种杂交瘤的通过ELISA吸收的CD99结合的图。
图5包含示出1H3H7、1H3E9、4C5E2、4C5H10、9G12C9和9G12G6的二次筛选的流式细胞图。
图6A至图6D示出抗CD99 CAR的细胞毒性活性。将过表达CD99的CHO细胞(CHO-CD99)用作靶细胞。将表达抗CD99 CAR的γ逆转录病毒转导到从健康PBMC中分离的原代T细胞中。通过mCherry表达的流式细胞术分析确定每个CAR的转导效率(图6A和图6B)。将CAR阳性细胞以1:1(图6C)或1:5(图6D)的效靶比添加到靶细胞。UT＝未转导，MFI＝中值荧光强度。
图7A至图7C示出抗CD99 CAR的细胞因子分泌。将CAR阳性细胞与CHO-CD99靶细胞以1:1的效靶比共孵育过夜。共孵育后，收集上清液，并分析细胞因子IFNγ(图7A)、IL-2(图7B)和IL-6(图7C)的产生。UT＝未转导。
图8A至图8I示出抗CD99 CAR的免疫表型。从PBMC中分离的健康T细胞用抗CD99CAR进行转导。在没有抗原刺激的情况下培养1周后，对细胞进行CD3、CD4、CD8、PD1、CCR7和CD45RA染色，并在流式细胞仪上收集数据。基于mCherry表达确定转导效率(图8A和图8B)。分析活CAR阳性T细胞的CD4、CD8和PD1表达(图8C至图8H)。还基于CCR7和CD45RA表达分析了T细胞亚群(图8I)。EFF＝效应，EM＝效应记忆，CM＝中枢记忆，N＝幼稚。
图9A至图9F示出抗CD99 CAR的CD4和CD8免疫表型。分析CD4和CD8 T细胞的PD1的表达(图9A和图9B，图9D和图9E)和T细胞亚群(图9C和图9F)。EFF＝效应，EM＝效应记忆，CM＝中枢记忆，N＝幼稚。
具体实施方式
本文公开了双特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)，其可以特异性识别表达CD99的癌症上的肿瘤相关抗原(TAA)。还公开了经工程化以表达这些CAR的免疫效应细胞，诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开了使用所公开的抗体和免疫效应细胞在患有表达CD99的癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法。
抗体
可以用于所公开的组合物和方法中的抗体包括任何种类的全免疫球蛋白(即完整抗体)、其片段以及至少包含抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。可变结构域在抗体之间的序列不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不是通过抗体的可变结构域均匀地分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为互补决定区(CDR)或高变区的片段中。可变结构域中保守性较高的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR区，所述FR区主要采用β-折叠构型，并通过三个CDR连接，所述三个CDR形成连接并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR区紧密结合在一起，并且与另一条链中的CDR一起促进抗体的抗原结合位点的形成。
可以采用在不产生内源性免疫球蛋白的情况下能够在免疫后产生完整人抗体谱系的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失会导致内源性抗体产生的完全抑制。人类种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击后产生人抗体(参见例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-255(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.,7:33(1993))。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991))。Cote等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。
任选地，抗体在其他物种中产生并“人源化”以在人体中施用。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其包含最少的非人免疫球蛋白序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可以包括在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包括至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。
人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
还公开了具有生物活性的抗体的片段。所述片段无论是否与其他序列连接都包括特定区或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，条件是所述片段的活性与未经修饰的抗体或抗体片段相比没有显著更改或受损。
技术也可以适用于产生对本公开的抗原蛋白特异的单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。可以通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起来创建单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。已开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端经由15至25个氨基酸肽或接头与另一个可变结构域的N端相连，而不会显著破坏抗原结合或结合的特异性。选择接头以允许重链和轻链以其适当的构象取向结合在一起。
二价单链可变片段(di-scFv)可以通过连接两个scFv进行工程化。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单肽链来完成，从而产生串联scFv。ScFv也可以用接头肽设计，所述接头肽对于两个可变区来说太短而不能折叠在一起(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚。这种类型被称为双抗体。已示出双抗体的解离常数比对应的scFv低40倍，这意味着它们对其靶标具有更高的亲和力。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三抗体或三倍体)的形成。还产生了四抗体。与双抗体相比，它们对靶标的亲和力更高。
设计为选择性结合CD3和CD99的双特异性抗体将触发非特异性T细胞激活和细胞因子风暴。设计为选择性结合CD3和CD99的双特异性双抗体的分子量(55-60kD)小于肾脏清除阈值，这将导致快速清除。因此，双抗体必须通过连续输注施用。所公开的四价双特异性抗体的分子量(例如，105-110kD)可以大于具有明显延长的PK的肾脏滤过阈值。
提供能够形成多价工程抗体的融合多肽，所述工程抗体能够与T细胞结合以破坏表达CD99的恶性细胞。所述工程抗体可以包括例如至少一个scFv、至少一个Fab片段、至少一个Fv片段等。它可以是二价、三价、四价等。多价抗体是多特异性的，例如双特异性的、三特异性的、四特异性的等。多价抗体可以是任何形式，诸如双抗体、三抗体、四抗体等。
可以仅使用抗体可变结构域来构建二价和双特异性抗体。一种相当有效且相对简单的方法是使VH和VL结构域之间的接头序列过短，以使得它们无法折叠并彼此结合。将接头长度减少到3-12个残基防止了scFv分子的单体构型，并有利于分子间VH-VL配对，形成60kDa的非共价scFv二聚体“双抗体”。双抗体形式也可用于产生重组双特异性抗体，其通过两个单链融合产物的非共价结合而获得，所述两个单链融合产物由一个抗体的VH结构域通过短接头与另一个抗体的VL结构域连接组成。将接头长度进一步减少到少于三个残基可导致三聚体(“三抗体”，约90kDa)或四聚体(“四抗体”，约120kDa)的形成。关于工程抗体，特别是单结构域片段的综述，参见Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136。所有此类工程抗体都可以用于本文提供的融合多肽中。可以基本上如WO1999057150A3或US20060233787中所述制备四价
Figure GDA0002685031870000251
所述文献出于教示制备
Figure GDA0002685031870000252
分子的方法的目的通过引用并入。
工程抗体的抗原识别位点或整个可变区可以源自针对任何目的抗原(例如，CD99)的一种或多种亲本抗体。亲本抗体可以包括天然存在的抗体或抗体片段、从天然存在的抗体改编的抗体或抗体片段、使用已知具有目的抗原特异性的抗体或抗体片段的序列从头构建的抗体。可以源自亲本抗体的序列包括重链和/或轻链可变区和/或CDR、框架区或其其他部分。
多价、多特异性抗体可以包含包括两个或更多个可变区的重链和/或包括一个或更多个可变区的轻链，其中可变区中的至少两个识别相同抗原上的不同表位。
可以使用多种已知测定法来筛选包括在融合多肽中的候选工程抗体或融合多肽本身的活性。例如，用于确定结合特异性的筛选测定法是本领域众所周知的和常规实践的。有关此类测定法的全面讨论，参见Harlow等人(编)，《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL)；冷泉港实验室；冷泉港，纽约，1988年，第6章。
药物组合物
还公开了一种在药学上可接受的载体中包括所公开的分子的药物组合物。药物载体是本领域技术人员已知的。这些药物载体最典型地将是用于向人施用药物的标准载体，包括诸如无菌水、盐水的溶液以及在生理pH下的缓冲溶液。例如，合适的载体及其制剂描述于雷明顿的《药学科学与实践》(Science and Practice of Pharmacy)(第21版)，PP.Gerbino、Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城，2005年。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，更优选为约7至约7.5。溶液应不含RNAse。其他载体包括持续释放制剂，诸如包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈定型制品的形式，例如膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。
药物组合物除了选择的分子外，还可以包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油，诸如橄榄油，以及可注射有机酯，诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
组合物中的一些可以以药学上可接受的酸或碱加成盐的形式施用，所述酸或碱加成盐是通过与无机酸(诸如，盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)反应或通过与无机碱(诸如，氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(诸如，单、二、三烷基和芳基胺以及取代的乙醇胺)反应形成。
治疗方法
还公开了一种通过向受试者施用治疗有效量的所公开的药物组合物来治疗受试者中表达CD99的癌症的方法。所述方法还可以包括向受试者施用化学疗法，诸如氟达拉滨、阿糖胞苷、环磷酰胺、伊达比星、柔红霉素，或靶向抑制剂，诸如茵布鲁伏、米多骨蛋白、依德利西伯，或免疫试剂，诸如PD1或PDL1抑制剂。
所公开的组合物，包括药物组合物，可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。例如，所公开的组合物可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮施用。所述组合物可以口服、肠胃外(例如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮、体外、眼部、阴道、直肠、鼻内、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入施用。
