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CN111996129B - 蝉花新菌株及其在抗肿瘤及抑菌方面的用途 - Google Patents

蝉花新菌株及其在抗肿瘤及抑菌方面的用途 Download PDF

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CN111996129B CN202010929239.2A CN202010929239A CN111996129B CN 111996129 B CN111996129 B CN 111996129B CN 202010929239 A CN202010929239 A CN 202010929239A CN 111996129 B CN111996129 B CN 111996129B
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Abstract

本发明涉及蝉花新菌株及其在抗肿瘤及抑菌方面的用途，新菌株分离自福建武夷山，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为蝉花Isaria cicadae新菌株，命名为蝉花Isaria cicadae HMGIM‑N140534，已于2020年7月8日保藏至广东省微生物菌种保藏中心(中国广州)，保藏编号为：GDMCC No.61083。本发明的蝉花菌株是一个采自于野外的活力较强的新菌株，通过野外采集分离出新菌株并保藏于专利菌种保藏中心，经传统鉴定结合分子鉴定确认为蝉花，通过人工发酵可实现大量制备，并且对于抗肿瘤和白色念球菌具有显著的抑制效果，是一个具有开发前景的新菌株。

Description

蝉花新菌株及其在抗肿瘤及抑菌方面的用途
技术领域
本发明涉及一种珍稀药用菌的新菌株及其应用，具体涉及蝉花新菌株及其在抗肿瘤及抑菌方面的用途。
背景技术
食药用菌在我国成为粮、菜、果、油之后的第五大种植业，据中国食用菌协会的统计， 2018年全国28个省、自治区、直辖市的食药用菌总产量继续增长，达3789.03万吨(鲜品)，产值高达2938.38亿元。食药用菌营养成分均衡、次级代谢产物丰富、含有多种天然活性成分，如多糖、黄酮类和萜类化合物、生物碱等，在健胃助消化、降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等方面具有显著效果。一些食药用菌资源已被开发成化妆品、保健食品、药品等产品。我国食用菌产业占全球75％以上，从业人员超过2000万人，是一个有极大发展潜力的产业。
在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789 种，药用菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，大型真菌对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。
蝉花又名金蝉花，属于虫草科棒束孢属真菌，是蝉的若虫被蝉花菌Isariacicadae Miquel (旧称蝉拟青霉)寄生形成的干燥复合体。蝉花是传统名贵中药材，《本草纲目》记载其“甘，寒，无毒。主治小儿天吊，惊痫螈，夜啼心悸。”现代研究表明蝉花具有免疫调节、解热镇痛、镇静催眠、改善肾功能等多种作用，其中以蝉花改善肾功能的研究报道较多。蝉花作为一种珍贵的虫草菌，其野生资源日益稀少，2019年被列入《中华人民共和国农业植物品种保护名录(第十一批)》。目前，对于蝉花人工培养的研究和需求日益增多。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种具有体外抗肿瘤活性及抑菌作用的野生的珍稀药用菌蝉花Isaria cicadae新菌株及其发酵提取物的抗肿瘤用途及其发酵液的抑制白色念珠菌的用途。
本发明通过以下方案达到上述目的：
本发明提供一种蝉花新菌株，分离自福建武夷山，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为蝉花Isaria cicadae新菌株，将该菌株命名为蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534，已于2020年7月8日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCCNO.61083。
发明人分离得到的菌株，并且对该菌株完成测序，将其测序结果在GenBank进行序列 Blast，发现与蝉花Isaria cicadae相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Isaria cicadae描述一致，鉴定结果为P Isaria cicadae Miq.。
在此基础上，发明人还对上述蝉花新菌株实现了人工培养，并且将蝉花HMGIM-N140534 新菌株进行固体发酵物的提取和液体发酵液的提取，它们对于体外和体内的抗肿瘤方面都表现出显著的效果，进一步地，其发酵液对抑制白色念珠菌也表现出显著的效果。
