CN112007039B - 一种包含氟西汀和维生素d3或其衍生物的组合物，及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种组合物，该组合物在制备用于治疗和/或缓解色素减退性疾病的药物中的应用以及包含所述组合物的药物制剂。所述组合物包含氟西汀和VD₃或其衍生物。在所述组合物中，氟西汀可以联合协同VD₃衍生物促进黑素的合成，相比单用VD₃衍生物或氟西汀效果更优，氟西汀联合VD₃衍生物不但能够提高疗效，且可以降低VD₃衍生物或氟西汀的使用剂量，减少毒副作用的发生。

Description

一种包含氟西汀和维生素D3或其衍生物的组合物，及其应用

技术领域

本发明涉及用于治疗和/或缓解色素减退性疾病的药物领域，更具体而言，涉及一种包含氟西汀和VD₃或其衍生物的组合物，以及其在制备用于治疗和/或缓解色素减退性疾病的药物中的应用，以及包含所述组合物的药物制剂。

背景技术

色素减退性疾病是一种以皮肤局部色素脱失为主要临床病症的常见皮肤病，如白癜风、白发、白色糠疹、贫血痣等，其中以白癜风和白发最为常见。白癜风是一种以皮肤出现局部或泛发性色素脱失斑为临床特征的色素脱失性皮肤病，好发于儿童和青少年时期。白发指头发全部或部分变白，可分为先天性和后天性两种。先天性白发往往有家族史；后天性白发有老年性白发和青少年、中年人所患的早年性白发两种。色素减退性疾病的主要表现是皮肤或者毛发中黑素细胞的缺失或者黑素合成功能的缺失。皮肤中黑素主要分布于皮肤表皮基底层中的黑素细胞中，皮肤表皮起源于胚胎外胚层，主要由角朊细胞(约占表皮细胞的 80％-90％)、非角朊细胞(又称树枝状细胞，主要为黑素细胞。约占表皮细胞的2％-3％)、朗格汉斯细胞及Merkel细胞组成。黑素细胞主要分布在皮肤基底层、眼睛虹膜及毛囊等部位，尤以表皮分布最为广泛。在表皮基底层的黑素细胞总数为20亿，表皮中的黑素细胞是决定皮肤颜色及抵御紫外线照射损伤的关键元件。因此，表皮黑素细胞损伤或者合成黑素的功能异常时皮肤会出现色素紊乱或其他疾病，如白癜风、白发、痣或黑色素细胞瘤(melanoma)^[1]。

专利ZL201110403173.4、CA2,877,423A公开了氟西汀具有治疗色素脱失性疾病的用途，其中主要描述了氟西汀可以促进B16F10细胞及正常人皮肤色素细胞的黑素合成，促进黑素合成相关蛋白表达的上调。同时，氟西汀口服给药可以促进C57BL/6小鼠黑素合成的皮肤色素合成相关蛋白的表达。首次提出应用氟西汀治疗色素脱失性疾病。文献报道氟西汀口服20mg/kg可促使正常小鼠皮肤颜色着色可能与其调控皮肤中 5-HT1A受体的表达有关^[2]。同时，口服2.6mg/kg氟西汀可通过调控皮肤中5-HT1A受体和5-HT2A受体改善慢性不可预见应激和慢性束缚应激诱导的C57BL/6小鼠背部脱毛皮肤色素减退^[3]。美国专利US9,833,424B2 公开了氟西汀制备成外用制剂在0.1％g/g规格时具备治疗白癜风的用途。以上专利及文献均显示氟西汀在一定的剂量范围内(2.6mg/kg-20mg/kg) 具有治疗色素脱失性疾病的用途。

临床研究发现白癜风患者中维生素D及其代谢产物1,25-二羟基维生素D₃(1,25-(OH)₂D₃)水平相比正常人较低可能与白癜风的发病有关^[4]。白癜风患者体内自身抗体Ig高表达，可通过补体溶解和细胞毒作用致使黑素细胞破坏而形成白斑。1,25-(OH)₂D₃可通过抑制自身抗体的产生从而减少自身抗体对黑素细胞的破坏作用^[5]。同时，VD₃衍生物卡泊三醇可通过调控黑素细胞的自噬过程影响黑素细胞的树突从而降低氧化应激对黑素细胞的损伤^[6]。研究结果提示皮肤微环境可影响黑素细胞功能，卡泊三醇通过调控免疫细胞的功能从而改善黑素细胞的生存环境，从而避免黑素细胞的凋亡和黑素合成功能的缺失。虽然白癜风的诊疗共识 (2018版)建议使用VD₃衍生物治疗白癜风^[7,8]，其中具有代表性的药物是他卡西醇和卡泊三醇，但其临床适应症是银屑病。卡泊三醇1991年首次由利奥(Leo)公司上市局部用于治疗银屑病的药物。2002年Leo 公司分别以卡泊三醇搽剂(商品名：达力士；规格：50μg/ml(约50μg/g) 和卡泊三醇软膏(calcipotriol ointment；规格：50μg/g)进入中国市场。

