CN111978411A - 一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域及兽医生物制药领域，具体公开了一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用。本发明首先提供一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，接着提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗，其包括所述融合蛋白。该猪蓝耳病亚单位疫苗中的融合蛋白是将进行密码子优化后的PRRSV NADC30‑like毒株的ORF5全长基因与去除DomainⅢ结构域的绿脓杆菌的基因融合表达，利用昆虫杆状病毒/昆虫细胞表达系统来获得的。本发明疫苗的保护效果好，能够诱导有效的体液免疫和细胞免疫，适合用于临床对蓝耳病的预防。

Description

一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是PRRSV引起的高度传染性的疾病，能够引起母猪繁殖障碍、各年龄段猪呼吸道症状、仔猪高死亡率等，是造成养猪业严重经济损失的重要疾病之一。目前市场上针对该病防疫的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗安全性高但不能很好地诱导细胞免疫，弱毒疫苗免疫保护效果良好但存在散毒和返强风险。而亚单位疫苗预期能够起到较好的预防作用。

新发流行毒株NADC30-like，可引起猪场免疫猪蓝耳病发病，相比高致病性PRRSV，NADC30-like毒力相对温和，能够引起经典毒株的致病症状和30％-50％的死亡率，其基因序列上与美国NADC30毒株高度同源，也因此得名NADC30-like。现市场上并无针对该毒株的相关疫苗，已有的蓝耳病疫苗并不能对该毒株引起的蓝耳病爆发起到很好的防御作用。

PRRSV基因组包含8个开放阅读框，编码的重要结构蛋白主要是ORF5、ORF6、ORF7，分别编码GP5蛋白(又名E蛋白)、M蛋白和N蛋白。GP5蛋白不仅能同时诱导细胞免疫应答和体液免疫应答。而且在蛋白的表面还带有中和位点。但GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白，是变异性最明显的蛋白之一，欧洲株和北美株基因亚型之间的序列同源性只有51％-55％，即使在同一个基因亚型毒株之间，同源性也仅为94％左右。因此，针对不同的毒株，需要有针对性的研究相关疫苗。

现有技术中已有的猪蓝耳病疫苗设计方案有：“能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗(申请号201610333073.1)”、“一种蓝耳病亚单位疫苗的制备(申请号201310190308.2)”和“重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗(申请号201510257656.6)”。以它们思路所设计的疫苗对于机体细胞免疫反应的刺激仍有待进一步提升。

因此，有必要对猪蓝耳病亚单位疫苗的构建进行进一步研究。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种保护效果良好，适合用于临床对猪蓝耳病预防的疫苗。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该编码基因编码上述融合蛋白。

本发明另提供一种含有上述编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

本发明又提供一种上述融合蛋白或编码基因或生物材料在制备猪蓝耳病亚单位疫苗中的应用。

本发明再提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗，其有效成分为上述融合蛋白。

本发明还提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗的制备方法，其包括将上述融合蛋白与佐剂混合的步骤。

其中，所述融合蛋白的制备方法包括：

(1)将PRRSV NADC30-like毒株的ORF5全长基因序列进行密码子优化；

(2)将去除DomainⅢ结构域的绿脓杆菌外毒素A的基因序列与优化后的所述ORF5全长基因序列串联，加His标签和酶切位点，合成所述融合蛋白的基因序列。

所述融合蛋白的制备方法还包括：

(3)将合成的所述融合蛋白的基因序列连入昆虫杆状病毒表达载体中，转化大肠杆菌感受态，提取重组穿梭载体；

(4)将提取的所述重组穿梭载体转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；

(5)将获得的所述重组杆状病毒接种于昆虫细胞中，收获并纯化目的蛋白。

本发明中的猪蓝耳病亚单位疫苗中采用的GP5蛋白的核苷酸序列(ORF5全长基因)来源于新发流行毒株PRRSV NADC30-like，可针对该毒株引起的疾病暴发起到预防作用。而由于不同毒株的GP5蛋白会表现出不同的N糖基化位点，且这些位点的变化将对相应的免疫反应产生不可简单预期的影响，故而现有毒株的疫苗设计思路并不一定能简单套用到新毒株的疫苗研发中，因此，本发明针对PRRSV NADC30-like这一毒株的特性，对其疫苗构建进行了反复研究，最终才获得本发明所记载的效果理想的针对性疫苗。

绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A，PEA)是绿脓杆菌感染的毒性因子，具有4个功能结构域，Domain Ia、Ib、Ⅱ和Ⅲ。其中Domain Ia是细胞结合功能区，DomainⅡ是转位功能区，Domain Ib和DomainⅢ的末端氨基酸位点为ADP核糖基化活性区，即毒性结构域。本发明是将PEA的DomainⅢ毒性结构域去除后(PEA △DⅢ)与特定病原的免疫原性区域结合，表达出重组蛋白(PEA△DⅢ-GP5)，经纯化、乳化制备成亚单位疫苗后免疫机体，从而刺激机体产生更强的特异性细胞免疫反应，进而提高了亚单位疫苗的保护效果。

本发明中亚单位疫苗为GP5全蛋白序列，源自流行毒株PRRSV NADC30-like，且包含绿脓杆菌外毒素蛋白PEA的转位结构域，相比只含有病毒抗原蛋白的亚单位疫苗，本疫苗能够更好的刺激机体对PRRSV的体液免疫和细胞免疫应答。且本发明中的融合蛋白为分泌型蛋白，无需经历翻译后修饰和内质网滞留的过程，可直接分泌到细胞外，纯化过程更为简便。

进一步的，本发明所制备的亚单位疫苗含有猪繁殖与呼吸系统综合征病毒PRRSVNADC30-like GP5蛋白，以及绿脓杆菌外毒素转位结构域(PEA △DⅢ)和纯化标签8×His。

本发明疫苗的制备具体包含以下内容，利用基因工程技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinere productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)流行毒株NADC30-like的GP5蛋白和绿脓杆菌外毒素蛋白(去除毒性结构域)的编码区串联到昆虫-杆状病毒系统表达载体上，经昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen)表达、重组蛋白纯化、乳化工艺后，可用做疫苗进行猪蓝耳病的预防。

本发明的有益效果至少在于：

1、本发明采用昆虫细胞表达系统，相比于现有技术中的原核表达系统，能够最大可能的保持蛋白质在真核生物体内的结构和修饰状态。

2、本发明采用经密码子优化后的ORF5全长基因，无羧基端KEDL信号肽，融合蛋白能够分泌到细胞外，更易分离纯化；

3、本发明采用ORF5全长基因PEA结构1和2融合表达形成的重组蛋白，经免疫试验猪后并未发现炎症反应，疫苗安全性良好；

4、本发明的亚单位疫苗中包含了能够刺激细胞免疫应答的绿脓杆菌外毒素PEA转位结构域，能够有效刺激机体产生抗原特异性T细胞免疫应答，提高本方案中亚单位疫苗的免疫原性；

5、本发明的亚单位疫苗的N端中还包含了8个连续的组氨酸，即8×His标签，利于该融合蛋白亚单位疫苗的纯化步骤；

6、本发明疫苗保护效果良好，能够诱导有效的体液免疫和细胞免疫，适合用于临床对蓝耳病的预防。

附图说明

图1为WB检测PEA△DⅢ-GP5的表达结果，其中，泳道1、2、3分别为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第3、5、8天，细胞培养液中的目的蛋白表达情况；

图2为SDS-PAGE检测PEA △DⅢ-GP5纯化结果，其中，泳道1为不接毒的HiFi细胞培养液；泳道2为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第8天培养液；泳道3为重组杆状病毒rAc-PEA △DⅢ-GP5接种HiFi细胞后第8天培养液纯化后所得目的蛋白；

图3为WB检测PEA △DⅢ-GP5纯化结果，其中，泳道1为纯化后的融合蛋白PEA△DⅢ-GP5经50倍稀释后的样品测试结果；

图4为第二次免疫后第14天试验猪血清IFN-γ水平检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1

一、目的蛋白表达载体的构建

1、获取目的蛋白序列：

从NCBI得到PRRSV NADC30-like毒株的基因序列(Accession：MH651743)，选择GP5蛋白的核苷酸序列并对其进行优化；从NCBI得到绿脓杆菌的基因序列(GenBank：CP039293)，选择外毒素PEA的转位结构域(去除其DomainⅢ，以下简称PEA△DⅢ)序列；将PEA△DⅢ和优化后的GP5基因序列串联，并加8×His标签序列，N端和C端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，生物合成重组蛋白(PEA△DⅢ-GP5)的基因序列(如SEQ ID No.1所示)。

