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CN112029750A - 一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法 - Google Patents

一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法 Download PDF

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CN112029750A
CN112029750A CN202010523100.8A CN202010523100A CN112029750A CN 112029750 A CN112029750 A CN 112029750A CN 202010523100 A CN202010523100 A CN 202010523100A CN 112029750 A CN112029750 A CN 112029750A
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China
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amylase
bacillus subtilis
batch
fed
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CN202010523100.8A
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夏建业
刘姗姗
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East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
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Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
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Abstract

本发明公开了一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α‑淀粉酶的流加发酵方法，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势，在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态，继续发酵合成α‑淀粉酶；所述补料为葡萄糖或全培养基。本发明利用在线检测尾气中的OUR的变化趋势来流加补料，调控发酵参数，促进枯草芽孢杆菌产中温α‑淀粉酶，大大提高了α‑淀粉酶的酶活产量。

Description

一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种基于OUR的枯草芽孢杆 菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法。
背景技术
随着酿造和发酵工业的发展，α-淀粉酶广泛应用于酱油、酱类、食醋、酒 类、味精及糖色等工业生产，代替传统的制曲技术。应用酶制剂与传统制曲相 比，既省工省厂房、设备，又能提高出品率，降低成本，增加效益。枯草芽孢 杆BF7658α-淀粉酶是我国产量最大、用途最广的一种高效液化型淀粉酶，是 由耐热性能高的枯草芽孢杆菌诱变后逐级扩大培养，再经提纯而获得的一种浅 灰褐色粉末状有臭味的酶制剂，主要作用是能将原料中的淀粉质液化为糊精。 1965年，我国开始应用枯草芽孢杆菌BF7658生产α-淀粉酶，发酵单位为200U/mL左右。何纪春等以BF7658变异株209经UV和NTG复合诱变，得 到诱变株8a5，产酶活力比出发株提高了17～35％，而且具有比原株生长快、 产酶早的优点。2t发酵罐中试和16t发酵罐规模化生产中，α-淀粉酶活力分别 达到529U/mL和505U/mL，经济效益显著。中温α-淀粉酶是指一类最适反应 温度在50～70℃的α-淀粉酶，已经广泛应用于淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、 酒精工业等行业，也用于饲料、纺织、造纸、医药等各个领域。目前，国内对中温α-淀粉酶的研究不多，大多数科研院所已转向耐高温α-淀粉酶、酸性α- 淀粉酶、碱性α-淀粉酶等领域。