文献报道卡泊三醇(10^-9-10^-5mol/L)即约4.13×10^-4-4.13μg/g可以促进正常黑素细胞的黑素合成^[9]。但是临床报道卡泊三醇软膏(50μg/g) 在用于银屑病的治疗过程中用于脸部易出现红疹、潮红等副作用，同时可能出现血钙含量升高的风险^[10]。而临床使用氟西汀(20mg/天)口服长期应用过程中易出现失眠、嗜睡、自杀、神经病症等副作用^[11]。中国专利公开号107375428A公开了一种氟西汀与中药联合应用治疗白癜风的方法。

经过长期而深入的研究，本发明的发明人发现当将氟西汀联合VD₃衍生物治疗白癜风能够产生较好的协同治疗白癜风的作用，同时，可减少氟西汀与卡泊三醇单药剂量从而避免单药临床使用过程中出现的副作用。

氟西汀可以联合协同VD₃衍生物促进黑素的合成，相比单用VD₃衍生物或氟西汀效果更优，氟西汀联合VD₃衍生物不但能够提高疗效，且可以降低VD₃衍生物或氟西汀的使用剂量，减少毒副作用的发生。

发明内容

本发明的发明人发现氟西汀联合VD₃或其衍生物可有效降低两者的毒性，同时氟西汀可协同VD₃及其衍生物剂量依赖性地促进黑素合成增加，并且能剂量依赖性地促进酪氨酸酶活性增加，因此可以用于治疗或改善黑素合成减少导致的色素脱色性疾病。白癜风患者体内维生素D₃含量下降，会导致5-HT水平降低，氟西汀为5-HT重摄取抑制剂，氟西汀与VD₃及其衍生物联合使用可达到恢复体内5-HT水平至正常水平。发明人发现一定剂量范围的氟西汀(0.01-10mg/g)和卡泊三醇(0.5-50μg/g) 联合使用时能够产生协同作用，产生的促黑素合成作用优于单用氟西汀和卡泊三醇时的效果，同时优于氟西汀和卡泊三醇分别使用时的药效。这样在临床使用卡泊三醇或氟西汀治疗色素脱失疾病过程中联合使用不但能提高药效，且在保证药效的基础上可降低剂量减少副作用。

因此，本发明的目的在于提供一种氟西汀和维生素D₃(VD₃)或其衍生物的组合物，所述组合物在制备用于治疗或缓解色素减退性疾病的药物中的应用以及包含所述组合物的制剂。

本发明的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种组合物，其包含氟西汀和VD₃或其衍生物，所述组合物用于治疗和/或缓解色素减退性疾病。

优选地，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为10以上，优选 20以上。

优选地，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为500以下，优选 400以下，更优选200以下。

优选地，所述氟西汀选自氟西汀外消旋体、R-氟西汀或它们的药学上可接受的盐。

优选地，所述VD₃或其衍生物选自VD₃、卡泊三醇、钙泊三醇、骨化三醇和他卡西醇中的一种或多种。

所述组合物可以进一步包含药学上可接受的辅料，只要该辅料不损害本发明的目的即可，其示例性的实例包括，但不限于，乳化剂、抗氧化剂、润湿剂、保湿剂、表面活性剂、高分子化合物、pH调节剂、金属离子络合剂、抛射剂、溶剂、液体油脂类等。

在所述组合物包含辅料的情况下，所述氟西汀的含量为0.01～10 mg/g组合物，优选0.01～5mg/g组合物，更优选0.1～1mg/g组合物。

优选地，所述VD₃或其衍生物的含量为0.005～500μg/g组合物，优选0.5～250μg/g组合物，更优选5～50μg/g组合物。

根据本发明的另一方面，其提供了上述组合物在制备用于治疗和/ 或缓解色素减退性疾病的药物中的应用。

所述色素脱色疾病为黑素合成减少引起的疾病，其选自白癜风、白发、白色糠疹、贫血痣或白化病等。

根据本发明的又一方面，其提供了一种制剂，其包含本发明所述的组合物。

所述制剂选自乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、溶液剂、芳香水剂、酊剂、醑剂、甘油剂、溶胶剂、混悬剂、乳剂、搽剂、涂膜剂、糊剂、洗剂、搽剂和酊剂等。

根据本发明的再一方面，其提供了一种治疗色素脱色疾病的方法，其包括：外用给药方式在皮肤上涂覆本发明所述的组合物或由所述组合物制成的制剂。

优选地，在所述的组合物或由所述组合物制成的制剂中，所述氟西汀的浓度为0.01～10mg/g组合物，优选0.01～5mg/g组合物，更优选0.1～1 mg/g组合物。

所述色素脱色疾病为黑素合成减少引起的疾病，其选自白癜风、白发、白色糠疹、贫血痣或白化病等。

本发明所述的组合物中的R-氟西汀和VD₃或其衍生物相互协同降低彼此毒性并协同促进黑素合成，增加酪氨酸酶的活性。因此，能够有效地治疗和/或缓解色素减退性疾病。

附图说明

图1为显示实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7的部分实验的流程图。

图2为显示在实施例1中单独使用氟西汀、VD₃、卡泊三醇、他卡西醇时对斑马鱼的存活率影响的图。

图3为显示在实施例2的2.1部分中的氟西汀与不同浓度VD₃联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图4为显示在实施例2的2.2部分中的氟西汀与不同浓度卡泊三醇联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图5为显示在实施例2的2.3部分中的氟西汀与不同浓度他卡西醇联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图6为显示在实施例2的2.4部分中的VD₃与不同浓度氟西汀联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图7为显示实施例2的2.5部分中的卡泊三醇与不同浓度氟西汀联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图8为显示实施例2的2.6部分中的他卡西醇与不同浓度氟西汀联合使用时对斑马鱼存活率影响的图。

