CN112011501A - 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 - Google Patents
一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种携带c.3369‑3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系，已于2020年7月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.19956。该细胞系的建立可为临床肥厚性心肌病的新药筛选及药物治疗提供细胞模型，为肥厚性心肌病致病机制研究、基因改造研究提供有效工具；保存遗传性疾病的细胞资源，丰富疾病特异性iPSC细胞库，为后续的研究做储备。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，更具体涉及一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系。
背景技术
家族性肥厚性心肌病(Familial hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是心肌肌节的常染色体显性遗传性心脏疾病，被认为是世界上最常见的遗传性心脏病(Maron etal.， 1995;Teare,1958)。HCM患者在血流动力学负荷不增加的情况下，左心室(LV)心肌出现异常增厚，导致发生进行性心力衰竭、心律失常和心脏猝死(SCD)等临床并发症的风险增高(Maron, 2002;Maron等，2003)。过去20年的分子遗传学研究表明，HCM是由编码心肌肌节蛋白的基因突变引起的(Geisterfer-Lowrance et al.,1990; Seidman和Seidman,2001)。然而，肌节基因突变产生HCM临床表型的机制尚不清楚。对HCM的研究在很大程度上是基于转基因动物设计携带人类HCM突变小鼠α-肌凝蛋白骨干（α - myosin backbone），例如, 在小鼠α–肌球蛋白主干上携带人HCM突变基因的转基因小鼠。虽然这些动物模型为HCM的发展提供了重要的研究成果，但它们也存在一些限制，由于种族的差异，动物有时候不能完全体现人类的疾病的特征，例如，富含α–肌球蛋白的小鼠缺乏人心脏肌小节特有的β-肌球蛋白， 这两种肌球蛋白的生理特性是完全不同的，它们可引起完全不同的肌球蛋白的功能性收缩 (Fatkin et al .,1999;lompreet al.， 1981)，这在HCM显得尤为重要，β-myosin是最常见的基因突变的疾病(Seidman和Seidman, 2001)。最近的一项研究强调了不同的生物物理属性的α-和β-myosin通过克隆人类HCM相同的突变(R403Q)α-myosin骨干和β-myosin骨干(Lowey et al., 2008).。值得注意的是,同一R403Q突变导致完全不同的肌球蛋白收缩功能的影响取决于它是表示在α-或β-myosin亚型。可能这就是动物模型导致互为矛盾的结果的原因 (Arad et al.， 2002;Marian et al.， 1997;Tyska等，2000)。
诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells ，iPSCs）2006年由Takahashi and Yamanaka（Takahashi et al.,2006）将四种转录因子(c-Myc, Oct3/4,SOX2,和Klf4)通过逆转录病毒导入小鼠成纤维细胞重编程形成ES样细胞；人诱导性多能干细胞（hIPSCs）建立于2007年，通过导入同样的四个转录因子(c-Myc, Oct3/4, SOX2,和Klf4)以及另一套转录因子（Oct3/4, SOX2, Nanog, Lin28）到人的成纤维细胞进行重编程形成ES样细胞（Takahashi et al.,2007，Yu et al.,2007）。这种重编程技术如果能够在病人自己的iPSCs上对疾病的生物学及其治疗进行研究更有其应用价值。利用这种重编程技术，可以将病人的皮肤成纤维细胞或者外周血分离的T细胞作为细胞来源进行重编程，产生病人特异性iPSCs。
在HCM等遗传性心脏疾病的研究中由于几乎不可能获得人类心脏病变组织标本以供体外研究，也无法让心肌细胞在体外长期培养，解决动物和人类的这些差异受到了阻碍。患者特异性的iPSC的产生绕过了许多转基因动物模型在疾病研究的限制，比如扩张型心肌病、LEOPARD和长QT综合征(Carvajal-Vergara et al.， 2010;Itzhaki等，2011;Moretti等，2010;Narsinh等，2011a;Sun等，2012;Yazawa et al.， 2011)，这些研究都成功地建立了疾病特异的iPSC，并被用于体外模拟多种遗传性心血管疾病。
