CN111996219B - 一种辅酶q10的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅酶Q10的发酵方法，属于微生物发酵领域，方法中分周期控制铵离子浓度，发酵培养基中添加赖氨酸盐并且在发酵过程中再次补入赖氨酸盐，发酵过程中补加一次硫酸钠。该发酵控制工艺使辅酶Q10产生菌的生长和代谢能力明显增强，菌体量明显增加，辅酶Q10发酵单位增长快，辅酶Q10放罐效价达到4000mg/L以上，发酵周期明显延长，菌体容易过滤收集，辅酶Q10的批产量大幅增加，明显降低了辅酶Q10的发酵成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅酶Q10的发酵方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
辅酶Q10(Ubiquinone-10)是一种天然存在的脂溶性醌类化合物，又名癸烯醌、泛醌-10，化学名称为：2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊二烯基-1,4-苯醌(2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzoquinone)，分子式为：C59H90O4，分子量为：863.37，结构式为：
该化合物为黄色至橙黄色结晶性粉末，无臭，无味，易溶于苯、丙酮、及乙醚，几乎不溶于水及甲醇，日光直射下不稳定，辅酶Q10在自然界中分布广泛，主要存在于酵母、植物叶子、种子及动物的心、肝和肾的细胞中特别是哺乳动物富含线粒体的生物膜中，在人类的心、肝、肾及胰腺中含量较高，辅酶Q10能激活细胞呼吸、加速产生具有高能量的ATP，加强心肌新陈代谢功能，提高心脏跳动效率，治疗心血管疾病，如缺血性心脏病、风湿性心脏病，心肌炎，心绞痛，心律不齐及降低高血压等症；辅酶Q10还能抑制线粒体的过氧化，保护生物膜结构完整性，具有提高人体免疫力、延缓衰老和增强人体活力等功能。辅酶Q10在心血管疾病、癌症综合治疗、预防牙病等方面具有较明显的疗效。同时，在保健品及化妆品领域的有效应用已显示出其强劲的需求。
目前国内外工业化生产辅酶Q10的技术为微生物发酵法。利用类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)为辅酶Q10发酵菌种，该菌种通过斜面或摇瓶菌液接种，三级发酵。所用培养基为常用的葡萄糖、玉米浆粉、硫酸铵、硫酸镁、氯化铁、氯化钠、味精、磷酸二氢钾和微量元素等，发酵过程中补入葡萄糖、氨水和磷元素，发酵罐温度为32-35℃，利用氨水将发酵罐pH控制在6.5-7.0。如公开号为CN102168115的中国发明专利一种辅酶Q10工业化生产方法中描述：通过加入关键存进因子，控制溶磷含量，控制氨基氮含量，补入3倍浓缩的发酵基础料等方法提高辅酶Q10的发酵单位，发酵单位达到3400mg/L；公开号为CN104561154的中国发明专利一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略中描述：以发酵过程中菌体形态过渡期作为工艺参数调整的时间点，调整发酵罐的通气量、罐压和搅拌转速等方法提高辅酶Q10的发酵单位，发酵单位达到3500mg/L；公开号为CN105483171的中国发明专利一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法中描述：通过控制种子培养基中亚铁离子的浓度提高辅酶Q10的发酵单位，发酵单位达到3382mg/L，可见辅酶Q10的发酵技术相对比较成熟，但现有的微生物发酵生产辅酶Q10的工业化生产方法都存在发酵单位偏低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种发酵生产辅酶Q10的方法，包括：(1)辅酶Q10发酵过程中不断补加铵离子，在不同发酵周期控制不同铵离子浓度；(2)辅酶Q10发酵培养基中添加赖氨酸盐，并在发酵过程中分3次补加赖氨酸盐(3)辅酶Q10发酵过程中补加硫酸钠或硫酸钾。使用该发酵控制工艺后，辅酶Q10发酵单位明显提高，菌体干重明显增加，发酵周期明显延长，辅酶Q10的产量大幅增加，明显降低了辅酶Q10的发酵成本。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种辅酶Q10的发酵方法，
1)母瓶培养：将辅酶Q10生产菌种稀释至1000-1200个/mL后接种0.5mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30-34℃，相对湿度为40％-60％的培养箱中培养4-8d后，挑取2-5个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30-34℃，相对湿度为40％-60％，转速为200-250rpm的摇床中培养24-32h，得到母瓶菌种；
斜面培养基配方为：葡萄糖1.0-4.0g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，蛋白胨0.2-1.0g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，琼脂粉15-25g/L，pH6.8-7.2，121℃灭菌20-25min；