图9为显示在实施例3的3.1部分中单用氟西汀对斑马鱼黑素含量影响的图。

图10为显示在实施例3的3.1部分中氟西汀单用时量效关系的拟合图。

图11为显示在实施例3的3.2部分中单用氟西汀对斑马鱼酪氨酸酶活性影响的图。

图12为显示在实施例4的4.1部分中单用维生素D₃对斑马鱼黑素含量的影响的图。

图13为显示在实施例4的4.1部分中单用维生素D₃量效关系的拟合图

图14为显示在实施例4的4.2部分中单用卡泊三醇对斑马鱼酪氨酸酶活性影响的图。

图15为显示在实施例5的5.1部分中的单用卡泊三醇对斑马鱼黑素含量的影响的图。

图16为显示实施例5的5.1部分中单用卡泊三醇量效关系的拟合图。

图17为显示在实施例5的5.2部分中单用卡泊三醇对斑马鱼酪氨酸酶活性影响的图。

图18为显示实施例6的6.1部分的合用中氟西汀与维生素D₃不同比例对斑马鱼黑素影响的图。

图19为显示实施例6的6.2部分的合用组中以维生素D₃浓度为横坐标的预期相加效应图和实际效应的图。

图20为显示实施例7的7.1部分的合用组中以卡泊三醇浓度为横坐标的预期相加效应图和实际效应图。

图21为显示在实施例8的8.4部分中的氟西汀乳膏、卡泊三醇乳膏、氟西汀乳膏加卡泊三醇乳膏、氟西汀卡泊三醇复方乳膏对经松香石蜡物理脱毛氢醌模型C57BL/6小鼠背部皮肤颜色影响的效果的图。

图22为显示在实施例8的8.4部分中的氟西汀乳膏、卡泊三醇乳膏、氟西汀乳膏加卡泊三醇乳膏、氟西汀卡泊三醇复方乳膏对经松香石蜡物理脱毛氢醌模型C57BL/6小鼠背部皮肤毛囊HE染色影响的效果的图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。以下实施例如无特殊说明，氟西汀指的是氟西汀外消旋体盐酸盐和R-氟西汀盐酸盐。以下实施例及附图中Flu为氟西汀的简写，VD₃为维生素D₃的简写，Cal为卡泊三醇的简写，Tal为他卡西醇的简写。实施例斑马鱼实验和小鼠实验中的剂量折算于临床使用剂量的0.01和0.081，即实施例中氟西汀作用于斑马鱼的剂量范围为0.1-100μg/ml换算成临床剂量为0.01-10mg/ml或 0.01-10mg/g，具体的换算方法见参考文献^[12]。实施例中C57BL/6小鼠购自于扬州大学实验动物中心；斑马鱼成鱼购自于国家斑马鱼资源中心，胚胎是实验室自行孵化获得；氟西汀购自于浙江普洛家园药业有限公司；卡泊三醇购自于上海易势化工有限公司；维生素D₃、PTU和他卡西醇购自于Sigma公司。

实施例1：

1.1氟西汀、维生素D₃、卡泊三醇、他卡西醇单用时对斑马鱼存活率的影响对斑马鱼受精获得胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU(1-苯基-2-硫脲，PTU是一种可逆的酪氨酸酶抑制剂)35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU的水溶液中培养至胚胎发育35小时，然后再将斑马鱼胚胎放入纯化水继续培养25小时，观察斑马鱼的成活率；

PTU35h+氟西汀处理组：除了分别用浓度为0.1、1、10、100μg/ml 的氟西汀的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+卡泊三醇处理组：除了分别用浓度为0.005、0.05、0.5、5 μg/ml的卡泊三醇水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+他卡西醇处理组：除了分别用浓度为0.005、0.05、0.5、5 μg/ml的他卡西醇水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+维生素D₃处理组：除了分别用浓度为0.005、0.05、0.5、5 μg/ml的维生素D₃水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作。结果示于图2中，其中，与Control相比，^*表示P<0.05，^***表示P<0.001。

如图2所示，维生素D₃在5μg/ml剂量下对斑马鱼的存活率具有显著的抑制作用，IC₅₀＝4.5μg/ml；卡泊三醇在5μg/ml剂量下对斑马鱼的存活率具有显著的抑制作用，IC₅₀＝3.5μg/ml；他卡西醇在5μg/ml剂量下对斑马鱼的存活率具有显著的抑制作用，IC₅₀＝4.0μg/ml；氟西汀在100 μg/ml剂量下对斑马鱼的存活率有显著性影响，IC₅₀＝89.7μg/ml。

实施例2：

2.1氟西汀(100μg/ml)联合不同浓度维生素D₃对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：进行与实施例1中的PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)处理组：除了用浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)+维生素D₃(0.005-0.5μg/ml)处理组：除了向浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液中分别进一步加入浓度为 0.005、0.05、0.5μg/ml的维生素D₃之外，进行与上述PTU35h+氟西汀(100 μg/ml)处理组相同的操作。