组合物的肠胃外施用(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以以常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适于在注射前将悬浮在液体中的溶液的固体形式，或者可以是乳液。肠胃外施用的修订方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统，以便维持恒定剂量。
本文所公开的组合物可以预防性地施用于具有表达CD99的癌症风险的患者或受试者。因此，所述方法还可以包括在施用本文所公开的组合物之前鉴定具有表达CD99的癌症风险的受试者。
所需组合物的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的种类、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性疾病的严重程度、所使用的特定核酸或运载体、其施用方式等等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，给定本文的教示，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定适当的量。例如，可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。施用组合物的剂量范围足够大以产生希望的影响症状病症的效果。剂量不应太大而引起不利的副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病状、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在有禁忌症的情况下，剂量可由个体医师调整。剂量可以变化，并且可以以每日一次或多次剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到适当剂量的指南。单独使用所公开的组合物的典型日剂量可以为约1μg/kg体重/天至至多100mg/kg体重/天或更多，这取决于上述因素。
在一些实施例中，以相当于约0.1ng至约100g/kg体重、约10ng至约50g/kg体重、约100ng至约1g/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1mg至约500mg/kg体重；以及约1mg至约50mg/kg体重的肠胃外施用的剂量施用分子。替代地，经施用以达到治疗有效剂量的包含来那度胺的分子的量为约0.1ng、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg/kg体重或更大。
CD99特异性嵌合抗原受体(CAR)
CAR通常并有来自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)的抗原识别结构域，所述单克隆抗体具有涉及淋巴细胞激活的跨膜信号传导基序(Sadelain M等人，Nat RevCancer 2003 3:35–45)。本文公开了一种CD99特异性嵌合抗原受体(CAR)，其可以在免疫效应细胞中表达以增强针对CD99特异性CAR的抗肿瘤活性。
所公开的CAR通常由三个结构域组成：胞外结构域、跨膜结构域和内结构域。胞外结构域包括CD99结合区并负责抗原识别。它还任选地包含信号肽(SP)，以便CAR可以被糖基化并锚定在免疫效应细胞的细胞膜中。跨膜结构域(TD)顾名思义将胞外结构域连接到内结构域，并在细胞表达时位于细胞膜内。内结构域是CAR的在抗原识别后将激活信号传输到免疫效应细胞的工作端。例如，内结构域可以包含信号传导结构域(ISD)和共刺激信号传导区(CSR)。
“信号传导结构域(SD)”通常包含当ITAM被磷酸化时激活信号传导级联的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。术语“共刺激信号传导区(CSR)”是指来自共刺激蛋白受体(诸如CD28、41BB和ICOS)的细胞内信号传导结构域，其能够增强T细胞受体对T细胞的激活。
在一些实施例中，内结构域包含SD或CSR，但不包含两者。在这些实施例中，仅在包含缺失结构域的另一CAR(或T细胞受体)也结合其各自的抗原的情况下，才激活包含所公开的CAR的免疫效应细胞。
在一些实施例中，所公开的CAR由下式定义：
SP–CD99–HG–TM–CSR–SD；或
SP–CD99–HG–TM–SD–CSR；
其中“SP”代表任选的信号肽，
其中“CD99”代表CD99结合区，
其中“HG”代表任选的铰链结构域，
其中“TM”代表跨膜结构域，
其中“CSR”代表有一个或多个共刺激信号传导区，
其中“SD”代表信号传导结构域，且
其中“–”代表肽键或接头。
另外的CAR构建体描述于例如Fresnak AD等人的《工程T细胞：癌症免疫疗法的前景和挑战》(Engineered T cells:the promise and challenges of cancerimmunotherapy)，Nat Rev Cancer.2016Aug23；16(9):566-81中，所述文献的全部内容出于教示这些CAR模型的目的通过引用并入。
例如，CAR可以是TRUCK、通用CAR、自驱动CAR、装甲CAR、自毁CAR、条件性CAR、标记CAR、TanCAR、双CAR或sCAR。
TRUCK(通用细胞因子杀伤重定向T细胞)共表达嵌合抗原受体(CAR)和抗肿瘤细胞因子。细胞因子表达可以是组成性的或由T细胞激活诱导的。以CAR特异性为靶标，促炎性细胞因子的局部产生将内源性免疫细胞招募到肿瘤位点，并且可以增强抗肿瘤应答。
通用的同种异体CAR T细胞经工程化，不再表达内源性T细胞受体(TCR)和/或主要组织相容性复合体(MHC)分子，从而分别防止移植物抗宿主病(GVHD)或排斥。
自驱动CAR共表达CAR和趋化因子受体，所述趋化因子受体与肿瘤配体结合，从而增强肿瘤归巢。
经工程化以抵抗免疫抑制的CAR T细胞(装甲CAR)可以进行基因修饰，以不再通过免疫检查点转换受体表达各种免疫检查点分子(例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD1))，或者可以与阻断免疫检查点信号传导的单克隆抗体一起施用。
可以使用通过电穿孔递送的RNA来设计自毁CAR以编码CAR。替代地，可以基于更昔洛韦与基因修饰的淋巴细胞中的胸苷激酶结合或更近期描述的通过小分子二聚体激活人胱天蛋白酶9的系统来实现T细胞的诱导性凋亡。
默认情况下，条件性CAR T细胞无反应或‘关闭’，直到添加小分子以完成回路，从而能够完全转导信号1和信号2两者，从而激活CAR T细胞。替代地，T细胞可以经工程化以表达对后续在靶抗原处施用的二级抗体具有亲和力的衔接子特异性受体。
标记CAR T细胞表达CAR加与现有单克隆抗体结合的肿瘤表位。在无法忍受的不良反应的情况中，单克隆抗体的施用清除了CAR T细胞并缓解了症状，而无其他肿瘤外效应。
串联CAR(TanCAR)T细胞表达由两个连接的单链可变片段(scFv)组成的单个CAR，所述片段具有与细胞内共刺激结构域和CD3ζ结构域融合的不同亲和力。仅当靶细胞共表达两个靶标时，才实现TanCAR T细胞激活。
双CAR T细胞表达两个具有不同配体结合靶标的单独CAR；一个CAR仅包括CD3ζ结构域，而另一CAR仅包括共刺激结构域。双CAR T细胞激活需要共表达肿瘤上的两个靶标。
安全CAR(sCAR)由融合至细胞内抑制结构域的细胞外scFv组成。共表达标准CAR的sCAR T细胞只有在遇到具有标准CAR靶标但缺少sCAR靶标的靶细胞时才被激活。
所公开的CAR的抗原识别结构域通常是scFv。然而，具有很多替代方案。已经描述了来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域，所述抗原识别结构域具有简单的胞外结构域(例如，CD4胞外结构域，以识别感染HIV的细胞)和更特殊的识别组分，诸如连接的细胞因子(促使识别带有细胞因子受体的细胞)。实际上，几乎以高亲和力与给定靶标结合的任何物都可以用作抗原识别区。
内结构域是CAR的工作端，在抗原识别后，所述工作端将信号传输到免疫效应细胞，从而激活免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，所述内结构域可以包括T细胞受体(TCR)和任选的共受体的“细胞内信号传导结构域”。尽管通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分来说，只要其转导效应子功能信号，就可以使用所述截短部分代替完整链。
调节以刺激方式起作用的TCR复合体的初次激活的细胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。包含ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括源自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的序列。
在特定实施例中，细胞内信号传导结构域源自CD3 zeta(CD3ζ)(TCR zeta，基因库登陆号BAG36664.1)。T细胞表面糖蛋白CD3 Zeta(CD3ζ)链，也称为T细胞受体T3 Zeta链或CD247(分化簇247)，是在人体中由CD247基因编码的蛋白质。
第一代CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，所述细胞内结构域是来自内源性TCR的信号的主要传输者。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体的细胞内信号传导结构域(例如，CD28、41BB，ICOS)添加到CAR的内结构域，以向T细胞提供其他信号。临床前研究表明，第二代CAR设计改善了T细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代CAR结合了多个信号传导结构域，以进一步增强效能。移植有这些CAR的T细胞表现出改善的扩增、激活、持久性和根除肿瘤的效率，而与共刺激受体/配体的相互作用无关(Imai C等人，Leukemia2004 18:676–84；Maher J等人，Nat Biotechnol 2002 20:70–5)。
例如，可以将CAR的内结构域设计成单独包括CD3ζ信号传导结构域，或者与在本发明的CAR的背景下有用的任何其他所需的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞有效应答抗原所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3和NKG2D特异性结合的配体。因此，虽然CAR主要以CD28作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件可以单独使用或与其他共刺激信号传导元件组合使用。
在一些实施例中，CAR包括铰链序列。铰链序列是促进抗体柔性的氨基酸的短序列(参见，例如Woof等人，Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可以位于抗原识别部分(例如，抗CD99 scFv)与跨膜结构域之间。铰链序列可以是源自任何合适的分子或从任何合适的分子获得的任何合适的序列。在一些实施例中，例如，铰链序列源自CD8a分子或CD28分子。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自(即至少包括以下的跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR和PAG/Cbp。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包括疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些情况下，在合成的跨膜结构域的每个末端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。短的寡肽或多肽接头，诸如长度在2至10个氨基酸之间，可以形成CAR的跨膜结构域与内质结构域之间的连接。
在一些实施例中，CAR具有多于一个的跨膜结构域，其可以是相同跨膜结构域的重复，或者可以是不同的跨膜结构域。