产中温α-淀粉酶的菌株来源较为广泛，主要为细菌与真菌，如Aspergilluskawachii，Aspergillus niger，Bacillus acidocaldarius，Bacillusamyloliquefaciens， Bacillus substilis，Bacillus brevis等，芽孢杆菌属类细菌是微生物源中温α-淀 粉酶的主要来源。淀粉酶一般为诱导酶类，在淀粉或其水解产物存在时可诱导 α-淀粉酶大量的分泌。国内外对淀粉酶类发酵条件优化的研究由来已久，Syu 等研究了发酵培养基中不同碳源来对中温α-淀粉酶的产酶影响，研究表明以葡 萄糖为碳源时其可加速微生物生长，而以淀粉为碳源则可使产酶量显著提高。 Gangadharan D，Sharma A等通过响应面优化芽孢杆菌产α-淀粉酶的发酵条件， 有效提高了产酶量。
发酵中尾气组分浓度变化反映了整个发酵过程物质的变化情况。特别是尾 气中CO2和O2的变化，包含了非常有价值的过程反应信息。CO2是细胞呼吸 和分解代谢的终产物，还是某些合成代谢的基质。几乎所有发酵均产生大量 CO2。CO2的产生是一种重要的生长指标，特别适用于早期生长阶段。在对数 生长期CO2的释放在一定条件下与细胞量成正比。监测CO2的生成是跟踪生长 活动的有效方法。氧是构成细胞本身及代谢产物的组分之一。对于好氧发酵， 无论是基质的氧化、菌体的生长或是产物的代谢均需要大量的氧。
通过发酵尾气中的CO2及O2在线检测分析，可以获取发酵过程重要的呼 吸代谢参数，如CO2释放速率(CER)、摄氧率(OUR)、呼吸商(RQ)等。 这些参数反映了微生物的代谢状况，尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质 间的代谢过渡指标。CO2释放率(Carbon-dioxide Escape Rate，CER)是指单位 时间、单位体积发酵液细胞释放的CO2量。摄氧率(Oxygen Uptake Rate,OUR) 是指单位时间、单位体积发酵液细胞消耗的氧。OUR取决于菌体浓度，也与 发酵液的营养成分、溶解氧水平、菌体的生长速率以及碳源的种类和浓度等因 素有关。CER除以OUR所得的商称为呼吸商(Respiratory Quotient,RQ)。目前 发酵尾气CO2和O2检测分析技术已日臻成熟。其性能稳定，可靠性高，可实 现连续在线检测。因是从尾气取气分析，对发酵无任何影响，也无需高温灭菌， 故为其应用创造了有利条件。
近年来，尾气分析在发酵中的应用研究越来越广泛深入。这些对于深入研 究发酵过程机理，摸索、优化发酵工艺，全面控制发酵过程具有重大意义。尤 其在基因工程、生物制药领域，能够大大加快新品研发及产业化，稳定生产， 提高产率。
枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的补料工艺国内研究不是很多，有相关研究 通过测定发酵过程中总糖浓度来进行补料，由于总糖浓度不能快速的测定，且 发酵过程会有一定的波动，于是不能快速且准确的观测到菌体的生长代谢程 度，既费劳动力又欠缺准确性。而且总糖浓度偏低并不能完全说明菌体开始衰 退，孙静等人的研究表明，总糖浓度偏低，淀粉酶酶活依旧处在快速合成的阶 段。在含有大量固体复合氮源的发酵液中，由于发酵体系固液比值较高，一定 程度会影响菌体对周围溶液中碳氮源的充分吸收，导致发酵液中的碳源浓度不 低于5g/L的情况下就已经出现糖限的情况，只检测糖浓度会错过最佳的补料 时间。
因此，亟需提供一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发 酵方法，利用尾气在线检测，实时且准确的观测到发酵参数的变化，可以合理 控制流加时间、流加速率，从而及时地调控参数对发酵过程进行控制，提高生 产水平。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶 的流加发酵方法，通过在线检测发酵尾气，实时且准确的观测到发酵参数的变 化，及时地控制流加补料，进而实现α-淀粉酶生产水平的提高。
为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
本发明提供了一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势， 在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态， 继续发酵合成α-淀粉酶；所述补料为葡萄糖或全培养基。
进一步，所述基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法， 包括如下步骤：