2、将合成的融合蛋白pUC-PEA△DⅢ-GP5序列用NdeI和XhoI酶切位点连入表达载体pFastBacdual：

(1)酶切pUC-PEA △DⅢ-GP5和昆虫杆状病毒表达载体pFastBacdual(购自丰晖生物，产品编号BR248)：

用ddH₂O补充至40ul。

酶切条件：37℃水浴消化1h。

酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，操作步骤按照胶回收试剂盒的标准步骤进行操作。

(2)将PEA △DⅢ-GP5连接到pFastBacdual：

连接条件：22℃2h。

二、构建重组杆状病毒rAc-PEA△DⅢ-GP5

1、获得重组穿梭载体：

取4ul重组转移质粒pFastBacdual-PEA△DⅢ-GP5转入100ul大肠杆菌感受态DH10Bac(购自GiBCO BRL)中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入900ul无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落、提取重组杆粒rAc-PEA△DⅢ-GP5。

提取方法：无菌挑取阳性白色菌落于三抗LB液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L CH₃COOK，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL无菌水中，立即使用或-20℃保存。

2、获得重组杆状病毒：

利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到Sf9昆虫细胞(来自武汉科前生物股份有限公司)中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。

转染方法按照脂质体说明书(lipo2000购自invitrogen)进行。

三、目的蛋白PEA△DⅢ-GP5的表达与纯化

1、目的蛋白PEA△DⅢ-GP5的表达：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen)中，接毒剂量为0.01MOI，细胞密度为1.0×10⁶/ml，细胞体积为400ml。于3、5、8日后分别收获细胞培养上清进行Western blotting检测目的蛋白PEA△DⅢ-GP5的表达，检测结果见图1。

2、目的蛋白的纯化：

纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：取接毒后8日的HighFive^TM细胞培养物，10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45um的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mM咪唑，1×PBS)过柱洗杂；洗脱缓冲液(150mM咪唑，1×PBS)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(1×PBS)4℃透析过夜，得到目的蛋白。进行SDS-PAGE和Western blotting检测纯化后的蛋白。检测结果分别见图2和图3。

四、PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗的制备

将纯化得到的PEA△DⅢ-GP5蛋白测定浓度后过滤，与无菌ISA201佐剂(购自SEPPIC公司)按照1:1的比例乳化制备成亚单位疫苗，使每毫升疫苗中的PEA△DⅢ-GP5抗原含量为200ug，置于4℃保存待用。将无菌透析缓冲液(1×PBS)与等体积ISA201佐剂充分乳化制备成疫苗对照物，置于4℃冰箱备用。

实验例1 PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗对小鼠的安全性试验

选购4～5周龄的Balb/C小鼠10只，分为2组，每组5只，分别为免疫组和对照组。免疫组在第0天和第14天分别以小腿肌肉注射的方式接种实施例1制得的PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗200μL；空白对照组以相同的方式注射等体积疫苗对照物。免疫后连续观察14天，试验小鼠精神、食欲均正常，健康状况良好，未产生任何不良反应，说明该亚单位疫苗对小鼠的安全性良好。小鼠安全性试验结果具体见表1。

表1

实验例2 PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗对仔猪安全性和有效性试验

1、PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗对仔猪的安全性和有效性试验：

选择45日龄PRRSV阴性仔猪10头，分为2组，免疫组5头，对照组5头。免疫组在第0天和第14天分别耳后肌肉注射实施例1制得的PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗1.0ml，空白对照组不免疫。连续观察14天，仔猪未出现任何临床症状，精神、食欲、体温均正常，未产生任何不良反应，结果表明该亚单位疫苗对仔猪的安全性良好。

仔猪安全性试验具体结果见表2。

表2

2、PEA △DⅢ-GP5亚单位疫苗的免疫效力试验

选择45日龄PRRSV阴性仔猪10头，分为2组。分别为PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗免疫组5头；空白对照组5头。免疫组在第0天和第14天分别耳后肌肉注射疫苗1.0ml，空白对照组不免疫。分别在第二次免疫当天(免疫前)、第二次免疫后第14、28、42、56、60天前腔静脉采血，进行ELISA抗体水平检测；并在第14天检测血清中IFN-γ水平(检测试剂盒购自BD公司，BD-EL-P0003，按照试剂盒说明书操作)和中和抗体效价。测试结果分别见表3、图4(猪血清IFN-γ水平检测结果图)和表4。试验结果显示，PEA△DⅢ-GP5亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高水平的特异性抗体。