在一些实施例中，CAR是多链CAR，如WO2015/039523中所述，所述文献处于此种教示目的通过引用并入。多链CAR可以在不同的跨膜多肽中包括分开的细胞外配体结合和信号传导结构域。信号传导结构域可以设计成在近膜位置组装，以形成更接近天然受体的柔性结构，从而赋予最佳的信号转导。例如，多链CAR可以包括FCERIα链的一部分和FCERIβ链的一部分，使得FCERI链自发地二聚在一起，以形成CAR。
下表1、2和3提供了可能在所公开的CAR中出现的CD99结合区、共刺激信号传导区和细胞内信号传导结构域的一些实例组合。
表1.第一代CAR
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表3.第三代CAR
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在一些实施例中，抗CD99结合剂是单链可变片段(scFv)抗体。抗CD99 scFv的亲和力/特异性在很大程度上由重(VH)和轻(VL)链中的互补决定区(CDR)内的特异序列驱动。每个VH和VL序列将具有三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)。
在一些实施例中，抗CD99结合剂源自天然抗体，诸如单克隆抗体。在一些情况下，抗体是人源抗体。在一些情况下，当施用于人类时，抗体经历改变，以使其免疫原性降低。例如，改变包括选自由嵌合、人源化、CDR移植、脱免疫和框架氨基酸突变组成的组以对应于最接近的人种系序列的一种或多种技术。
还公开了靶向CD99和至少一种附加肿瘤抗原的双特异性CAR。还公开了被设计成仅与结合不同抗原(诸如肿瘤抗原)的另一CAR联合作用的CAR。例如，在这些实施例中，所公开CAR的内结构域可以仅包含信号传导结构域(SD)或共刺激信号传导区(CSR)，而不同时包含两者。如果第二CAR(或内源性T细胞)被激活，则其会提供缺失信号。例如，如果所公开CAR包含SD但不包含CSR，则只有在包含CSR的另一CAR(或T细胞)结合其相应抗原的情况下才激活包含此CAR的免疫效应细胞。类似地，如果所公开CAR包含CSR但不包含SD，则只有在包含SD的另一个CAR(或T细胞)结合其相应抗原的情况下才激活包含CAR的免疫效应细胞。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引起免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。附加抗原结合结构域可以是肿瘤抗原的抗体或天然配体。其他抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原在本领域中是众所周知的，包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CALX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、cyclin Bl、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、聚唾液酸、PLAC1、RUl、RU2(AS)、肠道羧酸酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、prostase、前列腺特异性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变、Ras突变、gplOO、prostein、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、survivin和端粒酶、legumain、HPV E6,E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、TIM3、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受体、GD2、o-乙酰基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。在优选实施例中，肿瘤抗原选自由叶酸受体(FRa)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、TIM3、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUCl、HER2及其任何组合组成的组。
肿瘤抗原的非限制性实例包括以下各项：分化抗原，诸如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多向抗原，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过表达的胚胎抗原，诸如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如Epstein-Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他较大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2结合蛋白质\环孢素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6以及MET。
核酸和运载体
还公开了编码所公开的CD99特异性CAR的多核苷酸和多核苷酸运载体，其允许在公开的免疫效应细胞中表达CD99特异性CAR。
编码所公开的CAR及其区的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，所述方法例如像通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括所述基因的运载体中衍生基因，或者通过使用标准技术来直接从包含所述基因的细胞和组织分离。替代地，目的基因可以合成产生，而非克隆产生。
编码CAR的核酸的表达通常通过将编码CAR多肽的核酸可操作地连接到启动子上，并将构建体并入表达运载体中来实现。典型的克隆运载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节期望核酸序列的表达的启动子。
所公开的核酸可以克隆到多种类型的运载体中。例如，核酸可以克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒的运载体中。特定目的运载体包括表达运载体、复制运载体、探针生成运载体和测序运载体。
此外，表达运载体可以以病毒运载体的形式提供给细胞。病毒运载体技术在本领域中是众所周知的，并且例如在Sambrook等人(2001年，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约)以及其他病毒学和分子生物学手册中予以描述。可用作运载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的运载体包含在至少一个生物体中有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标记。在一些实施例中，多核苷酸运载体是慢病毒或逆转录病毒运载体。
已经开发了多种基于病毒的系统来将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术来将选择的基因插入运载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒，并在体内或体外将其递送至受试者的细胞。
合适的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一实例是伸长生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、MND(骨髓增生性肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
附加的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30至110bp的区，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以使得当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，要导入细胞中的表达运载体也可以包含选择性标记基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒运载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择表达细胞。在其他方面中，选择性标记可以携载在单独的DNA片上并且用于共转染程序。选择性标记和报告基因两者可以用适当的调节序列侧翼化，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因。
报告基因用于鉴定潜在的转染细胞和用于评估调节序列的功能。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不被受体生物体或组织表达且编码多肽的基因，所述多肽的表达通过一些容易检测的特性(例如酶活性)来表现。在将DNA导入受体细胞中后，在合适的时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知的技术制备或商购获得。一般来说，具有示出报告基因的最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并且用以评估试剂调控启动子驱动转录的能力。
将基因导入和表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达运载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将运载体容易地导入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母菌或昆虫细胞。例如，表达运载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
将多核苷酸导入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包括运载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见Sambrook等人(2001年，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约)。
将目的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA运载体的使用。病毒运载体，尤其是逆转录病毒运载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如人细胞)中的最广泛使用的方法。
用于将多核苷酸导入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒剂是脂质体。在另一方面中，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层中，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子附着在脂质体上，被包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或与胶束复合，或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达运载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或以“塌陷”结构呈现。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不一致的聚集体。脂质是脂肪物质，它们可以是天然的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二巯基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从St.Louis,Mo.的Sigma公司获得；二乙酰基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二巯基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc(阿拉巴马州伯明翰)获得。