母瓶培养基配方为：葡萄糖3.0-6.0g/L，酵母粉0.2-0.5g/L，蛋白胨0.1-0.5g/L，玉米浆0.5-1.0g/L，硫酸铵0.5-2.0g/L，味精0.4-2g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸2-5mg/L，生物素0.05-0.2mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌20-25min。
2)一级种子罐培养：将母瓶菌种按1-5‰的接种量接种至一级种子罐中的培养基，在30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，通气比0.3-0.6，搅拌转速140-180rpm，培养28-36h，得到葡萄糖残量0.5-1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液；
一级种子罐中的培养基配方为：葡萄糖4.0-8.0g/L，酵母粉0.3-0.6g/L，蛋白胨0.1-0.4g/L，玉米浆0.6-1.2g/L，硫酸铵0.8-2.5g/L，味精0.4-2g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.5-4.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸2.0-5.0mg/L，生物素0.05-0.2mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌25-30min。
3)二级种子罐培养：将一级种子液按8-15％的接种量接种至二级种子罐中的培养基，在30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，通气比0.4-0.7，搅拌转速120-160rpm，培养16-24h，得到葡萄糖残量0.4-0.8g/L，菌体形状均一，无菌良好的二级种子液；
二级种子罐中的培养基配方为：葡萄糖6.0-12g/L，酵母粉0.3-0.6g/L，玉米浆0.8-1.5g/L，硫酸铵1.0-3.5g/L，味精0.8-3g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.5-4.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸4.0-8.0mg/L，生物素0.08-0.3mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌25-30min。
4)发酵罐培养：将二级种子液按15-25％的接种量接种至发酵罐中的培养基，在32-35℃，罐压0.03-0.06MPa，通气比0.6-0.8，搅拌转速110-140rpm，培养至菌体消耗葡萄糖速率明显下降，菌体部分自溶时终止发酵；
发酵罐中的培养基配方为：葡萄糖10-15g/L，玉米浆1.5-2.5g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，味精1.0-3g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁3.0-6.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.2-1.0g/L，碳酸钙1.0-3.0g/L，盐酸硫胺2.0-5.0mg/L，烟酸6.0-12mg/L，生物素0.1-0.5mg/L；赖氨酸盐0.001-5g/L，优选0.01-0.1g/L；pH6.3-6.8，121℃灭菌25-30min。
发酵罐工艺控制措施：
a)补加铵盐水溶液的操作，铵盐水溶液的补加方式为：发酵周期1-20h时，补加至发酵罐中铵离子浓度0.8-1.2g/L；发酵周期21-40h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.2-1.6g/L；发酵周期41-65h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.6-2.0g/L；发酵周期66-80h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.2-1.6g/L；发酵周期81h-放罐时，补加至发酵罐中铵离子浓度0.6-1.2g/L；
b)补加赖氨酸盐水溶液的操作，赖氨酸盐水溶液的补加方式为：发酵周期20-28h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.01-0.1g/L；发酵周期40-48h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.04-0.12g/L；发酵周期60-68h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.005-0.05g/L；
