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CN111979209A - 一种聚八酮合酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种聚八酮合酶及其编码基因与应用 Download PDF

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CN111979209A
CN111979209A CN202010856096.7A CN202010856096A CN111979209A CN 111979209 A CN111979209 A CN 111979209A CN 202010856096 A CN202010856096 A CN 202010856096A CN 111979209 A CN111979209 A CN 111979209A
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emodin
pcoks
gene
producing
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CN202010856096.7A
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王红
郭艳武
陈默
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Original Assignee
University of Chinese Academy of Sciences
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Abstract

本发明公开了一种聚八酮合酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，来源于虎杖(Polygonum cuspidatum)，命名为PcOKS蛋白，是序列表中序列1所示的蛋白质。编码PcOKS蛋白的基因，命名为PcOKS基因，也属于本发明的保护范围。本发明还保护PcOKS蛋白作为聚八酮合酶的应用。本发明还保护一种生产大黄素的方法，包括如下步骤：(1)将PcOKS基因导入受体植物，得到可以生产大黄素的转基因植物；(2)从所述转基因植物中获取大黄素。本发明所提供的生产大黄素的方法解决了传统大黄素生产对野生资源的依赖，而且拟南芥的生长周期短，易于大规模种植，有利于大黄素的工业生产。

Description

一种聚八酮合酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种聚八酮合酶及其编码基因与应用。
背景技术
大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌)，别名朱砂莲甲素，是一种常见的天然蒽醌类化合物，其结构式见式(Ⅰ)。大黄素为橘黄色晶体，难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，广泛存在于虎杖、芦荟、掌叶大黄、何首乌、鼠尾草、决明子等多种药用植物中。
Figure BDA0002646401970000011
研究表明，大黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗骨质疏松、抗糖尿病、免疫抑制、降血压、神经保护和肝保护等多种药理作用。在临床上，大黄素被广泛应用到肠道、肾脏、心血管及胰腺等器官相关疾病的治疗。大黄素的生理活性决定它不仅可用于医疗，亦可以用于保健和日用化工品中，有人把它用于护发和护肤品中，亦有人把它编入天然色素中。此外，大黄素还可以作为一种很有前景的天然植物提取物用于饲料添加剂。
目前大黄素的主要来源是从含有大黄素的植物中提取。虎杖的根和根茎常用作提取大黄素的植物原料，虎杖中含有丰富的蒽醌类化合物，除了大黄素等基本蒽醌骨架，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-1-O-β-D葡萄糖苷等经过修饰的蒽醌类化合物种类也很多，通过不同的修饰形成多样的具有不同活性和生物功能的分子。由于大黄素及其衍生物主要存在于药用植物的地下根和根茎中，大量采挖容易造成野生资源的匮乏。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚八酮合酶及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，来源于虎杖(Polygonum cuspidatum)，命名为PcOKS蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示蛋白质进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与大黄素合成相关的由(a1)衍生的蛋白质；
(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
标签具体如表1所示。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
编码PcOKS蛋白的基因，命名为PcOKS基因，也属于本发明的保护范围。
所述基因是如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)来源于虎杖且与(b1)所示DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有PcOKS基因的表达盒、重组表达载体或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有PcOKS基因的重组表达载体。
所述表达载体可为载体pET-30a(+)。
可用现有的植物表达载体构建含有PcOKS基因的重组表达载体。
所述植物表达载体可为重建pBI121载体。
构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物。
所述重组表达载体可为重组质粒pET∷PcOKS或重组质粒pBI::PcOKS。
重组质粒pET∷PcOKS：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2中第4-1173位核苷酸所示的双链DNA分子。
重组质粒pBI::PcOKS：在重建pBI121载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
本发明还保护PcOKS蛋白作为聚八酮合酶的应用。
本发明还保护PcOKS蛋白在制备目标物中的应用；所述目标物为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)：
