CN112023110B - 一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料，属于生物医药制品技术领域，选用壳聚糖作为载体材料，复合抑菌性竹荪蛋提取物，制成3种新型医用抑菌性敷料。该抗菌敷料抑菌效果好、无任何免疫原性、无溶血性，在伤口处形成凝胶保护层，有效吸收伤口渗出液；保湿、透气、不黏连、具有良好的生物相容性，并对创面愈合有很好的治疗效果，达到理想功能性外用敷料的要求。

Description

一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料

技术领域

本发明属于生物医药制品技术领域，涉及一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，使体内各种组织和器官免受外界物理性、机械性、化学性以及病原微生物性的侵袭。皮肤自身具有良好的自我修复再生能力，但若皮肤所受到的创伤过大，创伤处自我修复过慢导致伤口不能及时愈合，外界的各种病原微生物和化学类污染物等都会通过伤口进入，导致体液流失和伤口感染，更甚者危及生命。据世卫组织统计，每年死于外伤人数约500万左右，而其中约20%是由于皮肤过大面积的缺损而导致的伤口感染而死亡。现今临床中所用的医用敷料功能单一，使用过程中有着诸多缺点，开发新型的伤口医用敷料具有重大的现实意义。

理想的医用敷料应具有以下功能（1）有利于营造低氧、微酸、湿润的环境，能够保持创面的温度，从而加速上皮组织形成；（2）能够有效地吸收创面渗出物，移除方便；（3）具有良好的通透性，并且能够有效阻隔细菌和有害粒子；（4）具有良好的生物相容性，无不良刺激，无过敏反应；（5）便于观察伤口，减少更换敷料时的痛苦及更换次数，黏附性好，不易脱落；（6）储存稳定，使用方便。

加载活性成分的生物敷料与传统敷料相比具有相容性好，毒副作用小、抗原性低、有一定的透水性、降低创面菌落密度、提高创面愈合质量、减轻病人痛苦等优点，目前已经应用于各类皮肤创伤的治疗。在所添加的活性成分中，化学抗菌素易产生耐药性，作用单一。具有抗菌抑菌作用的天然产物资源丰富，作用更全面，前景广阔。

竹荪是“草八珍”之一，有“天然防腐剂”之称。竹荪蛋是竹荪生长前期的胚胎，具有调节人体新陈代谢、增强人体免疫功能，强壮益气、补脑宁神、生精补肾、健体等多种生理功效。同时，研究发现竹荪蛋提取液的抑菌杀菌、抗氧化、消炎效果非常显著。竹荪中富含的多糖成分有一定的吸水性和成膜性，即有很好的保湿作用，对人体的副作用小，适于所有人使用。壳聚糖是一种天然的聚阳离子多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、成膜性和良好的抗菌、吸湿、促凝血、镇痛等功效，同时壳聚糖能够促进透明质酸等糖胺多糖的分泌，使伤口愈合加快，并能抑制成纤维细胞的生长，促进肉芽组织及上皮的生成，减少伤口的收缩，减轻疤痕的形成。

当前，还未见关于竹荪蛋活性提取物在医用敷料领域的相关报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料，由从竹荪蛋中提取的活性物质与壳聚糖载体复合而成，为以下三种中的任意一种：

活性抑菌敷料I，是将壳聚糖海绵浸入竹荪蛋提取液中，充分吸收后于-80℃下预冷处理至少10h，然后冷冻干燥24~48h制得；

活性抑菌敷料II，是将质量分数为5%~10%的竹荪蛋提取物均匀涂布在壳聚糖海绵表面，然后干燥制得；

活性抑菌敷料III，以质量分数计，将壳聚糖、明胶和蜂蜜分别按照0.75%、25％和20％的用量添加，溶胀处理30min，再加入10%的竹荪蛋提取液和5%的竹荪蛋提取物，恒温搅拌均匀，静置过夜，制得初生复合水凝胶，再将该初生复合水凝胶于-20℃冷冻24h，室温解冻处理2~4h，反复冷冻-解冻处理3次制得。

优选地，所述竹荪蛋提取液的制备方法如下：

取竹荪蛋，以乙酸乙酯作为浸提试剂，混合后先打浆处理30秒，然后浸提2~4h，提取液过滤、浓缩，制得竹荪蛋提取液。

优选地，竹荪蛋与乙酸乙酯的料液比为1:15；浸提是在75~80℃下进行；滤液采用真空浓缩至1/5体积制得竹荪提取液。

优选地，所述竹荪蛋提取物的制备方法如下：

取竹荪蛋，以水为浸提试剂，混合后先打浆处理30秒，然后浸提处理3~6h，提取液过滤、浓缩，然后进行醇沉处理，过夜静置、收集沉淀，再经水复溶、活性炭脱色、乙醇沉淀处理，收集沉淀，加水复溶后浓缩，浓缩液冷冻干燥，获得竹荪蛋提取物。

