CN111996189A - 一种磁珠法核酸提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：样本保存液、DNA/RNA裂解液、蛋白酶K、蛋白酶K保存液、磁珠DNA/RNA洗涤液、洗脱液、磁珠；所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括三(羟甲基)氨基甲烷10‑20mM、甘露醇1‑2％；所述磁珠包含于含0.5‑1mM的IDHA的10mM PBS溶液中。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学实验领域，具体地涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种磁珠法提取核酸的试剂盒。
背景技术
随着分子生物学的发展，核酸提取作为基本的分子生物学技术被广泛地应用。从样本中提取高质量的核酸是对其进行准确检测的前提。基于磁珠法核酸提取试剂盒是用修饰后的磁珠能够与核酸分子特异性地识别并高效结合，利用磁场分离样本中的核酸DNA或RNA，是一种分子生物学实验中广泛采用的核酸提取试剂盒种类。
现有的核酸提取试剂盒存在着因样本裂解不充分导致提取效果较差，洗涤和洗脱步骤繁琐/洗涤效果不好的问题。
发明内容
针对上述问题，申请人一方面改进试剂盒中裂解成分的组成以提供更好的裂解效果，另一方面，改进洗涤液组成和磁珠预处理，以提供更好的洗涤/洗脱效果，在某些条件下实现一步洗涤。
一方面，本申请提供了一种磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：样本保存液、DNA/RNA裂解液、蛋白酶K、蛋白酶K保存液、磁珠DNA/RNA洗涤液、洗脱液、磁珠。
进一步地，所述样本保存液组成成分为：异硫氰酸胍10g-20g/L、乙二胺四乙酸5g-15g/L、氯化钠8g-15g/L、三(羟甲基)氨基甲烷2g-10g/L。
进一步地，所述DNA/RNA裂解液包括3～15％的吐温20。
进一步地，所述蛋白酶K保存液含40-80mM Tris-HCl，5-15mM CaCl2，pH为7.5；所述蛋白酶K保存液与蛋白酶混合后蛋白酶K终浓度为10-30mg/ml。
进一步地，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括三(羟甲基)氨基甲烷、甘露醇；所述磁珠为羟基修饰二氧化硅颗粒，所述的二氧化硅颗粒的直径为200-500nm。
进一步地，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括三(羟甲基)氨基甲烷10-20mM、甘露醇1-2％。
进一步地，所述磁珠包含于含0.5-1mM的IDHA的10mM PBS溶液中。
进一步地，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，其中洗涤液1包括三(羟甲基)氨基甲烷10-20mM、甘露醇1-2％；所述的洗涤液2包括三(羟甲基)氨基甲烷1-10mM。
进一步地，洗脱液为无DNase/RNase水。
附图说明
附图图1 ：人属细胞(HCT 116)核酸提取检测结果。自左向右泳道依次为marker，样品1，样品2。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅用于解释本发明，而非限制本发明。
实施例1 试剂盒的组成
一种磁珠法核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括：
实施例2 使用实施例1试剂盒的实际提取实验
使用实施例1提供的提取试剂盒提取培养细胞(人属细胞(HCT 116))的核酸(包括DNA、 RNA)，所述的核酸提取步骤为：
样品1：
1、收集的培养细胞(96孔板1个孔，各实验均使用类似量)放入1.5mlEP管内，加入400ul样本保存液，混匀。加入800ul体积的裂解液与蛋白酶K溶液的混合液，室温放置15 分钟。
2、加入60ul的混匀过的磁珠，振荡10分钟。
3、将EP管置于磁力架上，直到磁珠沉淀下来，吸弃上清液。将EP管从磁力架上移走。
4、添加500μl洗涤液1(使用前加等体积的异丙醇到洗涤液1中)到样品中混匀。将EP 管转移到一个磁力架上，直到磁珠沉淀下来，吸弃上清液。将EP管从磁力架上移走。
5、添加500μl洗涤液2(使用前加两倍体积的异丙醇到洗涤液2中)到样品中混匀。将 EP管转移到一个磁力架上，直到磁珠沉淀下来，吸弃上清液。将EP管从磁力架上移走。
6、添加500μl乙醇(95％-100％)到样品中混匀。
7、将EP管转移到一个磁力架上，直到磁珠沉淀下来，吸弃上清液。将EP管从磁力架上移走。
8、室温下放置10分钟自然晾干，添加50μl的无DNase/RNase无DNA酶RNA酶的水到EP管中充分混匀，室温静置3分钟，吸取上清转移至新的的离心管中。
样品2
洗涤步骤仅使用洗涤液1，不使用洗涤液2。
核酸浓度检测结果见表1，电泳检测结果见表2。
表1 核酸浓度检测
| 样本1 | 样本2 | |
| 浓度(ng/ul) | 378.9726 | 412.8542 |
| OD260/280 | 2.117 | 2.012 |
| OD260/230 | 1.853 | 2.058 |
结果表明，样本1和样本2的质量基本相当，特别是样本2在仅使用一步洗涤的情况下，仍然达到了较好的OD260/280值，完全可以满足后续一般检测需要。表明洗涤液中加入甘露醇从静电角度削弱某些蛋白和磁珠的结合力并通过螯合剂增强某些细胞成分与磁珠的结合力的思路完全可行。
使用相同种类和量的HCT 116样本，使用惠尔纳米科技的磁珠核酸提取试剂盒提取核酸时，浓度(ng/ul)为408.5ng/ul，OD260/280为2.089，OD260/230为1.941。特别注意的是，如果使用该试剂盒时仅使用PWB洗涤液洗涤一次，所得样品的OD260/280仅有1.5左右，质量上完全达不到后续使用的标准。
Claims (10)
1.一种磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：样本保存液、DNA/RNA裂解液、蛋白酶K、蛋白酶K保存液、磁珠DNA/RNA洗涤液、洗脱液、磁珠。
2.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述样本保存液组成成分为：异硫氰酸胍10g-20g/L、乙二胺四乙酸5g-15g/L、氯化钠8g-15g/L、三(羟甲基)氨基甲烷2g-10g/L。
3.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述DNA/RNA裂解液包括3～15％的吐温20。
4.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K保存液含40-80mM Tris-HCl，5-15mM CaCl2，pH为7.5；所述蛋白酶K保存液与蛋白酶混合后蛋白酶K终浓度为10-30mg/ml。
5.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括三(羟甲基)氨基甲烷、甘露醇；所述磁珠为羟基修饰二氧化硅颗粒，所述的二氧化硅颗粒的直径为200-500nm。
6.根据权利要求5所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括三(羟甲基)氨基甲烷10-20mM、甘露醇1-2％。
7.根据权利要求5或6的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠包含于含0.5-1mM的IDHA的10mM PBS溶液中。
8.根据权利要求5所述的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠DNA/RNA洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，其中洗涤液1包括三(羟甲基)氨基甲烷10-20mM、甘露醇1-2％；所述的洗涤液2包括三(羟甲基)氨基甲烷1-10mM。
9.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂盒，洗脱液为无DNase/RNase水。
10.使用权利要求1-9任一项的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸的方法。
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