免疫效应细胞
还公开了经工程化以表达所公开的CAR的免疫效应细胞(本文也称为“CAR-T细胞”)。这些细胞优选地从待治疗的受试者获得(即是自体的)。然而，在一些实施例中，使用免疫效应细胞系或供体效应细胞(同种异体)。免疫效应细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。免疫效应细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术(诸如FicollTM分离)来从采集自受试者的血液中获得。例如，来自个体循环血液中的细胞可以通过单采获得。在一些实施例中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离免疫效应细胞。免疫效应细胞的特定亚群可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，可以使用针对阳性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合，例如通过与抗体缀合珠一起孵育足以阳性选择期望免疫效应细胞的时间来分离免疫效应细胞。替代地，免疫效应细胞群体的富集可以通过使用针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合进行阴性选择来完成。
在一些实施例中，免疫效应细胞包括参与使身体抵御传染性疾病和外来物质的任何白细胞。例如，免疫效应细胞可以包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合。例如，免疫效应细胞可以包括T淋巴细胞。
T细胞或T淋巴细胞可以通过细胞表面上是否存在T细胞受体(TCR)来与其他淋巴细胞(诸如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开来。它们被称为T细胞，因为它们在胸腺中成熟(尽管有些也在扁桃体中成熟)。T细胞有几种亚群，每个亚群各自具有不同的功能。
辅助性T细胞(TH细胞)在免疫过程中辅助其他白细胞，包括辅助B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及辅助细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4糖蛋白。当MHC II类分子通过肽抗原呈递辅助性T细胞时，辅助性T细胞被激活，所述MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌称为调节或协助主动免疫应答的细胞因子的小蛋白质。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH，它们分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面处表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合存在于全部有核细胞表面的与MHC I类分子相关的抗原来识别它们的靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，CD8+细胞可以被灭活至无反应状态，从而预防自身免疫性疾病。
记忆T细胞是抗原特异性T细胞的亚群，它们在感染消退后会长期存在。当再次暴露于其同源抗原时，它们会迅速扩展成大量效应T细胞，从而为免疫系统提供对过去感染的“记忆”。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制胸腺中逃避阴性选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了CD4+Treg细胞的两个主要类别——天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
自然杀伤T(NKT)细胞(勿与自然杀伤(NK)细胞混淆)桥接适应性免疫系统与先天免疫系统。与识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。
在一些实施例中，T细胞包括CD4+细胞的混合物。在其他实施例中，基于细胞表面表达，T细胞富集一个或多个亚群。例如，在一些情况下，T包括是细胞毒性CD8+T淋巴细胞。在一些实施例中，T细胞包括具有不同的T细胞受体(TCR)的γδT细胞，所述受体具有一个γ链和一个δ链而非α链和β链。
自然杀伤(NK)细胞是可以杀死病毒感染和转化细胞的CD56+CD3-大颗粒淋巴细胞，并且构成先天免疫系统的重要细胞亚群(Godfrey J等人，Leuk Lymphoma 2012 53:1666–1676)。与细胞毒性CD8+T淋巴细胞不同，NK细胞不需要预先致敏就能对肿瘤细胞产生细胞毒性，并且还能根除MHC-I-阴性细胞(Narni-Mancinelli E等人，Int Immunol 2011 23:427–431)。NK细胞是更安全的效应细胞，因为它们可以避免细胞因子风暴(Morgan RA等人，Mol Ther 2010 18:843–851)、肿瘤溶解综合征(Porter DL等人，N Engl J Med 2011 365:725–733)和靶向、非肿瘤效应的潜在致命性并发症。尽管众所周知NK细胞具有杀死癌细胞的作用，并且已广泛地证明NK细胞损伤对MM的发展至关重要(Godfrey J等人，LeukLymphoma 2012 53:1666–1676；Fauriat C等人，Leukemia 2006 20:732–733)，但是在所公开的CAR之前，增强NK细胞介导的抗MM活性的方法在很大程度上还未被探索。
Epstein-Barr病毒(EBV)诱导的淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)是异基因造血细胞移植(HCT)接受者发病率和死亡率的重要原因，特别是那些已接受某些T细胞反应性Ab以预防或治疗GVHD的接受者。通过过继转移EBV特异性T细胞的预防和治疗以及随后针对EBV相关淋巴细胞增殖的免疫的长期恢复，已为处理这种完全致命的骨髓转移并发症提供了积极的结果。因此，在一些实施例中，所公开的免疫效应细胞是同种异体或自体的EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。例如，这可能涉及从自体或同种异体供体分离PBMC，并通过单核细胞和NK细胞的消耗而使其富集T细胞。例如，供体可以是EBV血清阳性供体。然后可以用自体EBV血清阳性或转化的淋巴细胞刺激这些T细胞。EBV抗原包括潜伏膜蛋白(LMP)和EBV核抗原(EBNA)蛋白，诸如LMP-1、LMP-2A、LMP-2B和EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C和EBNA-LP。这些方法描述于例如Barker等人，Blood 2010 116(23):5045-49；Doubrovina等人，Blood 2012 119(11):2644-56；Koehne等人Blood 2002 99(5):1730-40；和Smith等人，Cancer Res 2012 72(5):1116-25中，所述文献出于这些教示的目的通过引用并入。
治疗方法
表达所公开的CAR的免疫效应细胞可以引发针对表达CD99的癌细胞的抗肿瘤免疫应答。由所公开的CAR修饰的免疫效应细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继免疫疗法的一部分，在过继免疫疗法中CAR修饰的免疫效应细胞诱导对CD99特异的免疫应答。
表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的过继转移是有前景的抗癌治疗剂。在收集患者的免疫效应细胞后，可以对细胞进行基因工程化以表达所公开的CD99特异性CAR，然后将所述细胞输注回患者体内。
所公开的CAR修饰的免疫效应细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或其他组分诸如IL-2、IL-15或其他细胞因子或细胞群体组合施用。简而言之，药物组合物可以包括本文所述的靶细胞群体，以及与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在一些实施例中，用于所公开的方法的组合物被配制用于静脉施用。药物组合物可以以任何适当治疗MM的方式施用。施用的数量和频率将由患者的状况和患者疾病的严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可以由临床试验决定。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异来确定本发明组合物的精确施用量。可以概括地说，可以以104至109个细胞/kg体重，诸如105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用包括本文所述T细胞的药物组合物。T细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病症状并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施例中，可能需要为受试者施用激活的T细胞，然后随后再抽取血液(或进行单采)，根据所公开的方法从中激活T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞回输给患者。此过程可以每隔几周进行多次。在某些实施例中，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些实施例中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。使用此多次抽血/多次回输方案可以用来选择特定的T细胞群体。
所公开的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括注射、输血或植入。本文所述的组合物可通过皮下、皮内、瘤内、鼻内、髓内、肌内、静脉内(静脉内)方式注射或腹膜内施用给患者。在一些实施例中，所公开的组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。在一些实施例中，所公开的组合物通过静脉注射施用。组合物也可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在某些实施例中，将所公开的CAR修饰的免疫效应细胞与任何数量的相关治疗模式一起(例如，在此之前、同时或之后)施用给患者，包括但不限于沙利度胺、地塞米松、硼替佐米和来那度胺。在其他实施例中，CAR修饰的免疫效应细胞可以与化疗剂、放疗剂、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消融剂(诸如CAM PATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射组合使用。在一些实施例中，使用化疗剂(诸如氟达拉滨)、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合骨髓移植、T细胞消融疗法(例如，在此之前、同时或之后)向患者施用CAR修饰的免疫效应细胞。在另一实施例中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的试剂，例如Rituxan)后施用。例如，在一些实施例中，受试者可以经历高剂量化学疗法接着外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施例中，在移植后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在附加实施例中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