我们在临床发现一个肥厚型心肌病的先证者，在家系调查中，其家族成员有3个确诊为HCM（图1），利用外显子捕获技术针对HCM相关的16个基因，包括ACTC1、LAMP2、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPMI、PRKAG2、CSRP3、GLA、VCL、TNNC1、TTR等编码肌小节蛋白的常见致病基因对该HCM家系成员利用目标基因靶向捕获高通量测序技术筛选致病突变基因，发现2例MYBPC3 c.3369-3370 insC突变，患者DNA测序分析电泳图显示MYBPC3基因在C.3369 - 3370 insC位置发生框移杂合突变，使半胱氨酸转化为亮氨酸（p.Cys1124Leufs*25; EX31/CDS31; Het;）（图2），目前暂无该位点致病性的相关文献报道。我们将其中的一例使用episomal方法重编程为患者特异性iPSC，未检索到国际上有携带肌球蛋白结合蛋白C (MYBPC3) c.3369-3370 insC突变的肥厚性心肌病特异性诱导多功能干细胞系的专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系HCM-iPSC，为携带肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) c.3369-3370 insC突变的肥厚性心肌病（HCM）特异性诱导多能干细胞系FJMA0001i-HCM，已于2020年7月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.19956。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
将收集到的PBMNC在4ml PBMNC扩增培养基(Nuwacell Ltd)重悬，分别接种于6孔板的2个孔中培养，培养期间每4天补加2mlPBMNC扩增培养基(Nuwacell Ltd)。
将冷冻的PBMNC解冻并接种至纤连蛋白包被的培养板上进行扩增，在CD34+细胞扩增培养基中（StemSpan SFEM ，STEMCELL Technologies) 添加EX-CYTE growthenhancement media supplement (1:1000, Millipore, Billerica, MA), 2 mMGlutaMAX, 250 ng/ml SCF, 250 ng/ml FLT3L, 100 ng/ml TPO, 20 ng/ml IL-3, 50ng/ml IL-6 and 10 ng/ml sIL6-R (all from Peprotech, Rocky Hill, NJ).），扩增培养第7天的细胞进行重编程，最终获得所述细胞系HCM-iPSC，即为FJMA0001i-HCM。
重编程方法为：Episomal重编程载体包含人类OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC、KLF4和SV40LT基因。扩增培养后的PBMNC细胞，用Human CD34+ Cell Nucleofector Kit（VPA-1003，Amaxa）和15-20ug质粒DNA混合进行核转染，每次核转染细胞数为1×106，质粒DNA比例为3.0 µg pEP4EO2SEN2K，3.2 µg pEP4EO2SET2K，2.4 µg pCEP4-M2L。核转染程序为T-16。核转染后的细胞立即接种到预先铺好纤连蛋白/基质凝胶的6孔板中，纤维连接蛋白与基质凝胶一起使用，可促进细胞从核转染中恢复。转染后第2天至第11天用含有1X N-2、(1X B-27、100 ng/ml bFGF、0.5 uM PD0325901、3 uM CHIR99021、0.5 uM A-83-01、 1000U/ml hLIF、10uM HA-100的DMEM/F12 培养液进行换液，然后使用hPSC培养液（NuwaCellLtd）进行iPSC扩增。结果可见传代第6代第三天（P6,Day3）的细胞克隆，显微镜下可见细胞呈典型的克隆状生长，克隆呈集落状、隆起的圆形或者椭圆形，边界清晰，细胞团内细胞排列紧密，界限和形态不易区分。
本发明的优点在于：
1.建立了携带肌球蛋白结合蛋白C (MYBPC3) c.3369-3370 insC突变的肥厚性心肌病（HCM）特异性诱导多功能干细胞系，为基因突变引起的家族遗传性HCM提供细胞模型；
2.该细胞系的建立可为临床肥厚性心肌病的新药筛选及药物治疗提供细胞模型，为肥厚性心肌病致病机制研究、基因改造研究提供有效工具；
3.保存遗传性疾病的细胞资源，丰富疾病特异性iPSC细胞库，为后续的研究做储备。
附图说明
图1. HCM家系图，其中■为男性病人，■ 为男性死于本病，□为正常男性，〇为正常女性。
图2. 患者DNA测序分析电泳图显示MYBPC3基因在C.3369 - 3370 insC位置发生框移杂合突变。
图3.包含人类OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC、KLF4和SV40LT基因的Episomal重编程载体。
图4 所述细胞系HCM-iPSC传代至第6代培养第三天(P6 Day3)细胞克隆结果图。显微镜下可见细胞呈典型的克隆状生长，克隆呈集落状、隆起的圆形或者椭圆形，边界清晰（图4A，40X），细胞团内细胞排列紧密，界限和形态不易区分（图4B，200X）。
图5. Real-time PCR扩增结果，与MSC-P3相比，HCM-iPSC (20180803CQ-C2-P6)和hESC-H1中POU5F1(蓝色)和NANOG(橙色)基因的表达增加。内参为RPL13A(Ribosamalprotein L13A)。 ** p < 0.01，被认为有显著的差异。
图6. HCM-iPSC 同时表达SSEA4和tra1 -81的结果图。