c)补加硫酸盐水溶液的操作，硫酸盐水溶液的补加方式为：发酵周期36-70h时，优选48-58h，补加至发酵罐中赖氨酸盐硫酸盐浓度为0.2-0.8g/L；
d)发酵罐培养过程中连续补入浓度为50-60％的葡萄糖溶液，使发酵罐中葡萄糖残量控制在8-15g/L；培养过程中连续补入浓度为13-16％的磷酸二氢钾溶液，使发酵罐中磷残量控制在0.15-0.25g/L；培养过程中连续补入浓度为18-22％的氨水，使发酵罐中的pH值控制在6.5-7.0。
进一步，铵盐水溶液为硫酸铵、氯化铵、碳酸铵或碳酸氢铵的水溶液，铵盐水溶液的浓度为5％-80％，优选20％-60％，更优选30％-50％，最优选35％-45％；
赖氨酸盐水溶液为赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或赖氨酸磷酸盐的水溶液，赖氨酸盐水溶液的浓度为1％-30％，优选2％-20％，更优选3％-10％；
硫酸盐水溶液为硫酸钠或硫酸钾的水溶液，硫酸盐水溶液的浓度为10％-60％，优选20％-50％，更优选30％-40％。
本发明的有益效果在于：在试验过程中惊奇的发现辅酶Q10产生菌发酵过程对铵离子的需求非常显著，虽然发酵过程中补加氨水控制发酵液的pH在6.5-7.0，但氨水提供的铵离子是远远不够的，所以本发明在辅酶Q10发酵过程中增加了连续补入硫酸铵的操作，并且在不同发酵周期控制不同的铵离子浓度，使辅酶Q10产生菌的生长和代谢达到最佳状态。
在辅酶Q10发酵培养基中添加赖氨酸盐，并且发酵过程中分3次补加赖氨酸盐；在辅酶Q10发酵中期补加一次硫酸钠，明显促进辅酶Q10产生菌生长，菌体粗壮。
通过以上技术手段，使辅酶Q10产生菌的生长和代谢能力明显增强；菌体量明显增加，增幅约10％；辅酶Q10发酵单位增长快，辅酶Q10放罐效价达到4000mg/L以上，比使用本发明工艺前增加约20％；发酵周期明显延长，辅酶Q10的批产量大幅增加，菌体容易过滤收集，明显降低辅酶Q10的发酵成本。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施方案中，该方法可应用于任何生产辅酶Q10的菌种，作为一种具体实施方式，使用的菌种为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。
实施例1
种子培养：将甘油管中的辅酶Q10生产菌种稀释至合适浓度后接种至茄子瓶斜面培养基上，将斜面置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％的培养箱中培养6天。茄子瓶斜面培养完成后，用接种针挑取3个菌落接种于装有60mL培养基的500mL三角瓶中，将母瓶置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％，转速为220rpm的摇床中培养30h后作为母瓶种子接种一级种子罐。茄子瓶斜面培养基配方为：葡萄糖2g/L，酵母粉1.5g/L，蛋白胨0.5g/L，氯化钠1.5g/L，琼脂粉15g/L，pH6.85，121±0.5℃灭菌20min。母瓶培养基配方为：葡萄糖5g/L，酵母粉0.4g/L，蛋白胨0.3g/L，玉米浆0.7g/L，硫酸铵1.2g/L，味精1.5g/L，氯化钠1.5g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙5.0g/L，盐酸硫胺2.0mg/L，烟酸4.0mg/L，生物素0.1mg/L，pH6.8，121±0.5℃灭菌20min。
一、二级种子罐扩大培养：将培养好的母瓶种子按2‰接种量接种一级种子罐，一级种子罐培养基体积为800L，一级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.5，搅拌转速为160rpm，培养30h后，种子液中葡萄糖残量降至0.5g/L，菌体形状均一，无菌良好即按10％接种量接种二级种子罐，接种后二级种子罐料液体积为8m3，二级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.55，搅拌转速为140rpm，培养20h后二级种子液中葡萄糖残量降至0.6g/L，菌体形状均一，无菌良好即可移种发酵罐。一级种子罐培养基配方为：葡萄糖5g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨0.2g/L，玉米浆0.8g/L，硫酸铵1.3g/L，味精1.5g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.0g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙6g/L，盐酸硫胺1.5mg/L，烟酸3.5mg/L，生物素0.05mg/L，pH6.6，121±0.5℃灭菌30min。