(c1)6-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3,5-二氧己酸；
(c2)SEK4b；
(c3)4-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3-氧丁酸；
(c4)大黄素。
所述目标物包括但不限于：大黄素和/或大黄素的前体和/或大黄素的衍生物。
所述应用中，PcOKS蛋白作为催化剂。
所述应用中，以丙二酰辅酶A为原料制备所述目标物。
所述应用中，以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为原料制备所述目标物。
本发明还保护PcOKS蛋白的应用，为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)：
(d1)催化丙二酰辅酶A形成6-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3,5-二氧己酸(6-(7-hydroxy-5-methyl-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-3,5-dioxohexanoicacid)；
(d2)催化丙二酰辅酶A形成SEK4b；
(d3)催化丙二酰辅酶A形成4-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3-氧丁酸(4-(7-hydroxy-5-methyl-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-3-oxobutanoic acid)。
本发明还保护一种制备可以生产大黄素的转基因植物的方法，包括如下步骤：将PcOKS基因导入受体植物，得到可以生产大黄素的转基因植物。
所述PcOKS基因具体可通过以上任一重组表达载体导入受体植物。
所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述受体植物为十字花科植物。所述受体植物为拟南芥属植物。所述受体植物为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护一种生产大黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将PcOKS基因导入受体植物，得到可以生产大黄素的转基因植物；
(2)从所述转基因植物中获取大黄素。
从所述转基因植物中获取大黄素具体可为从所述转基因植物的根中获取大黄素。
所述PcOKS基因具体可通过以上任一重组表达载体导入受体植物。
所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述受体植物为十字花科植物。所述受体植物为拟南芥属植物。所述受体植物为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护一种生产大黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将PcOKS基因导入受体植物的外植体，得到可以生产大黄素的转基因材料；
(2)从所述转基因材料中获取大黄素。
所述PcOKS基因具体可通过以上任一重组表达载体导入受体植物。
所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述受体植物为十字花科植物。所述受体植物为拟南芥属植物。所述受体植物为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述外植体包括但不限于：叶片、茎段、根段、叶柄、幼胚、花器官。
所述转基因材料包括但不限于：转基因愈伤组织、转基因细胞系、转基因发根系或转基因植株。
本发明的发明人从虎杖中发现了PcOKS蛋白。PcOKS蛋白在体外酶促反应中的功能是聚八酮合酶(octaketide synthase)。将PcOKS基因导入拟南芥从而在拟南芥中异源表达(拟南芥本身不能合成大黄素)，能够利用拟南芥的丙二酰辅酶A产生具有生理活性的大黄素，大黄素的平均产量可达到0.37mg/g(DW)。
目前，大黄素的主要来源是从虎杖、掌叶大黄等含有大黄素的药用植物中提取，大黄素及其衍生物主要存在于植物的地下根和根茎中，大量采挖容易造成野生资源的匮乏。本发明所提供的生产大黄素的方法解决了传统大黄素生产对野生资源的依赖，而且拟南芥的生长周期短，易于大规模种植，有利于大黄素的工业生产。
附图说明
图1为实施例2中的SDS-PAGE电泳图。
图2为实施例2中的HPLC-MS检测图谱。
图3为实施例3中的Western blot的结果图。
图4为实施例3中的HPLC-MS检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、PcOKS蛋白的发现
发明人从虎杖(Polygonum cuspidatum)的幼根中发现一个新蛋白，命名为PcOKS蛋白。PcOKS蛋白如序列表的序列1所示，由391个氨基酸残基组成，预测分子量为43.3kDa。将编码PcOKS蛋白的基因命名为PcOKS基因。虎杖幼根的cDNA中，PcOKS基因如序列表的序列2所示。
实施例2、蛋白的制备和酶活鉴定
一、蛋白的制备
1、取虎杖幼根，采用Trizol法提取总RNA，然后采用Promega公司反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用PcOKS-S和PcOKS-A组成的引物对进行PCR扩增，得到一条约1200bp的扩增条带，回收PCR扩增产物。
PcOKS-S：5′-TCACATATGGCGAATGTACTGCAGGAGATC-3′；
PcOKS-A：5′-TGACTCGAGCAGAATTGGAACACTTCGCA-3′。
PCR扩增的反应条件：95℃变性3分钟；95℃20秒、56℃30秒、72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物连接至载体pMD18-T，得到重组质粒pMD∷PcOKS，进行测序验证。
4、取重组质粒pMD∷PcOKS，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收约1200bp的酶切产物。
5、取载体pET-30a(+)，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收载体骨架。
6、将步骤4得到的酶切产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET∷PcOKS。重组质粒pET∷PcOKS进行测序验证。测序结果表明：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2中第4-1173位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pET∷PcOKS表达具有His6标签的PcOKS蛋白。具有His6标签的PcOKS蛋白，又称为His6-PcOKS蛋白。