所公开的方法的癌症可以是受试者中的正在经历的不受控制的生长、侵袭或转移的任何表达CD99的细胞。表达CD99的癌症包括前列腺癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。在Jurkat细胞上也发现了CD99。在某些方面中，癌症是胆囊癌、外分泌腺癌或顶泌腺癌。在一些情况下，癌症包括骨髓增生异常综合征、急性髓细胞白血病或双表型白血病。
在某些方面中，癌症可以是目前对其使用放射疗法的任何赘生物或肿瘤。替代地，癌症可以是使用标准方法对放射疗法不够敏感的赘生物或肿瘤。因此，癌症可以是肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌、母细胞瘤或生殖细胞瘤。所公开的组合物可以用来治疗的癌症的代表性但非限制性列表包括淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、髓样白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌(head and neck cancer)、头颈鳞状细胞癌、肾癌、肺癌(lung cancer)(诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、神经母细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌(prostate cancer)、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、喉、喉头和肺癌、子宫内膜癌、宫颈癌(cervical cancer)、宫颈癌(cervical carcinoma)、乳腺癌、上皮癌、肾脏癌、泌尿生殖癌、肺癌(pulmonary cancer)、食道癌、头颈癌(head andneck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌；睾丸癌；结肠和直肠癌、前列腺癌(prostaticcancer)和胰腺癌。
所公开的CAR可以与具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团组合使用。药物部分包括化疗剂，其可以用作微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂，特别是用于癌症疗法的那些化疗剂。
所公开的CAR可以与检查点抑制剂组合使用。两种已知的抑制性检查点通路涉及通过细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)受体的信号传导。这些蛋白质是CD28-B7共信号传导分子家族的成员，在T细胞功能的所有阶段都发挥重要作用。PD-1受体(也称为CD279)在激活的T细胞的表面表达。它的配体，PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在诸如树突状细胞或巨噬细胞的APC的表面表达。PD-L1是主要的配体，而PD-L2具有更受限制的表达模式。当配体与PD-1结合时，抑制信号被传递到T细胞，这减少了细胞因子的产生并抑制了T细胞的增殖。检查点抑制剂包括但不限于阻断PD-1(纳武单抗(BMS-936558或MDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHIgM12B7)、CTLA-4(艾匹利木单抗(MDX-010)、曲美利木单抗(CP-675,206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)的抗体。
美国专利号8,008,449中描述了抗程序性死亡1(PD-1)的人单克隆抗体和单独使用或与其他免疫疗法组合使用抗PD-1抗体治疗癌症的方法，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。美国专利号8,552,154号描述了抗PD-L1抗体及其用途，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。美国专利号8,617,546中描述了包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。
在一些实施例中，PDL1抑制剂包括特异性结合PDL1的抗体，诸如BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)或MPDL3280A(Roche)。在一些实施例中，PD1抑制剂包括特异性结合PD1的抗体，诸如派姆单抗(Merck)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)或MEDI4736(AstraZeneca)。美国专利号8,008,449中描述了抗PD-1的人单克隆抗体和单独使用或与其他免疫疗法组合使用抗PD-1抗体治疗癌症的方法，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。美国专利号8,552,154号描述了抗PD-L1抗体及其用途，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。美国专利号8,617,546中描述了包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂，所述专利出于这些抗体的目的通过引用并入。
所公开的CAR可以与其他癌症免疫疗法组合使用。存在两种不同类型的免疫疗法：被动免疫疗法使用免疫系统的组分来指导针对癌细胞的靶向细胞毒性活性，而不必在患者中引发免疫应答，而主动免疫疗法主动触发内源性免疫应答。被动策略包括使用由B细胞应答特定抗原而产生的单克隆抗体(mAb)。杂交瘤技术在20世纪70年代的发展以及肿瘤特异性抗原的鉴定使得能够开发出可以特异性地靶向肿瘤细胞以被免疫系统破坏的mAb的药物。迄今为止，mAb是免疫疗法最大的成功案例；2012年最畅销的三大抗癌药物是mAb。其中包括利妥昔单抗(Rituxan，Genentech)，其与CD20蛋白结合，所述CD20蛋白在B细胞恶性肿瘤诸如非霍奇金淋巴瘤(NHL)的表面高度表达。利妥昔单抗被FDA批准用于治疗NHL和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及化学疗法。另一重要的mAb是曲妥珠单抗(Herceptin；Genentech)，其通过靶向HER2的表达而彻底改变了HER2(人表皮生长因子受体2)阳性乳腺癌的治疗方法。
产生最佳的“杀伤”CD8 T细胞应答还需要T细胞受体激活加上共刺激，这可以通过连接肿瘤坏死因子受体家族成员(包括OX40(CD134)和4-1BB(CD137))来提供。OX40特别有意义，因为用激活(激动剂)抗OX40 mAb进行治疗增强了T细胞分化和细胞溶解功能，从而增强了针对各种肿瘤的抗肿瘤免疫。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自抗代谢物，诸如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、癸基嘧啶、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自烷化剂，诸如甲氯雷他敏、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴嗪、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物，诸如卡铂。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自抗有丝分裂剂，诸如紫杉烷，例如多西他赛和紫杉醇，以及长春花生物碱，例如长春地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自拓扑异构酶抑制剂，诸如拓扑替康或伊立替康，或者细胞抑制药物，诸如依托泊苷和替尼泊苷。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自生长因子抑制剂，诸如ErbBl(EGFR)的抑制剂(诸如EGFR抗体，例如扎鲁图单抗、西妥昔单抗、帕尼图单抗或尼妥珠单抗或其他EGFR抑制剂，诸如吉非替尼或厄洛替尼)、ErbB2(HER2/neu)的另一抑制剂(诸如HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM l或培图珠单抗)或EGFR和HER2二者的抑制剂，诸如拉帕替尼)。
在一些实施例中，此附加治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂，诸如伊马替尼(Glivec，Gleevec STI571)或拉帕替尼。
因此，在一些实施例中，所公开的抗体与奥法木单抗、扎木单抗、达雷木单抗、雷珠单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、hu806、达利珠单抗(Zenapax)、巴利昔单抗(Simulect)、阿达木单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、那他利珠单抗(Tysabri)、奥马珠单抗(Xolair)、依法利珠单抗(Raptiva)和/或利妥昔单抗组合使用。
在一些实施例中，与用于治疗上述疾病的CAR组合使用的治疗剂可以是抗癌细胞因子、趋化因子或其组合。合适的细胞因子和生长因子的实例包括IFNy、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa(例如，INFa2b)、IFN、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、安塞司亭和TNFa。合适的趋化因子可以包括Glu-Leu-Arg(ELR)-阴性趋化因子，诸如来自人CXC和C-C趋化因子家族的IP-10、MCP-3、MIG和SDF-la。合适的细胞因子包括细胞因子衍生物、细胞因子变体、细胞因子片段和细胞因子融合蛋白。
在一些实施例中，与用于治疗上述疾病的CAR组合使用的治疗剂可以是细胞周期控制/凋亡调节剂(regulator)(或“调节剂(regulating agent)”)。细胞周期控制/细胞凋亡调节剂可以包括靶向和调控细胞周期控制/细胞凋亡调节剂的分子，诸如(i)cdc-25(诸如NSC 663284)，(ii)过刺激细胞周期的细胞周期蛋白依赖性激酶(诸如黄嘌呤核苷(L868275，HMR1275)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01，KW-2401)和roscovitine(R-roscovitine，CYC202)、以及(iii)端粒酶调控剂(诸如BIBR1532、SOT-095、GRN163和例如US6,440,735和US 6,713,055中描述的组合物)。干扰凋亡通路的分子的非限制性实例包括TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)/凋亡-2配体(Apo-2L)、激活TRAIL受体的抗体、IFN和反义Bcl-2。
在一些实施例中，与用于治疗上述疾病的CAR组合使用的治疗剂可以是激素调节剂，诸如用于抗雄激素和抗雌激素疗法的试剂。这种激素调节剂的实例是他莫昔芬、伊多昔芬、氟维司群、羟洛昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、己烯雌酚、乙炔雌二醇/炔雌醇、抗雄激素(诸如氟他胺/尤乐欣)、孕激素(诸如羟孕酮、甲羟孕酮/普维拉、甲地孕酮/美格司他)、肾上腺皮质类固醇(诸如氢化可的松、泼尼松)、促黄体生成激素释放激素(及其类似物和其他LHRH激动剂，诸如布舍瑞林和戈舍瑞林)、芳香酶抑制剂(诸如阿那曲唑/阿立米得、氨基谷酰胺/胞苷、依西美坦)或激素抑制剂(诸如奥曲肽/善得定)。
在一些实施例中，与用于治疗上述疾病的CAR组合使用的治疗剂可以是抗癌核酸或抗癌抑制性RNA分子。
如上所述，组合施用可以是同时施用、单独施用或依次施用。对于同时施用，视情况而定，试剂可以作为一种组合物或单独的组合物施用。
在一些实施例中，所公开的CAR与放射疗法组合施用。放射疗法可以包括向患者提供放射或放射性药物的相关施用。放射源可以在被治疗的患者的外部或内部(放射治疗可以是例如外束放射疗法(EBRT)或近距离放射疗法(BT)的形式)。可用于实践这种方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘化物-123、碘化物-131和铟-111。