批培养发酵：发酵罐中装有发酵罐培养基，调节温度至34℃后接种枯草芽 孢杆菌，接种量为10％(V/V)，进行发酵，发酵过程中控制pH为6.2～6.8、 溶氧40％以上；
流加补料发酵：待上述批培养发酵尾气中的OUR出现下降时，按总糖量 流加全培养基或按还原糖流加葡萄糖，使OUR保持平稳不再下降，后发酵至 发酵结束。
进一步，所述补料的流加速率与所述批培养发酵过程中稳定期的耗糖量相 同。按总糖的消耗速率流加全培养基；按还原糖的消耗速率流加葡萄糖。
进一步，按总糖量4g/L/h的补料速率流加全培养基或按还原糖3g/L/h的 补料速率流加葡萄糖。
进一步，批培养发酵：发酵罐中装有发酵罐培养基，装液量为3/5，调节 温度至34℃后接种枯草芽孢杆菌，接种量为10％(V/V)，在搅拌转速300epm rpm、通气量为6L/min、罐压0.05Kpa的条件下标定溶氧150％，进行发酵， 发酵过程中控制pH为6.2～6.8、溶氧40％以上。
进一步，在所述批培养发酵前，用饱和亚硫酸钠溶液标定溶氧电极至0％。 批培养发酵前，标定pH电极。
进一步，在整个批培养发酵过程中：流加浓氨水控制pH为6.2～6.8；调整 转速控制溶氧40％以上。
进一步，所述发酵罐培养基包括：玉米淀粉158g/L、豆粕37.5g/L、棉粕 40g/L、氯化钙1g/L、氯化铵2.3g/L、玉米浆17.25g/L、磷酸氢二钠8.3g/L、高 温淀粉酶0.01mL/100mL；于121℃灭菌60min。
进一步，流加补料后发酵pH值回升至7.3～7.7范围时为发酵结束。
进一步，流加补料后发酵过程中的淀粉酶酶活不再增加时为发酵结束。
进一步，所述葡萄糖的浓度为42.5g/100mL，且于115℃灭菌20min。
进一步，所述全培养基包括：玉米淀粉210.67g/L、豆粕50g/L、棉粕 53.33g/L、氯化钙1.33g/L、氯化铵3.07g/L、玉米浆20g/L、磷酸氢二钠11.07g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL；121℃灭菌30min。
进一步，所述接种的枯草芽孢杆菌经过种子摇瓶培养得到，步骤如下：取 甘油管中菌液接种至种子摇瓶培养基中，接种量为0.6％(V/V)，在温度34℃、 转速220r/min的条件下摇瓶发酵，培养24h。
进一步，所述种子摇瓶培养基包括：玉米淀粉47.4g/L、豆粕11.25g/L、棉 粕12g/L、氯化钙0.5g/L、氯化铵1.15g/L、玉米浆4.5g/L、磷酸氢二钠3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL；调pH至7.3～7.7，121℃灭菌30min，冷却后加入 卡那霉素至终浓度为25ug/mL。
本发明中，总糖的消耗速率或还原糖的消耗速率采用DNS法测定。对批 发酵过程中快速产酶期即稳定期的耗糖量进行检测，来确定补料的速率。
本发明中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由邢台思倍特生物技术有限 公司提供。
本发明中，整个过程每隔4～5h取样进行相关样品的测定，通过发酵之星 和质谱仪对相关参数进行全程监控。
本发明中，pH测定可以采用如下方法：使用pH计离线测定发酵液原液的 pH，与pH电极读数对比，实时校准pH参数。
本发明中，菌体生物量的测定，可以采用如下方法：发酵液原液稀释至适 当倍数于分光光度计上测定OD600，OD为所测吸光度值×稀释倍数。
本发明中，还原糖的测定，可以采用如下方法：
取1mL稀释后的样品(稀释100倍)于10mL比色管中，随后加入1.5 mL DNS试剂，在漩涡震荡仪上混匀后，100℃沸水浴中显色5min，后迅速 冷却，降至室温后定容至10mL，在漩涡震荡仪上混匀后，从管中分别吸取200 μL溶液到96孔酶标板中，用酶标仪测定各样品在550nm处的吸光度。将测 出的吸光度带入标准曲线公式中，计算出稀释后样品中还原糖的含量，再乘以 稀释倍数得到原样品中的还原糖含量。
本发明中，总糖的测定，可以采用如下方法：
取1mL稀释后的样品(稀释10倍)于10mL比色管中，后加入1.5mL 3M盐酸，混匀后于100℃沸水浴中水解20min，冷却至室温后加入1.5mL 3M NaOH溶液，冷却至室温后定容至10mL。取定容后的溶液1mL于10mL比 色管中，随后加入1.5mL DNS试剂，混匀后于100℃沸水浴中显色5min， 冷却至室温后定容至10mL，在漩涡震荡仪上混匀后，从管中分别吸取200 μL溶液到96孔酶标板中，用酶标仪测定各样品在550nm处的吸光度。将 测出的吸光度代入标准曲线公式中，计算出稀释后样品中总糖含量，再乘以稀 释倍数得到原样品中的总糖含量(总糖含量是以还原糖含量来表示的)。