7、将重组质粒pET∷PcOKS导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
8、取步骤7得到的重组菌的单克隆，接种至液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm＝0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.4mmol/L，然后37℃、200rpm振荡培养8小时。
9、完成步骤8后，12000rpm离心2分钟，收集菌体沉淀。
10、采用binding buffer重悬菌体，然后置于冰浴中进行超声破碎，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。
binding buffer(pH 8.0)：25mM Tris-HCl、250mM氯化钾、5mM咪唑、2mM巯基乙醇，余量为水。
11、取步骤10得到的上清液，上样于用binding buffer平衡好的Ni-琼脂糖柱(Invitrogen)，先用5倍柱体积的binding buffer进行洗涤，然后用5倍柱体积的washingbuffer进行洗涤，最后用3ml elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。
washing buffer(pH8.0)：25mM Tris-HCl、250mM氯化钾、20mM咪唑、2mM巯基乙醇，余量为水。
elution buffer(pH8.0)：25mM Tris-HCl、250mM氯化钾、500mM咪唑、2mM巯基乙醇，余量为水。
12、取步骤11得到的洗脱液，采用PD-10脱盐柱进行脱盐，然后收集溶液，即为His6-PcOKS蛋白溶液。
13、采用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
SDS-PAGE电泳图见图1。图1中，M为蛋白质分子量marker，1为IPTG诱导前的菌体总蛋白，2为IPTG诱导前的上清，3为完成IPTG诱导后的菌体总蛋白，4为完成IPTG诱导后的上清，5为His6-PcOKS蛋白溶液。
14、取His6-PcOKS蛋白溶液，采用Bradford法检测蛋白浓度，蛋白纯度为0.36mg/ml。
二、PcOKS蛋白的酶活鉴定
聚八酮合酶(octaketide synthase)：催化8分子丙二酰辅酶A缩合形成聚八酮骨架的聚酮合酶。
反应体系(250μl)：含有64μM乙酰辅酶A、240μM丙二酰辅酶A、2μg步骤一制备的His6-PcOKS蛋白，余量为pH 7.0、0.1M的磷酸钾缓冲液。
反应体系置于37℃反应30分钟，然后加入25μl 20％(体积比)盐酸水溶液以终止反应。然后用乙酸乙酯抽提2次(每次采用275μl乙酸乙酯)。然后合并有机相并进行真空干燥，收获干燥产物。将干燥产物溶解于50μl 50％(体积比)甲醇水溶液，然后进行HPLC-MS检测。
HPLC(高效液相色谱)参数：使用VWR-Hitachi LaChrom Elite系统(pump L-2130,autosampler L-2200,diode array detector L-2455)，配有Symmetry柱(C8，4.6×150mm，3.5μm；Waters，Eschborn，Germany)；流动相为0.1％(体积比)甲酸水溶液(A液)和乙腈(B液)，流动相流速为0.5ml/min；洗脱过程(％均代表体积比)：5％B液2分钟，随后在20分钟内B液占流动相的体积比线性增加到30％，然后95％B液4分钟，然后5％B液平衡8分钟。检测波长为200nm-500nm。
MS(质谱)参数：使用配有Turbo V电喷雾电离接口的3200Qtrap质谱仪(3200Qtrap；Applied Biosystems/MDS SCIEX，Darmstadt，Germany)，采用3200QTrap质谱仪的集成注射泵(Syringe；1,000ml,i.d.2.3mm；Hamilton,Nevada,USA)，流速为10μl/min。MS/MS采用负离子模式。数据采集和处理采用Analyst软件(version 1.64.2；AppliedBiosystems/MDS SCIEX)。
结果见图2，图2的A为HPLC图谱，图2的B为A中的3个峰的MS图谱。主产物为：6-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3,5-二氧己酸(6-(7-hydroxy-5-methyl-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-3,5-dioxohexanoic acid)，其结构式见式(Ⅱ)；SEK4b，其结构式见式(Ⅲ)。副产物为：4-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3-氧丁酸(4-(7-hydroxy-5-methyl-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-3-oxobutanoic acid)，其结构式见式(Ⅳ)。
Figure BDA0002646401970000071
上述结果表明，His6-PcOKS蛋白(PcOKS蛋白)具有合成聚八酮产物的功能，在体外酶促反应体系中能够催化丙二酰辅酶A形成大黄素的骨架结构。
实施例3、生产大黄素
一、构建重组质粒
1、以实施例2中的重组质粒pMD∷PcOKS为模板，采用PcOKS-PS和PcOKS-PA组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
PcOKS-PS：5′-GTAGGATCCATGGCGAATGTACTGCA-3′；
PcOKS-PA：5′-GCACTCGAGTCACAGAATTGGAACACT-3′。
2、取步骤1的PCR扩增产物，采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收酶切产物。
3、取重建pBI121载体，采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收载体骨架。
重建pBI121载体(the reconstructed pBI121 vector)记载于如下文献：Isolation and Characterization of AaWRKY1,an Artemisia annua TranscriptionFactor that Regulates the Amorpha-4,11-diene Synthase Gene,a Key Gene ofArtemisinin Biosynthesis，Plant Cell Physiol.50(12):2146–2161(2009)，2146-2161。