二级种子罐培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉0.4g/L，玉米浆1.2g/L，硫酸铵2.0g/L，味精2.5g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.5g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.3g/L，碳酸钙4g/L，盐酸硫胺2.5mg/L，烟酸5.0mg/L，生物素0.15mg/L，pH6.7，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐培养：将培养好的二级种子罐种子液按20％接种量接种发酵罐，接种后发酵罐料液体积为40m3，发酵罐培养条件为：罐温为33±0.5℃，罐压为0.05±0.005MPa，通气比为0.65，搅拌转速为120rpm。发酵罐培养基配方为：葡萄糖12g/L，玉米浆2.0g/L，硫酸铵2.5g/L，味精2.5g/L，氯化钠2.0g/L，硫酸镁5.5g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化铁0.8g/L，碳酸钙1.5g/L，盐酸硫胺4.0mg/L，烟酸8.0mg/L，生物素0.25mg/L；赖氨酸盐酸盐0.02g/L，pH6.4，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐工艺控制措施：发酵罐培养过程中连续补入含量为浓度为55％的葡萄糖溶液，发酵罐中葡萄糖残量控制在10±1g/L，放罐前2小时停止补糖；培养过程中连续补入浓度为15％的磷酸二氢钾溶液，发酵罐中磷残量控制在0.2±0.05g/L；培养过程中连续补入浓度为20％的氨水，发酵罐的pH控制在6.7±0.1。发酵过程中连续补入浓度为35％的硫酸铵溶液，发酵罐中铵离子浓度控制为：发酵周期1-20h，铵离子浓度1.1±0.05g/L；发酵周期21-40h，铵离子浓度1.4±0.05g/L；发酵周期41-65h，铵离子浓度1.8±0.05g/L；发酵周期66-80h，铵离子浓度1.3±0.05g/L；发酵周期81h-放罐，铵离子浓度0.8±0.05g/L。
发酵过程中分3次补入浓度为5％的赖氨酸盐溶液，补入方式为：发酵周期25h时补入终浓度为0.02g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵周期44h时补入终浓度为0.06g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵周期62h时补入终浓度为0.01g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵过程中补加浓度为35％的硫酸钠溶液，补入方式为：发酵周期55h时补入终浓度为0.3g/L的硫酸钠。
发酵罐培养98h后菌体消耗葡萄糖速率明显下降，菌体部分自溶，发酵罐培养终止并放罐，Q10放罐效价为4035mg/L，菌体干重为103g/L。
实施例2
种子培养：将甘油管中的辅酶Q10生产菌种稀释至合适浓度后接种至茄子瓶斜面培养基上，将斜面置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％的培养箱中培养5天。茄子瓶斜面培养完成后，用接种针挑取4个菌落接种于装有60mL培养基的500mL三角瓶中，将母瓶置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％，转速为220rpm的摇床中培养28h后作为母瓶种子接种一级种子罐。茄子瓶斜面培养基配方为：葡萄糖3g/L，酵母粉1.6g/L，蛋白胨0.4g/L，氯化钠1.5g/L，琼脂粉15g/L，pH6.80，121±0.5℃灭菌20min。母瓶培养基配方为：葡萄糖4g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨0.2g/L，玉米浆0.6g/L，硫酸铵1.3g/L，味精1.6g/L，氯化钠1.5g/L，硫酸镁2.8g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙5.0g/L，盐酸硫胺2.0mg/L，烟酸4.0mg/L，生物素0.1mg/L，pH6.85，121±0.5℃灭菌20min。
一、二级种子罐扩大培养：将培养好的母瓶种子按1‰接种量接种一级种子罐，一级种子罐培养基体积为800L，一级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.5，搅拌转速为160rpm，培养32h后，种子液中葡萄糖残量降至0.4g/L，菌体形状均一，无菌良好即按10％接种量接种二级种子罐，接种后二级种子罐料液体积为8m3，二级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.55，搅拌转速为140rpm，培养18h后二级种子液中葡萄糖残量降至0.5g/L，菌体形状均一，无菌良好即可移种发酵罐。一级种子罐培养基配方为：葡萄糖4g/L，酵母粉0.6g/L，蛋白胨0.2g/L，玉米浆0.8g/L，硫酸铵1.5g/L，味精1.7g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.0g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙6g/L，盐酸硫胺1.8mg/L，烟酸3.8mg/L，生物素0.05mg/L，pH6.65，121±0.5℃灭菌30min。