本发明中的蝉花菌株是一个采自于野外的活力较强的新菌株，其通过野外采集分离出新菌株并保藏于专利菌种保藏中心，经传统鉴定结合分子鉴定确认为蝉花，通过人工发酵可实现大量制备，并且对于抗肿瘤和白色念球菌具有显著的抑制效果，是一个具有开发前景的新菌株。
附图说明
图1为蝉花Isaria cicadae的野生子实体图。
图2为ITS测序结果。
图3为试验例2的技术路线图。
图4为试验例2的粗多糖提取物的提取方法路线。
图5为试验例2的动物实验中小鼠肿瘤质量对比结果。
图6为试验例2的动物实验中小鼠肿瘤体积对比结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
第一方面，本发明提供一种蝉花新菌株，分离自福建武夷山，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为蝉花Isaria cicadae新菌株，将该菌株命名为蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534，已于2020年7月8日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，地址为：中国广州，保藏编号为：GDMCC No.61083。
发明人对该菌株完成测序，将其测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与蝉花Isaria cicadae相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Isaria cicadae 描述一致，鉴定结果为P Isaria cicadae Miq.。
本发明的蝉花Isaria cicadae分生孢子体由从蝉蛹头部长出的孢梗束组成。虫体表面棕黄色，为灰色或白色菌丝包被。孢梗束长1.6-6cm，分枝或不分枝。上部可育部分长5-8mm，直径2-3mm，总体长椭圆形、椭圆形或纺锤形或穗状，长有大量白色粉末状分生孢子。不育菌柄长1-5cm，直径1-2mm，黄色至黄褐色。分生孢子梗5-8×2-3μm，瓶状，中部膨大，末端渐细或突然窄细，常成丛聚生在束丝上。分生孢子5-14×1.8-3.5μm，长椭圆形、纺锤形或近半圆形，具1-3个油滴。散生于疏松的土壤中蝉蛹上。药用。国内记录分布于华中地区，本菌株采自于东南部的福建地区。
第二方面，本发明提供上述蝉花新菌株的人工培养方法，包括：菌株分离，菌株纯化，以及固体发酵，其中，固体发酵包括将固体发酵培养基装入聚丙烯菌种袋，灭菌后冷却，无菌操作接入纯化的菌种，25℃恒温暗培养44-46天，湿度50％-60％，保持二氧化碳浓度4000ppm 以下，得到固体发酵培养物，其中，固体发酵培养基包括1:1(g/ml)的大米和水。
其中，上述25℃恒温暗培养45天。
其中，上述菌株分离包括：将采集回来的野生蝉花在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式向分离培养基中接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织，25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面后可进行转接。
优选的，上述菌丝长满的时间在10天-15天之间。
其中，上述菌株分离培养基为综合PDA培养基和0.5％重量百分比的蚕蛹粉。
具体为：以重量百分比计，菌株分离培养基为20％马铃薯、2％葡萄糖、2％琼脂、0.3％磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁、微量维生素B1、0.5％蚕蛹粉。
其中，上述纯化包括：将分离后感染细菌的菌种进行转接，25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接。
其中，上述纯化培养基为孟加拉红培养基。
具体为：以重量百分比计，每1000ml纯化培养基包括：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。
优选的，上述培养方法中的水为蒸馏水。
第三方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的固体发酵物的提取物在抗肿瘤方面的用途。
第四方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的固体发酵物的提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途。
其中，所述蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的固体发酵物的提取物为蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534固体发酵物的乙酸乙酯提取物。