图7.所述细胞系GTG分析结果，其显示正常的男性核型（46,XY）。
图8.HCM-iPSC体内分化实验染色结果，包含所有三胚层的移植物中的畸胎瘤， A:神经组织(外胚层)，B:软骨(中胚层)， C:原肠(内胚层)，标尺:100毫米。
图9 HCM-iPSC外源性重编程基因丢失检测结果，HCM-iPSC细胞样品(20180803CQH-C1，20180803CQH-C2, 20180803CQH-C3)外源基因重编程检测X(n)表示HCM-iPSC样本的真实gEBNA1值。1.0896 Y = x + 0.7276。图中红色阴影区域的红点为样品20180803cqm - c1、20180803cqm - c2、20180803cqm - c3的位置。
图10 HCM-iPSC突变患者DNA测序分析及验证，MYBPC3基因在c.3369 – 3370位点出现杂合突变。上面是患者显示基因突变的测序结果，下面是HCM-iPSC对同一位点基因突变的验证。
图11.21个STR位点电泳图。一个单独的峰形（A）表示纯合子，两个大小相近的峰形(B)表示杂合子。
图12复苏的HCM-iPSC 传代第8代（40X）。
图13复苏的HCM-iPSC 传代第8代（200X）。
具体实施方式
实施例1
(一) HCM家族队列招募及疾病突变基因筛选。
HCM的诊断依据肥厚性心肌病指南及专家共识，遵照赫尔辛基宣言并通过伦理委员会审查，每名参与者均签署书面知情同意书；同时收集病史资料及临床检查资料，确定家族性遗传性肥厚型心肌病家系；对研究对象采集静脉血10ml保存。委托深圳华大临床检验中心利用目标基因靶向捕获高通量测序技术筛选致病突变基因。利用外显子捕获技术针对HCM相关的16个基因，包括ACTC1、LAMP2、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPMI、PRKAG2、CSRP3、GLA、VCL、TNNC1、TTR等编码肌小节蛋白的常见致病基因对HCM家系成员进行高通量测序。我们筛查出一个家系有3例（I-1,II-2,II-3）确诊为家族性肥厚型心肌病（HCM），其中发现2例MYBPC3 c.3369-3370 insC突变（II-2,II-3），患者DNA测序分析电泳图显示MYBPC3基因在C.3369 - 3370 insC位置发生框移杂合突变，使半胱氨酸转化为亮氨酸（p.Cys1124Leufs*25; EX31/CDS31; Het;）（图2）。暂无该位点致病性的相关文献报道。
二) 人外周血单个核细胞（PBMNC）的分离和培养
选择家系中II-2（65岁，男性，先证者）患者，采集5ml患者静脉血（5ml）于肝素钠抗凝管中，将抗凝血加入淋巴细胞分离管(Nuwacell Ltd)中离心分离PBMNC，将收集到的PBMNC在4ml PBMNC扩增培养基(Nuwacell Ltd)重悬，分别接种于6孔板的2个孔中培养，培养期间每4天补加2ml PBMNC扩增培养基(Nuwacell Ltd)。
(三) 重编程过程
将冷冻的PBMNC解冻并接种至纤连蛋白包被的培养板上进行扩增培养，在CD34+细胞扩增培养基中（StemSpan SFEM ，STEMCELL Technologies) 添加EX-CYTE growthenhancement media supplement (1:1000, Millipore, Billerica, MA), 2 mMGlutaMAX, 250 ng/ml SCF, 250 ng/ml FLT3L, 100 ng/ml TPO, 20 ng/ml IL-3, 50ng/ml IL-6 and 10 ng/ml sIL6-R (all from Peprotech, Rocky Hill, NJ).），扩增培养第7天的细胞进行重编程。
Episomal重编程载体包含人类OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC、KLF4和SV40LT基因（图3，由中盛溯源馈赠）。扩增培养后的PBMNC细胞，用Human CD34+ Cell NucleofectorKit（VPA-1003，Amaxa）和15-20ug质粒DNA混合进行核转染，每次核转染细胞数为1×106，质粒DNA比例为3.0 µg of pEP4EO2SEN2K, 3.2 µg of pEP4EO2SET2K and 2.4 µg ofpCEP4-M2L。核转染程序为T-16。核转染后的细胞立即接种到预先铺好纤连蛋白/基质凝胶的6孔板中，纤维连接蛋白与基质凝胶一起使用，可促进细胞从核转染中恢复。转染后第2天至第11天用含有N-2 (1X, ThermoFisher Scientific), B-27 (1X, ThermoFisherScientific), bFGF (100 ng/ml, Peprotech), PD0325901 (0.5 uM Stemgent),CHIR99021 (3 uM, Stemgent), A-83-01 (0.5 uM, Stemgent), hLIF (1000 U/ml,Millipore), HA-100 (10uM, Santa Cruz Biotechnology) 的DMEM/F12 培养液进行换液，然后使用hPSC培养液（NuwaCell Ltd）进行iPSC扩增。图4可见传代第6代第三天（P6,Day3）的细胞克隆，显微镜下可见细胞呈典型的克隆状生长，克隆呈集落状、隆起的圆形或者椭圆形，边界清晰（图4A，40X），细胞团内细胞排列紧密，界限和形态不易区分（图4B，200X），最终获得细胞系HCM-iPSC，即为携带肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) c.3369-3370insC突变的肥厚性心肌病（HCM）特异性诱导多能干细胞系FJMA0001i-HCM。
