CN112034184A - 一种蛋白互作阻断多肽的辅助筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蛋白互作阻断多肽的辅助筛选方法，是以中国对虾蛋白PcRab7和白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28相互作用阻断多肽为目标的筛选方法。本发明方法是构建中国对虾Rab7蛋白和白斑综合征病毒WSSV囊膜蛋白VP28的复合体结构PcRab7‑VP28；确定复合体结构PcRab7‑VP28的相互作用界面；然后以WSSV囊膜蛋白VP28为受体靶标蛋白，根据其活性区域设定活性口袋；将待筛选的多肽片段，在设定的活性口袋位置与受体靶蛋白VP28依次对接，并计算多肽与VP28的结合自由能；根据自由能高低筛选出阻断多肽。本发明所建立的蛋白互作阻断多肽的筛选方法基于相互作用的阻断多肽筛选，能弥补传统的仅仅依赖实验筛选的高成本短板，能做到多范围、多长度的多肽筛选。
Description
技术领域
本发明属于蛋白多肽互作技术领域，具体涉及一种蛋白互作阻断多肽的辅助筛选方法。
背景技术
对虾白斑综合征是由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)引发的一种综合性病征，是对虾暴发性流行病的主要病害之一，死亡率极高，严重危害对虾养殖业，是国际兽医局(OIE)规定需要报告的重要水生动物传染病。
WSSV的基因组大小在300kb左右，预测编码约180种蛋白，其中有50个以上病毒编码的蛋白质被鉴定为结构蛋白。在这些结构蛋白中，囊膜蛋白是病毒感染与致病力的重要决定因子，被认为是与宿主直接接触的第一个分子，因此在细胞靶向和宿主防御中起关键作用。虽然WSSV病毒进入对虾体内的精确机制至今仍未知，但是相关研究推测病毒进入宿主细胞是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞受体的相互作用而发生的。例如包膜蛋白通过与β–整合素蛋白，PmRab7等相互作用进入对虾体内，引起感染。既然病毒进入宿主细胞是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞受体的相互作用而发生的，相互作用阻断剂的筛选，对于今后抗白斑综合症病毒药物的研发具有重要意义。
药物的筛选一直都是新药研发的主要途径之一。通过体内和体外的实验筛选能够获得较为准确的阻断剂。以VP28为靶标，通过噬菌体表面展示的方法获得的多肽片段2E6(VAVNNSY)能够有效地抑制病毒感染。虽然噬菌体表面展示的方法能够通过淘洗的方法获得活性多肽片段，但是，由于该方法在构建多肽库中存在片段长度单一，实验成本高的问题，导致其没有办法穷尽所有片段长度。使得实验方法在筛选规模和范围上存在一定的局限性。
发明内容
本发明提供一种蛋白互作阻断多肽的辅助筛选方法，尤其涉及以中国对虾蛋白PcRab7和白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28相互作用阻断多肽为目标的筛选方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供一种中国对虾蛋白PcRab7和白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28相互作用阻断多肽的筛选方法，包括如下的步骤：
1)构建中国对虾Rab7蛋白和白斑综合征病毒WSSV囊膜蛋白VP28的复合体结构PcRab7-VP28；
2)确定复合体结构PcRab7-VP28的相互作用界面；
3)以WSSV囊膜蛋白VP28为受体靶标蛋白，根据其活性区域设定活性口袋；
4)将待筛选的多肽片段，在设定的活性口袋位置与受体靶蛋白VP28依次对接，并计算多肽与VP28的结合自由能，根据自由能高低筛选出阻断多肽。
所述步骤1)中PcRab7-VP28复合体结构的构建方法如下：
A、通过蛋白质结构预测软件I-TASSER构建完成PcRab7三级结构；
B、通过ZDock2程序生成多个PcRab7-VP28复合体结构，并根据结合能量进行排序；
C、依据对接结果，选取Auto Dock打分最高的配体构象，确定PcRab7-VP28的复合体结构。
所述的步骤2)中确定复合体结构PcRab7-VP28的相互作用界面，包括如下的步骤：
A、通过复合体结构的分子动力学模拟，获得其分子动力学轨迹；
B、利用单一分子动力学轨迹的MM-PBSA能量计算方法，计算PcRab7-VP28之间的结合自由能，分析驱动PcRab7-VP28可逆结合的主要因素；
C、利用MM-GBSA能量分解方法计算PcRab7的各个残基对结合自由能的贡献值，确定对PcRab7-VP28结合起决定作用的残基。
所述步骤3)中VP28活性口袋的设置，是选取VP28与PcRab7相互作用界面处残基为作用位点，通过软件Discovery Studio4.0生成相互作用区域；
所述步骤4)中将待筛选的多肽片段与受体靶蛋白VP28依次对接，是利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4.2软件共同完成；其中Autodock对接参数设定如下：格点间距为盒子为50×50×50的格点组成的正方体区域，首先为VP28和多肽片段添加氢键和Gaussian电荷，再采用多肽和VP28活性位点区域完全柔性的对接方法，其余参数设置均为默认值；提取对接结果中的相互作用能，选取聚类中构象结合自由能的平均值作为最终打分结果。