其中，所述肿瘤为乳腺癌。
第五方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵液的提取物在抗肿瘤方面的用途。
第六方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵液的提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途。
其中，所述蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵液的提取物为蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵物的粗多糖提取物。
其中，所述粗多糖提取物为采用乙酸乙酯提取得到的粗多糖提取物。
其中，所述肿瘤为乳腺癌。
第七方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵液在抑制白色念珠菌方面的用途。
第八方面，本发明提供蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵液在制备抑制白色念珠菌药物方面的用途。
本发明通过功能实验证实，蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534固体发酵物的乙酸乙酯提取物体外抑制肿瘤效果显著，蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534的液体发酵物的粗多糖提取物具有显著的体内抑制小鼠乳腺癌细胞的作用，同时液体发酵液能强烈地抑制白色念珠菌。
研究证明，本发明人工培养的蝉花也具有与野生蝉花相同或相似的作用，尤其是固体发酵培养的蝉花更有优势。
实施例1
一种蝉花新菌株，分离自福建武夷山，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为蝉花Isaria cicadae新菌株，将该菌株命名为蝉花Isaria cicadae HMGIM-N140534，已于2020年7月8日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，地址为：中国广州，保藏编号为：GDMCC NO.61083。
蝉花Isaria cicadae分生孢子体由从蝉蛹头部长出的孢梗束组成。虫体表面棕黄色，为灰色或白色菌丝包被。孢梗束长1.6-6cm，分枝或不分枝。上部可育部分长5-8mm，直径2-3mm，总体长椭圆形、椭圆形或纺锤形或穗状，长有大量白色粉末状分生孢子。不育菌柄长1-5cm，直径1-2mm，黄色至黄褐色。分生孢子梗5-8×2-3μm，瓶状，中部膨大，末端渐细或突然窄细，常成丛聚生在束丝上。分生孢子5-14×1.8-3.5μm，长椭圆形、纺锤形或近半圆形，具1-3 个油滴。散生于疏松的土壤中蝉蛹上。药用。国内记录分布于华中地区，本菌株采自于东南部的福建地区。
实施例2
蝉花(蝉棒束孢)Isaria cicadae Miq.的鉴定
2014年7月曹仁润、陈胜臻在福建武夷山采集到一份蝉花(初步鉴定)标本。经组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，进行ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：
TaKaRaTaq(5units/μl)0.25μl
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)4μl
DNA模板2μl
引物1(10μmol·L-1)5μl
引物2(10μmol·L-1)5μl
灭菌蒸馏水28.75μl
反应条件为:94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min。PCR产物直接送检进行双向测序。其ITS序列为图2所示。
将测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与蝉花Isaria cicadae相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Isaria cicadae描述一致，鉴定结果为P Isaria cicadae Miq.。该菌种N140534于2020年7月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(中国，广州)，保藏编号为GCMCC NO:61083。
实施例3
人工培养
一：培养基
1、分离培养基(以重量百分比计)
综合PDA(马铃薯20％+葡萄糖2％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素 B1微量)+0.5％蚕蛹粉
2、纯化培养基(以重量百分比计)