(四) RNA提取及qRT-PCR
对前述步骤获得的HCM-iPSC的总RNA提取用Trizol 试剂（10296010，invitrogen，Thermo Fisher Scientific）按照试剂盒说明书裂解细胞分离RNA，按照说明书(PrimeScript Reagent kit, DRR037A, Takara Bio)的描述1ug RNA作为模板进行反转录成cDNA， 37℃孵育15 min, 85℃孵育5秒。用SYBR Premix Ex Taq (RR820A, Takara Bio)在7500 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)对转基因表达进行qPCR分析。
PCR 反应条件为 94℃ for 30 s，1 cycle； 94℃for 5 sec，60℃ for 15 sec，repeated for 45 cycles; 72℃，10s，1 cycle。以 RPL13α 为参考基因。
表1为所用的上下游引物。为了评估HCM-iPSC(即图中的20180803CQ-C2-P6)、MSC-P3（指MSC传代到第三代的细胞）和hESC-H1中多能性基因的差异表达，我们使用f(x)=2-△△CT对qRT-PCR结果进行分析。Real-time PCR显示，与MSC-P3相比，HCM-iPSC(20180803CQ-C2-P6)和hESC-H1中POU5F1(蓝色)和NANOG(橙色)基因的表达增加（图5）。
表1 qRT-PCR上下游引物
（五）多能性标记物的流式细胞术分析
HCM-iPSC用消化液消化5分钟成单细胞悬液，1 500 r/min的速度离心5 min，用20%山羊血清的FACS缓冲液重悬。HCM-iPSC与PE标记的anti-TRA1-81 抗体(12-8883-82,Thermo) or或anti-SSEA-4 抗体 (MA1-021-PE, Thermo)（表2） 4 ℃孵育30 min，以Isotype为同型对照，以流式细胞仪（Beckman）和FlowJo (FlowJo Enterpirse)软件进行分析。结果显示HCM-iPSCs同时表达SSEA4和tra1 -81(图6)，说明它们处于未分化状态。
表2. 流式细胞术抗体
（六）核型分析
当6孔板细胞汇合度为60%时，加入50ng/ml的秋水仙碱，37℃孵育2h。细胞制成单细胞悬液，与固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）混合4℃过夜。沉淀的细胞滴到预冷的玻片上然后在75℃干燥1-2小时，玻片用jimsa (5ml jimsa +45ml PBS)染色后再室温干燥以备核型分析。GTG分析提示该细胞系显示正常的男性核型（46,XY）（图7）。
（七）体内分化实验—畸胎瘤形成试验
将2-4×106个HCM-iPSC (P6)注射到6周龄免疫缺陷SCID beige mice的后肢肌肉中。2个月后，将移植物解剖并以4% PFA固定4℃ 24h，然后石蜡包埋。将标本切成4mm厚以HE进行染色。结果如图8显示，包含所有三胚层的移植物中的畸胎瘤，A:神经组织(外胚层)，B:软骨(中胚层)，C:原肠(内胚层)，标尺:100毫米。
（八）HCM-iPSC外源性重编程基因丢失检测
提取HCM-iPSC细胞样本总DNA，采用实时荧光定量PCR(引物见表1)测定OCT4和gEBNA1的Ct值，检测HCM-iPSC外源基因重编程缺失情况。采用标准曲线Y(n) (Y=1.0896X+0.7276)计算HCM-iPSC样本的真实gEBNA1值X(n)。在外源基因标准曲线(Y= 0.1)中，当Y(n)小于源时，视为外源基因完全丢失。
如外源基因标准曲线所示，红色点为样本HCM-iPSC（20180803CQH-C1、20180803CQH-C2、20180803CQH-C3）在标准曲线图中的位置，位于红色阴影区域，即样本的Y（n）值小于0.1个拷贝的Y（0.1），表明其外源基因丢失。
（九）HCM-iPSC的 MYBPC3基因突变验证
提取HCM-iPSC的DNA进行PCR扩增，并进行测序分析。结果提示HCM-iPSC存在相同位点的基因突变（图10）。引物序列描述如下：
（十）STR分析
以chelex法提取HCM-iPSC（20180803CQ）和病人外周血基因组DNA，在9700扩增仪（Applied Biosystems inc., USA)）按照说明书扩增21个STR位点（PowerPlex ® 21System produced by Promega）。每个STR位点的引物序列见产品说明书。在3130基因分析仪（Applied Biosystems, Inc）上进行毛细管电泳以确定PCR产物大小，以Gene Mapper IDv3.2 (AB SCIEX, Framingham, MA, USA)软件判定获得的PCR产物大小（表3），在21个STR位点电泳图中，显示一个单独的峰形（A）表示纯合子，显示两个大小相近的峰形（B）的表示杂合子（图11）。结果显示，HCM-iPSC和病人外周血基因组DNA在21个STR位点的基因型完全相同，表明他们来自同一个个体。