本发明中，淀粉酶活的测定，可以采用如下方法：
将发酵罐中的发酵液取出10mL左右，吸取1mL发酵液用磷酸缓冲液稀 释至合适的倍数备用；
吸取4mL淀粉溶液于10mL离心管中，再加入1mL磷酸缓冲液，混匀后 放入60℃水浴锅中预热8min。加入已经稀释到合适倍数的发酵液0.2mL，混 匀后于60℃水浴锅中准确反应5min。立即用移液枪吸取1mL反应完的溶液， 加入到预先盛有5mL稀碘液和0.5mL盐酸的试管中，混匀，并以5mL稀碘液 和0.5mL盐酸为空白，于660nm波长下测定吸光度。根据吸光度查相关酶活 对应表，从而求得发酵菌液中淀粉酶的酶活浓度。
本发明中，OUR的测定，可以采用如下方法：
采用过程质谱仪对发酵过程的尾气进行监测，使用biostar采集软件根据拟 稳态测量原理计算得到单位时间单位菌体摄氧率(OUR)。原理是基于一个假 设：溶氧在短时间间隔内不发生变化，且要忽略罐体上方气体成分变化。在密 闭发酵罐中，对发酵液中DO(溶解氧)进行物质衡算：
Figure BDA0002532777810000071
通过进出口气体氧分压比和流量计算OTR(氧气透过率)：
OTR＝(FinyO2,in-FoutyO2,out)/V (2-2)
根据氮气平衡计算Fout：
Fin·yN2,in＝Fout·yN2,out (2-3)
由方程(2-2)和(2-3)得到OUR：
Figure BDA0002532777810000072
其中，Fin为进气流量，Fout为尾气流量，yO2,in为进气氧分压比，yO2,out为 尾气氧分压比，V为发酵液体积。
本发明通过尾气中的OUR可以实时且准确的观测到前期菌浓的变化，从 而及时的调控参数使菌株前期可以快速的增长。
本发明的有益效果在于：
本发明的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，利 用在线检测尾气中的OUR的变化趋势来流加补料，调控发酵参数，促进枯草 芽孢杆菌产中温α-淀粉酶，大大提高了α-淀粉酶的酶活产量。
本发明的流加发酵的方法可在系统中维持很低的基质浓度，从而避免发生 阻遏效应，并按设备能力维持适当供氧，减缓代谢有害物的不利影响，进而可 对发酵过程进行控制，提高淀粉酶的生产水平。本发明中，在线检测OUR技 术能够在线识别整个发酵过程的不同阶段，利用尾气在线检测分析可以合理、 准确地控制流加时间、流加速率，进而实现流加的反馈控制，有效调控发酵参 数，实现淀粉酶的合成速率及中温α-淀粉酶酶活的提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中的发酵参数变化图。
图2为本发明实施例2中还原糖和总糖的参数变化图。
图3为本发明实施例3中的发酵参数变化图。
图4为本发明实施例3中还原糖和总糖的参数变化图。
图5为本发明实施例4中的发酵参数变化图。
图6为本发明实施例4中还原糖和总糖变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势， 在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态， 继续发酵合成α-淀粉酶；所述补料为葡萄糖或全培养基。
本实施例中，所述基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，包括如下步骤：
批培养发酵：发酵罐中装有发酵罐培养基，调节温度至34℃后接种枯草芽 孢杆菌，接种量为10％(V/V)，进行发酵，发酵过程中控制pH为6.2～6.8、 溶氧40％以上；
流加补料发酵：待上述批培养发酵尾气中的OUR出现下降时，按总糖量 流加全培养基或按还原糖流加葡萄糖，使OUR保持平稳不再下降，后发酵至 发酵结束。
所述补料的流加速率与所述批培养发酵过程中稳定期的耗糖量相同。按总 糖的消耗速率流加全培养基；按还原糖的消耗速率流加葡萄糖。
实施例2
本实施例提供一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势， 在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态， 继续发酵合成α-淀粉酶；所述补料为葡萄糖。
本实施例中，取170g葡萄糖定容至400mL，115℃灭菌20min，得到补料 葡萄糖。
本实施例中，所述基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，包括如下步骤：
取甘油管中菌液0.3mL接种至500mL的三角摇瓶中，摇瓶中种子摇瓶培 养基的装液量为50mL，用8层纱布包扎，于巡回式摇床上，温度34℃，转速 220r/min条件下摇甁培养24h。