二级种子罐培养基配方为：葡萄糖12g/L，酵母粉0.5g/L，玉米浆1.2g/L，硫酸铵2.2g/L，味精2.5g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.8g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.3g/L，碳酸钙4g/L，盐酸硫胺2.8mg/L，烟酸5.5mg/L，生物素0.18mg/L，pH6.65，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐培养：将培养好的二级种子罐种子液按20％接种量接种发酵罐，接种后发酵罐料液体积为40m3，发酵罐培养条件为：罐温为34±0.5℃，罐压为0.05±0.005MPa，通气比为0.60，搅拌转速为120rpm。发酵罐培养基配方为：葡萄糖13g/L，玉米浆2.5g/L，硫酸铵2.2g/L，味精2.8g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁6.5g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化铁0.9g/L，碳酸钙1.5g/L，盐酸硫胺4.5mg/L，烟酸8.5mg/L，生物素0.20mg/L；赖氨酸盐酸盐0.03g/L，pH6.45，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐工艺控制措施：发酵罐培养过程中连续补入含量为浓度为54％的葡萄糖溶液，发酵罐中葡萄糖残量控制在10±1g/L，放罐前2小时停止补糖；培养过程中连续补入浓度为12％的磷酸二氢钾溶液，发酵罐中磷残量控制在0.2±0.05g/L；培养过程中连续补入浓度为18％的氨水，发酵罐的pH控制在6.7±0.1。发酵过程中连续补入浓度为30％的硫酸铵溶液，发酵罐中铵离子浓度控制为：发酵周期1-20h，铵离子浓度1.2±0.05g/L；发酵周期21-40h，铵离子浓度1.5±0.05g/L；发酵周期41-65h，铵离子浓度1.9±0.05g/L；发酵周期66-80h，铵离子浓度1.4±0.05g/L；发酵周期81h-放罐，铵离子浓度0.9±0.05g/L。
发酵过程中分3次补入浓度为6％的赖氨酸盐溶液，补入方式为：发酵周期24h时补入终浓度为0.03g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵周期42h时补入终浓度为0.06g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵周期65时补入终浓度为0.01g/L的赖氨酸盐酸盐；发酵过程中补加浓度为30％的硫酸钠溶液，补入方式为：发酵周期58h时补入终浓度为0.2g/L的硫酸钠。
发酵罐培养95h后菌体消耗葡萄糖速率明显下降，菌体部分自溶，发酵罐培养终止并放罐，Q10放罐效价为4120mg/L，菌体干重为105g/L。
对比例1
种子培养：将甘油管中的辅酶Q10生产菌种稀释至合适浓度后接种至茄子瓶斜面培养基上，将斜面置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％的培养箱中培养6天。茄子瓶斜面培养完成后，用接种针挑取3个菌落接种于装有60mL培养基的500mL三角瓶中，将母瓶置于温度为32±0.5℃，相对湿度为40％-60％，转速为220rpm的摇床中培养30h后作为母瓶种子接种一级种子罐。茄子瓶斜面培养基配方为：葡萄糖2g/L，酵母粉1.5g/L，蛋白胨0.5g/L，氯化钠1.5g/L，琼脂粉15g/L，pH6.75，121±0.5℃灭菌20min。母瓶培养基配方为：葡萄糖5g/L，酵母粉0.4g/L，蛋白胨0.3g/L，玉米浆0.7g/L，硫酸铵1.2g/L，味精1.5g/L，氯化钠1.5g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙5.0g/L，盐酸硫胺2.0mg/L，烟酸4.0mg/L，生物素0.1mg/L，pH6.85，121±0.5℃灭菌20min。
一、二级种子罐扩大培养：将培养好的母瓶种子按2‰接种量接种一级种子罐，一级种子罐培养基体积为800L，一级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.5，搅拌转速为160rpm，培养31h后，种子液中葡萄糖残量降至0.4g/L，菌体形状均一，无菌良好即按10％接种量接种二级种子罐，接种后二级种子罐料液体积为8m3，二级种子罐培养条件为：罐温为32±0.5℃，罐压为0.04±0.005MPa，通气比为0.55，搅拌转速为140rpm，培养22h后二级种子液中葡萄糖残量降至0.6g/L，菌体形状均一，无菌良好即可移种发酵罐。