在一些实施例中，所公开的CAR与外科手术组合施用。
CAR-T细胞可以通过多种方式设计，以增强肿瘤细胞毒性和特异性、规避肿瘤免疫抑制、避免宿主排斥，并延长其治疗半衰期。TRUCK(通用细胞因子杀伤重定向T细胞)T细胞例如具有CAR，但也经工程化以释放促进肿瘤杀伤的细胞因子，诸如IL-12。因为这些细胞被设计成一旦被定位在肿瘤环境中，就能在激活CAR时释放分子有效载荷，所以这些CAR-T细胞有时也被称为‘装甲CAR’。作为癌症疗法的几种细胞因子正在进行临床前和临床研究，并且当类似地并入到CAR-T疗法的TRUCK形式中时，也可以被证明是有用的。其中包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、M-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TRAIL、FLT3配体、淋巴细胞趋化因子和TGF-β(Dranoff 2004)。“自驱动”或“归巢”的CAR-T细胞经工程化以表达除其CAR外的趋化因子受体。由于某些趋化因子可以在肿瘤中上调，因此趋化因子受体的并入有助于肿瘤向过继性T细胞运输并被过继性T细胞浸润，从而增强CAR-T的特异性和功能性(Moon 2011)。通用CAR-T细胞也具有CAR，但它们经工程化以使得不表达内源性TCR(T细胞受体)或MHC(主要组织相容性复合体)蛋白。从过继性T细胞疗法的信号传导谱系中去除这两种蛋白质，可以分别防止移植物抗宿主病和排斥。装甲CAR-T细胞因其规避肿瘤免疫抑制和肿瘤诱导的CAR-T功能减退的能力而得名。这些特定CAR-T拥有CAR，并且可以经工程化以免表达检查点抑制剂。替代地，这些CAR-T可以与阻断检查点信号传导的单克隆抗体(mAb)共同施用。施用抗PDL1抗体显著恢复了CAR TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的杀伤能力。虽然已经研究了PD1-PDL1和CTLA-4-CD80/CD86信号传导通路，但是在装甲CAR-T的设计中有可能靶向其他免疫检查点信号传导分子，包括LAG-3、Tim-3、IDO-1、2B4和KIR。TIL的其他细胞内抑制剂包括磷酸酶(SHP1)、泛素连接酶(即cbl-b)和激酶(即二酰基甘油激酶)。装甲CAR-T还可以经工程化以表达蛋白质或受体，保护他们免受或使他们抵抗肿瘤分泌细胞因子的影响。例如，用双阴性形式的TGF-β受体转导的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)对由淋巴瘤分泌的TGF-β产生的免疫抑制具有抗性。与对照细胞相比，这些转导细胞示出显著增加的体内抗肿瘤活性。
串联和双CAR-T细胞的独特之处在于它们具有两个不同的抗原结合结构域。串联CAR包含两个面向与细胞内共刺激和刺激结构域相连的细胞外环境的连续抗原结合结构域。双CAR经工程化以使得一个细胞外抗原结合结构域连接到细胞内共刺激结构域，且第二不同的细胞外抗原结合结构域连接到细胞内刺激结构域。因为刺激和共刺激结构域在两个单独的抗原结合结构域之间分裂，所以双CAR也被称为“分裂CAR”。在串联和双CAR设计两者中，两个抗原结合结构域的结合对于允许在T细胞中信号传导CAR回路是必需的。因为这两种CAR设计对不同的、区别的抗原具有结合亲和力，所以它们也被称为“双特异性”CAR。
作为“活疗法”的一种形式，CAR-T细胞的一个主要问题是它们在体内的可操作性及其潜在的免疫刺激副作用。为了更好地控制CAR-T疗法并防止不必要的副作用，已经对多种特征进行工程化，包括关闭开关、安全机制和条件控制机制。例如，自毁和标记/标注的CAR-T细胞都经工程化以具有“关闭开关”，以促进表达CAR的T细胞的清除。自毁CAR-T包含CAR，但也经工程化以表达在施用外源分子时可诱导的促凋亡自杀基因或“消除基因”。多种自杀基因可用于此目的，包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、Fas、iCasp9(诱导型半胱天冬酶9)、CD20、MYC TAG和截短的EGFR(内皮生长因子受体)。例如，HSK将把前药更昔洛韦(GCV)转化为GCV-三磷酸酯，所述GCV-三磷酸酯自身并入到复制DNA中，最终导致细胞死亡。iCasp9是一种嵌合蛋白，包含FK506结合蛋白的组分，所述组分与小分子AP1903结合，从而导致caspase 9二聚化和凋亡。然而，标记/标注的CAR-T细胞是既具有CAR又经工程化以表达选择标记的一种细胞。针对此选择标记施用mAb将促进CAR-T细胞的清除。截短的EGFR是抗EGFR mAb的一种此类可靶向抗原，并且西妥昔单抗的施用有助于促进CAR-T细胞的消除。为具有这些特征而创建的CAR也称为sCAR‘可切换CAR’，以及RCAR‘可调节CAR’。被称为“抑制性CAR”(iCAR)的“安全CAR”经工程化以表达两个抗原结合结构域。这些细胞外结构域中的一个针对肿瘤相关抗原，并与细胞内共刺激和刺激结构域结合。然而，第二细胞外抗原结合结构域具有正常组织特异性，并结合到细胞内检查点结构域，诸如CTLA4、PD1或CD45。将多个细胞内抑制结构域并入到iCAR也是可能的。可以提供这些抑制结构域的一些抑制分子包括B7-H1、B7-1、CD160、PIH、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、TIGIT、BTLA、LAIR1和TGFβ-R。在存在正常组织的情况下，刺激此第二抗原结合结构域将有助于抑制CAR。应注意，由于此双抗原特异性，iCAR也呈双特异性CAR-T细胞的形式。安全CAR-T工程化增强了CAR-T细胞对肿瘤组织的特异性，并且在某些正常组织可能表达非常低水平的肿瘤相关抗原(可能导致标准CAR脱靶效应)的情况下是有利的(Morgan 2010)。条件性CAR-T细胞表达与细胞内共刺激结构域和单独的细胞内共刺激因子连接的细胞外抗原结合结构域。共刺激和刺激结构域序列的工程化方式使得当施用外源分子时，所得蛋白质将在细胞内聚集在一起以完成CAR回路。以此方式，CAR-T激活可以被调控，甚至有可能被‘微调’或针对特定患者进行个性化。类似于双CAR设计，当在条件性CAR中不活动时，刺激结构域和共刺激结构域在物理上是分开的；出于这个原因，这些也被称为“分裂CAR”。
在一些实施例中，这些工程化的特征中的两个或更多个可以被组合以创建增强的多功能CAR-T。例如，有可能创建具有也释放如TRUCK的细胞因子的双CAR设计或条件性CAR设计的CAR-T细胞。在一些实施例中，可以制造双条件性CAR-T细胞，使得其表达具有针对两种不同癌症抗原的两个单独的抗原结合结构域的两种CAR，每种抗原与它们的相应共刺激结构域结合。共刺激结构域只有在施用激活分子后才能与刺激结构域一起发挥功能。为了使这种CAR-T细胞有效，癌症必须表达两种癌症抗原，且激活分子必须施用给患者；这种设计从而结合了双CAR T细胞和条件性CAR T细胞两者的特征。
典型地，使用α-βT细胞产生CAR-T细胞，然而也可以使用γ-δT细胞。在一些实施例中，用以产生CAR-T细胞的所描述CAR构建体、结构域和工程化特征可以类似地用于产生其他类型的表达CAR的免疫细胞，包括NK(自然杀伤)细胞、B细胞、肥大细胞、髓样衍生的吞噬细胞和NKT细胞。替代地，可以产生表达CAR的细胞，使其具有T细胞和NK细胞两者的特性。在附加实施例中，用CAR转导的细胞可以是自体的或同种异体的。
可以使用几种不同的CAR表达方法，包括逆转录病毒转导(包括γ-逆转录病毒)、慢病毒转导、转座子/转座酶(Sleeping Beauty和PiggyBac系统)以及信使RNA转移介导的基因表达。同样关于工程化CAR-T细胞的可能性而言，基因编辑(基因插入或基因缺失/破坏)已变得越来越重要。CRISPR-Cas9、ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活因子样效应子核酸酶)系统是可以产生CAR-T细胞的三种潜在方法。
定义
术语“氨基酸序列”是指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或单词的列表。本文中使用的氨基酸缩写是氨基酸的常规单字母代码，表达如下：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。
术语“抗体”是指免疫球蛋白、其保持特异性结合能力的衍生物以及具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的蛋白质。这些蛋白质可能源自天然来源，或部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在示例性实施例中，与本文描述的方法和组合物一起使用的抗体是IgG类别的衍生物。除了完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及选择性结合靶抗原的人或人源化形式的免疫球蛋白分子。
术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。在示例性的实施例中，抗体片段至少保留了全长抗体的特异性结合能力的重要部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv双抗体、Fc和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的分段来以酶的方式或者以化学的方式产生，可以从编码部分抗体序列的基因重组产生，或者可以全部或部分合成产生。抗体片段可以任选地是单链抗体片段。替代地，片段可以包括多个链，所述多个链例如通过二硫键连接在一起。片段也可以任选地是多分子复合体。功能性抗体片段通常将包括至少约50个氨基酸，且更通常将包括至少约200个氨基酸。
术语“抗原结合位点”是指与抗原上的表位特异性结合的抗体区。
术语“适配体”是指与特定靶分子结合的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列库。选择的适配体能够适应独特的三级结构并以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适配体”是通过其构象与靶分子结合并从而抑制或阻止此分子的功能的DNA或RNA寡核酸。核酸适配体可以由DNA、RNA或其组合构成。“肽适配体”是在恒定支架蛋白内插入可变肽序列的组合蛋白分子。肽适配体的鉴定通常在严格的酵母双杂交条件下进行，这增加了选择的肽适配体在细胞内环境中稳定表达并正确折叠的可能性。
术语“载体”是指化合物、组合物、物质或结构，其当与化合物或组合物结合时，出于化合物或组合物的预期用途或目的，帮助或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征。例如，可以选择载体以最小化活性成分的任何降解并且最小化受试者中的任何不利副作用。
术语“嵌合分子”是指通过结合以天然状态分开存在的两个或更多个分子而形成的单个分子。单个嵌合分子具有其所有组成分子的所需功能。嵌合分子的一种类型是融合蛋白。
术语“工程抗体”是指重组分子，其至少包括抗体片段，所述抗体片段包括源自抗体重链和/或轻链可变结构域的抗原结合位点，并且可以任选地包括来自任何Ig类(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的可变和/或恒定结构域的全部或部分。
术语“表位”是指抗体优先和特异性结合的抗原区。单克隆抗体优先结合可以分子定义的分子的单个特定表位。在本发明中，多表位可以被多特异性抗体识别。
术语“融合蛋白”是指一种多肽，其通过借助在一个多肽的氨基端与另一多肽的羧基端之间形成的肽键将两个或更多个多肽连接而形成。融合蛋白可以通过组成多肽的化学偶联而形成，或者可以表达为来自编码单个连续融合蛋白的核酸序列的单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽主链的融合蛋白。可以使用分子生物学中的常规技术来制备融合蛋白，以将框中的两个基因连接成单个核酸，然后在产生融合蛋白的条件下在适当的宿主细胞中表达核酸。
术语“Fab片段”是指包括抗原结合位点的抗体的片段，所述片段是通过用木瓜蛋白酶切割抗体而产生的，所述木瓜蛋白酶在H链间二硫键的N端的铰链区处切割并产生来自抗体分子的两个Fab片段。
术语“F(ab’)2片段”是指包含两个抗原结合位点的抗体的片段，所述片段是通过用胃蛋白酶切割抗体分子而产生的，所述胃蛋白酶在H链间二硫键的C端铰链区处切割。