调试好发酵罐的转速，温度，罐压后，将打湿的抹布覆盖于发酵罐的电机 及各种管路上，留出发酵罐的接种口；在接种口套上装满酒精棉的火焰圈，关 闭发酵间大门和窗户(防止在接种过程中由于空气大幅度流动带来的染菌)点 燃火焰圈，快速的将培养24h的种子液倒入发酵罐中。
标定pH电极，用饱和亚硫酸钠溶液标定溶氧电极至0％。5L发酵罐中发 酵罐培养基的装液量为3.0L，121℃灭菌60min，接种前温度调试到34℃， 搅拌转速300epm rpm，通气量为6L/min，罐压0.05Kpa的条件下标定溶氧 150％。接种量为10％(V/V)，整个过程中流加浓氨水控制pH在6.5左右， 调整转速控制溶氧40％以上。
在OUR出现下降趋势的时候，即发酵开始进入最后阶段的时期，按还原 糖3g/L/h的补料速率来流加葡萄糖，使OUR保持平稳不再下降。整个过程每 隔4h取样进行相关样品的测定，通过发酵之星和质谱仪对相关参数进行全程 监控。补料后发酵pH值回升至7.5左右或者检测淀粉酶酶活不再增加代表发 酵结束。
当OUR开始下降、溶氧开始回升时，表示发酵开始进入最后的阶段。
本实施例中，所述发酵罐培养基包括：玉米淀粉158g/L、豆粕37.5g/L、 棉粕40g/L、氯化钙1g/L、氯化铵2.3g/L、玉米浆17.25g/L、磷酸氢二钠8.3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL，定容至2.7L，121℃灭菌60min。
本实施例中，所述种子摇瓶培养基包括：玉米淀粉47.4g/L、豆粕11.25g/L、 棉粕12g/L、氯化钙0.5g/L、氯化铵1.15g/L、玉米浆4.5g/L、磷酸氢二钠3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL；调pH至7.3～7.7，121℃灭菌30min；冷却后加入 卡那霉素至终浓度为25ug/mL。
本实施例中，整个发酵过程中，对发酵相关参数进行全程监控，得到图1 和图2。
图1为本发明实施例2中的发酵参数变化图。
图2为本发明实施例2中还原糖和总糖的参数变化图。
从图1中可以看出：
当发酵34h时发酵参数OUR呈现快速下降的趋势，这是因为此时由于营 养物质的限制，菌株无法利用充足的营养来维持自身的生长和进行产物的合 成，进入衰亡期，于是出现OUR快速下降的趋势。此时流加一定浓度的葡萄 糖，葡萄糖的流加速度和浓度由菌株稳定期快速产酶时，对还原糖的消耗速率 决定。
流加补料培养基后，OUR不再下降，呈现平稳或者缓慢下降的状态，DO 值持续处在接近零的状态，酶活以19.64U/mL·h的合成速率增加，说明菌体开 始利用补加的营养物质对发酵酶活进一步合成，直至54h酶活不再增加时停止 流加葡萄糖，发酵结束，最终发酵液中的发酵酶活达到1039U/mL左右。
从图中可以看到，OD值与OUR的变化趋势大体上是一致的，OD值代表 菌浓的参数，需要不停的取样来进行OD值的测量由于本培养基中存在大量的 不溶物质，OD值的准确性会受很大的影响，由OD的变化趋势来补料，不仅 耗时耗力，而且参数的准确性也不佳。
实施例3
本实施例提供一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势， 在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态， 继续发酵合成α-淀粉酶；所述补料为全培养基。
本实施例中，所述全培养基包括：玉米淀粉210.67g/L、豆粕50g/L、棉粕 53.33g/L、氯化钙1.33g/L、氯化铵3.07g/L、玉米浆20g/L、磷酸氢二钠11.07g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL，定容至1.5L，于121℃灭菌30min。
本实施例中，所述基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵 方法，包括如下步骤：
取甘油管中菌液0.3mL接种至500mL的三角摇瓶中，摇瓶中种子摇瓶培 养基的装液量为50mL，用8层纱布包扎，于巡回式摇床上，温度34℃，转速 220r/min条件下摇甁培养24h。
调试好发酵罐的转速，温度，罐压后，将打湿的抹布覆盖于发酵罐的电机 及各种管路上，留出发酵罐的接种口；在接种口套上装满酒精棉的火焰圈，关 闭发酵间大门和窗户(防止在接种过程中由于空气大幅度流动带来的染菌)点 燃火焰圈，快速的将培养24h的种子液倒入发酵罐中。