一级种子罐培养基配方为：葡萄糖5g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨0.2g/L，玉米浆0.8g/L，硫酸铵1.3g/L，味精1.5g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.0g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.2g/L，碳酸钙6g/L，盐酸硫胺1.5mg/L，烟酸3.5mg/L，生物素0.05mg/L，pH6.6，121±0.5℃灭菌30min。二级种子罐培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉0.4g/L，玉米浆1.2g/L，硫酸铵2.0g/L，味精2.5g/L，氯化钠1.8g/L，硫酸镁3.5g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，氯化铁0.3g/L，碳酸钙4g/L，盐酸硫胺2.5mg/L，烟酸5.0mg/L，生物素0.15mg/L，pH6.7，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐培养：将培养好的二级种子罐种子液按20％接种量接种发酵罐，接种后发酵罐料液体积为40m3，发酵罐培养条件为：罐温为33±0.5℃，罐压为0.05±0.005MPa，通气比为0.65，搅拌转速为120rpm。发酵罐培养基配方为：葡萄糖12g/L，玉米浆2.0g/L，硫酸铵2.5g/L，味精2.5g/L，氯化钠2.0g/L，硫酸镁5.5g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化铁0.8g/L，碳酸钙1.5g/L，盐酸硫胺4.0mg/L，烟酸8.0mg/L，生物素0.25mg/L；pH6.45，121±0.5℃灭菌30min。
发酵罐工艺控制措施：发酵罐培养过程中连续补入含量为浓度为56％的葡萄糖溶液，发酵罐中葡萄糖残量控制在10±1g/L，放罐前2小时停止补糖；培养过程中连续补入浓度为16％的磷酸二氢钾溶液，发酵罐中磷残量控制在0.2±0.05g/L；培养过程中连续补入浓度为19％的氨水，发酵罐的pH控制在6.7±0.1。
发酵罐培养85h后菌体消耗葡萄糖速率明显下降，菌体部分自溶，发酵罐培养终止并放罐，Q10放罐效价为3075mg/L，菌体干重为88g/L。
上述对比例1中，除未采用本发明提出的发酵工艺控制措施外，其余菌种、培养基配方和设备等条件均相同。结果表明，对比例1中的辅酶Q10放罐效价、菌体干重和发酵周期均明显偏低，辅酶Q10的批产量更加偏低。实施例1和2采用了本发明提出的发酵工艺控制措施，其辅酶Q10的放罐效价、菌体干重和发酵周期均明显高于对比例1，辅酶Q10的批产量大幅增加，发酵成本明显降低，所带来的技术效果显著。
Claims (6)
1.一种辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)母瓶培养：将辅酶Q10生产菌种稀释至1000-1200个/mL后接种0.5mL至斜面培养基上，将斜面培养基置于温度为30-34℃，相对湿度为40％-60％的培养箱中培养4-8d后，挑取2-5个菌落接种于母瓶培养基中，将母瓶培养基置于30-34℃，相对湿度为40％-60％，转速为200-250rpm的摇床中培养24-32h，得到母瓶菌种；
2)一级种子罐培养：将母瓶菌种按1-5‰的接种量接种至一级种子罐中的培养基，在30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，通气比0.3-0.6，搅拌转速140-180rpm，培养28-36h，得到葡萄糖残量0.5-1.0g/L，菌体形状均一，无菌良好的一级种子液；
3)二级种子罐培养：将一级种子液按8-15％的接种量接种至二级种子罐中的培养基，在30-35℃，罐压0.03-0.05MPa，通气比0.4-0.7，搅拌转速120-160rpm，培养16-24h，得到葡萄糖残量0.4-0.8g/L，菌体形状均一，无菌良好的二级种子液；
4)发酵罐培养：将二级种子液按15-25％的接种量接种至发酵罐中的培养基，在32-35℃，罐压0.03-0.06MPa，通气比0.6-0.8，搅拌转速110-140rpm，培养至菌体消耗葡萄糖速率明显下降，菌体部分自溶时终止发酵；
发酵罐培养过程中连续补入浓度为50-60％的葡萄糖溶液，使发酵罐中葡萄糖残量控制在8-15g/L；培养过程中连续补入浓度为13-16％的磷酸二氢钾溶液，使发酵罐中磷残量控制在0.15-0.25g/L；培养过程中连续补入浓度为18-22％的氨水，使发酵罐中的pH值控制在6.5-7.0；
所述发酵罐培养的操作中，还包括补加铵盐水溶液的操作；所述铵盐水溶液为硫酸铵、氯化铵、碳酸铵或碳酸氢铵的水溶液，所述铵盐水溶液的浓度为5％-80％；所述铵盐水溶液的补加方式为：发酵周期1-20h时，补加至发酵罐中铵离子浓度0.8-1.2g/L；发酵周期21-40h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.2-1.6g/L；发酵周期41-65h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.6-2.0g/L；发酵周期66-80h时，补加至发酵罐中铵离子浓度1.2-1.6g/L；发酵周期81h-放罐时，补加至发酵罐中铵离子浓度0.6-1.2g/L；