4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pBI::PcOKS。根据测序结果，对重组质粒pBI::PcOKS进行结构描述如下：在重建pBI121载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、制备转基因植物
1、将重组质粒pBI::PcOKS导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、采用花序浸泡法，将步骤1得到的重组农杆菌对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转化，培养植株后收获种子。
3、将步骤2得到的种子进行表面消毒后平铺于含40mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基平板上，可以正常生长的植株即为抗性植株。
4、取抗性植株的叶片，提取总蛋白进行Western blot，筛选转基因植株。Westernblot采用的抗体为实施例2制备的His6-PcOKS蛋白的抗体。
部分植株Western blot的结果见图3。图3中，1对应的样本为实施例2制备的His6-PcOKS蛋白，2对应哥伦比亚生态型拟南芥的总蛋白，3对应转空载体植株的总蛋白，4-9对应步骤4得到的不同抗性植株的总蛋白。图3中，泳道6、泳道7和泳道9对应的植株为转基因植株。
三、制备转空载体植株
用重建pBI121载体代替重组质粒pBI::PcOKS，按照步骤二进行操作，得到转空载体植株。
四、检测代谢产物
供试植株：哥伦比亚生态型拟南芥、步骤二得到的转基因植株、步骤三得到的转空载体植株。
在平行条件下培养供试植株，结实后，取植株的整个根系。
取根系，冷冻干燥至恒重(称重，即为干重，DW)，然后粉碎。精确称取50mg，加入2.5mL 60％(体积比)乙醇水溶液，涡旋振荡，60℃超声提取30min。12000rpm离心10分钟，取上清，用60％(体积比)乙醇水溶液定容至2.5mL，经0.22μm过滤器过滤。然后进行HPLC-MS检测(HPLC-MS检测方法同实施例2)。
结果见图4。图4中，A对应转基因植株；B对应哥伦比亚生态型拟南芥；C对应大黄素(emodin)标准品。结果表明，过表达PcOKS基因的转基因拟南芥根中能够检测到大黄素，而野生型哥伦比亚生态型拟南芥根中检测不到大黄素。转空载体植株根中检测不到大黄素。结果表明，将PcOKS基因导入拟南芥中并表达，能够利用拟南芥自身的丙二酰辅酶A为底物合成大黄素。根据HPLC-MS检测的结果，20株转基因植株中大黄素的平均产量可达到0.37mg/g DW。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院大学
<120> 一种聚八酮合酶及其编码基因与应用
<130> GNCYX202130
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 391
<212> PRT
<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)
<400> 1
Met Ala Asn Val Leu Gln Glu Ile Arg Asn Ser Gln Lys Ala Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Val Pro Pro Thr Cys Tyr
20 25 30
Pro Gln Ala Asp Tyr Pro Asp Phe Tyr Phe Arg Val Cys Lys Ser Glu
35 40 45
His Met Thr Gln Leu Lys Lys Lys Met Gln Tyr Ile Cys Asp Arg Ser
50 55 60
Gly Ile Arg Gln Arg Tyr Met Phe His Thr Glu Glu Asn Leu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Pro Ser Met Cys Thr Phe Asp Gly Ala Ser Leu Asn Ala Arg Gln
85 90 95
Glu Met Leu Ile Met Glu Val Pro Lys Leu Gly Val Glu Ala Ala Glu
100 105 110
Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Asp Lys Ser Lys Ile Thr His Leu
115 120 125
Ile Phe Cys Thr Thr Thr Ser Asn Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln
130 135 140
Phe Ala Thr Met Phe Gly Leu Asn Pro Thr Val Ser Arg Thr Met Val
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Val Lys
165 170 175
Asp Ile Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ser Arg Val Leu Ile Val Cys Ser
180 185 190
Glu Ile Val Ala Phe Ala Phe Arg Gly Pro His Glu Asp His Ile Asp
195 200 205
Ser Leu Ile Gly Gln Leu Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Leu Val
210 215 220
Val Gly Ala Asp Ile Asp Glu Ser Val Glu Lys Pro Ile Phe Gln Ile
225 230 235 240
Met Ser Ala Ser Gln Ala Thr Ile Pro Asn Ser Leu His Thr Met Ala
245 250 255
Leu His Leu Thr Glu Ala Gly Leu Thr Phe His Leu Ser Lys Glu Val
260 265 270
Pro Lys Ala Val Ser Asp Asn Met Glu Glu Leu Met Leu Glu Ala Phe
275 280 285
Lys Pro Leu Gly Ile Thr Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Gln Val His
290 295 300