标定pH电极，用饱和亚硫酸钠溶液标定溶氧电极至0％。5L发酵罐中发 酵罐培养基的装液量为3.0L，121℃灭菌60min，接种前温度调试到34℃， 搅拌转速300epm，通气量为6L/min，罐压0.05Kpa的条件下标定溶氧150％。 接种量为10％(V/V)，整个过程中流加浓氨水控制pH在6.5左右，调整转 速控制溶氧40％以上。
在OUR出现下降趋势的时候，即发酵开始进入最后阶段的时期，按总糖 量4g/L/h的补料速率来流加全培养基，使OUR保持平稳不再下降。整个过程 每隔4h取样进行相关样品的测定，通过发酵之星和质谱仪对相关参数进行全 程监控。补料后发酵pH值回升至7.5左右代表发酵结束。
本实施例中，所述发酵罐培养基包括：玉米淀粉158g/L、豆粕37.5g/L、 棉粕40g/L、氯化钙1g/L、氯化铵2.3g/L、玉米浆17.25g/L、磷酸氢二钠8.3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL，定容至2.7L，121℃灭菌60min。
本实施例中，所述种子摇瓶培养基包括：玉米淀粉47.4g/L、豆粕11.25g/L、 棉粕12g/L、氯化钙0.5g/L、氯化铵1.15g/L、玉米浆4.5g/L、磷酸氢二钠3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL；调pH至7.3～7.7，121℃灭菌30min；冷却后加入 卡那霉素至终浓度为25ug/mL。
本实施例中，整个发酵过程中，对发酵相关参数进行全程监控，得到图3 和图4。
图3为本发明实施例3中的发酵参数变化图。
图4为本发明实施例3中的还原糖和总糖变化图。
从图3中可以看出：
根据图3，当OUR开始下降，溶氧开始回升时表示发酵开始进入最后的 阶段，根据图3可知大约在34h左右流加全培养基。
流加全培养基后OUR基本维持比较平稳的趋势，说明菌株没有继续衰亡 变为空孢，而是利用流加的培养基继续合成淀粉酶。从酶活的变化趋势可以看 到，流加全培养基比流加葡萄糖，淀粉酶的合成速率更快，达到35.5U/mL·h， 基本上与批发酵过程之中的淀粉酶合成速率相同，且最终酶活也比只流加葡萄 糖效果好很多，达到1247U/mL，说明流加营养成分更加丰富的培养基，比只 流加碳源效果更佳。淀粉酶合成期间溶氧(DO)值基本一直处于跌零的状态， 直到46h停止流加培养基后，溶氧开始回升，OUR值又开始迅速下降，直至 发酵到62h跌至20mmol/L·h之下，此时取样镜检超过90％的菌体变为空孢， 说明发酵结束，此时中温α-淀粉酶酶活达到1247U/mL。
实施例4
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的发酵方法，包括如下步 骤：
取甘油管中菌液0.3mL接种至500mL的三角摇瓶中，摇瓶中种子摇瓶培 养基的装液量为50mL，用8层纱布包扎，于巡回式摇床上，温度34℃，转速 220r/min条件下摇甁培养24h。
调试好发酵罐的转速，温度，罐压后，将打湿的抹布覆盖于发酵罐的电机 及各种管路上，留出发酵罐的接种口；在接种口套上装满酒精棉的火焰圈，关 闭发酵间大门和窗户(防止在接种过程中由于空气大幅度流动带来的染菌)点 燃火焰圈，快速的将培养24h的种子液倒入发酵罐中。
标定pH电极，用饱和亚硫酸钠溶液标定溶氧电极至0％。5L发酵罐中发 酵罐培养基的装液量为3.0L，121℃灭菌60min，接种前温度调试到34℃， 搅拌转速300epm，通气量为6L/min，罐压0.05Kpa的条件下标定溶氧150％； 接种量为10％(V/V)，整个过程中流加浓氨水控制pH在6.5左右，调整转速 控制溶氧40％以上；直至发酵结束。
本实施例中，所述种子摇瓶培养基包括：玉米淀粉47.4g/L、豆粕11.25g/L、 棉粕12g/L、氯化钙0.5g/L、氯化铵1.15g/L、玉米浆4.5g/L、磷酸氢二钠3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL；调pH至7.3～7.7，121℃灭菌30min；冷却后加入 卡那霉素至终浓度为25ug/mL。
本实施例中，所述发酵罐培养基包括：玉米淀粉158g/L、豆粕37.5g/L、 棉粕40g/L、氯化钙1g/L、氯化铵2.3g/L、玉米浆17.25g/L、磷酸氢二钠8.3g/L、 高温淀粉酶0.01mL/100mL，定容至2.7L，121℃灭菌60min。
本实施例中，整个发酵过程中，对发酵相关参数进行全程监控，得到图5 和图6。
图5为本发明实施例4中的发酵参数变化图。
图6为本发明实施例4中还原糖和总糖变化图。
从图5中可以看出：
根据图5中的溶氧(DO)变化趋势，可知芽孢杆菌前期大量消耗氧气， 为提高菌浓，使OUR值呈指数上升，前期需要不断提高转速以提供充足的氧 气来使菌株快速繁殖，以确保稳定期时有大量的菌株来合成淀粉酶。