结果示于图3中，与PTU35h处理相比，^***表示P<0.001；与氟西汀 (100μg/ml)组相比，^##表示P<0.01，^###表示P<0.001。

如图3所示，氟西汀在100μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着维生素D₃的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果提示维生素D₃与氟西汀联合使用时可以降低氟西汀对斑马鱼的毒性。

2.2氟西汀(100μg/ml)联合不同浓度卡泊三醇对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：与实施例1中的PTU35h处理进行相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)处理组：除了用浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)+卡泊三醇(0.005-0.5μg/ml)处理组：除了向浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液中分别进一步加入浓度为 0.005、0.05、0.5μg/ml的卡泊三醇之外，进行与上述PTU35h+氟西汀(100 μg/ml)组相同的操作。

结果示于图4中，与PTU35h处理组相比，^***表示P<0.001；与氟西汀(100μg/ml)组相比，^##表示P<0.01，^###表示P<0.001，ns表示P>0.05。

如图4所示，氟西汀在100μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着卡泊三醇的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果提示卡泊三醇与氟西汀联合使用时可以降低氟西汀对斑马鱼的毒性。

2.3氟西汀(100μg/ml)联合不同浓度他卡西醇对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：进行与实施例1中的PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)处理组：除了用浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h组相同的操作；

PTU35h+氟西汀(100μg/ml)+他卡西醇(0.005-0.5μg/ml)处理组：除了向浓度为100μg/ml的氟西汀的水溶液中分别进一步加入浓度为 0.005、0.05、0.5μg/ml的他卡西醇之外，进行与上述PTU35h+氟西汀(100 μg/ml)处理组相同的操作。

结果示于图5中，与PTU35h处理组相比，^***表示P<0.001；与氟西汀(100μg/ml)组相比，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01，ns表示P>0.05。

如图5所示，氟西汀在100μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着他卡西醇的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果显示他卡西醇与氟西汀联合使用时可以降低氟西汀对斑马鱼的毒性。

2.4维生素D₃(5μg/ml)联合不同浓度氟西汀对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：进行与实施例1中的PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+维生素D₃(5μg/ml)处理组：除了用浓度为5μg/ml的维生素D₃的水溶液代替纯水之外，进行与实施例1中PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+维生素D₃(5μg/ml)+氟西汀(0.1-10μg/ml)处理组：除了向浓度为5μg/ml的维生素D₃的水溶液中分别进一步加入浓度为0.1、 1、10μg/ml的氟西汀之外，进行与上述PTU35h+维生素D₃(5μg/ml) 处理组相同的操作。

结果示于图6中，与PTU35h处理组相比，^***表示P<0.001；与维生素D₃(5μg/ml)组相比，^##表示P<0.01，ns表示P>0.05。

如图6所示，维生素D₃在5μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着氟西汀的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果提示维生素D₃与氟西汀联合使用时也可以降低维生素D₃对斑马鱼的毒性。

2.5卡泊三醇(5μg/ml)联合不同浓度氟西汀对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：进行与实施例1中的PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+卡泊三醇(5μg/ml)处理组：除了用浓度为5μg/ml的卡泊三醇的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+卡泊三醇(5μg/ml)+氟西汀(0.1-10μg/ml)处理组：除了向浓度为5μg/ml的卡泊三醇的水溶液中分别进一步加入浓度为0.1、 1、10μg/ml的氟西汀之外，进行与上述PTU35h+卡泊三醇(5μg/ml) 处理组相同的操作。

结果示于图7中，与PTU35h处理组相比^***表示P<0.001；与卡泊三醇(5μg/ml)组相比，^###表示P<0.001，ns表示P>0.05。

如图7所示，卡泊三醇在5μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着氟西汀的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果提示卡泊三醇与氟西汀联合使用时也可以降低卡泊三醇对斑马鱼的毒性。

2.6他卡西醇(5μg/ml)联合不同浓度氟西汀对斑马鱼存活率的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组：即不给药组；

PTU35h处理组：进行与实施例1中的PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+他卡西醇(5μg/ml)处理组：除了用浓度为5μg/ml的他卡西醇的水溶液代替纯水之外，进行与上述PTU35h处理组相同的操作；

PTU35h+他卡西醇(5μg/ml)+氟西汀(0.1-10μg/ml)处理组：除了向浓度为5μg/ml的他卡西醇的水溶液分别进一步加入浓度为0.1、1、 10μg/ml的氟西汀之外，进行与上述PTU35h+他卡西醇(5μg/ml)处理组相同的操作。

结果示于图8中，与PTU35h处理组相比，^***表示P<0.001；与他卡西醇(5μg/ml)组相比，^###表示P<0.001，ns表示P>0.05。

如图8所示，他卡西醇在5μg/ml时对斑马鱼的存活率具有显著性的抑制作用，随着氟西汀的加入剂量的升高斑马鱼的死亡率逐渐降低。结果提示他卡西醇与氟西汀联合使用时可以降低卡泊三醇对斑马鱼的毒性。

实施例3：

3.1氟西汀单用时对斑马鱼黑素含量的影响

将斑马鱼进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60h；

PTU 35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU 的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