Pro Gly Gly Lys Ala Ile Leu Asp Lys Ile Glu Glu Lys Leu Glu Leu
305 310 315 320
Lys Lys Asp Lys Met Leu Asp Ser Arg Tyr Ile Leu Ser Glu Tyr Gly
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Ala Cys Val Leu Phe Val Met Asp Glu Met Arg Lys
340 345 350
Arg Ser Phe Arg Glu Gly Lys Lys Thr Thr Gly Asp Gly Tyr Glu Trp
355 360 365
Gly Val Ala Ile Gly Leu Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Ile Val
370 375 380
Leu Arg Ser Val Pro Ile Leu
385 390
<210> 2
<211> 1176
<212> DNA
<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)
<400> 2
atggcgaatg tactgcagga gatccgcaac tctcagaagg cgacaggccc tgccaccgtc 60
ctggccatcg gcaccgcggt gccaccgact tgctaccctc aggccgatta tccggatttc 120
tacttccgtg tctgcaagag cgaacacatg acccaactca agaagaaaat gcaatacatt 180
tgtgaccgat cgggcataag gcagcggtat atgttccaca cggaagaaaa cctgggtaag 240
aaccctagca tgtgcacatt tgacggcgca tccttgaacg ctcgacaaga gatgttgatc 300
atggaagtgc cgaagctagg cgtggaggcg gctgaaaagg caatcaaaga atgggggcag 360
gacaagtcga agatcaccca cctcatcttc tgcaccacca ctagcaacga catgcccggg 420
gctgactacc agttcgccac catgttcggc ctcaacccca ccgtgagccg caccatggtc 480
taccagcagg gctgcttcgc tgggggcacc gtcctccgcc tcgtcaagga catagccgag 540
aacaacaagg gctctcgcgt cctcatcgtc tgctctgaga tcgtcgcctt cgccttccgt 600
gggccccacg aggaccacat cgactccctc attggacagc tcctgtttgg tgacggggcc 660
gccgcgctcg tcgttggggc ggatatcgac gagagtgtcg agaagcccat cttccagatc 720
atgtcggcgt ctcaggccac catcccgaac tcgttgcaca ccatggctct ccatctgacg 780
gaggccgggc tgaccttcca tcttagcaag gaggttccaa aggcagttag tgataacatg 840
gaggagctca tgcttgaagc gttcaagccg ctcgggataa ctgattggaa ctcgatattc 900
tggcaggttc atcccggggg taaggcaatc cttgacaaga tagaggagaa gctggagctc 960
aagaaagata agatgctgga ctctcgatac atcctcagcg agtacgggaa tctgaccagc 1020
gcgtgtgtgt tgttcgtgat ggatgagatg agaaagaggt cttttcgaga agggaagaag 1080
accaccggag atggctacga gtggggagtc gccattggat tgggcccggg gcttacagtc 1140
gagaccattg tcctgcgaag tgttccaatt ctgtga 1176

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示蛋白质进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与大黄素合成相关的由(a1)衍生的蛋白质；
(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b3)来源于虎杖且与(b1)所示DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质作为聚八酮合酶的应用。
6.权利要求1所述蛋白质在制备目标物中的应用；所述目标物为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)：
(c1)6-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3,5-二氧己酸；
(c2)SEK4b；
(c3)4-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3-氧丁酸；
(c4)大黄素。
7.权利要求1所述的蛋白质的应用，为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)：
(d1)催化丙二酰辅酶A形成6-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3,5-二氧己酸；
(d2)催化丙二酰辅酶A形成SEK4b；
(d3)催化丙二酰辅酶A形成4-(7-羟基-5-甲基-4-氧-4H-色酮-2-)-3-氧丁酸。
8.一种制备可以生产大黄素的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述基因导入受体植物，得到可以生产大黄素的转基因植物。
9.一种生产大黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求2或3所述基因导入受体植物，得到可以生产大黄素的转基因植物；
(2)从所述转基因植物中获取大黄素。
10.一种生产大黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求2或3所述基因导入受体植物的外植体，得到可以生产大黄素的转基因材料；
(2)从所述转基因材料中获取大黄素。
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