更进一步的，本发明还提供所筛选获得的多肽与VP28的结合模式，是运用分子动力学软件Amber16对靶蛋白-多肽片段体系进行分子动力学模拟；
所述的，对靶蛋白-多肽片段(VP28-IP)体系进行分子动力学模拟，其一种实施例的具体记载如下：固定复合体蛋白VP28-IP而使水和脂质平衡2ns；然后，选取多肽片段全部柔性和活性位点区残基为柔性残基，固定除柔性残基外的其它残基的Cα原子，其力常数从10千卡/摩尔逐渐减至0.1千卡/摩尔；所有的四步平衡中，每一步运行10ns；平衡后，在恒定温度(310K)和压力(1atm)下进行了400ns的MD模拟。
为了避免随机性的影响，以不同的起始原子速度分别进行两次独立的动力学模拟；由此产生的轨迹进行使用的amber16软件包cpptraj模块分析。
本发明所建立的蛋白互作阻断多肽的筛选方法，具有以下优点：
1)筛选高效，基于相互作用的阻断多肽筛选，能弥补传统的仅仅依赖实验筛选的高成本短板，能做到多范围、多长度的多肽筛选。
2)适用性广，本发明的方法不仅仅能够成功针对PcRab7-VP28的相互作用阻断剂进行筛选，对其它体系相互作用阻断多肽筛选同样适用。
附图说明
图1：PcRab7模建结构及其合理性检验图，其中(A)PcRab7三级结构的卡通图展示，该图由分子图形软件pymol生成，图片以彩虹色展示(N-端为蓝色，C-端为红色)。(B)PcRab7的Ramachandran Plot检验结果，该图由DS4.2生成，其中红色三角表示处于不可接受范围的残基。
图2：PcRab7和VP28分子对接形成的复合体结构图，其中，PcRab7以卡通形式展示，VP28以亲疏水表面展示。
图3：VP28与PcRab7的相互作用界面图，采用疏水表面方式展示；
图4：VP28-PP1的RMSD轨道模型图，方框中部分是最后选取的聚类结构；
图5：VP28与PP1的相互作用图，其中相互作用图由DiscoveryStuduo4.0Visualizer(DS4.0)计算生成。
具体实施方式
囊膜蛋白VP28作为对虾亚单位疫苗有明显优势，是一个抗病毒药物筛选的重要靶标。免疫电镜定位证实VP28分布在病毒的外表面，能够与斑节对虾体内的Rab7(PmRab7)蛋白以及中国对虾体内的PcRab7都能与VP28特异结合。因此抑制VP28和Rab7中任意蛋白都可以有效降低对虾感染WSSV的风险。而本发明选取中国对虾蛋白PcRab7和WSSV囊膜蛋白VP28的相互作用为目标，进行相互作用阻断剂的筛选。
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明保护范围并非限于下列实施例。
实施例1：建立筛选方法
(1)首先对PcRab7进行结构模建，并将模建后结构与VP28进行对接模拟，获得PcRab7-VP28复合体结构；
(2)将复合体结构在通过amber软件包进行300ns显含水分子动力学模拟，对平衡后结构通过进行相互作用分析，预测确定PcRab7-VP28相互作用的关键残基区域为D76-M83；
(3)将PcRab7与VP28相互作用界面上相互接触的片段单独截取，由于是以VP28为筛选靶标蛋白，因此选取PcRab7中与VP28接触的片段(D76-M83，DFLTKEVM)为“母片段”，构建多肽片段库，步骤主要包括：
①将“母片段”(D76-M83)从两头开始截短，选取五肽至八肽之间各个长度片段构成多肽库1(PPD1)；
表1：多肽片段库1(PPD1)
| 五肽 | TKEVM | DFLTK | FLTKE | LTKEV |
| 六肽 | LTKEVM | DFLTKE | FLTKEV | |
| 七肽 | FLTKEVM | DFLTKEV | ||
| 八肽 | DFLTKEVM |
②将PPD1中所有残基突变为其它同组(分为非极性残基组：Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met，极性残基组：Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Cys，Gly，带正电荷组：Lys，Arg，His和带负电荷组：Asp，Glu)残基，随机组合构成多肽库2(PPD2)
3、多肽片段的虚拟筛选
⑴分子对接：以VP28为受体，多肽片段为配体，利用Autodock4.2将多肽片段库中所有多肽片段与VP28进行分子对接。以(35.395，93.984，76.586)为中心，盒子为60×60×60的格点组成的正方体空间，进行格点划分，确定结合区域；
⑵分析对接结果：导出每个多肽片段所有对接后构象，选取结合能最低的构象为该多肽片段的代表构象，与VP28形成多肽-VP28复合体(PP-VP28)复合体。选取PP-VP28结合能Ei和结合强度Ki都比较小的前100个多肽片段；
⑶对接后复合体构象打分：将选取的100个多肽片段与VP28形成的复合体利用Score2.01进行进打分，计算其pKd值，选取pKd最高的前10个片段(表2)进行进一步的分析。
表2：十条可能的多肽片段
这些多肽片段可以作为候选PcRab7-VP28相互作用的多肽阻断剂。
(4)对筛选出的可能片段，运用分子动力学软件Amber16对VP28-PP1与VP28-PP2两个体系进行400ns的分子动力学模拟。其中，VP28采用AMBER99SB力场，多肽片段选用leaprc.ff03.r1力场。使用tleap程序生成系统的拓扑文件，体系质心位于立方体盒子中心，在蛋白周围加