氟西汀(0.1、0.4、1.6、6.4、25.6μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至0.1、0.4、1.6、6.4、25.6μg/ml的氟西汀水溶液中培养25小时之外，进行与上述PTU 35h处理组相同的处理。使用NaOH裂解法对斑马鱼黑素进行定量分析，收集各组斑马鱼吸掉多余的水分，加入100μl PBS在冰浴条件下超声破碎1min后，4℃，12,000 r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(BCA法)，计算总蛋白含量；下层黑素沉淀加入100μl NaOH(含10％DMSO))，置于80℃水浴中裂解2小时；将溶解完全的黑素以80μl/孔加入96孔板中，405nm波长下测定吸光度值，计算每毫克蛋白的黑素含量。所有实验重复3次，所有数据进行了单向方差分析(ANOVA)，之后还进行了Turkey测试，与正常对照组相比，^***表示P<0.001；与PTU 35h组相比，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01，ns表示P>0.05。

如图9所示，与正常对照组相比，PTU 35h处理组黑素含量明显降低，证明PTU可以导致斑马鱼色素缺失，相比PTU 35h处理组，给药氟西汀(6.4-25.6μg/ml)能剂量依赖性的促进斑马鱼黑素含量的增加。对氟西汀单用(0.1-25.6μg/ml)作用于斑马鱼黑素合成的有效率进行计算结果如表1，同时对氟西汀的量效关系进行多项式拟合后见图10。

表1氟西汀单用对斑马鱼黑素合成的有效率

C_给药组：为给药组黑素含量；

C_空白组：为空白对照组黑素含量

3.2氟西汀单用时对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响

使用L-DOPA法来测量斑马鱼酪氨酸酶活性，L-DOPA氧化法测定酪氨酸酶活性的方法如下：使用实施例3中3.1离心后获得上清液采用BCA 法进行蛋白定量，计算蛋白浓度；取含10μg蛋白体积加入96孔板，用 PBS(0.1M，pH 6.8)定量至100μl，再加入0.1％g/ml L-DOPA100μl，每一浓度设定3个复孔，37℃避光孵育60min，波长475nm处测定 OD值。所有实验重复3次，所有数据进行了单向方差分析(ANOVA)，之后还进行了Turkey测试，与正常对照组相比，^***表示P<0.001；与PTU 35h处理组相比，^###表示P<0.001，^##表示P<0.01，^#表示P<0.05，ns 表示P>0.05。

图11结果表明，相比正常对照组，PTU 35h组酪氨酸酶活性明显下降，与PTU 35h处理组相比，氟西汀(1.6-25.6μg/ml)能剂量依赖的升高斑马鱼酪氨酸酶活性。

实施例4：

4.1维生素D₃单用时对斑马鱼黑素含量的影响

将斑马鱼进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60小时；

PTU 35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU 的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

维生素D₃(0.005、0.02、0.08、0.32、1.28μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至0.005、0.02、0.08、0.32、1.28 μg/ml的维生素D₃水溶液中继续培养25小时之外，进行与上述PTU 35h 处理组相同的处理。黑素含量测定方法参考实施例3中3.1部分，与正常对照组相比^***表示P<0.001；与PTU35h处理组相比ns表示P>0.05。

如图12所示，与正常对照组相比，PTU35h处理组的黑素含量明显降低，证明PTU可以导致斑马鱼色素缺失，相比PTU35h处理组，给药维生素D₃(0.005-1.28μg/ml)虽然能部分促进斑马鱼黑素含量的增加但均没有显著性差异。对维生素D₃(0.005-1.28μg/ml)作用于斑马鱼胚胎黑素合成有效率进行计算，结果见表2，同时对维生素D3的量效关系进行多项式拟合后见图13。

表2：VD₃单用对斑马鱼黑素合成的有效率

4.2维生素D₃单用时对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60h；

PTU 35h组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU的水溶液中继续培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

维生素D₃(0.005、0.02、0.08、0.32、1.28μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至0.005、0.02、0.08、0.32、1.28 μg/ml的维生素D₃水溶液中培养25小时之外，进行与上述PTU 35h处理组相同的操作。

酪氨酸酶活性测定方法参考实施例3中3.2部分的试验方法，与正常对照组相比，^***表示P<0.001；与PTU35h处理组相比，ns表示P>0.05。

试验结果：图14结果表明，相比正常对照组，PTU 35h处理组斑马鱼酪氨酸酶活性显著降低，与PTU35h处理组相比，维生素D₃ (0.005-1.28μg/ml)剂量对斑马鱼酪氨酸酶活性没有显著性的影响。

实施例5：

5.1卡泊三醇单用时对斑马鱼黑素含量的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60h；

PTU 35h组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

卡泊三醇(0.005、0.02、0.08、0.32、1.28μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至0.005、0.02、0.08、0.32、1.28 μg/ml的卡泊三醇水溶液中培养25小时之外，进行与上述PTU 35h处理组相同的处理。黑素含量测定方法参考实施例3中3.1部分，与正常对照组相比^***表示P<0.001；与PTU35h处理组相比，ns表示P>0.05。

试验结果：如图15所示，与正常对照组相比，PTU 35h组黑素含量明显降低，证明PTU可以导致斑马鱼色素缺失，相比PTU35h处理组，给药卡泊三醇(0.005-1.28μg/ml)对斑马鱼黑素含量的增加没有显著性的影响。对卡泊三醇单用(0.005-1.28μg/ml)应用于斑马鱼黑素合成的有效率进行计算，结果见表3，同时，对卡泊三醇的量效关系进行多项式拟合后见图16。