配方：孟加拉红培养基(蛋白胨0.5％+葡萄糖1％+磷酸二氢钾0.1％+硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.05％+琼脂2％+1/3000孟加拉红溶液10％+氯霉素0.01％+蒸馏水)
3、固体发酵培养基
配方：大米50g，蒸馏水50ml
二、方法：
1、菌株分离
将分离培养基分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生蝉花在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式向分离培养基中接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接，长满的时间大概在10-15天之间。
2、菌株纯化
按配方制作纯化培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离后感染细菌的菌种进行转接，置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接。
3、固体发酵
采用5丝米厚的聚丙烯菌种袋(15×30cm)按配方装入固体发酵培养基，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入纯化成功的菌种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，湿度50％-60％，注意保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养时间为45天左右。
试验例1
固体发酵物的提取物的抑制肿瘤细胞功能
一、方法：
1、乙酸乙酯提取物的制备
采用实施例3的方法进行蝉花菌株的固体发酵，培养基为大米和水，培养45天后将长满菌丝体的大米培养基用乙酸乙酯浸泡，10小时后超声提取，超声100min，提取两次，合并两次有机相。将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，低温保藏(4℃)备用。
同时同样操作发酵其他野生菌株并提前作为对照。以紫杉醇为阳性对照，浓度为0.5mg/ml。
2、肿瘤细胞培养
用含青霉素、链霉素和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液进行乳腺癌细胞MCF-7培养。将含有10％FBS的DMEM细胞悬液接种于96孔组织培养板上，细胞浓度为2×104cells/ml。培养物置于37℃、5％CO2的组织培养箱中培养4小时待用。
3、抑制肿瘤试验
将乙酸乙酯提取物用DMSO溶解，配制成浓度为20mg/ml的母液，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液将母液稀释为100μg/ml的样品溶液。小心吸去96孔板里的细胞培养液，加入终浓度为100μg/ml及200μg/ml的样品溶液。每样品三个复孔。同时设置调零孔 (培养基)，对照孔(细胞、培养液)。置于37℃、5％CO2组织培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，与台酚蓝1：1混合进行拒染法染色。根据死细胞被染成蓝色，活细胞因有完整的细胞膜而未着色，用细胞计数器测定活细胞数，样品重复三次实验。
4、数据分析
使用SPSS.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，P<0.05具有显著性差异。
二、结果
采用SPSS.21专用统计软件进行统计，在100μg/ml和200μg/ml浓度下，食药用菌乙酸乙酯提取物在体外抑制MCF-7细胞对比结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002669618460000071
Figure BDA0002669618460000081
从表1可以看出，在100μg/ml和200μg/ml浓度下，蝉花HMGIM-N140534对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率分别为92.13％和99.84％，显示其具有强烈的体外抑制肿瘤细胞作用。同时，在开展的14种其他食药用菌的乙酸乙酯提取物的体外抑制肿瘤细胞的对照实验中，超过了同时试验的其他食药用菌。其中，桦褐孔菌是较为著名的药用菌，同等条件下的实验表明，其体外抑制乳腺癌细胞MCF-7的效果也远远比不上本发明的新菌株。
试验例2
液体发酵液的粗多糖提取物的体内抑制肿瘤细胞功能
一、方法
整体方法流程如图3所示，具体如下：
1、粗多糖提取物制备
具体为：以重量百分比计，菌株分离培养基为20％马铃薯、2％葡萄糖、2％琼脂、0.3％磷酸二氢钾、0.15％硫酸镁、微量维生素B1、0.5％蚕蛹粉。
菌种采用液体发酵，培养基为：综合PDA(以重量百分比计，马铃薯20％+葡萄糖2％+ 磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量)，发酵条件为25℃，摇瓶发酵，140rpm，避光培养。培养7天后，将菌丝抽滤收集后冻干，粉碎，用乙酸乙酯进行提取，将提取液采用经水提醇沉后离心弃上清，取沉淀以纯水溶解后冻干，制成粗多糖提取物，具体提取过程如图4所示。