优选地，竹荪蛋干子实体与水的料液比为1:15；所述浸提是在75~80℃浸提2次，每次3h；过滤是将2次浸提液合并后过滤，滤液浓缩至1/3体积。

优选地，醇沉处理是加入浓缩液3倍体积的乙醇进行沉淀处理。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选用壳聚糖作为载体材料，复合抑菌性的竹荪蛋提取物，制得3种新型医用活性抑菌敷料，竹荪蛋提取液和竹荪蛋提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌等常见菌均有良好的抑菌效果，因此将其与壳聚糖结合能够很好地发挥抑菌作用，且该活性抑菌敷料无任何免疫原性、无溶血性，在伤口处能够形成凝胶保护层，有效吸收伤口渗出液；保湿、透气、不黏连、具有良好的生物相容性，并对创面愈合有很好的治疗效果，达到理想功能性外用敷料的要求。本发明经过实验验证，三种活性抑菌敷料均具有良好的吸水性，且均为弱酸性，不仅对皮肤无刺激性，而且使皮肤处于吸收的最佳状态。

附图说明

图1为本发明的制备的3种活性敷料抑菌圈；

图2 为凝胶敷料对胎鼠成纤维细胞增殖率的影响；其中，A 对照组；B活性敷料I；C活性敷料II；D 活性敷料III；

图3为活性敷料III对小鼠皮肤贴附性能影响照片。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

、竹荪蛋提取物的制备

取竹荪蛋，称重，以乙酸乙酯作为浸提试剂，料液比1:15，打浆30秒，75~80℃浸提3h，过滤，真空浓缩至1/5体积，获得竹荪蛋提取物I。

取竹荪蛋干子实体，称重，以水为浸提试剂，料液比1:15，打浆30秒，75~80℃浸提2次，每次3h，过滤，滤液合并，真空浓缩至1/3体积，加3倍体积乙醇，过夜，收集沉淀，以水复溶，脱色，乙醇沉淀，收集沉淀，水复溶后浓缩，冷冻干燥，获得竹荪蛋提取物II。

2、提取物抑菌活性实验

以金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌为供试菌种，牛肉膏蛋白胨培养基培养，滤纸圆片法测抑菌圈直径。结果如表1所示。

表1 竹荪蛋提取物抑菌效果（抑菌圈直径/mm，`X±SD）

竹荪蛋提取物I和II均有显著抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌活性的作用。

3、生物活性敷料开发

将壳聚糖按重量百分比配制成浓度为0.5%~3%的壳聚糖溶液，加入0.5%~3%的柔软剂（柔软剂为甘油、乙二醇、山梨糖醇、麦芽糖醇中的至少一种），混匀，静止脱泡，倒入1.3cm深的模具中，-80℃预冷冻1~8h，冷冻干燥24~48h。将冻干的壳聚糖海绵于110℃加热，用110℃热平板将海绵由1.3cm压缩至0.5cm。将壳聚糖海绵浸入竹荪蛋提取液I中0.5h~1h，-80℃预冷冻10h以上，冷冻干燥24~48h，得活性抑菌敷料I。

将质量分数为5~10%的竹荪提取物II均匀涂布在海绵表面并干燥，得活性抑菌敷料II。

壳聚糖、明胶和蜂蜜按照0.75%、25％和20％的终浓度顺序添加，溶胀30 min，再加入10%竹荪蛋提取物I和5%竹荪蛋提取物II，恒温搅拌2h，静置过夜脱泡，得到初生复合水凝胶。再将所得水凝胶放入-20℃冷冻24h，室温解冻2~4h。如此反复冷冻-解冻3次，得到多孔复合水凝胶，即为活性抑菌敷料III。

以上获得的活性抑菌敷料分别涂敷在无纺布上，装入热封袋，包装前采用γ射线15kGy辐照灭菌。

三种敷料吸收率、保水率、无膨胀吸收量、弥散特性、pH等参数见表2。

表2 活性敷料性能表征

由表2可以看到，活性抑菌敷料I和活性抑菌敷料II吸收液体量均达到了自身重量的20倍以上，活性抑菌敷料III达到了自身重量的9倍，已达到新型敷料对大量液体吸收量的要求，说明所制备的活性抑菌敷料具有良好的吸水性，作为创伤敷料可保持创面干燥不引起水肿发炎，有利于创面愈合。

依据行业标准，评价凝胶弥散性。三种敷料均能保持完整形态，并未产生弥散或溶解，说明他们若应用于皮肤敷料应可充分吸收创伤渗出液，不会溃烂而失去创面保护作用。pH值测定结果显示， 3种敷料的pH均在6.0-6.7之间，处于弱酸性，符合药典中软膏类剂pH＜8.3的要求，不仅对皮肤无刺激性，而且使皮肤处于吸收的最佳状态。

4、活性抑菌敷料抑菌性能

根据国家标准，采用接触性创面敷料的试验方法，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为试验菌种，测试水凝胶敷料的抗菌效果。将所制备的活性敷料样品在37℃下培养18h后观察抑菌效果。依据国家医疗器械生物学评价标准，抑菌环宽度大于1mm者便认为有抗菌性。由图1所示，可以看出本发明制得的3种活性敷料抑菌环宽度分别为2mm，1.5mm，2mm，说明均已达到良好的抗菌效果。