术语“Fc片段”是指包括其重链的恒定结构域的抗体的片段。
术语“Fv片段”是指包括其重链和轻链的可变结构域的抗体的片段。
“基因构建体”是指核酸，诸如运载体、质粒、病毒基因组等，所述核酸包括多肽的“编码序列”或以其他方式可转录成生物活性RNA(例如，反义、诱饵、核酶等)的核酸，所述核酸可以被转染到细胞中，例如，在某些实施例中，转染到哺乳动物细胞中，并且可能导致编码序列在用构建体转染的细胞中表达。基因构建体可以包括与编码序列以及内含子序列、多腺苷酸化位点、复制起点、标记基因等可操作地连接的一种或多种调节元件。
术语“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较在每个序列中可以用于比较目的比对的位置确定同一性。当比较序列中的一个位置被相同碱基占据时，那么分子在所述位置是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共有的位置上相同或匹配核苷酸的数目的函数。各种比对算法和/或程序可以用于计算两个序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，它们可用作GCG序列分析程序包(威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星州)的一部分，并可以以例如默认设置使用。例如，预期与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性并且优选地表现出基本上相同的功能的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。除非另有说明，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比基于BLASTP阳性得分，而百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”示出高得分序列对中相同的总残基的数量和分数；BLASTP“阳性”示出比对得分具有正值且彼此相似的残基的数量和分数。本公开预期并涵盖与本文所公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中等同一性或相似性程度的氨基酸序列。使用基因密码推导相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规方式获得，具体地通过使用基因密码反向翻译其氨基酸序列获得。
术语“接头”是本领域公认的，并且是指连接两个化合物(诸如两个多肽)的分子或分子组。接头可以由单个连接分子组成，或者可以包括连接分子和间隔子分子，旨在将连接分子和化合物分开特定距离。
术语“多价抗体”是指包括多于一个抗原识别位点的抗体或工程抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相对)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点全部结合相同的表位。“双特异性”抗体具有结合第一表位的至少一个抗原识别位点和结合与第一表位不同的第二表位的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有全部结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一个表位，而一些结合与第一个表位不同的第二个表位。
术语“核酸”是指包括单个核苷酸或两个或更多个核苷酸的天然或合成分子，所述两个或更多个核苷酸通过一个核苷酸的3’位置处的磷酸基团与另一个核苷酸的5’端连接。核酸不受长度限制，因此核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
术语“可操作地连接到”是指核酸与另一核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列是可操作地连接到其他序列的核酸序列的实例。例如，DNA与转录控制元件的可操作连接是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得这种DNA的转录是通过特异性识别、结合并转录DNA的RNA聚合酶从启动子开始的。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可以互换使用，是指包括两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述两个或更多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基连接。
术语“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“多肽片段”或“片段”在用于特定多肽时，是指与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失的多肽，但其余氨基酸序列通常与参考多肽的氨基酸序列相同。这种缺失可以发生在参考多肽的氨基端或羧基端，或替代地两者处。片段的长度通常为至少约5、6、8或10个氨基酸长，至少约14个氨基酸长，至少约20、30、40或50个氨基酸长，至少约75个氨基酸长，或至少约100、150、200、300、500或更多个氨基酸长。片段可以保留参考多肽的一种或多种生物活性。在各种实施例中，片段可以包括参考多肽的酶活性和/或相互作用位点。在另一个实施例中，片段可以具有免疫原性。
术语“蛋白质结构域”是指蛋白质的一部分、蛋白质的多个部分或示出结构完整性的整个蛋白质；此确定可以基于蛋白质的一部分、蛋白质的多个部分或整个蛋白质的氨基酸组成。
术语“单链可变片段或scFv”是指其中重链结构域和轻链结构域连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可以与其他抗体片段(诸如重链或轻链的恒定结构域)连接，以形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。
如本文所用，“间隔子”是指连接包括融合蛋白的蛋白质的肽。通常，间隔子除了连接蛋白质或保持它们之间的一些最小距离或其他空间关系外，没有特定的生物学活性。然而，可以选择间隔子的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
如本文所用，术语“特异性结合”在涉及多肽(包括抗体)或受体时是指结合反应，其决定了蛋白质或多肽或受体在异质蛋白质群体和其他生物制剂中的存在。因此，在指定条件下(例如在抗体情况下的免疫测定条件下)，当指定的配体或抗体与样品中存在的其他蛋白质或与配体或抗体在生物体中可能接触的其他蛋白质不大量结合时，特定的配体或抗体与其特定的“靶标”“特异性结合”(例如抗体与内皮抗原“特异性结合”)。通常，与第二分子“特异性结合”的第一分子与第二分子的亲和力常数(Ka)大于约105M–1(例如，106M–1、107M–1、108M–1、109M–1、1010M–1、1011M–1和1012M–1或更高)。
如本文所用，术语“特异性递送”是指分子与带有特定靶分子或标记物的细胞或组织而非与缺少所述靶分子的细胞或组织的优先结合。当然，已经认识到在分子与非靶细胞或组织之间可能会发生某种程度的非特异性相互作用。然而，可以如通过靶分子的特异性识别介导来区分特异性递送。通常，特异性递送导致递送的分子与带有靶分子的细胞之间的关系比递送的分子与缺乏靶分子的细胞之间的关系强得多。
术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类或动物患者。术语“患者”是指接收临床医生(例如医师)治疗的对象。
术语“治疗有效”是指所用组合物的量具有足以缓解疾病或病症的一种或多种病因或症状的量。这种缓解仅需要减少或改变，而不必消除。
术语“转化”和“转染”意指将核酸，例如表达运载体，导入受体细胞，包括将核酸导入所述细胞的染色体DNA。
术语“治疗”是指旨在治愈、缓解、稳定或预防疾病、病理状况或病症的对患者的医学管理。此术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即针对相关疾病、病理状况或病症的病因移除的治疗。另外，此术语包括姑息治疗，即旨在减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症发展的治疗；和支持治疗，即用于补充另一种针对相关疾病、病理状况或病症改善的特定疗法的治疗。
术语“变体”是指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、在编码氨基酸的每个密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内的取代、添加到肽的C端的氨基酸、与参考序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的肽的氨基酸或肽序列。
术语“运载体”是指能够将已经与运载体序列连接的另一核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达运载体”包括任何运载体(例如，质粒、黏粒或噬菌体染色体)，其包含具有适合于细胞表达的形式(例如，与转录控制元件连接)的基因构建体。
已经描述了本发明的多个实施例。然而，应当理解，可在不脱离本发明的精神和范围的前提下作出各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求书的范围内。
实例
实例1：CD99杂交瘤筛选
EL4-hCD99细胞与来自杂交瘤的抗体/上清液一起孵育。然后将细胞用活死ZombieGreen染料染色，并用F(ab2)抗mIgG-PE染色。使用INTELLICYT高通量筛选器(iQue)评估CD99 PE阳性的细胞。图1包含示出CD99-PE分析中用于活细胞的门的流式细胞图。图2包含示出用于CD99-PE分析的阳性(右)和阴性(左)对照的流式细胞图。左侧直方图是未使用上清液即抗体(abs)的对照样品。右侧直方图是其中使用了PE标记的CD99抗体的阳性对照。门代表CD99-PE阳性群体。图3包含示出CD99阳性的杂交瘤的流式细胞图。直方图底部的数字代表孔/杂交瘤。
对从初级筛选中选择的杂交瘤进行亚克隆。ELISA板在室温下用CD99抗原(Origene，Sku#TP304058，lot##105470)，0.5μg/ml在DPBS(Lonza cat#17-512F，lot#0000615334)中，50μl/孔，包被1小时，然后在室温下用1％BSA/DPBS 100μl/孔阻断1小时。然后将来自单克隆杂交瘤的上清液添加到包被的板中(50μl/孔)。使用山羊抗小鼠Ig-HRP(1010-05)在室温下在50μl/孔的TBST中以1:4000检测抗体，持续40分钟，接着用ABTs/H2O2检测抗体，持续10分钟。表7至表12示出此筛选的结果。
Figure GDA0002685031870001781
Figure GDA0002685031870001791
Figure GDA0002685031870001792
Figure GDA0002685031870001801
Figure GDA0002685031870001802
Figure GDA0002685031870001811
图4包含描绘在ELISA中呈阳性并选择用于IgH/IgL克隆的克隆的图。CD99的克隆1H3 D1为阴性/低。图5包含示出1H3H7、1H3E9、4C5E2、4C5H10、9G12C9和9G12G6的二次筛选的流式细胞图。
使用通过iQUe进行的初次筛选以及通过iQue和ELISA进行的二次筛选，选择产生单克隆CD99抗体的杂交瘤和克隆。将来自二级筛选的单克隆杂交瘤进一步亚克隆，并确定抗体的重链和轻链的基因重排，以设计CD99嵌合抗原受体(CAR)。
除非另有定义，否则本文所用所有技术及科学术语皆具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文所引用的出版物及其所引用的材料通过引用具体地并入。
本领域技术人员仅使用常规实验即可识别或能确定本文所述的本发明具体实施例的许多等效内容。这些等同内容旨在由所附权利要求书涵盖。
序列表
<110> H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, Inc.