2、给药
将提取的的多糖提取物经无菌过滤后以腹腔注射给药，在动物造模后次日起开始给药，连续 30天。按表2的实验设计，选取低剂量及中剂量开展实验，选用紫杉醇作为阳性对照。动物实验用药分组如表2所示。
表2蝉花抑制乳腺癌动物实验分组情况
Figure BDA0002669618460000091
3、肿瘤细胞培养
(1)提前一周复苏肿瘤细胞(鼠源乳腺癌细胞4T1)，注意观察细胞需满足生长迅速，活力强等特点。
(2)小鼠造模当天需要先处理细胞，先进行胰酶消化，用计数板计数，按1.5×105个/ 只皮下注射，而每只小鼠的注射体积最好是在0.2ml，所以所需的浓度为7.5×105。注意动作快捷，防止细胞重新贴壁。
(3)吹打均匀的肿瘤细胞分装至1.5ml小离心管，用冰盒放置(防止肿瘤细胞死亡)带到动物房。
(4)注射肿瘤细胞前还需要重新混匀细胞，具体操作是将离心管轻轻颠倒几下，用移液枪轻柔吹打。
4、动物实验
造模对象为体重为18-22g的活泼小鼠，将小鼠乳腺癌细胞4T1细胞按1.5×105个/只皮下注射到小鼠前背部空腔。造模次日起各组按前述准备的样品进行每日腹腔注射相应液体 0.2ml，其中阳性对照组每周注射2次。7天及之后肿瘤开始形成，观察小鼠情况并记录。30 天后处死，头一天进行称重，记录，第二天颈部脱臼处死，测量肿瘤体积，称量肿瘤质量，评估药物作用。
5、统计
肿瘤体积V＝a*b2/2(a-肿瘤最长径；b-肿瘤最短径)
抑瘤率＝(1-Qtest/Qcontrol)*100％(Qtest-供试样品的肿瘤质量；Qcontrol-对照的肿瘤质量)
二、实验结果
经过对肿瘤重量的称量、肿瘤体积的测量及抑瘤率的计算，得出结果如表3及图5和图 6所示。
表3动物实验肿瘤质量、肿瘤体积及抑瘤率
Figure BDA0002669618460000101
表中同列数值中大写字母代表p<0.01，表示差异极显著。同列数值中小写字母代表 p<0.05，差异显著。
图5动物实验中小鼠肿瘤质量对比
图6动物实验中小鼠肿瘤体积对比
从表3、图5和图6的结果表明，蝉花HMGIM-N140534的发液液体发酵菌丝的粗多糖提取物在抑制小鼠肿瘤细胞增长实验中表现出极显著差异，而且与剂量呈依赖关系，与阳性对照紫杉醇相比，抑制肿瘤生长的效果在中等剂量(100mg/kg)下更为突出，抑癌率达84％。
同时，发明人还在实验中观察发现蝉花粗多糖提取物注射的小鼠呈现出一定的神经兴奋性，尤其是在注射的头一周，低、中剂量多糖的注射均使小鼠十分兴奋及大便干燥，饮水量大大减少。但是经过一周后，神经兴奋的症状渐渐消失，最终动物实验结果是在肿瘤抑制上呈现出较好的效果，这可能与蝉花的神经兴奋作用有关，值得进一步深入开展研究。
试验例3抑制白色念珠菌的试验
1、培养基的制备
SDB培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml，pH5.6±0.2
SDA培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml,pH5.6±0.2
2、样品的制备
阳性对照品的制备：称取两性霉素，用含10％吐温的水溶液溶解，超声，离心，取上清液过滤除菌，配制为25μg/mL溶液备用。
3、菌悬液的制备
将供试菌从-80℃冰箱中取出，接种到新鲜斜面培养基上活化。用无菌接种环挑取真菌接种到SDB培养基中，28℃、20r/min振荡培养48h。将真菌均匀涂到SDA平板上，28℃培养 48h，每个浓度重复3次；通过平板计数法，确定菌液的浓度。
4、抑菌圈的测定
采用涂布平板法，将经过计数的菌液通过稀释使白色念珠菌终浓度为105cfu/mL，用移液枪吸取200μL配好的菌悬液于平板上，用涂布器均匀涂布；用已灭菌的打孔器在含菌平板上均匀打孔，挑去孔中培养基，在无菌条件下吸取对照品/供试品200μL打入孔中，真菌于28℃培养2天，观察抑菌圈大小。阳性对照为25μg/mL的两性霉素。
二、实验结果
试验结果发现，本发明菌种发酵液对白色念珠菌呈现的抑菌圈大于阳性对照，这说明，本发明菌株的发酵液有明显的抑制白色念珠菌的作用。
发明人还进一步将本发明菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538P)进行了研究，发现发酵液对金黄色葡萄球菌呈现的抑菌圈≤阳性对照，说明本发明菌株的发酵液无明显的抑制金黄色葡萄球菌的作用。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种蝉花(Isaria cicadae)HMGIM-N140534菌株，其特征在于保藏编号为：GDMCCNO.61083。
2.权利要求1所述的一种蝉花HMGIM-N140534菌株的液体发酵液在制备抑制白色念珠菌药物方面的用途。
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