仔猪有效性试验(ELISA抗体水平检测)具体结果见表3。

表3

本实验例ELISA抗体水平检测采用购自武汉科前生物股份有限公司的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，具体方法为：

用包被液稀释PEA △DⅢ-GP5重组蛋白到1μg/ml，包被96孔Elisa板，100μl/孔，4℃包被过夜。加PBS洗涤液200ul，重复洗涤2次；将稀释好的(按照试剂盒说明书，用试剂盒中的血清稀释液按1:40稀释)待检血清、阳性(PRRSV特异性血清，购自中国兽医药品监察所)各取100μl加入到抗原包被板孔中，阳性对照和阴性对照各设2孔。轻轻振匀混匀，置37℃孵育30分钟。加PBS洗涤液200ul，重复洗涤5次，最后拍干；每孔HRP标记的抗猪lgG二抗(用PBS稀释1000倍使用)100ul，置37℃孵育30分钟。加PBS洗涤液200ul，重复洗涤5次，最后拍干。每孔先加底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，轻微振动反应板混匀,室温避光显色10分钟；每孔加终止液50μl,轻微振动反应板混匀；设置酶标仪测量波长为630nm，进行测试。

中和抗体效价测定具体方法如下：

(1)血清处理

无菌待检血清56℃水浴灭活30min。

(2)血清稀释

在96孔细胞培养板各孔中加入50μl无血清的DMEM培养基，随后将待检血清作连续系列稀释，从1:2至1:256，每个稀释度作4个重复，每孔50μl。

(3)病毒中和

用无血清的DMEM培养基将已测好TCID50的PRRSV NADC30-like株病毒液稀释为100μl含400个TCID50的病毒液，将稀释好的病毒液加入到血清稀释孔中，每孔50μl，置37℃、含5％CO₂的培养箱中作用1h。

(4)加入Marc-145细胞

将长满单层的Marc-145细胞用胰酶消化后，用DMEM培养基(含4％新生牛血清)吹下，计数后用DMEM培养基(含4％新生牛血清)调整细胞密度至2.0×10⁵个/ml，将调整好的细胞悬液接种于已中和完成的96孔细胞培养板，每孔100μl置37℃、含5％CO₂的培养箱培养。

(5)细胞对照

在上述96孔细胞培养板中设置8孔细胞对照，每孔加入100μl无血清的DMEM培养基。

(6)结果判定

每日观察并记录细胞病变(CPE)情况，连续观察4日。

细胞对照应无细胞病变，按Reed-Muench法计算被检血清中PRRSV中和抗体的效价。检测结果见表4。

表4

上述表4为试验猪第二次免疫后第14天采集的血清，用PRRSV NADC30-like进行中和试验得到的结果。从中可知，本发明的疫苗平均效价高，免疫效果理想。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种猪蓝耳病亚单位疫苗及其制备方法与应用

<130> KHP201114000.9

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His His His His His His His His Met His Leu Ile Pro His Trp

1 5 10 15

Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu Leu Ala Gly Gly Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala

35 40 45

Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val

50 55 60

Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser

65 70 75 80

Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn

85 90 95

Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly

100 105 110

Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg

115 120 125

Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro

130 135 140

Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu

165 170 175

Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser

180 185 190

Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val

195 200 205

Val Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp

210 215 220

Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly

245 250 255

Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp

260 265 270

Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly

275 280 285

Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu

290 295 300

Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln

305 310 315 320

Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg

325 330 335

Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser

340 345 350

Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu

355 360 365

Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe

370 375 380

Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp

385 390 395 400

Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Lys Phe

405 410 415

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Tyr Cys Ser Gln Leu Pro Phe

420 425 430

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Val Asn Ala Asn

435 440 445

Asn Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

450 455 460

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asp Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val

465 470 475 480

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly

485 490 495

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val

500 505 510

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Glu Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

515 520 525

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Cys Phe Ala Ile Arg Leu Ala

530 535 540

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

545 550 555 560

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile

565 570 575

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Asp Val Gly Gly His Leu Ile Asp Leu