<120> 靶向表达CD99的癌症的组合物和方法
<130> 320103-2030
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<151> 2018-04-09
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<151> 2018-11-15
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Arg Ala Thr
20
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Ala
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<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
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<211> 9
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Asp Pro Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gly Leu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 23
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
gaggttcaac tgcaacagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt cgacattaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtga tactagatat 180
gacccggaat tccagggcaa ggcctctcta acagctgaca catcctccaa tacagcctac 240
ctacaattca gcaacctgac atctgaagac actgccgtct attactgtgc tagaagaggc 300
ggcctctcct ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Val Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Phe Leu His Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Phe Cys Val Arg Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<210> 25
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
gaggtgcagc tggaggagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaaggatc attgaaactc 60
tcatgtgccg cctccggttt caccttcaat acctatgcca tgtactgggt ctgccaggct 120
ccaggaaagg gtttgaaatg ggttgctcgc ataagaagta aagttaataa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacagattc accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240
ctctttctgc acatgaacaa cctgaaaact gaggacactg ccatatattt ctgtgtgaga 300
gatcctatgg actactgggg tcaaggaatc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Val Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Phe Leu His Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Phe Cys Val Arg Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
gaggtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaaggatc attgaaactc 60
tcatgtgccg cctccggttt caccttcaat acctatgcca tgtactgggt ctgccaggct 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacgtttact actttctgga tgcagtgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatgatga tactaggtac 180
actcagaaat tcaagggcag ggccacattg actgcagata aatcgtccac cacagcctac 240
atgcaactca gcaacttgtc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgggg 300
tatgagaggg gcccatacta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Trp Met Gln Arg Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
gatgtgaagc ttcaggagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60
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actcagaaat tcaagggcag ggccacattg actgcagata aatcgtccac cacagcctac 240
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tca 363
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
caggtgcagc tgaaggagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacgtttact actttctgga tgcagtgggc aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatgatga tactaggtac 180
actcagaaat tcaagggcag ggccacattg actgcagata aatcgtccac cacagcctac 240
atgcaactca gcaacttgtc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgggg 300
tatgagaggg gcccatacta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
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<210> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180
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gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtggac gttcggtgga 300
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<223> 合成构建体
<400> 36
Gly Asn Ser Trp Ser His Ser Leu Arg Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gly Asn Ser Trp Arg His Ser Pro Arg Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成构建体
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20 25 30
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35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
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atctcctgcg ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
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tacacgttcg gaggggggac caggctggaa ataaaa 336
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Gly Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctgggga gtcagtatcc 60
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<220>
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<400> 42
Asp Thr Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Cys Arg
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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<220>
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Ser Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Lys
<210> 45
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
gacactgtga tgtcacagtc cccatcctcc ctagctgttt cagttggaga gaagataact 60
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Asp Pro Glu Phe
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
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Ser Gly Asn Ser Trp Arg His Ser Pro Arg Ser Leu Ser Val Thr Ile
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Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Asp Pro Glu Phe
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Ser Asp Thr Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val
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Leu Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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Glu Ile Lys
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
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Leu Glu Leu Lys
<210> 58
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Leu Phe Leu His Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Asp Thr Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val
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Ser Val Gly Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
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65 70 75 80
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<400> 73
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Trp Met Gln Arg Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser Trp Arg His Ser Pro
130 135 140
Arg Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Gly Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Leu Tyr Leu Val
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Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
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Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
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Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 74
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
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Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp
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195 200 205
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Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly
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Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 75
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
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1 5 10 15
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Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 79
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Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
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Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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245
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<211> 248
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
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Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
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<400> 84
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Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
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<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
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Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
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165 170 175
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 103
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
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1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Asp Pro Glu Phe
180 185 190
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
195 200 205
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210 215 220
Ala Arg Arg Gly Gly Leu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
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65 70 75 80
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
195 200 205
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210 215 220
Phe Cys Val Arg Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
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<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
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145 150 155 160
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Phe Cys Val Arg Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val
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Thr Val Ser Ser
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<223> 合成构建体
<400> 106
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
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165 170 175
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Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ser Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
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Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
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Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
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Trp Met Gln Arg Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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245
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<223> 合成构建体
<400> 108
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Ala Arg Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245

Claims (23)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述CAR多肽包括CD99抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导区。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述CD99抗原结合结构域是特异性结合CD99的抗体的单链可变片段(scFv)。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述scFv包括具有CDR1、CDR2和CDR3序列的可变重(VH)结构域以及具有CDR1、CDR2和CDR3序列的可变轻(VL)结构域，其中所述VH结构域的CDR1序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4；所述VH结构域的CDR2序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7；所述VH结构域的CDR3序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；所述VL的CDR1序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15；所述VL结构域的CDR2序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；并且所述VL结构域的CDR3序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区包括选自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任何组合组成的组的共刺激分子的细胞质结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述CAR多肽由下式定义：
SP–CD99–HG–TM–CSR–ISD；或
SP–CD99–HG–TM–ISD–CSR
其中“SP”代表信号肽，
其中“CD99”代表CD99结合区，
其中“HG”代表和任选的铰链结构域，
其中“TM”代表跨膜结构域，
其中“CSR”代表共刺激信号传导区，
其中“ISD”代表细胞内信号传导结构域，且
其中“–”代表二价接头。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3zeta(CD3ζ)信号传导结构域。
7.一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码权利要求1至6中任一项重组多肽。
8.一种运载体，所述运载体包括权利要求7所述的分离的核酸序列。
9.一种细胞，所述细胞包括权利要求8所述的运载体。
10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述细胞选自由αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、固有淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、调节性T细胞或其任何组合组成的组。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中当所述CAR的抗原结合结构域与CD99结合时，所述细胞表现出抗肿瘤免疫。
12.一种细胞，所述细胞包括权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)多肽。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是自体或同种异体Epstein-Barr病毒(EBV)特异性细胞毒性淋巴细胞。
14.一种在患有表达CD99的癌症的受试者中提供抗癌免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞经基因修饰以表达权利要求1至6中任一项所述的CAR多肽，从而在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞组成的组。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述免疫效应细胞是自体或同种异体Epstein-Barr病毒(EBV)特异性细胞毒性淋巴细胞。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施加检查点抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或其组合。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述癌症包括骨髓增生异常综合征、急性髓细胞白血病或双表型白血病。
20.一种融合多肽，所述融合多肽包括下式：
VLI–VHI–VLT–VHT、
VLT–VHT–VLI–VHI、
VHT–VLT–VHI–VLI、
VHI–VLI–VHT–VLT、
VLI–VHI–VHT–VLT、
VLT–VHT–VHI–VLI，
其中“VLI”是具有免疫细胞抗原特异性的轻链可变结构域；
其中“VHT”是具有CD99特异性的重链可变结构域；
其中“VLT”是具有CD99特异性的轻链可变结构域；
其中“VHI”是具有所述免疫细胞抗原特异性的重链可变结构域；
其中“–”由肽接头或肽键组成。
21.根据权利要求20所述的融合多肽，其中所述免疫细胞抗原是CD3。
22.根据权利要求20或21所述的融合多肽，其中所述VHT包括CDR1、CDR2和CDR3序列且所述VLT包括CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述VH结构域的CDR1序列包括氨基酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4；所述VH结构域的CDR2序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7；所述VH结构域的CDR3序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；所述VL的CDR1序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15；所述VL结构域的CDR2序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；并且所述VL结构域的CDR3序列包括氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21。
23.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的在药学上可接受的载体中的权利要求20至22中任一项所述的融合多肽。
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