表3：卡泊三醇单用对斑马鱼黑素合成的有效率

5.2卡泊三醇单用时对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响

将斑马鱼进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60小时；

PTU 35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU 的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

卡泊三醇(0.005、0.02、0.08、0.32、1.28μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至0.005、0.02、0.08、0.32、1.28 μg/ml的卡泊三醇水溶液中继续培养25h之外，进行与上述PTU 35h处理组相同的处理。

酪氨酸酶的测定方法参考实施例3中3.2部分的试验方法，与 Control相比^***表示P<0.001；与PTU35h相比ns表示P>0.05。

图17结果表明，相比正常对照组，PTU 35h处理组斑马鱼酪氨酸酶活性显著降低，与PTU35h处理组相比，卡泊三醇(0.005-1.28μg/ml) 剂量对斑马鱼酪氨酸酶活性没有显著性影响。

实施例6：

6.1不同比例氟西汀与VD3联合对斑马鱼黑素合成的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

正常对照组(Control)：斑马鱼受精后获得的胚胎在纯化水中培养至胚胎60小时；

PTU 35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU 的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

氟西汀+VD₃(0.005μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至含0.4μg/ml氟西汀+0.005μg/ml VD₃、0.2μg/ml氟西汀+0.005μg/ml VD₃、0.1μg/ml氟西汀+0.005μg/ml VD₃、0.05μg/ml氟西汀+0.005μg/ml VD₃、0.025μg/ml氟西汀+0.005μg/ml VD₃的水溶液中继续培养25小时之外，与上述PTU 35h处理组进行相同的处理。

黑素含量的测定参考实施例3中3.1部分。与Control相比^***表示 P<0.001；与PTU35h相比ns表示P>0.05，^#表示P<0.05。

图18结果表明，氟西汀与VD₃按照5:1，10:1，20:1，40:1，80:1 作用于斑马鱼时，在20:1时即表现出显著性差异。因此，以下实施例中以氟西汀与VD₃的比例按照20:1进行研究。

6.2氟西汀联合VD₃对斑马鱼黑素合成的影响

将斑马鱼胚胎进行如下分组：

PTU 35h处理组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU 的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

氟西汀+VD₃(0.1+0.005、0.4+0.02、1.6+0.08、6.4+0.32、25.6+1.28 μg/ml+μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至含0.1μg/ml氟西汀+0.005μg/mlVD₃、0.4μg/ml氟西汀+0.02μg/ml VD₃、 1.6μg/ml氟西汀+0.08μg/ml VD₃、6.4μg/ml氟西汀+0.32μg/ml VD₃、25.6 μg/ml氟西汀+1.28μg/ml VD₃的水溶液中继续培养25小时之外，与上述 PTU 35h处理组进行相同的处理。

黑素含量的测定参考实施例3中3.1部分。

见表4显示单用氟西汀和维生素D₃及氟西汀与维生素D₃联合使用时对斑马鱼黑素合成的有效率，通过等效剂量换算分别获得氟西汀与维生素D₃的预期相加效应见表5和表6，通过以维生素D₃的剂量为横坐标，以预期相加效应和实际效应作图，如图19所示，氟西汀与维生素D₃联合使用时的实际相加效应大于预期相加效应，对结果进行分析，结果见表7所示，氟西汀(0.1-25.6μg/ml)与维生素D₃(0.005-1.28μg/ml)在使用的剂量范围内具有相加效应。

表4：氟西汀(Flu)和维生素D₃(VD₃)单用及合用的量效关系数据

表5：氟西汀(Flu)+维生素D₃(VD₃)按固定比例合用，以氟西汀为目标药的序贯进行等效剂量兑换后，预期相加效应计算表

注：(3)：将(2)栏数据用公式2算出；(4)：将(3)栏用公式1算出； (5)：(1)栏+(4)栏；(6)：将(5)栏用公式1算出。

表6：氟西汀(Flu)+VD₃按固定比例合用，以VD₃为目标药的序贯进行等效剂量兑换后，预期相加效应计算表

注：(3)：将(2)栏数据用公式1(参见图10)算出；(4)：将(3)栏用公式2(参见图13)算出；(5)：(2)栏+(4)栏；(6)：将(5)栏用公式2(参见图13)算出。

表7：氟西汀(Flu)+维生素D₃(VD₃)按固定比例合用，序贯等效剂量兑换后，预期相加效应值的总结和合用指数计算

各栏数据说明：(3)栏：来自表5；(4)栏：来自表6；(5)栏：来自表4； (6)栏：(5)栏数据/(3)栏数据；(7)栏：(5)栏数据/(4)栏数据；(8) 栏标准见参考文献¹³。

实施例7：

7.1氟西汀联合卡泊三醇对斑马鱼黑素合成的影响

将斑马鱼进行如下分组：

PTU 35h组：将发育6小时的斑马鱼胚胎加入含0.2mM PTU的水溶液中培养29小时直至胚胎发育35小时，然后所述胚胎放置至纯化水继续培养25小时直至胚胎发育60小时；