所述发酵罐培养的操作中，还包括补加赖氨酸盐水溶液的操作；所述赖氨酸盐水溶液为赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或赖氨酸磷酸盐的水溶液，所述赖氨酸盐水溶液的浓度为1％-30％；所述赖氨酸盐水溶液的补加方式为：发酵周期20-28h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.01-0.1g/L；发酵周期40-48h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.04-0.12g/L；发酵周期60-68h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐浓度为0.005-0.05g/L；
所述发酵罐培养的操作中，还包括补加硫酸盐水溶液的操作；所述硫酸盐水溶液为硫酸钠或硫酸钾的水溶液，所述硫酸盐水溶液的浓度为10％-60％；所述硫酸盐水溶液的补加方式为：发酵周期36-70h时，补加至发酵罐中赖氨酸盐硫酸盐浓度为0.2-0.8g/L。
2.根据权利要求1所述的辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，所述斜面培养基配方为：葡萄糖1.0-4.0g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，蛋白胨0.2-1.0g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，琼脂粉15-25g/L，pH6.8-7.2，121℃灭菌20-25min。
3.根据权利要求1所述的辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，所述母瓶培养基配方为：葡萄糖3.0-6.0g/L，酵母粉0.2-0.5g/L，蛋白胨0.1-0.5g/L，玉米浆0.5-1.0g/L，硫酸铵0.5-2.0g/L，味精0.4-2g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸2-5mg/L，生物素0.05-0.2mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌20-25min。
4.根据权利要求1所述的辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，所述一级种子罐中的培养基配方为：葡萄糖4.0-8.0g/L，酵母粉0.3-0.6g/L，蛋白胨0.1-0.4g/L，玉米浆0.6-1.2g/L，硫酸铵0.8-2.5g/L，味精0.4-2g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.5-4.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸2.0-5.0mg/L，生物素0.05-0.2mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌25-30min。
5.根据权利要求1所述的辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，所述二级种子罐中的培养基配方为：葡萄糖6.0-12g/L，酵母粉0.3-0.6g/L，玉米浆0.8-1.5g/L，硫酸铵1.0-3.5g/L，味精0.8-3g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁1.5-4.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.1-0.5g/L，碳酸钙2.0-8.0g/L，盐酸硫胺1.0-3.0mg/L，烟酸4.0-8.0mg/L，生物素0.08-0.3mg/L，pH6.5-7.0，121℃灭菌25-30min。
6.根据权利要求1所述的辅酶Q10的发酵方法，其特征在于，所述发酵罐中的培养基配方为：葡萄糖10-15g/L，玉米浆1.5-2.5g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，味精1.0-3g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，硫酸镁3.0-6.0g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，氯化铁0.2-1.0g/L，碳酸钙1.0-3.0g/L，盐酸硫胺2.0-5.0mg/L，烟酸6.0-12mg/L，生物素0.1-0.5mg/L；赖氨酸盐0.001-5g/L。
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