表3. iPSC和病人外周血STR位点
实施例2
HCM-iPSC（FJMA0001i-HCM）复苏及扩增：将冷冻保存一年的HCM-iPSC 从液氮罐中取出，37℃水浴快速解冻后移至含有hPSC培养液的离心管中，离心后采用hPSC培养液（NuwaCell Ltd）重悬，接种至六孔板进行HCM-iPSC扩增。图12可见传代第8代（P8）的细胞克隆，显微镜下可见细胞呈典型的克隆状生长（图12，40X），细胞排列紧密（图13，200X）。可见，本发明所述细胞系再经过冷冻一年后，在体外仍然可以呈克隆状稳定生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省医学科学研究院
<120> 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (1)
1.一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系，其特征在于：所述细胞系为携带肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) c.3369-3370 insC突变的肥厚性心肌病（HCM）特异性诱导多能干细胞系FJMA0001i-HCM，已于2020年7月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.19956。
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| CN202010870802.3A Active CN112011501B (zh) | 2020-08-26 | 2020-08-26 | 一种携带c.3369-3370 insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112011501B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913655A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-30 | 浙江大学 | 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法 |
| CN116554297A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-08-08 | 中国医科大学附属第一医院 | 一种α-肌球蛋白突变体及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2762165A2 (en) * | 2008-09-30 | 2014-08-06 | CureVac GmbH | Composition comprising a complexed (m)RNA and a naked mRNA for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
| CN103987854A (zh) * | 2011-07-21 | 2014-08-13 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法 |
| CN105039399A (zh) * | 2014-04-23 | 2015-11-11 | 复旦大学 | 多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法 |
| CN105378089A (zh) * | 2013-04-17 | 2016-03-02 | 汉堡-艾本德大学医学中心 | 治疗心肌病的基因治疗载体 |
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-
2020
- 2020-08-26 CN CN202010870802.3A patent/CN112011501B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913655A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-30 | 浙江大学 | 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法 |
| CN108913655B (zh) * | 2018-07-16 | 2022-07-15 | 浙江大学 | 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法 |
| CN116554297A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-08-08 | 中国医科大学附属第一医院 | 一种α-肌球蛋白突变体及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112011501B (zh) | 2022-11-08 |
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