氟西汀+卡泊三醇(0.1+0.005、0.4+0.02、1.6+0.08、6.4+0.32、25.6+1.28 μg/ml+μg/ml)处理组：除了将所述胚胎发育35小时的胚胎分别放置至含0.1μg/ml氟西汀+0.005μg/ml卡泊三醇、0.4μg/ml氟西汀+0.02μg/ml 卡泊三醇、1.6μg/ml氟西汀+0.08μg/ml卡泊三醇、6.4μg/ml氟西汀+0.32 μg/ml卡泊三醇、25.6μg/ml氟西汀+1.28μg/ml卡泊三醇的水溶液中继续培养25小时之外，进行与上述PTU 35h处理组相同的处理。

黑素含量测定方法参考实施例3中3.1部分。

见表8所示单用氟西汀和卡泊三醇及氟西汀与卡泊三醇联合使用时对斑马鱼黑素合成的有效率，通过等效剂量换算分别获得氟西汀与卡泊三醇的预期相加效应见表9和表10，通过以卡泊三醇的浓度为横坐标，以预期相加效应和实际效应作图，如图20所示，氟西汀与卡泊三醇联合使用时的实际相加效应大于预期相加效应，对结果进行分析，结果见表11所示，氟西汀(0.1-25.6μg/ml)与卡泊三醇(0.005-1.28μg/ml) 在使用的剂量范围内具有相加效应。

表8：氟西汀(Flu)和卡泊三醇(Cal)单用及合用的量效关系数据

表9：氟西汀(Flu)+卡泊三醇(Cal)按固定比例合用，以氟西汀为目标药的序贯进行等效剂量兑换后，预期相加效应计算表

注：(3)：将(2)栏数据用公式3(参见图16)算出；(4)：将(3)栏用公式1(参见图10)算出；(5)：(1)栏+(4)栏；(6)：将(5)栏用公式1(参见图10)算出。

表10：氟西汀(Flu)+卡泊三醇(Cal)按固定比例合用，以卡泊三醇为目标药的序贯进行等效剂量兑换后，预期相加效应计算表

注：(3)：将(2)栏数据用公式1(参见图10)算出；(4)：将(3)栏用公式3(参见图16)算出；(5)：(1)栏+(4)栏；(6)：将(5)栏用公式3(参见图16)算出。

表11：氟西汀(Flu)+卡泊三醇(Cal)按固定比例合用，序贯等效剂量兑换后，预期相加效应值的总结和合用指数计算

各栏数据说明：(3)栏：来自表9；(4)栏：来自表10；(5)栏：来自表 8；(6)栏：(5)栏数据/(3)栏数据；(7)栏：(5)栏数据/(4)栏数据；(8) 栏标准见参考文献¹³。

实施例8：

8.1、氟西汀卡泊三醇复方乳膏的制备

以上计量均为重量百分比，首先将十八醇、硬脂酸、液状石蜡加热至80℃或以上并保温使之熔化呈液态作为溶液Ⅰ；再将SDS、甘油、丙二醇、生育酚和纯化水加热至80℃或以上作为溶液Ⅱ；依次将过200 目筛后的氟西汀与卡泊三醇加入到溶液Ⅰ中，抽真空，边搅拌边乳化约30min，然后边搅拌乳化边降温，降温至约35℃时，停止搅拌乳化，灌装至包材中。

8.2、0.1％g/g氟西汀乳膏的制备

以上计量均为重量百分比，将十八醇、硬脂酸、液状石蜡加热至 80℃或以上并保温使之熔化呈液态作为溶液Ⅰ；再将SDS、甘油、丙二醇、生育酚和纯化水加热至80℃或以上作为溶液Ⅱ；将过200目筛后的氟西汀加入到溶液Ⅰ中，抽真空，边搅拌边乳化约30min，然后边搅拌乳化边降温，降温至约35℃时，停止搅拌乳化，灌装至包材中。

8.3、0.005％卡泊三醇乳膏的制备

以上计量均为重量百分比，首先将十八醇、硬脂酸、液状石蜡加热至80℃或以上并保温使之熔化呈液态作为溶液Ⅰ；再将SDS、甘油、丙二醇、生育酚和纯化水加热至80℃或以上作为溶液Ⅱ；将过200目筛后的卡泊三醇加入到溶液Ⅰ中，抽真空，边搅拌边乳化约30min，然后边搅拌乳化边降温，降温至约35℃时，停止搅拌乳化，灌装至包材中。

8.4、氟西汀卡泊三醇复方乳膏剂对C57BL/6小鼠黑素合成的影响

分别选用上述制备的0.1％g/g氟西汀乳膏和0.005％g/g卡泊三醇乳膏及含0.1％g/g氟西汀和0.005％g/g卡泊三醇的复方乳膏研究其对氢醌模型C57BL/6小鼠黑素合成的影响。