的立方体水盒子，溶剂水分子模型采用TIP3P模型。同时，为了维持体系的电中性，添加11个Na+。为消除原子间的碰撞，首先采用最陡下降法进行5000步的能量优化，然后才用模拟退火方法，进行5000步的能量优化。平衡后，在恒定温度(310K)和压力(1atm)下进行了400ns的MD模拟。为长程静电作用应用周界性边界条件PME(Particle MeshEwald)方法处理。其中范德华相互作用和静电相互作用的截断值为10。模拟时间步长为2fs，每2ps保存一次轨迹能量、结构拓扑文件用于后续处理。为了避免随机性的影响，以不同的起始原子速度分别进行两次独立的动力学模拟。由此产生的轨迹进行使用的amber16软件包cpptraj模块分析。
(5)分别计算VP28-PP1的均方根偏差(RMSD)，分别见图4，并以RMSD的平均值为截断值，对轨迹的最后5ns进行聚类分析。选择最大团簇的中心构象，使用DS4.0和Pymol进行与结合模式分析，图5表明：PP1可以与VP28的Ser152和Gly178形成氢键，与Phe149，Val150，Pro180以及The184形成疏水作用而固定在VP28的活性口袋区域，抑制VP28活性。
上述实施例对蛋白互作阻断多肽的辅助筛选方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种筛选中国对虾蛋白PcRab7和白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28相互作用的阻断多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)构建中国对虾Rab7蛋白和白斑综合征病毒WSSV囊膜蛋白VP28的复合体结构PcRab7-VP28；
2)确定复合体结构PcRab7-VP28的相互作用界面；
3)以WSSV囊膜蛋白VP28为受体靶标蛋白，根据其活性区域设定活性口袋；
4)将待筛选的多肽片段，在设定的活性口袋位置与受体靶蛋白VP28依次对接，并计算多肽与VP28的结合自由能。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中PcRab7-VP28复合体结构的构建方法如下：
1)通过蛋白质结构预测软件I-TASSER构建完成PcRab7三级结构；
2)通过ZDock2程序生成多个PcRab7-VP28复合体结构，并根据结合能量进行排序；
3)依据对接结果，选取Auto Dock打分最高的配体构象，确定为PcRab7-VP28的复合体结构。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中确定复合体结构PcRab7-VP28的相互作用界面，包括如下的步骤：
1)通过复合体结构的分子动力学模拟，获得其分子动力学轨迹；
2)利用单一分子动力学轨迹的MM-PBSA能量计算方法，计算PcRab7-VP28之间的结合自由能，分析驱动PcRab7-VP28可逆结合的主要因素；
3)利用MM-GBSA能量分解方法计算PcRab7的各个残基对结合自由能的贡献值，确定对PcRab7-VP28结合起决定作用的残基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中VP28活性口袋的设置，是选取VP28与PcRab7相互作用界面处残基为作用位点，通过软件Discovery Studio4.0生成相互作用区域。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中将待筛选的多肽片段与受体靶蛋白VP28依次对接，是利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4.2软件共同完成；其中Autodock对接参数设定如下：格点间距为盒子为50×50×50的格点组成的正方体区域，首先为VP28和多肽片段添加氢键和Gaussian电荷，再采用多肽和VP28活性位点区域完全柔性的对接方法，其余参数设置均为默认值；提取对接结果中的相互作用能，选取聚类中构象结合自由能的平均值作为最终打分结果。
6.一种确定多肽与VP28的结合模式的方法，所述的多肽是使用权利要求1-5任一项所述的方法筛选的阻断多肽，其特征在于，所述的方法是运用分子动力学软件Amber16对靶蛋白-多肽片段体系进行分子动力学模拟。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的靶蛋白-多肽片段VP28-IP体系进行分子动力学模拟，是将固定复合体蛋白VP28-IP而使水和脂质平衡2ns；然后，选取多肽片段全部柔性和活性位点区残基为柔性残基，固定除柔性残基外的其它残基的Cα原子，其力常数从10千卡/摩尔逐渐减至0.1千卡/摩尔；所有的四步平衡中，每一步运行10ns；平衡后，在恒定温度和压力下进行了400ns的MD模拟。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的分子动力学模拟，是以不同的起始原子速度分别进行两次独立的动力学模拟；由此产生的轨迹进行使用的amber16软件包cpptraj模块分析。
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