5、血液相容性

根据国家评定标准，当生物材料的溶血率低于5%时，生物材料是安全的，可应用于生物医用材料。表3是三种活性抑菌敷料的溶血率，均低于5%，符合国家医用材料的标准。

表3活性抑菌敷料血液相容性

6、MTT法检测细胞毒性

用DMEM制备的3种活性抑菌敷料浸提液，MTT法检测胎鼠成纤维细胞的增殖率，进行细胞毒性评估。结果如图2所示：与对照相比，成纤维细胞均呈梭形，梭状成纤维细胞完全贴壁，伪足伸展，整个视野中健康细胞占据大部分面积；圆缩的死细胞数量很少，且其中也包含有部分正常生长凋零的死细胞，说明细胞生长状态良好；因此可定性判断三种凝胶敷料都能保证细胞正常生长增殖。

7.水凝胶的皮肤贴附性能

KM小鼠5只，雌雄不限；背部备皮后，涂覆凝胶敷料，以0.5g/cm²为标准，单只单笼喂养。间隔2h观察小鼠背部受试区域情况，试验时间12h。三种凝胶敷料均未发现小鼠皮肤有明显变化和凝胶残留，说明凝胶性能良好无刺激。其中，图3展示的是选择粘性最大的活性敷料III涂抹前后对小鼠皮肤粘附性能的照片，可见皮肤无变化，并无敷料残留。

8.皮肤刺激试验

体重2kg左右健康新西兰兔，背部脊柱两侧区域备皮，脱毛面积约为体表面积的10%。受试物0.5 g涂于经备皮的皮肤上，覆盖固定12小时之后，观察反应（红斑形成、紫红色红斑并有焦痂形成、水肿形成、水肿隆起等），按其严重程度评分并评价刺激强度（表4）。本发明制得的3种活性抑菌敷料均无皮肤刺激和皮肤致敏反应（表5）。

表4皮肤刺激反应的评分标准

皮肤刺激强度级别为0～＜0.5 无刺激性，0.5～＜2.0 轻刺激性，2.0～＜6.0 中等刺激性，6.0～8.0 强刺激性。

表5 3种活性抑菌敷料对新西兰兔皮肤刺激性试验结果

综上所述，本发明着眼于制备具有良好的生物活性的竹荪蛋复合敷料，从竹荪蛋中获得抗菌性提取物，首次制备了竹荪蛋提取物-壳聚糖海绵、竹荪蛋提取物-壳聚糖混合物，开发具有体外抑菌性能的活性敷料，用于抗外伤后感染。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (2)

1.一类基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料，其特征在于，由从竹荪蛋中提取的活性物质与壳聚糖载体复合而成，为以下三种中的任意一种：

活性抑菌敷料I，是将壳聚糖海绵浸入竹荪蛋提取液中，充分吸收后于-80℃下预冷处理至少10h，然后冷冻干燥24~48h制得；

活性抑菌敷料II，是将质量分数为5%~10%的竹荪蛋提取物均匀涂布在壳聚糖海绵表面，然后干燥制得；

活性抑菌敷料III，以质量分数计，将壳聚糖、明胶和蜂蜜分别按照0.75%、25％和20％的用量添加，溶胀处理30min，再加入10%的竹荪蛋提取液和5%的竹荪蛋提取物，恒温搅拌均匀，静置过夜，制得初生复合水凝胶，再将该初生复合水凝胶于-20℃冷冻24h，室温解冻处理2~4h，反复冷冻-解冻处理3次制得；

所述竹荪蛋提取液的制备方法如下：取竹荪蛋，以乙酸乙酯作为浸提试剂，混合后先打浆处理30秒，然后浸提2~4h，提取液过滤、浓缩，制得竹荪蛋提取液；其中，竹荪蛋与乙酸乙酯的料液比为1:15；浸提是在75~80℃下进行；滤液采用真空浓缩至1/5体积制得竹荪提取液；

所述竹荪蛋提取物的制备方法如下：取竹荪蛋，以水为浸提试剂，混合后先打浆处理30秒，然后浸提处理3~6h，提取液过滤、浓缩，然后进行醇沉处理，过夜静置、收集沉淀，再经水复溶、活性炭脱色、乙醇沉淀处理，收集沉淀，加水复溶后浓缩，浓缩液冷冻干燥，获得竹荪蛋提取物；其中，竹荪蛋干子实体与水的料液比为1:15；所述浸提是在75~80℃浸提2次，每次3h；过滤是将2次浸提液合并后过滤，滤液浓缩至1/3体积。

2.根据权利要求1所述的基于竹荪蛋提取物的活性抑菌敷料，其特征在于，醇沉处理是加入浓缩液3倍体积的乙醇进行沉淀处理。

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