健康6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠70只，适应性喂养1周后，按体重随机分为(1)正常对照组(Control)、(2)氢醌模型组(Model)、 (3)空白基质组(Matrix)、(4)0.1％g/g氟西汀乳膏剂组、(5)0.005％ g/g卡泊三醇乳膏剂组、(6)0.1％g/g氟西汀乳膏和0.005％g/g卡泊三醇乳膏分时段给药组、(7)0.1％g/g氟西汀与0.005％g/g卡泊三醇复方乳膏剂组、(8)甲氧沙林组(购自于重庆华邦制药股份有限公司)。各软膏给药剂量均为16.35mg/cm²。采用松香石蜡进行背部脱毛后(1) 正常对照组不做处理，(2)模型组上午涂抹2.5％氢醌凝胶10天后开始给药，模型组只给予2.5％氢醌；(3)基质组在上午涂抹氢醌的基础上下午涂抹空白基质；(4)0.1％氟西汀乳膏剂组下午涂抹0.1％g/g氟西汀乳膏；(5)0.005％卡泊三醇乳膏剂组下午涂抹卡泊三醇乳膏；(6) 组先涂抹0.1％g/g氟西汀12h后涂抹0.005％g/g卡泊三醇；(7)复方乳膏涂抹剂量为16.25mg/cm²复方乳膏；(8)甲氧沙林组涂抹甲氧沙林0.1ml，脱毛后开始每天对C57BL/6小鼠背部皮肤进行拍照观察，给药30天后脱颈椎处死小鼠，取背部给药部位皮肤置于4％多聚甲醛中固定后进行HE切片。

外观观察与HE染色结果如图21和图22所示，与正常对照组相比，氢醌模型组背部皮肤颜色明显降低，毛囊中黑素下降；基质组与模型组相当；氟西汀乳膏组背部皮肤颜色相比基质组明显加深，毛囊中黑素增多；卡泊三醇乳膏剂组皮肤颜色也有一定的加深，毛囊中黑素相对基质组增多；氟西汀乳膏和卡泊三醇乳膏分时段使用时皮肤颜色和毛囊中黑素增多，但是相比较于单独使用氟西汀乳膏和单独使用卡泊三醇乳膏皮肤颜色与毛囊黑素的变化不明显，而复方乳膏制剂组背部皮肤颜色及毛囊黑素含量明显强于氟西汀组和卡泊三醇乳膏剂单独使用组；效果强于氟西汀乳膏和卡泊三醇乳膏分时段给药。

参考文献：

[1]王晓艳,王婷琳,周城,等.中国六省市白癜风流行病学调查[J]. 中华皮肤科杂志,2010,43(7):463-466.

[2]Liao S,Shang J,Tian X,et al.Up-regulation of melanin synthesis bythe antidepressant fluoxetine[J].Experimental Dermatology,2012, 21(8):635-637.

[3]Zhou L,Cai M,Ren Y,et al.The different roles of 5-HT1A/2Areceptors in fluoxetine ameliorated pigmentation of C57BL/6 mouse skin inresponse to stress[J].Journal of Dermatological Science,2018, 92(3):222-229.

[4]顾文涛,许辉,马红,等.白癜风患者血清25-羟维生素D水平检测及卡泊三醇治疗的疗效观察[J].临床皮肤科杂志,2016(8):572-574.

[5]宋文婷,赵广.白癜风与自身免疫研究进展[J].中国美容医学,2011,20(2):327-330.

[6]Gong Q,Li X,Sun J,et al.The effects of calcipotriol on thedendritic morphology of human melanocytes under oxidative stress and apossible mechanism:Is it a mitochondrial protector？[J].Journal ofDermatological Science,2015,77(2):117-124.

[7]张倩.他卡西醇及卡泊三醇软膏治疗轻中度白癜风的系统评价 [J].基层医学论坛,2018(14).

[8]顾文涛,许辉,马红,等.白癜风患者血清25-羟维生素D水平检测及卡泊三醇治疗的疗效观察[J].临床皮肤科杂志,2016(8):572-574.

[9]汤芦艳,傅雯雯,张勇,等.卡泊三醇对黑素细胞黑素合成的影响[J].中华皮肤科杂志,2009,42(11):771-773.

[10]Khullar G,Kanwar A J,Singh S,et al.Comparison of efficacy andsafety profile of topical calcipotriol ointment in combination with NB-UVBvs.NB-UVB alone in the treatment of vitiligo:a 24-week prospective right–leftcomparative clinical trial[J].Journal of the European Academy of Dermatologyand Venereology,2014,29(5):925-932.

[11]Coulter D M,Pillans P I.Fluoxetine and extrapyramidal sideeffects.[J].American Journal of Psychiatry,1989,146(10):1352-3.

[12]黄继汉,黄晓晖,陈志扬,et al.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学,2004, 9(9):1069-1072.

[13]袁守军.多药合用药效相加的数学规律及协同拮抗的定量计算方法[M].江苏凤凰科学技术出版社,2016,第一版。

Claims (9)

1.一种包含氟西汀和VD₃或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或缓解色素减退性疾病的药物中的应用，其中，所述衍生物选自卡泊三醇或他卡西醇中的一种，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为10以上且500以下，所述氟西汀选自氟西汀外消旋体、R-氟西汀或它们的药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为20以上。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为400以下。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氟西汀与VD₃或其衍生物的重量比为200以下。

5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的应用，其中，所述色素脱色疾病选自白癜风、白发、白色糠疹、贫血痣或白化病。

7.根据权利要求1至5中的任一项所述的应用，其中，所述组合物被制备成制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述制剂选自乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、芳香水剂、酊剂、醑剂、甘油剂、溶胶剂、混悬剂、乳剂、搽剂、涂膜剂、糊剂和洗剂。

9.根据权利要求7所述的应用，其中，所述制剂为溶液剂。

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