580 585 590

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Ile

595 600 605

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro

610 615

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgcatc accatcacca tcaccatcac atgcacctga taccccattg gatccccctg 60

gtcgccagcc tcggcctgct cgccggcggc tcgtccgcgt ccgccgccga ggaagccttc 120

gacctctgga acgaatgcgc caaagcctgc gtgctcgacc tcaaggacgg cgtgcgttcc 180

agccgcatga gcgtcgaccc ggccatcgcc gacaccaacg gccagggcgt gctgcactac 240

tccatggtcc tggagggcgg caacgacgcg ctcaagctgg ccatcgacaa cgccctcagc 300

atcaccagcg acggcctgac catccgcctc gaaggcggcg tcgagccgaa caagccggtg 360

cgctacagct acacgcgcca ggcgcgcggc agttggtcgc tgaactggct ggtaccgatc 420

ggccacgaga agccctcgaa catcaaggtg ttcatccacg aactgaacgc cggcaaccag 480

ctcagccaca tgtcgccgat ctacaccatc gagatgggcg acgagttgct ggcgaagctg 540

gcgcgcgatg ccaccttctt cgtcagggcg cacgagagca acgagatgca gccgacgctc 600

gccatcagcc atgccggggt cagcgtggtc atggcccaga cccagccgcg ccgggaaaag 660

cgctggagcg aatgggccag cggcaaggtg ttgtgcctgc tcgacccgct ggacggggtc 720

tacaactacc tcgcccagca acgctgcaac ctcgacgata cctgggaagg caagatctac 780

cgggtgctcg ccggcaaccc ggcgaagcat gacctggaca tcaaacccac ggtcatcagt 840

catcgcctgc actttcccga gggcggcagc ctggccgcgc tgaccgcgca ccaggcttgc 900

cacctgccgc tggagacttt cacccgtcat cgccagccgc gcggctggga acaactggag 960

cagtgcggct atccggtgca gcggctggtc gccctctacc tggcggcgcg gctgtcgtgg 1020

aaccaggtcg accaggtgat ccgcaacgcc ctggccagcc ccggcagcgg cggcgacctg 1080

ggcgaagcga tccgcgagca gccggagcag gcccgtctgg ccctgaccct ggccgccgcc 1140

gagagcgagc gcttcgtccg gcagggcacc ggcaacgacg aggccggcgc ggccaacgcc 1200

gacgtggtga gcctgacctg cccggtcgcc gccggtgaat gcgcaaaatt tatgttgggt 1260

aaatgcttga ccgcgggtta ctgctcccaa ttgcctttct tgtggtgtat cgtgccattc 1320

tgtttcgctg tgctggtcaa cgccaacaac aacagcagct cccatttgca attgatttac 1380

aacctgacca tatgtgagct gaatggcaca gattggttgg ataaaaaatt cgactgggca 1440

gtggagactt tcgttatctt ccctgtgttg actcacatcg tctcctacgg tgccctgacc 1500

actagccatt tcctggacac cgtcggcctg atcactgtgt ccaccgccgg ttactaccac 1560

gagcgttacg tattgagtag catctacgct gtctgtgctc tggctgcgtt ggtttgcttc 1620

gccattaggt tggcgaaaaa ttgcatgtcc tggcgttact cctgcaccag atacaccaat 1680

ttcctgctgg acaccaaggg caaactgtac cgttggcgtt cccccgtcat tatagagaag 1740

ggtggtaaag ttgatgtggg tggtcatttg atcgacctga agagagttgt gctggatggt 1800

tccgcggcaa cccctgtaac caagatttcc gcggaacaat ggggtcgtcc atag 1854

Claims (8)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述的编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备猪蓝耳病亚单位疫苗中的应用。

5.猪蓝耳病亚单位疫苗，其特征在于，所述猪蓝耳病亚单位疫苗的有效成分为权利要求1所述的融合蛋白。

6.权利要求5所述的猪蓝耳病亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的融合蛋白与佐剂混合的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法包括：

(1)将PRRSV NADC30-like毒株的ORF5全长基因序列进行密码子优化；

(2)将去除Domain Ⅲ结构域的绿脓杆菌外毒素A的基因序列与优化后的所述ORF5全长基因序列串联，加His标签和酶切位点，合成所述融合蛋白的基因序列。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法还包括：

(3)将合成的所述融合蛋白的基因序列连入昆虫杆状病毒表达载体中，转化大肠杆菌感受态，提取重组穿梭载体；

(4)将提取的所述重组穿梭载体转染到昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；

(5)将获得的所述重组杆状病毒接种于昆虫细胞中，收获并纯化目的蛋白。

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