由OUR的变化趋势可知，1-6h为枯草芽孢杆菌的延滞期，6-20h为指数 增长期，菌株进入稳定期之前溶氧(DO)值不断的下降，需要不停的调节转 速使前期有充足的氧气供应。
20-34h为稳定期，该期间菌株主要合成淀粉酶，溶氧跌至零点。
8h左右就可以检测到有淀粉酶，但是淀粉酶快速合成的时期为菌株生长的 稳定期，如图中淀粉酶酶活在20h后出现急剧增加的趋势。
32h溶氧开始回升，OUR值开始快速下降，菌株进入衰亡期，发酵进入最 后阶段。直至42h，溶氧回升至最初的饱和度水平，OUR降至20mmol/L·h之 下，酶活也不再增加，发酵液镜检90％菌体变为空孢，此时发酵完全结束，最 终发酵酶活约880U/mL左右。
综上所述，本发明的流加发酵方法比普通批发酵方法相比较，淀粉酶的合 成速率更快，且发酵结束后的最终淀粉酶酶活也更高。本发明在稳定的批发酵 的基础上进行了补料批发酵，分别流加葡萄糖和全培养基，使中温α-淀粉酶的 发酵酶活分别达到了1039U/mL和1247U/mL，大大提高了淀粉酶的酶活产量， 效果显著，具有较高的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，在枯草芽孢杆菌批培养发酵中，在线检测尾气中的OUR的变化趋势，在OUR下降的时间点进行流加补料，使OUR呈现平稳或者缓慢下降的状态，继续发酵合成α-淀粉酶；所述补料为葡萄糖或全培养基。
2.根据权利要求1所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，所述全培养基包括：玉米淀粉210.67g/L、豆粕50g/L、棉粕53.33g/L、氯化钙1.33g/L、氯化铵3.07g/L、玉米浆20g/L、磷酸氢二钠11.07g/L、高温淀粉酶0.01mL/100mL。
3.根据权利要求1或2所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，在所述枯草芽孢杆菌批培养发酵中，包括如下步骤：
批培养发酵：发酵罐中装有发酵罐培养基，调节温度至34℃后接种枯草芽孢杆菌，接种量为10％，进行发酵，发酵过程中控制pH为6.2～6.8、溶氧40％以上；
流加补料发酵：待上述批培养发酵尾气中的OUR出现下降时，按总糖量流加全培养基或按还原糖流加葡萄糖，使OUR保持平稳不再下降，后发酵至发酵结束。
4.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，所述补料的流加速率与所述批培养发酵过程中稳定期的耗糖量相同。
5.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，批培养发酵：发酵罐中装有发酵罐培养基，装液量为3/5，调节温度至34℃后接种枯草芽孢杆菌，接种量为10％，在搅拌转速300epm rpm、通气量为6L/min、罐压0.05Kpa的条件下标定溶氧150％，进行发酵，发酵过程中控制pH为6.2～6.8、溶氧40％以上。
6.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，在所述批培养发酵前，用饱和亚硫酸钠溶液标定溶氧电极至0％。
7.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，所述发酵罐培养基包括：玉米淀粉158g/L、豆粕37.5g/L、棉粕40g/L、氯化钙1g/L、氯化铵2.3g/L、玉米浆17.25g/L、磷酸氢二钠8.3g/L、高温淀粉酶0.01mL/100mL。
8.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，流加补料后发酵pH值回升至7.3～7.7为发酵结束。
9.根据权利要求3所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，所述接种的枯草芽孢杆菌经过种子摇瓶培养得到，步骤如下：取甘油管中菌液接种至种子摇瓶培养基中，接种量为0.6％，在温度34℃、转速220r/min的条件下摇瓶发酵，培养24h。
10.根据权利要求9所述的基于OUR的枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的流加发酵方法，其特征在于，所述种子摇瓶培养基包括：玉米淀粉47.4g/L、豆粕11.25g/L、棉粕12g/L、氯化钙0.5g/L、氯化铵1.15g/L、玉米浆4.5g/L、磷酸氢二钠3g/L、高温淀粉酶0.01mL/100mL和卡那霉素25ug/mL。
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